BR112021003996A2

BR112021003996A2 - receptores de célula t restritos à mr1 para imunoterapia contra o câncer

Info

Publication number: BR112021003996A2
Application number: BR112021003996-1A
Authority: BR
Inventors: Gennaro De Libero; Marco LEPORE; Lucia Mori
Original assignee: Universität Basel
Priority date: 2018-09-12
Filing date: 2019-09-11
Publication date: 2021-05-25
Also published as: KR20210057750A; EP3850005A1; CN112673018A; JP2022500038A; WO2020053312A1; AU2019338226A1; CA3107859A1; US20220339271A1; SG11202100644YA; IL280375A; MX2021002125A

Abstract

"RECEPTORES DE CÉLULA T RESTRITOS À MR1 PARA IMUNOTERAPIA CONTRA O CÂNCER". A presente invenção se refere a um método de isolamento de uma célula T que expressa um receptor de célula T capaz de se ligar especificamente a um antígeno apresentado por uma célula cancerígena em associação com uma molécula MR1. O método compreende as etapas de (A) prover uma preparação de células T, (b) contatar a preparação com as células cancerígenas que expressam a proteína MR1; (c) isolar uma célula T que é especificamente reativa às ditas células cancerígenas. A invenção se refere adicionalmente a um método de preparação de uma preparação de célula T que expressa MR1 selecionado que reconhece os receptores de célula T a partir dos vetores de expressão transgene, ao uso de tais preparações de célula T no tratamento do câncer, e às coletâneas do receptor de célula T reativo a MR1 que codifica ácidos nucleicos e células.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “RECEPTORES DE CÉLULA T RESTRITOS À MR1 PARA IMUNOTERAPIA CONTRA O CÂNCER”

[001] A invenção se refere à identificação de receptores de antígeno de célula T de humanos reativos ao tumor (TCRs), restritos à molécula MR1 que apresenta antígeno não polimórfico. As sequências de transcrição TCR funcionais foram isoladas dos clones representativos de uma população inédita de células T de humano (descobertas pelos inventores e chamadas de células MR1T), as quais reagem com células de tumor que expressam MR1 na ausência de qualquer antígeno estranho adicionado, e de maneira dependente de MR1. A invenção também se refere ao uso de sequências de gene de TCR reativo ao tumor, restritas à MR1, no tratamento do câncer.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[002] Linfócitos T podem detectar uma gama diversificada de antígenos não peptídicos, incluindo lipídeos e isoprenóides fosforilados, apresentados por moléculas de superfície celular não polimórficas. As propriedades fenotípicas e funcionais heterogêneas destas células T apoiam funções especializadas na proteção do hospedeiro contra infecções, autoimunidade e câncer. O repertório de células T específicas para antígenos não peptídicos recentemente aumentou para incluir células T invariantes associadas à mucosa (MAIT), que respondem aos pequenos precursores de riboflavina produzidos por uma ampla faixa de leveduras e bactérias, e apresentadas pela proteína MR1 relacionada ao MHC de classe I. Células MAIT são frequentes no sangue, rim e intestino de humano, e compreendem uma fração maior de células T residentes no fígado. Após ativação, células MAIT liberam um arranjo de citocinas pro-inflamatórias e imunomoduladoras, e podem mediar a morte direta de células infectadas por micróbio. Permanece desconhecido se o papel de MR1 se estende além da apresentação de metabólitos microbianos às células MAIT.

[003] MR1 é uma proteína do tipo MHC de classe I não polimórfica, que é expressa em baixos níveis na superfície de muitos tipos de célula. MR1 é altamente conservada em muitas espécies, com MR1 de humano e camundongo compartilhando

>90 % de homologia de sequência no nível de proteína.

[004] Os inventores propuseram a existência de células T humanas que reconhecem antígenos associados ao tumor apresentado por MR1. Estas células T inéditas podem participar da vigilância imune do tumor, representando assim ferramentas inéditas para imunoterapia contra o câncer. Terapia adotiva com células T derivadas de doador ou paciente, geneticamente modificadas para expressar TCRs específicos para antígenos selecionados associados ao tumor, representa uma estratégia promissora e segura para induzir resposta imune antitumor clinicamente relevante em pacientes com câncer. Mesmo assim, a maioria dos antígenos associados ao tumor identificados até o momento são peptídeos apresentados por moléculas MHC polimórficas. O polimorfismo extremo de genes de MHC limita a aplicação desta abordagem àqueles pacientes que expressam alelos de MHC exclusivos. O alvejamento de antígenos de tumor ligados às moléculas apresentadoras de antígeno não polimórficas, tal como MR1, pode superar esta restrição e, a princípio, ser aplicável a todos os pacientes que carregam tumores que expressam MR1. O uso de receptores de célula T reativos ao tumor, que reconhecem antígenos apresentados a MR1, também pode apresentar a vantagem de complementar respostas antitumor mediadas por antígenos de peptídeo apresentado por MHC, excluindo a competição cruzada de antígenos tumorais para se ligar ao mesmo tipo de molécula apresentadora. Além do mais, esta estratégia pode prover a possibilidade de alvejar antígenos de natureza diferente nas mesmas células de tumor, minimizando assim a ocorrência potencial de variantes de escape de tumor sob pressão imune seletiva. Portanto, a identificação de antígenos associados ao tumor apresentados à MR1, e a caracterização de TCRs restrito à MR1 que reconhecem estes antígenos, podem apresentar implicações importantes para imunoterapia contra o câncer.

[005] Com base na tecnologia de ponta, o objetivo da presente invenção é prover meios e métodos de tratamento inéditos para tratar câncer. Este objetivo é alcançado pelo assunto em questão das reivindicações independentes, com soluções vantajosas adicionais providas pelas reivindicações dependentes, exemplos e figuras divulgados aqui.

DEFINIÇÕES

[006] O termo MR1, no contexto da presente especificação, se refere tanto ao gene MR1 (Entrez 3140) quanto ao produto do gene MR1 (Uniprot Q95460).

[007] MR1, no contexto fisiológico de um paciente não portador de tumor, apresenta subprodutos de riboflavina bacteriana (anteriormente referidos como “antígenos derivados de microrganismo exógeno”) e os apresenta às células T invariantes de mucosa.

[008] Uma célula cancerígena que expressa MR1 apresenta um antígeno particular do câncer, ou inúmeros antígenos particulares do câncer, em MR1.

[009] O termo célula MR1T, no contexto da presente especificação, se refere à uma célula T que expressa um receptor de célula T capaz de se ligar especificamente a uma molécula MR1 apresentada por uma célula cancerígena.

[010] O termo receptor de célula MR1T, no contexto da presente especificação, se refere a um receptor de célula T capaz de se ligar especificamente a um antígeno apresentado por uma célula cancerígena em associação com uma molécula MR1.

[011] Uma sequência de TCR ou molécula de TCR aqui descrita compreende, para ser completamente funcional, uma cadeia de polipeptídeo TCR alfa e uma TCR beta, ou uma cadeia de polipeptídeo TCR gama e uma TCR delta. Se for feita referência a um polipeptídeo TCR alfa ou beta com uma sequência particular, entende-se que, para que seja totalmente funcional nos métodos e células aqui descritos, é necessária a presença de uma cadeia de polipeptídeo complementar (beta ou alfa, respectivamente). O mesmo se aplica, por analogia, ao pareamento gama delta. A menção de uma sequência de TCR alfa, beta, gama ou delta específica implica na possibilidade de que é pareada com a sequência de TCR com a qual é pareada no clone original, da maneira aqui descrita, ou uma sequência de certa identidade com a sequência de pareamento original, da maneira aqui especificada. A menção de uma sequência de TCR alfa, beta, gama ou delta específica também implica na possibilidade de ser pareada com uma outra sequência de TCR de pareamento.

[012] O reconhecimento de antígenos do câncer apresentados à MR1 é realizado principalmente através de sequências CDR3. Onde uma sequência de TCR caracterizada apenas por uma sequência de CDR3 específica é aqui mencionada, está implícito que a sequência de TCR é uma sequência completa de TCR alfa, beta, gama ou delta da maneira aqui provida, e uma molécula de TCR resultante é pareada com uma segunda sequência apropriada.

[013] No contexto da presente especificação, os termos identidade de sequência e percentual de identidade de sequência se referem a um único parâmetro quantitativo que representa o resultado de uma comparação de sequência determinado comparando duas sequências alinhadas, posição por posição. Métodos para alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na tecnologia. O alinhamento de sequências para comparação pode ser conduzido pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento global de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pelo método de busca por similaridade de Pearson e Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. 85:2444 (1988), ou por implementações computadorizadas destes algoritmos incluindo, mas sem limitação: CLUSTAL, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA e TFASTA. Software para realizar análise BLAST é disponível publicamente, por exemplo, através do National Center for Biotechnology-Information (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).

[014] Um exemplo para comparação de sequências de aminoácido é o algoritmo BLASTP, que usa as configurações padrão: Limite esperado: 10; tamanho de palavra: 3; Correspondências máximas em uma faixa de pesquisa: 0; Matriz: BLOSUM62; Custos de intervalo: Existência 11, Extensão 1; Ajustes composicionais: Ajuste de matriz de pontuação composicional condicional. Um exemplo como este para comparação de sequências de ácido nucleico é o algoritmo BLASTN que usa as configurações padrão: Limite esperado: 10; Tamanho da palavra: 28; correspondências máximas em uma faixa de pesquisa: 0; Classificações correspondência/incompatibilidade: 1.-2; Custos de intervalo: Linear. A menos que de outra forma declarada, os valores de identidade de sequência providos aqui se referem ao valor obtido usando o suite BLAST de programas (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)) que usam os parâmetros padrões identificados anteriormente para comparação de proteína e ácido nucleico, respectivamente.

[015] A referência às sequências idênticas sem especificação de um valor percentual implica em 100 % de sequências idênticas (isto é, a mesma sequência).

[016] Na presente especificação, o termo positivo, quando usado no contexto de expressão de um marcador, se refere à expressão de um antígeno ensaiado por um anticorpo fluorescente rotulado, em que a fluorescência é pelo menos 30 % maior (≥ 30 %), particularmente ≥50 % ou ≥80 %, em intensidade de fluorescência mediana, em comparação à coloração com um anticorpo correspondente ao isotipo que não se liga especificamente ao mesmo alvo. Tal expressão de um marcador é indicada por um sobrescrito “mais” (+), após o nome do marcador, por exemplo, CD4+.

[017] Na presente especificação, o termo negativo, quando usado no contexto de expressão de um marcador, se refere à expressão de um antígeno ensaiado por um anticorpo fluorescente rotulado, em que a intensidade de fluorescência mediana é menos que 30 % maior, particularmente menos que 15 % maior que a intensidade de fluorescência mediana de um anticorpo correspondente ao isotipo, que não se liga especificamente no mesmo alvo. Tal expressão de um marcador é indicada por um sobrescrito menos (-), após o nome do marcador, por exemplo, CD127-.

[018] O termo vetor de expressão do ácido nucleico no contexto da presente especificação se refere a um plasmídeo ou um genoma viral, que é usado para transfectar (no caso de um plasmídeo) ou transduzir (no caso de um genoma viral) uma célula alvo com um certo gene de interesse. O gene de interesse está sob o controle de uma sequência promotora, e a sequência promotora é operacional dentro da célula alvo, assim, o gene de interesse é transcrito tanto constitutivamente quanto em resposta a um estímulo ou dependente do estado da célula. Em certas modalidades, o genoma viral é embalado em um capsídeo para se tornar um vetor viral, que pode transduzir na célula alvo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[019] No sentido mais amplo, a invenção se refere a um método de tratamento do câncer, em que sequências de TCR isoladas de células T reativas às células cancerígenas que expressam MR1 (células MR1T) são expressas após a transferência de gene, em uma população de células T de um paciente. Estas sequências de TCR expressas transgenicamente, externas, são usadas para conferir reconhecimento específico de células cancerígenas que expressam MR1 em células T como um tratamento do tumor do paciente.

[020] A invenção provê similarmente uma célula T, e preparações de célula T compreendendo uma pluralidade de células T, transduzida com genes de TCR específicos de célula MR1T. Em certas modalidades, as células T transduzidas com genes de TCR de célula MR1T podem ser usadas para imunoterapia de adotiva célula em combinação com outras intervenções terapêuticas.

[021] A invenção também se refere a um método pelo qual células T infiltrantes de tumor são preparadas a partir da mesma biópsia de tecido de câncer, de acordo com este protocolo previamente estabelecido (De Libero, ibid.). Clones de célula T individuais são testados contra um painel de linhagem celular de tumor que expressa proteína MR1. Os clones mais reativos de célula T são estudados em relação à sua restrição de MR1, morte do tumor e liberação de citocinas inflamatórias. Os genes de TCR de clones de célula T selecionados são sequenciados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[022] Células reativas são aquelas que, em resposta a serem colocadas em contato com uma célula cancerígena que expressa MR1 (apresentando um antígeno de câncer de uma maneira restrita à MR1), suprarregulam marcadores de ativação (particularmente os marcadores citados nos parágrafos precedentes), liberam citocinas e iniciam a proliferação.

[023] Em outras palavras, células T que exibem atividade restrita a MR1 são células T que podem ser ativadas por um antígeno associado ao tumor exibido por

MR1.

[024] Estas células podem ser classificadas por classificação de célula ativada por fluorescência (FACS), após coloração com os anticorpos apropriados, rotulados fluorescentemente, específicos para o marcador, ou classificando por esferas magnéticas rotuladas com os anticorpos apropriados (que é o método de classificação comum em um ambiente clínico).

[025] Um primeiro aspecto da invenção se refere a um método para produzir uma preparação de células MR1T transgênicas reativas a MR1 na ausência de antígenos exógenos. O método inclui, primeiramente, determinar quais receptores de célula T são mais prováveis de serem reativos a um câncer que expressa MR1 particular em um paciente, a seguir preparar uma população de célula T que expressa estes genes de receptor de célula T específicos, a partir de construções de expressão transferidas para as células, e administrar estas células T geneticamente modificadas no paciente.

[026] Este método compreende as etapas de a. prover uma amostra do tumor obtida a partir de um paciente; b. colocar a dita amostra do tumor em contato com uma pluralidade de molécula do receptor de célula MR1T reativa a MR1, tanto - apresentado uma pluralidade de clones de célula T, em que cada clone de célula T é caracterizado por uma molécula do receptor de célula MR1T reativa a MR1; quanto - como moléculas do receptor de célula MR1T solúveis que são rotuladas, e seu reconhecimento é ensaiado de uma maneira não dependente de célula; c. identificar inúmeros clone(s) de célula T especificamente reativos à dita amostra do tumor; d. prover uma preparação de célula T, particularmente uma preparação de célula T obtida do mesmo paciente; e. introduzir uma construção de expressão de ácido nucleico que codifica um receptor de célula T reativo à molécula MR1 expressa em um clone de célula T,

identificado como sendo especificamente reativo à dita amostra do tumor na etapa c na dita preparação de célula T, produzindo uma preparação de célula T transgene.

[027] A preparação de célula T transgene para o paciente pode ser assim administrada ao paciente.

[028] Em certas modalidades, cada um dos clones de célula T específicos de MR1 ou receptores de célula T solúveis isolados, rotulados e multimerizados é caracterizado por um trecho de sequência CDR3 selecionada a partir de qualquer uma de SEQ ID NO 065 até SEQ ID NO 096. Igualmente, o trecho de sequência CDR3 pode ser caracterizado por uma sequência idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma de SEQ ID NO 065 até SEQ ID NO 096, com uma ou duas substituições de aminoácido. Em modalidades particulares, as substituições realizadas na sequência CDR3 são selecionadas de acordo com as seguintes regras de substituição: - glicina (G) e alanina (A) são intercambiáveis; valina (V), leucina (L), e isoleucina (I) são intercambiáveis, A e V são intercambiáveis; - triptofano (W) e fenilalanina (F) são intercambiáveis, tirosina (Y) e F são intercambiáveis; - serina (S) e treonina (T) são intercambiáveis; - ácido aspártico (D) e ácido glutâmico (E) são intercambiáveis; - asparagina (N) e glutamina (Q) são intercambiáveis; N e S são intercambiáveis; N e D são intercambiáveis; E e Q são intercambiáveis; - metionina (M) e Q são intercambiáveis; - cisteína (C), A e S são intercambiáveis; - prolina (P), G e A são intercambiáveis; - arginina (R) e lisina (K) são intercambiáveis.

[029] Em certas modalidades, cada um dos clones de célula T específicos de MR1 ou receptores de célula T solúveis isolados, monoméricos solúveis ou rotulados e multimerizados é caracterizado por um trecho de sequência CDR3, selecionada a partir de qualquer uma de SEQ ID NO 065 até SEQ ID NO 096, em que a sequência compreende um total máximo de 0, 1 ou 2 substituições nas três posições N e/ou C- terminais, de acordo com as regras anteriores de substituição nas três posições N e/ou C-terminais, enquanto os aminoácidos centrais da sequência CDR3 da maneira indicada não são alterados. Sabe-se que a parte central da sequência CDR3 contribui mais para a ligação ao antígeno ou especificidade de reconhecimento.

[030] Em certas modalidades, cada um dos clones de célula T específicos de MR1 ou receptores de célula T solúveis isolados, rotulados e multimerizados é caracterizado por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir de SEQ ID NO 007 até SEQ ID NO 012, ou SEQ ID NO 037 até SEQ ID NO 060, ou SEQ ID NO 063 até SEQ ID NO 064, e/ou uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NO 001 até SEQ ID 006, ou SEQ ID NO 013 até SEQ ID NO 036, ou SEQ ID NO 061 até SEQ ID NO 062.

[031] Em certas modalidades, cada um dos clones de célula T específicos de MR1 ou receptores de célula T solúveis isolados, rotulados e multimerizados é caracterizado por: “A mesma atividade biológica”, neste contexto se refere à capacidade de uma sequência TCR recombinante de reconhecer (ou contribuir no reconhecimento de) uma molécula MR1 que apresenta um antígeno do câncer em uma célula cancerígena. Ensaios e métodos para determinar tal interação são descritos aqui.

[032] Em certas modalidades, cada um dos clones de célula T específicos de MR1 ou receptores de célula T solúveis isolados, rotulados e multimerizados é caracterizado por uma sequência de ácido nucleico de cadeia α do receptor de célula T selecionada a partir de SEQ ID NO 007, 009 até 011 ou SEQ ID NO 037 até SEQ ID NO 048, e/ou uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NO 001, 003 até 005, ou SEQ ID NO 013 até SEQ ID NO 024.

[033] Em certas modalidades, cada um dos clones de célula T específicos de MR1 ou receptores de célula T solúveis isolados, monoméricos solúveis ou rotulados e multimerizados é caracterizado por uma sequência de aminoácido da cadeia α do receptor de célula T pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98) idêntica à SEQ ID NO 001,

003 até 005, ou SEQ ID NO 013 até SEQ ID NO 024 e com a mesma atividade biológica, particularmente uma sequência de aminoácido pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98) idêntica à SEQ ID NO 001, 003 até 005, ou SEQ ID NO 013 até SEQ ID NO 024 compreendendo uma sequência CDR selecionada a partir de SEQ ID NO 065 até SEQ ID NO 079.

[034] Em certas modalidades, cada um dos clones de célula T específicos de MR1 ou receptores de célula T solúveis isolados, rotulados e multimerizados é caracterizado por uma sequência de ácido nucleico de cadeia β do receptor de célula T selecionada a partir de SEQ ID NO 008, 010 até 012, ou SEQ ID NO 049 até SEQ ID NO 060, e/ou uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NO 002, 004 até 006, ou SEQ ID NO 025 até SEQ ID NO 036.

[035] Em certas modalidades, cada um dos clones de célula T específicos de MR1 ou receptores de célula T solúveis isolados, rotulados e multimerizados é caracterizado por uma sequência de aminoácido da cadeia β do receptor de célula T pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98) idêntica à SEQ ID SEQ ID NO 002, 004 até 006, ou SEQ ID NO 025 até SEQ ID NO 036, e com a mesma atividade biológica, particularmente uma sequência de aminoácido pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98) idêntica à SEQ ID NO 002, 004 até 006, ou SEQ ID NO 025 até SEQ ID NO 036, compreendendo uma sequência CDR selecionada a partir de SEQ ID NO 080 até SEQ ID NO 094.

[036] Em certas modalidades, cada um dos clones de célula T específicos de MR1 ou receptores de célula T solúveis isolados, rotulados e multimerizados é caracterizado por uma sequência de ácido nucleico de cadeia γ do receptor de célula T SEQ ID NO 61 e/ou uma sequência de aminoácido SEQ ID NO 063, ou uma sequência pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98) idêntico a esta, e com a mesma atividade biológica, particularmente uma sequência de aminoácido pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98) idêntica à SEQ ID NO 063 e compreendendo uma CDR3 de SEQ ID NO 095.

[037] Em certas modalidades, cada um dos clones de célula T específicos de

MR1 ou receptores de célula T solúveis isolados, rotulados e multimerizados é caracterizado por uma sequência de ácido nucleico de cadeia δ do receptor de célula T SEQ ID NO 64, e/ou uma sequência de aminoácido SEQ ID NO 062, ou uma sequência de aminoácido pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98) idêntica à SEQ ID NO 062 e compreendendo uma CDR3 de SEQ ID NO 096.

[038] Em certas modalidades, cada um dos clones de célula T específicos de MR1 ou receptores de célula T solúveis isolados, rotulados e multimerizados é caracterizado por um par de sequência de ácido nucleico de cadeia α e cadeia β do receptor de célula T selecionado a partir dos pares: SEQ ID NO 007 e SEQ ID NO 008, SEQ ID NO 009 e SEQ ID NO 010, SEQ ID NO 011 e SEQ ID NO 012, SEQ ID NO 037 e SEQ ID NO 049, SEQ ID NO 038 e SEQ ID NO 050, SEQ ID NO 039 e SEQ ID NO 051, SEQ ID NO 040 e SEQ ID NO 052, SEQ ID NO 041 e SEQ ID NO 053, SEQ ID NO 042 e SEQ ID NO 054, SEQ ID NO 043 e SEQ ID NO 055, SEQ ID NO 044 e SEQ ID NO 056, SEQ ID NO 045 e SEQ ID NO 057, SEQ ID NO 046 e SEQ ID NO 058, SEQ ID NO 047 e SEQ ID NO 059, ou SEQ ID NO 048 e SEQ ID NO 060.

[039] Em certas modalidades, cada um dos clones de célula T específicos de MR1 ou receptores de célula T solúveis isolados, rotulados e multimerizados é caracterizado por um par de sequência de ácido nucleico de cadeia γ e cadeia δ do receptor de célula T selecionado a partir de SEQ ID NO 063 e SEQ ID NO 064, ou uma sequência pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98) idêntica a estas com a mesma atividade biológica do par inalterado.

[040] Em certas modalidades, cada um dos clones de célula T específicos de MR1 ou receptores de célula T solúveis isolados, rotulados e multimerizados é caracterizado por um par de sequência de aminoácido de cadeia α e cadeia β do receptor de célula T selecionado a partir dos pares: SEQ ID NO 001 e SEQ ID NO 002, SEQ ID NO 003 e SEQ ID NO 004, SEQ ID NO 005 e SEQ ID NO 006, SEQ ID NO 013 e SEQ ID NO 025, SEQ ID NO 014 e SEQ ID NO 026, SEQ ID NO 015 e SEQ ID NO 027, SEQ ID NO 016 e SEQ ID NO 028, SEQ ID NO 017 e SEQ ID NO 029, SEQ ID NO 018 e SEQ ID NO 030, SEQ ID NO 019 e SEQ ID NO 031, SEQ ID NO

20 e SEQ ID NO 032, SEQ ID NO 021 e SEQ ID NO 033, SEQ ID NO 022 e SEQ ID NO 034, SEQ ID NO 023 e SEQ ID NO 035, SEQ ID NO 024 e SEQ ID NO 036, ou um par selecionado a partir dos pares fornecidos no parágrafo prévio, em que cada um dos parceiros pode apresentar uma sequência pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98) idêntica à SEQ ID NO indicada, e o par apresenta a mesma atividade biológica do par inalterado.

[041] Em certas modalidades, cada um dos clones de célula T específicos de MR1 ou receptores de célula T solúveis isolados, rotulados e multimerizados é caracterizado por uma cadeia γ do receptor de célula T e sequência de aminoácido de cadeia δ par selecionadas a partir de SEQ ID NO 061 e SEQ ID NO 062.

[042] Em certas modalidades, a preparação de célula T de acordo com a invenção é obtida do mesmo paciente (terapia de célula T adotiva autóloga). Este método apresenta a vantagem de evitar o risco de reações adversas, particularmente uma reação alo-imune direcionada pelos receptores de célula T endógenos da preparação de célula T geneticamente modificada.

[043] Em certas modalidades, a preparação de célula T de acordo com a invenção é obtida a partir de um outro sujeito, particularmente um sujeito correspondente ao HLA (terapia de célula T adotiva alogênica). Embora dependendo da qualidade da correspondência ao HLA, o risco de aloimunidade pode ser significativo, a logística e vantagens procedimentais de apresentar uma grande seleção de preparações de TC pré-fabricadas para selecionar podem facilitar esta terapia em uma comunidade de pacientes muito maior, em comparação aos custos e obstáculos regulatórios muito maiores de uma terapia personalizada, individual para o paciente.

[044] A introdução da construção de expressão do receptor de célula MR1T na preparação de célula T pode ser alcançada por transdução lentiviral, que os inventores usaram rotineiramente em seu trabalho em células MR1T, ou por métodos padrões do vetor de expressão de DNA (plasmídeo) ou transfecção de RNA. Os versados na técnica estão cientes dos protocolos e procedimentos relevantes.

[045] Opcionalmente, a preparação de célula T transgene pode ser mantida na cultura por algum tempo antes de ser administrada ao paciente, a fim de expandir seu número e, novamente de maneira opcional, estimular adicionalmente sua diferenciação em um subconjunto de célula T particularmente desejado.

[046] Em certas modalidades, a preparação de célula T obtida a partir do dito paciente é obtida a partir de sangue periférico do paciente, particularmente em que a dita preparação de célula T é obtida selecionando células de sangue periférico mononuclear (PBMC) para a expressão de um ou diversos marcadores de célula T, selecionados a partir do grupo que contém CD4, CD8, CD27, CD45RA e CD57.

[047] Em certas modalidades, a preparação de célula T, obtida a partir do dito paciente, é obtida a partir de uma biópsia de tumor seguida pela subsequente expansão in vitro. Em certas modalidades, células T são expandidas na presença de fito-hemaglutinina, IL-2, IL-7 e IL-15. As células T em proliferação são isoladas por classificação magnética e usadas para alterar geneticamente receptor de célula T, ou para clonagem e isolamento de células T restritas à MR1 específicas de tumor. As células MR1T isoladas são usadas para clonagem do gene de TCR.

[048] A pluralidade de clones de célula T específicos de MR1 pode ser preparada em antecipação do procedimento, e mantida na forma de uma biblioteca ou painel para uso específico, sempre que surge a necessidade de caracterização rápida de um tumor. Esta etapa é essencialmente uma identificação das moléculas do receptor de célula T específicas de MR1, que reconhecerão uma entidade tumoral particular.

[049] Alternativamente, MR1T TCRs solúveis podem ser gerados e multimerizados (vide Subbramanian et al. Nature Biotechnology, 22, 1429, (2004)). Multímeros de TCR serão rotulados com fluorocromos e usados para corar células de tumor isoladas a partir de biópsias de tumor. A ligação de multímeros de MR1T TCR solúvel indicará a capacidade deste MR1T TCR reconhecer células de tumor e, assim, facilitará a seleção dos MR1T TCRs adequados para terapia gênica neste paciente.

[050] Um outro aspecto da invenção se refere a um vetor de expressão compreendendo, e levando à transcrição de, uma sequência de ácido nucleico que codifica um heterodímero do receptor de célula T funcional, ou uma cadeia α do receptor de célula T capaz de formar um heterodímero do receptor de célula T funcional juntamente com uma cadeia β do receptor de célula T, e/ou uma cadeia β do receptor de célula T capaz de formar um heterodímero do receptor de célula T funcional juntamente com uma cadeia α do receptor de célula T. De maneira importante, heterodímeros γ-δ específicos de MR1 também foram observados pelos inventores, assim o mesmo se aplica a estas cadeias.

[051] Em modalidades onde o vetor de expressão compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia α do receptor de célula T ou uma cadeia β do receptor de célula T (ou uma cadeia γ ou δ), dois vetores de expressão diferentes (um que codifica uma cadeia α (cadeia γ) e um que codifica uma cadeia β (cadeia δ)) foram introduzidos em uma célula, a fim de possibilitar a expressão de um heterodímero do receptor de célula T funcional pela dita célula. O heterodímero do receptor de célula T se liga especificamente a uma molécula MR1, em que a dita molécula MR1 é expressa em uma célula de tumor e apresenta um antígeno associado ao tumor.

[052] A expressão das sequências de ácido nucleico supramencionadas é controlada por uma sequência promotora operável em uma célula de mamífero, particularmente uma célula T de humano. Em certas modalidades, o promotor é um promotor ativado constitutivamente, por exemplo, o promotor precoce imediato de CMV comumente usado na biologia molecular. Em certas outras modalidades, o promotor é um promotor indutível.

[053] Em certas modalidades deste aspecto da invenção, a sequência de ácido nucleico compreendida no vetor de expressão é ou compreende uma sequência de ácido nucleico que é selecionada a partir de SEQ ID NO 007, SEQ ID NO 009 ou SEQ ID NO 011, e/ou codifica uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NO 001, SEQ ID NO 003 ou SEQ ID NO 005 (cadeias alfa).

[054] Em certas modalidades deste aspecto da invenção, a sequência de ácido nucleico compreendida no vetor de expressão é ou compreende uma sequência de ácido nucleico que é selecionada a partir de SEQ ID NO 008, SEQ ID NO 010 ou SEQ ID NO 012, e/ou codifica uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NO 002, SEQ ID NO 004 ou SEQ ID NO 006 (cadeias beta).

[055] Um outro aspecto da invenção se refere a uma sequência de ácido nucleico que codifica um heterodímero do receptor de célula T funcional. O heterodímero do receptor de célula T se liga especificamente a uma molécula apresentadora de antígeno relacionada ao MHC-1 (MR1) não polimórfica, expressa em uma célula de tumor que apresenta um antígeno associado ao tumor.

[056] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico codifica uma cadeia α do receptor de célula T e é selecionada a partir de SEQ ID NOs SEQ ID NO 007, SEQ ID NO 009 ou SEQ ID NO 011, ou codifica uma cadeia α do receptor de célula T especificada por uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NO 001, SEQ ID NO 003 ou SEQ NO ID 005.

[057] Em certas modalidades, a sequência de ácido nucleico codifica uma cadeia β do receptor de célula T e é selecionada a partir de SEQ ID NO 008, SEQ ID NO 010 ou SEQ ID NO 012, ou codifica uma cadeia β do receptor de célula T especificada por uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NO 002, SEQ ID NO 004 ou SEQ ID NO 006, ou uma sequência pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98) idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NOs 001 até 006, e com a mesma atividade biológica. Em modalidades particulares, cada uma das sequências de aminoácido compreende uma sequência CDR3 selecionada a partir de SEQ ID 65, 66, 67, 80, 81 e 82.

[058] Em certas modalidades, o receptor de célula MR1 T é constituído de uma cadeia alfa e uma cadeia beta aqui divulgada. Os inventores observaram surpreendentemente que as cadeias alfa e beta podem ser combinadas para tornar moléculas TCR funcionais capazes de reconhecer MR1.

[059] Em certas modalidades, o receptor de célula MR1 T é constituído de uma cadeia alfa e uma cadeia beta, da maneira especificada pelas sequências da seguinte lista:

a. SEQ ID NOs 001 e 002, b. SEQ ID NOs 003 e 004, c. SEQ ID NOs 005 e 006, ou um par selecionado a partir dos pares fornecidos anteriormente, em que cada um dos parceiros pode apresentar uma sequência pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98) idêntica à SEQ ID NO indicada, e o par apresenta a mesma atividade biológica do par inalterado. Em modalidades particulares, cada uma das sequências de aminoácido compreende uma sequência CDR3 idêntica à SEQ ID NO indicada, como pode ser deduzido a partir da tabela abaixo.

[060] Um outro aspecto da invenção se refere a uma proteína do receptor de célula T que se liga a uma molécula apresentadora de antígeno MR1 relacionado ao MHC I não polimórfico. A molécula MR1 é expressa em uma célula de tumor e apresenta um antígeno associado ao tumor. Em certas modalidades, a proteína do receptor de célula T que se liga a uma molécula apresentadora de antígeno MR1 relacionado ao MHC I não polimórfico é identificada pelo método de acordo com o primeiro aspecto da invenção.

[061] Em certas modalidades, a proteína do receptor de célula T compreende uma cadeia α do receptor de célula T, caracterizado por uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NO 001, SEQ ID NO 003 ou SEQ NO ID 005, e uma cadeia β do receptor de célula T caracterizado por uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NO 002, SEQ ID NO 004 ou SEQ ID NO 006.

[062] Um outro aspecto da invenção se refere a uma célula recombinante compreendendo o vetor de expressão de acordo com a invenção, e/ou o polipeptídeo receptor de célula T de acordo com a invenção, da maneira especificada nos parágrafos precedentes. Os versados na técnica estão cientes de que nos exemplos onde o vetor de expressão compreende apenas uma sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia α do receptor de célula T, ou uma cadeia β do receptor de célula T, mas não ambas, dois vetores de expressão diferentes (um que codifica uma α e uma que codifica uma β) foram introduzidos na célula recombinante, a fim de possibilitar a expressão de um heterodímero do receptor de célula T funcional pela dita célula. Em certas modalidades, a célula recombinante é uma célula T derivada a partir de sangue periférico. Em certas modalidades, a célula recombinante é derivada deum linfócito infiltrante de tumor.

[063] Ainda um outro aspecto da invenção se refere ao uso da célula recombinante, de acordo com o aspecto previamente especificado da invenção, para uso em um método de terapia ou prevenção de câncer. O método compreende administração da célula recombinante.

[064] Em certas modalidades, o câncer é caracterizado pela expressão de MR1.

[065] Em certas modalidades, a administração é realizada por imunoterapia com célula T adotiva.

[066] A invenção se refere adicionalmente a um método de tratamento, ou prevenção de recorrência, de câncer, compreendendo administração da célula recombinante de acordo com a invenção. Em certas modalidades, o câncer é caracterizado pela expressão de MR1.

[067] Em certas modalidades, a administração é alcançada por imunoterapia com célula T adotiva.

[068] A invenção também se refere a um coleção de sequências de ácido nucleico, em que cada elemento da coleção codifica uma cadeia α do receptor de célula T, cadeia β do receptor de célula T, cadeia γ do receptor de célula T, cadeia δ do receptor de célula T diferente, ou uma combinação de cadeia α e cadeia β do receptor de célula T, ou uma combinação de cadeia γ e cadeia δ do receptor de célula T, em que a dita combinação é capaz de se ligar especificamente a uma molécula MR1 que apresenta um antígeno do câncer. As sequências de ácido nucleico são capazes de facilitar a expressão da combinação de cadeia α, cadeia β, ou α do receptor de célula T em uma célula de mamífero.

[069] Tal coleção será usada para selecionar construções de transgene para transferência em células T coletadas de um paciente. Após identificação das sequências de TCR, que são melhores para instigar reação a um conjunto particular de antígenos de tumor, apresentadas pelo tumor na primeira fase do método de tratamento, o médico será capaz de selecionar vetores de expressão pré-produzidos a partir de tal coleção fabricada em GMP, para efetuar rapidamente a transferência de gene nas células T do paciente.

[070] Em certas modalidades, a coleção compreende uma sequência selecionada a partir de SEQ 007 até SEQ ID NO 012, e/ou a coleção compreende sequências que codificam uma molécula do receptor de célula T (ou um receptor de célula T que constitui cadeia α ou β) selecionada a partir de SEQ ID NO 001 até SEQ ID NO 006.

[071] Ainda um outro aspecto da invenção se refere a uma coleção de células T recombinantes, em que cada elemento da coleção expressa como um transgene um receptor de célula T capaz de se ligar especificamente a uma molécula MR1 que apresenta um antígeno do câncer. Em certas modalidades, a coleção compreende uma célula T recombinante compreendendo um heterodímero da proteína do receptor de célula T, de acordo com o respectivo aspecto da invenção.

[072] Os inventores identificaram e isolaram uma população inédita de células T restritas à MR1, reativas, de humano, em uma variedade de células de tumor de maneira dependente de MR1. Clones de célula MR1T foram comumente observados no sangue de diferentes animais saudáveis, expressaram diversos genes de TCR e não reconheceram ligantes de MR1 derivados de micro-organismo previamente identificado ou folato. Como alternativa, reconheceram diversos conjuntos de antígenos ainda desconhecidos isolados de células de tumor, e apresentados por MR1. A identificação e caracterização dos antígenos estimulatórios associados com as células de tumor está atualmente em andamento. Clones de célula MR1T reconheceram e mataram diferentes tipos de células de tumor, exibindo assim atividade antitumor acentuada in vitro. Além do mais, liberaram diferentes combinações de citocinas Th1, Th2 e Th17, e exibiram múltiplos perfis de expressão de receptor de quimiocina, sugerindo heterogeneidade fenotípica e funcional. De maneira importante, quando pareados, genes de TCR α e β ou genes de TCR γ e δ,

isolados de clones individuais de célula MR1T, foram transferidos para células T deficientes em TCR, os células T receptoras adquiriram a capacidade de reconhecer células de tumor que expressam MR1, indicando assim que a transferência de gene TCR de célula MR1T é suficiente para este tipo de reconhecimento de tumor, e pode ser usada para selecionar por instrução células T para reconhecer células de tumor que expressam MR1.

[073] Obtidos juntos, estes achados revelam uma população funcionalmente diversa inédita de células T humanas reativas ao tumor, restritas às moléculas MR1 não polimórficas com papel potencial diverso na imunidade tumoral, provendo assim estruturas conceituais inéditas para vigilância imune e imunoterapias contra câncer.

[074] Na presente especificação, as seguintes abreviações são usadas: APC, célula apresentadora de antígeno; β2m, β2 microglobulina; DC, célula dendrítica; GM- CSF, fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos; HPLC, cromatografia líquida de alta-pressão; IFN-γ, interferon-γ; mAb, anticorpo monoclonal; célula MAIT, célula T invariante associada à mucosa; MHC, complexo de histocompatibilidade maior; MR1, molécula relacionada ao MHC de classe I; célula MR1T, célula T restrita a MR1; PBMC, célula mononuclear de sangue periférico; TCR, Receptor de célula T; TIL, linfócito de infiltração de tumor.

[075] A invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos e figuras, a partir dos quais modalidades adicionais e vantagens podem ser desenhadas. Estes exemplos são destinados a ilustrar a invenção, mas não limitam seu escopo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[076] Figura 1. Células MR1T não reconhecem antígenos microbianos. (A) Expressão superficial de MR1 por células CCRFSB, THP-1 e A375-MR1. Histogramas cinza indicam coloração com mAbs controle com correspondência de isotipo. Estímulo de (B) clone de célula MR1T DGB129 ou (C) clone de célula MAIT SMC3 pelas três linhagens celulares em A na ausência (sem Ag) ou presença de lisado de E. coli (E. coli), e/ou anti-MR1 que bloqueia mAbs (α-MR1). O clone MAIT SMC3 foi previamente isolado a partir de PBMC de um doador saudável e expressa fenótipo e função de

MAIT canônica. Colunas indicam liberação de IFN-γ (média + SD). Estimulação de células MAIT (D) DGB129 MR1T ou (E) SMC3 por células THP-1, que expressam constitutivamente MR1 de superfície, preenchidas com 6,7-dimetil-8-D-ribitilumazina sintético (RL-6,7-diMe) com ou sem mAbs anti-MR1. Colunas indicam liberação de IFN-γ média + SD. Dados são representativos de quatro (A, B e C), dois (D e E). * P<0,05 (Teste t de Student não pareado).

[077] Figura 2. Estratégia de isolamento de clones de célula MR1T a partir de células T periféricas. (A)Análise FACS de células T purificadas previamente expandidas com células A375-MR1 irradiadas, após co-cultivo por toda a noite com células A375-MR1, na ausência de antígenos exógenos. Gráfico de pontos à esquerda mostra CD3 e coloração com CellTrace violeta (CTV) em células vivas. Gráfico de pontos à direita mostra a expressão de CD69 e CD137 de células fechadas CD3- positivas CTV-negativas. Setas indicam hierarquia de separação. Números indicam os percentuais de células nas separações. Células do doador A são ilustradas como um doador representativo. (B, D) Resultados cumulativos de seleção de clones de célula T de doadores A e B. Clones de célula T foram gerados a partir de células T classificadas como CD3+CTV-CD137+, da maneira representada em A. Os gráficos mostram os clones individuais (eixo geométrico x) e sua liberação de IFN-γ (eixo geométrico y), expressados como razão entre a quantidade de citocina secretada em resposta às células A375-MR1 vs. células A375 WT. Cada ponto representa um único clone de célula T, testado ao mesmo tempo nas condições experimentais indicadas. As linhas verticais indicam o número de clones de célula T que exibem reatividade restrita à MR1 (isto é, os clones que exibem uma razão de liberação de IFN-γ acima do corte arbitrário de 2). Resultados são representativos de dois experimentos independentes. (C, E) Liberação de IFN-γ por 14 clones representativos do doador A e 11 clones do doador B após estímulo com A375 WT, A375-MR1 e A375-MR1 na presença de mAbs anti-MR1 de bloqueio (α-MR1). Os pontos representam a liberação de IFN-γ (média ± SD de culturas em duplicata) por cada clone. Resultados são representativos de três experimentos independentes. * P<0,05 (Teste t de Student não pareado).

[078] Figura 3. Células MR1T são comuns no sangue de indivíduos saudáveis. (A) Análise por citometria de fluxo de células T purificadas de um doador representativo (Doador C) após co-cultivo por toda a noite com células A375 WT ou A375-MR1. Gráficos de pontos mostram a expressão de CD69 e CD137 em células vivas CD3+. Números indicam o percentual de células nas separações. (B) Frequência de células T CD69+CD137+ de 5 doadores diferentes, após co-cultivo por toda a noite com células A375 WT ou A375-MR1. (C) Resultados cumulativos de ensaios de estímulo de clone de célula T de Doador C. Clones de célula T foram gerados a partir de células T classificadas CD3+CD69+CD137+, da maneira representada em A, gráfico de pontos à direita. O gráfico mostra o número de clones testados (eixo geométrico x) e liberação de IFN-γ (eixo geométrico y) expressos como razão entre as quantidades de citocina secretada em resposta às células A375-MR1 vs. células A375 WT. Cada ponto representa um único clone de célula T, testado ao mesmo tempo nas condições experimentais indicadas. A linha vertical indica o número de clones de célula T que exibe reatividade restrita à MR1 (isto é, os clones que mostram uma razão de liberação de IFN-γ acima do corte arbitrário de 2). Resultados são representativos de dois experimentos independentes. (D) Reconhecimento de células A375-MR1, mas não A375 WT, na ausência de antígenos exógenos por 8 clones de célula T restritos à MR1 representativos do doador C. Inibição de reatividade de clone de célula T em células A375-MR1 bloqueando mAbs anti-MR1 (α-MR1). Pontos representam a liberação de IFN-γ (média ± SD de culturas em duplicata) por cada clone testado nas três condições experimentais. Os resultados são representativos de três experimentos independentes. * P<0,05 (Teste t de Student não pareado).

[079] Figura 4. Transferência de gene de MR1T TCR confere reconhecimento restrito à MR1 de células A375. Estimulação de (A) células SKW-3 que expressam o DGB129 TCR (SKW3-DGB129) e (B) células J.RT3-T3.5 que expressam o MAIT MRC25 TCR (J.RT3-MAIT) com as células A375 que expressavam (A375-MR1) ou que não apresentavam (A375 WT) MR1, com ou sem lisado de E. coli e mAbs anti-

MR1. Estimulação de células SKW-3 que expressam os TCRs de três clones individuais de célula MR1T (C) DGA4 (SKW3-DGA4), (D) DGB70 (SKW3-DGB70) e (E) JMA (SKW3-JMA) com células A375-MR1 ou A375 WT, na presença ou não de mAbs anti-MR1. A intensidade de fluorescência mediana de CD69 (MFI) + SD de culturas em duplicata de células T transduzidas são mostradas. A CD69 MFI de células T transduzidas cultivadas na ausência de APCs também é mostrada. Células T transduzidas de maneira simulada mostraram níveis de base da expressão de CD69 quando incubadas com A375-MR1 ou A375 WT (não mostrado). Dados são representativos de três experimentos independentes. * P<0,05 (Teste t de Student não pareado).

[080] Figura 5. Reconhecimento diferencial de vários tipos de células de tumor por clones de célula MR1T. (A) Reconhecimento de quatro linhagens celulares humanas que expressam níveis superficiais constitutivos de MR1 pelo clone de célula SMC3 MAIT representativo na ausência (no Ag) ou presença de lisado de E. coli (E. coli), com ou sem anti-MR1 que bloqueia mAbs (α-MR1). (B) Reconhecimento dos mesmos tipos de célula como em A por treze clones de célula MR1T, com ou sem mAbs anti-MR1 (α-MR1). Gráficos mostram liberação de IFN-γ (média ± SD de culturas duplicadas).

[081] Figura 6. Clones de célula MR1T não reagem aos ligantes microbianos ou ao 6-FP. (A) Resposta de sete clones de célula MR1T e um clone de célula MAIT controle co-cultivados com células A375 que expressam (A375-MR1) ou não (A375 WT) MR1, na presença ou ausência de lisado de E. coli. O bloqueio da reatividade de clone de célula T por mAbs anti-MR1 (α-MR1) também é mostrado. (B) Resposta de clones de célula MR1T às células A375 que expressam tanto moléculas WT MR1 (A375-MR1) quanto moléculas MR1 mutadas em K43A (A375-MR1 K43A), na presença de 6-formil pterina (6-FP). (C) Estimulação de clone MRC25 de célula MAIT controle ou clone G2B9 de TCR Vγ9Vδ2 controle, com células A375-MR1 ou A375- MR1 K43A previamente incubadas com ou sem lisados de E. coli ou zoledronato, respectivamente, tanto na ausência quanto presença de 6-FP. Resultados são expressos como média ± SD de IFN-γ medida em culturas duplicadas. Resultados são representativos de três experimentos independentes. * P<0,05 (Teste t de Student não pareado).

[082] Figura 7. Clones de célula MR1T não reconhecem Ac-6-FP. (A) Estimulação de três clones de célula MR1T representativos de células A375-MR1, na ausência ou presença de acetil-6-formil pterina (Ac-6-FP). (B) Estimulação de dois clones de célula MAIT (MRC25 e SMC3) por células A375-MR1 pulsadas com lisado de E. coli na ausência ou presença de Ac-6-FP. (C) Células A375-MR1 foram tratadas com zoledronato (Zol) na ausência ou presença de Ac-6-FP (25 µg/mL), e usadas para estimular um clone de célula TCR Vγ9-Vδ2 (G2B9). (D) Células A375 que expressam moléculas MR1 mutantes em K43A (A375-MR1 K43A) foram usadas para estimular os três clones de célula MR1T mostrados em A, na ausência ou presença de Ac-6-FP (25 µg/mL). (E) Estímulo dos dois clones de célula MAIT usados em B por células A375-MR1 K43A, pulsadas com lisado de E. coli na ausência ou presença de Ac-6- FP (25 µg/mL). Resultados são expressos como média ± SD de liberação de IFN-γ, avaliados em culturas em duplicata e são representativos de três experimentos independentes. * P<0,05 (Teste t de Student não pareado).

[083] Figura 8. Células MR1T reconhecem antígenos presentes em células de tumor e não derivados de meio RPMI 1640. Estímulo do clone de célula MR1T DGB129 por MR1 que superexpressa (A) células A375 (A375-MR1) e (B) células THP- 1 (THP1-MR1), crescidas por 4 dias em RPMI 1640 ou em PBS, ambas suplementadas com soro humano 5 %. Inibição da reatividade de clone de célula T por mAbs que bloqueia anti-MR1 (α-MR1) é mostrada. Células DGB129 reconhecem APCs preenchidas com frações isoladas de (C) lisado de célula THP-1 ou de (D) EMT6 do tumor de mama em camundongo crescido in vivo. Frações E1 e E2 contêm moléculas hidrofóbicas; frações N1-N4 contêm moléculas hidrofílicas. (E) Células DGB70 MR1T reagem na fração N3 de lisado de THP-1. (F) Estimulação de células T DGB129 e DGB70 por frações N3 e N4 derivadas de THP-1, preenchidas sobre MR1 recombinante ligado ao plástico. É mostrada a liberação de célula T, média ± SD de

IFN-γ ou GM-CSF de culturas em duplicata (representativo de três experimentos independentes). A liberação de citocina total é mostrada em painéis A, B, F; número de vezes do aumento em relação à base é mostrado nos painéis C, D, E. * P<0,05 (Teste t de Student não pareado).

[084] Figura 9. Células MR1T exibem respostas antitumor diferenciais. As linhagens de célula de tumor que expressam MR1, THP-1 e A375, foram cultivadas por toda a noite com os clones de célula MR1T (A) DGB129 ou (B) DGB70 nas razões efetor:alvo (E:T) indicadas. Os gráficos mostram os percentuais de células alvo apoptóticas em condições experimentais individuais, avaliados por citometria de fluxo usando coloração com anexina V e iodeto de propídeo. As células MR1T foram identificadas corando com mAbs anti-CD3 e excluídas da análise. Inibição de clone de célula MR1T, com capacidade de matar, por mAbs anti-MR1 (α-MR1) também é mostrada na razão 1:1 E:T. (C) Reconhecimento de Mo-DCs isolado de um indivíduo saudável por treze clones de célula MR1T, com ou sem mAbs anti-MR1 (α-MR1). Gráficos mostram liberação de IFN-γ (média ± SD de culturas em duplicata). (D) Reconhecimento de Mo-DCs de três doadores pelo clone de célula MR1T DGB129 representativo, na ausência ou presença de mAbs anti-MR1 (α-MR1). Liberação de IFN-γ nos sobrenadantes é mostrada e expressa como média ± SD. (E) Análise por citometria de fluxo de moléculas co-estimulatórias CD83 e CD86 em Mo-DCs, após co-cultivo com células MR1T DGB129, com ou sem mAbs anti-MR1 (α-MR1). Um grupo controle que consiste em Mo-DCs estimulados com LPS (10 ng/mL) na ausência de células T também é mostrado. Números indicam percentuais de células em cada quadrante. (F) Estimulação de clone de célula JMAN MR1T por LS 174T e linhagens de célula tumoral gastrointestinal HCT116, e por células epiteliais intestinais normais (GEC) na presença ou não de mAbs anti-MR1 (α-MR1). Colunas mostram liberação de IFN-γ (média ± SD de culturas em duplicatas). Todos os resultados são representativos de pelo menos três experimentos independentes. * P<0,05 (Teste t de Student não pareado).

[085] Figura 10. Heterogeneidade funcional de clones de célula MR1T. (A) IFN-γ liberado por 7 clones de célula MR1T selecionados, estimulado com células A375- MR1. Resultados de ELISA são expressos como média ± SD de liberação de IFN-γ, medida em culturas em duplicata. (B) Análise de 16 citocinas adicionais por ensaio de citocina multiplexo, realizado nos mesmos sobrenadantes para os quais IFN-γ é mostrado em A. Resultados são representativos de dois experimentos independentes.

[086] Figura 11. Clones de célula MR1T exibem múltiplos perfis de expressão do receptor de quimiocina. Análise por citometria de fluxo da expressão superficial de CXCR3, CCR4 e CCR6 por sete clones de célula MR1T em repouso selecionados. Os gráficos mostram a intensidade de fluorescência relativa, calculada pela divisão da intensidade de fluorescência mediana (MFI) de coloração de mAb específico pelo MFI do isotipo controle correspondente. Dados são representativos de dois experimentos independentes.

[087] Figura 12. Células MR1T reduzem o número de nódulos de melanoma humano em camundongos. Camundongos NSG imunocomprometidos foram injetados com as células A375 de melanoma humano que expressam MR1 (A375- MR1), e com as células MR1T. No dia 14, os camundongos foram sacrificados e nódulos pulmonares foram contados após perfusão com tinta nanquim. P<0.0001 (Teste t de Student não pareado).

EXEMPLOS MÉTODOS

[088] Células. As seguintes linhagens celulares humanas foram obtidas a partir de American Type Culture Collection: A375 (melanoma), THP-1 (leucemia mielomonocítica), J.RT3-T3.5 (leucemia de célula T deficiente em TCRβ), LS 174T (adenocarcinoma de cólon), HCT116 (carcinoma de cólon), Huh7 (carcinoma hepatocelular), HEK 293 (rim embrionário humano), e CCRF-SB (leucemia linfoblástica de célula B aguda). Células SKW-3 (leucemia de célula T humana deficiente em genes TCRα, β, γ e δ) foram obtidas do Leibniz-Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures. Dois clones MAIT representativos (MRC25 e SMC3) e um clone de TCR γδ, (G2B9) (Gober et al., The Journal of experimental medicine 197, 163-168 (2003)) foram usados neste estudo como células controle, e foram gerados a partir do sangue de dois doadores saudáveis e mantidos em cultura da maneira previamente descrita (Lepore et al., Nat Commun 5, 3866 (2014)). As células MR1T foram isoladas do sangue periférico de indivíduos saudáveis após consentimento de informação ser obtido dos doadores no momento da coleta de sangue sob aprovação do “Ethikkommision Nordwest und Zentralschweiz/EKNZ (139/13). Em resumo, células T purificadas por seleção negativa (kit de enriquecimento de célula T humana EasySep™, StemCell) foram estimuladas com células A375-MR1 irradiadas (80 Gray) (razão 2:1) uma vez por semana, por três semanas. rIL-2 de humano (5 U/mL; Hoffmann-La Roche), rIL-7 e rIL-15 (ambos em 5 ng/mL, Peprotech) foram adicionados no dia +2 e +5 após cada estimulação. Doze dias após o último estímulo, as células foram lavadas e co-cultivadas por toda a noite com células A375-MR1 (razão 2:1). Células CD3+CD69+CD37+ foram então classificadas e clonadas por diluição limitante na presença de PHA (1 µg/mL, Wellcome Research Laboratories), rIL-2 de humano (100 U/mL, Hoffmann-La Roche) e PBMC irradiada (5x105 células /mL). Em outros experimentos, os clones de células MR1T foram gerados usando o mesmo protocolo de CD3+CD69+CD137+ escolhida, mediante uma única estimulação por toda a noite com células A375-MR1 (razão 2:1). Os clones de célula T foram periodicamente re-estimulados seguindo o mesmo protocolo (Lepore et al., ibid.). Monócitos e células B foram purificados (>90 % de pureza) a partir de PBMCs dos doadores saudáveis, usando kits de seleção de CD14 e CD19 positivos de humano EasySep (Stemcell Tecnologias), de acordo com as instruções do fabricante. Mo-DCs foram diferenciados dos monócitos CD14+ purificados por cultura na presença de GM-CSF e IL-4, da maneira previamente descrita (Lepore et al., ibidem). Células epiteliais intestinais normais de humano (GEC) foram isoladas a partir de biópsias intestinais de indivíduos livres de tumor, de acordo com um protocolo publicado (Graves et al., Journal of immunological methods 414, 20-31 (2014)).

[089] Geração de células que expressam gene MR1A covalentemente ligado a β2m. Uma construção de DNAc de MR1A de humano ligado a β2m por meio de um ligador flexível Gly-Ser foi gerada por PCR, da maneira previamente descrita (Lepore et al., ibid.). A substituição K43A no DNAc de MR1A foi introduzida na construção de fusão usando os seguintes oligonucleotídeos iniciadores: MR1K43A_f 5′- CTCGGCAGGCCGAGCCACGGGC (SEQ ID NO 097) e MR1K43A_r 5′GCCCGTGGCTCGGCCTGCCGAG (SEQ ID NO 098). Construções WT e mutantes resultantes foram clonadas em um vetor lentiviral bidirecional (LV) (Lepore et al., ibid.). Células HEK 293 foram transfectadas com construções individuais de LV-MR1A-β2m, juntamente com os plasmídeos de empacotamento de lentivírus pMD2.G, pMDLg/pRRE e pRSV-REV (Addgene), usando Metafectene Pro (Biontex), de acordo com instruções do fabricante. Células A375 e THP-1 foram transduzidas por infecção por centrifugação, com partícula viral contendo sobrenadante na presença de 8 µg/mL de sulfato de protamina. Expressão superficial de MR1 foi avaliada por citometria de fluxo e células positivas foram classificadas por FACS.

[090] Proteína de fusão β2m-MR1-Fc recombinante solúvel. Construção de fusão β2m-MR1-Fc foi obtida usando construção MR1A-β2m de humano supracitado como molde. DNA complementar em MR1A gene β2m foi amplificado por PCR usando oligonucleotídeos iniciadores: β2mXhoI_f 5’- CTCGAGATGTCTCGCTCCGTGGCCTTA (SEQ ID NO 099) e MR1-IgG1_r 5’- GTGTGAGTTTTGTCGCTAGCCTGGGGGACCTG (SEQ ID NO 100), excluindo assim domínios transmembrana e intracelular MR1. O DNA complementar para região de dobradiça e domínios CH2-CH3 de cadeia pesada de IgG1 de humano foi gerado usando os seguintes oligonucleotídeos iniciadores: NheI-hinge-f 5’- CAGGTCCCCCAGGCTAGCGACAAAACTCACAC (SEQ ID NO 101) e IgG1NotI_r 5’- GCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGA (SEQ ID NO 102) de pFUSE- hIgG1-Fc1 (InvivoGen). Os produtos de PCR β2m-MR1A e IgG1 foram associados juntos usando união de duas etapas, com PCR por sobreposição e extensão e a construção resultante subclonada nos sítios XhoI/NotI do vetor de expressão BCMGSNeo. Células CHO-K1 foram transfectadas com a construção final usando

Metafectene Pro (Biontex), clonadas limitando diluições e selecionadas por ELISA para a produção de proteína de fusão β2m-MR1-Fc. Os clones selecionados, adaptados ao meio sem soro EX-CELL ACF CHO (Sigma), foram usados para a produção de proteína e β2m-MR1-Fc foi purificada usando Protein-A-Sepharose (Thermo Fisher Scientific), de acordo com instruções do fabricante. Integridade e pureza da proteína foram verificadas por SDS-PAGE e Western Blot usando anti-MR1 mAb 25.6 (Biolegend).

[091] Citometria de fluxo e anticorpos. A rotulação da superfície celular foi realizada usando protocolos padrões. A rotulação intracelular foi realizada usando True-Nuclear™ Transcription Factor Buffer Set, de acordo com as instruções dos fabricantes. Os seguintes mAbs anti-humanos foram obtidos a partir de Biolegend: CD4-APC (OKT4), CD8α-PE (TuGh4), CD161-Alexa Fluor 647 (HP-3G10), CD69-PE (FN50), CD3-PE/Cy7, Brilliant Violet-711, ou Alexa-700 (UCHT1), CD137-biotina (n4b4-1), CXCR3-Brilliant Violet 421 (G025H7), CD83-biotina (HB15e), MR1-PE (26.5) e TRAV1-2-PE (10C3). CD86-FITC (2331), CCR4-PECy7 (1G1) e CCR6-PE (11A9) mAbs foram da BD Pharmingen. Todos estes mAbs foram usados em 5 µg/mL. mAbs biotinilados foram revelados com estreptavidina-PE, -Alexa Fluor 488, ou -Brilliant violet 421 (2 µg/mL, Biolegend). As amostras foram adquiridas em citômetro de fluxo LSR Fortessa (Becton Dickinson). Os experimentos de classificação de célula foram realizados usando um instrumento Influx (Becton Dickinson). As células mortas e duplicações foram excluídas com base na área de espalhamento frontal e largura, espalhamento lateral, e coloração DAPI. Todos os dados foram analisados usando o software FlowJo (TreeStar).

[092] Análise de gene de TCR de clones de célula MR1T. Expressão de gene de TCRα e β ou do TCRγ e δ pelos clones de célula MR1T foi avaliada tanto por RT-PCR usando DNAc total e oligonucleotídeos iniciadores específicos, quanto por citometria de fluxo usando o IOTest® Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kit (Beckman Coulter), de acordo com as instruções dos fabricantes, ou anticorpos monoclonais específicos de panγδ TCR (B1, Biolegend). Em relação a RT-PCR, RNA foi preparado usando o

NucleoSpin RNA II Kit (Macherey Nagel) e DNAc foi sintetizado usando transcriptase reversa Superscript III (Invitrogen). DNAcs de TCRα, β, γ e δ foram amplificados usando conjuntos de oligonucleotídeos iniciadores Vα, Vβ, Vγ e Vδ, da maneira direcionada pelo fabricante (TCR typing amplimer kit, Clontech). As transcrições funcionais foram identificadas por sequenciamento e então analisadas usando o sistema de informação ImMunoGeneTics (http://www.imgt.org).

[093] Transferência de gene de TCR. DNAc funcional de TCRα e β do clone de célula MAIT MRC25 foram clonados nos sítios XhoI/NotI do vetor de expressão BCMGSNeo (Karasuyama and Melchers Eur. J. Immunol. 1988 18:97-104), e as construções resultantes foram usadas para co-transfectar células J.RT3-T3.5 por eletroporação, de acordo com procedimento padrão. Os transfectantes que expressam TRAV1-2 e CD3 foram classificados por FACS. Os DNAcs funcionais de TCRα e β ou TCRγ e δ dos clones de MR1T foram clonados nos sítios XmaI/BamHI de uma versão modificada do vetor de expressão plasmídeo 52962 (Addgene). As células SKW-3 foram transduzidas com sobrenadante contendo partícula viral, gerado como exposto. As células foram classificadas por FACS com base na expressão de CD3.

[094] Fracionamento de lisados celulares e tumorais completos. Lisados celulares totais foram gerados a partir de um único precipitado de 2,5×10 9 células THP-1, por meio do rompimento em água com sonicação leve. O material sonicado foi então centrifugado (15.000 g por 15 minutos a 4 °C) e o sobrenadante coletado (S1). A seguir, o precipitado foi suspenso novamente em metanol, sonicado, centrifugado como antes, e o sobrenadante obtido foi agrupado com o sobrenadante S1. A concentração final de metanol foi 10 %. O extrato celular total foi então carregado sobre um cartucho C18 Sep-Pak (Waters Corporation) e o material não ligado foi coletado e seco (fração E-FT). O material ligado foi eluído em lotes com metanol 75 % (fração E1) e 100 % (fração E2). O material E-FT foi suspenso novamente em acetonitrila/água (9:1 vol/vol) e carregado sobre um cartucho NH 2 Sep- Pak (Waters Corporation). O material não ligado (fração N-FT) e 4 frações adicionais foram eluídas com quantidades crescentes de água. A fração N1 foi eluída com 35 % de H2O, fração N2 com 60 % de H2O, fração N3 com 100 % de H2O, e fração N4 com 100 % de H2O e acetato de amônio 50 mM (pH 7,0). Todas as frações foram secas e então suspensas novamente em 20 % de metanol (frações E1, E2 e N-FT) ou 100 % de H2O (todas as outras frações) antes de serem armazenadas a -70 °C.

[095] Tumores de mama de camundongo EMT6 foram preparados da maneira descrita (Zippelius et al., Cancer Immunol Res 3, 236-244 (2015)). Tumores excisados recentemente foram lavados extensivamente em salina, pesados, e massas de 4 g foram homogeneizadas em 7 mL de água grau HPLC usando um triturador de tecido Dounce. O homogenado tumoral passou por dois ciclos de congelamento- descongelamento, foi centrifugado (3.250 g) por 10 minutos a 4 °C, e o sobrenadante foi coletado e armazenado a -70 °C. O precipitado foi extraído uma segunda vez com 2 mL de água grau HPLC, centrifugado (5.100 g) por 10 minutos a 4 °C e o sobrenadante foi coletado e armazenado a -70 °C. O precipitado foi extraído adicionalmente com 9 mL de metanol grau HPLC por 5 minutos em temperatura ambiente, vortexando, foi centrifugado (5.100 g) por 10 minutos a 4 °C, e o sobrenadante coletado. Os três sobrenadantes foram agrupados, secos e suspensos novamente em água:metanol (10:1). O material foi fracionado usando cartuchos C18 e NH2 Sep-Pak da maneira anterior.

[096] Ensaios de ativação de célula T. Células T restritas a MR1 (5×10 4/poço, a menos que de outra forma indicada) foram co-cultivadas com células alvo indicadas (5×104/poço) em volume total de 200 µL, em duplicatas ou triplicatas. As células T foram cultivadas com APCs indicadas por 24 horas. Em alguns experimentos, mAbs anti-MR1 (clone 26,5) ou mAbs controle isotipo IgG2a de camundongo (ambos em 30 µg/mL) foram adicionados e incubados por 30 minutos antes da adição de células T. Lisados de E. coli foram preparados a partir da cepa DH5α (Invitrogen) crescida em meio LB, e coletados durante o crescimento exponencial. As células bacterianas foram lavadas duas vezes em PBS e então lisadas por sonicação. Após centrifugação (15.000 g por 15 minutos), o sobrenadante foi coletado, seco e armazenado a -70 °C.

APCs foram pulsados por 4 horas com lisado de E. coli equivalente a 108 CFU/mL (a menos que de outra forma indicada), antes da adição de células T. Em alguns experimentos, APCs foram pré-incubados com 6-FP ou Ac-6-FP (Schircks Laboratories) por 4 horas antes de co-cultivo com as células T. Em experimentos controle com células TCR γδ que expressam cadeias TCR Vγ9 e Vδ2, os APCs foram primeiro tratados por 6 horas com zoledronato (10 µg/mL) antes da adição de célula T. Experimentos de ativação com β2m-MR1-Fc humano recombinante ligado à placa foram realizados revestindo β2m-MR1-Fc em placas de 96 poços (4 µg/mL) e preenchendo com lisados celulares purificados em cartucho por 4 horas a 37 °C, antes de lavar duas vezes e adicionado células T. Os sobrenadantes foram coletados após 24 horas e IFN-γ ou GM-CSF foram avaliados por ELISA. Citocinas e quimiocinas múltiplas em sobrenadantes de cultura de células foram analisadas usando o Milliplex MAP Human cytokine/chemokine magnetic bead painel – Premixed 41 plex (HCYTMAG-60K-PX41; Merck Millipore), de acordo com as instruções do fabricante. Amostras foram adquiridas em um sistema Flexmap 3D (Merck Millipore) e o software Milliplex analyst foi usado para determinar intensidade média de fluorescência e concentração de analito.

[097] Morte de células de tumor. Ensaios de morte foram realizados usando linhagens celulares alvo (2×104 células/mL) incubadas tanto sozinhas quanto com as células T em diferentes razões E/T por 24 horas, na presença ou ausência de mAb anti-MR1 (30 µg/mL, clone 26.5). As células alvo foram coradas com PE-Anexina V (BD) e iodeto de propídeo (PI) (Sigma-Aldrich), da maneira previamente descrita (2). Células T foram identificadas corando com mAbs anti-CD3 e excluídas da análise. A apoptose foi avaliada da maneira a seguir: Anexina V + PI+ = apoptose avançada e Anexina V- PI+ = necrose. O percentual de células apoptóticas + necróticas na ausência de células T (apoptose espontânea; sem células T) também é mostrado.

[098] Estatística. Os dados foram analisados usando teste t de Student não pareado (Prism 6, software GraphPad).

IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE CÉLULAS T RESTRITAS À

MR1 REATIVA AO TUMOR INÉDITAS EM DOADORES SAUDÁVEIS

[099] Os inventores detectaram um clone de célula T restrito à MR1 atípico, que não reagiu aos ligantes microbianos durante estudos prévios no repertório de células MAIT de humano. Este clone de célula T (DGB129) reconheceu linhagens celulares que exibem constitutivamente MR1 de superfície (células de leucemia linfoblástica CCRF-SB, ou células de leucemia monocítica THP-1; Figura 1A), ou foi transfectado com o gene MR1 (células de melanoma A375; A375-MR1; Figura 1A) na ausência de quaisquer antígenos adicionados de maneira exógena (Figura 1B). Reconhecimento estéril de células alvo MR1+ foi completamente inibido pelo bloqueio com anticorpos monoclonais anti-MR1 (mAbs) (Figura 1B), e assemelhando-se assim à resposta de célula MAIT aos antígenos derivados de E. coli avaliada em paralelo (Figura 1C). De maneira importante, células T DGB129 também falharam em reconhecer o agonista de célula MAIT sintético 6,7-dimetil-8-D-ribitilumazina (RL-6,7-diMe; Figura 1D), diferentemente de um clone de célula MAIT controle, que por sua vez foi estimulado de maneira dependente de MR1 por este composto (Figura 1E). Células DGB129 não expressaram o TCR semi-invariante canônico típico de células MAIT (Tabela 1).

[0100] Os inventores questionaram se o clone DGB129 foi representativo de uma população inédita de células T restritas à MR1 reativa ao tumor, diferente das células MAIT reativas ao micróbio. Estabeleceram, portanto, um método para isolar e estudar estas células T restritas à MR1 não previstas. Células T purificadas de dois doadores saudáveis foram rotuladas com o marcador de proliferação violeta CellTrace (CTV) e estimuladas com células A375-MR1 irradiadas na ausência de antígenos exógenos. Células em proliferação foram desafiadas novamente com células A375-MR1, e aquela que expressam altos níveis do marcador de ativação CD137 foram classificadas e clonadas por diluição limitante (Figura 2A). Clones individuais de célula T foram então pesquisados em relação à sua capacidade de reconhecer células A375- MR1 e A375 que não apresentam MR1 (A375-WT). Em ambos os doadores, os inventores observaram que uma fração maior de clones de célula T (126/195 e 37/57, respectivamente) exibiu reconhecimento específico de células A375-MR1 (Figura

2B,D), que foi inibido por mAbs que bloqueia anti-MR1 (Figura 2C,E). A coloração com mAbs específico para TCR Vβ de 12 clones de célula T reativos à MR1 revelou que expressaram 7 cadeias de TRBV diferentes (TRBV4-3, 6-5/6-6/6-9, 9, 18, 25-1, 28, 29-1) com alguns dos clones que compartilham o mesmo gene TRBV. Além do mais, nenhum expressou a cadeia TRAV1-2, canônica para células MAIT.

[0101] A falta de marcadores específicos não permitiu identificação unívoca destas células T inéditas ex vivo por citometria de fluxo padrão. Portanto, sua frequência foi estimada combinando análise de citometria de fluxo após período de tempo muito curto de estímulo in vitro e experimentos de clonagem de célula T única. Células T de sangue purificadas de cinco doadores saudáveis foram co-cultivadas por toda a noite com células A375 deficientes em MR1 ou suficientes em MR1, e analisadas em relação à expressão dos marcadores de ativação CD69 e CD137 (Figura 3A). Em todos os cinco doadores selecionados, o percentual de células T CD69 +CD137+ detectado foi consistentemente maior após estímulo com células A375-MR1 (faixa de 0,034-0,072 % de células T) do que após co-cultivo com células A375-WT (faixa de 0,015-0,032 %) (Figura 3A,B). Uma vez que os dois tipos de APCs diferiram em relação à expressão de MR1, células T reativas à MR1 explicam os números aumentados de células T ativadas após estímulo com APCs positivas para MR1. Usando esta abordagem, os inventores estimaram que o agrupamento de célula T circulante dos indivíduos analisados continha células T reativas em relação à A375- MR1, na frequência que varia entre 1:2,500 (0,072-0,032=0,04 %) e 1:5,000 (0,034- 0,015=0,019 %). Esta frequência estimada é maior que a frequência de células T CD4+ específicas de peptídeo após exposição ao antígeno (Lucas et al., J Virol 78:7284- 7287; Su et al., Immunity 38:373-383). Estas observações foram apoiadas por experimentos paralelos, nos quais células T CD69+CD137+ ativadas por toda a noite, classificadas a partir de um destes doadores (Doador C, Figura 3A, painel à direita) foram clonadas. De fato, 31 dos 96 clones selecionados de célula T (32 %) exibiram reatividade específica com células A375-MR1 (Figura 3C), que foi inibida por mAbs anti-MR1 (Figura 3D). Desta maneira, a frequência calculada de células T responsivas à A375-MR1 entre as células T do sangue deste doador foi 1:5.000 (0,065 x 0,32= 0,02 %), um valor consistente com a faixa estimada. Análise detalhada de clones representativos de célula T, derivada a partir de três doadores, confirmou que estes exibiram diversas cadeias TCRα e β, e indicaram a expressão diferencial de CD4, CD8 e CD161 (Tabela 1).

[0102] Coletivamente, estes achados sugeriram que as células T restritas à MR1 reativa ao tumor identificadas são uma população policlonal comum, porém inédita, de linfócitos no sangue de indivíduos humanos saudáveis (a seguir chamados de células MR1T). TRANSFERÊNCIA DE GENE DE TCR DE CÉLULA MR1T CONFERE RECONHECIMENTO RESTRITO À MR1 DE CÉLULAS DE TUMOR

[0103] Os inventores investigaram a seguir se reatividade de célula MR1T com células de tumor foi mediada pelo TCR. Expressão de genes pareados TCRα e β, clonados de diferentes clones de célula MR1T nas células SKW-3 deficientes em TCR, conferiu reconhecimento de MR1 de células de tumor, que foi comparável àquele exibido pelas células MR1T originais e que foi completamente bloqueado por anti- MR1-mAbs (Figura 4A-C). Em experimentos controle, a transferência de genes TCRα e β de um clone de célula MAIT representativo conferiu a capacidade de reconhecer células A375-MR1, de maneira dependente de MR1, apenas na presença de antígenos de E. coli (Figura 4D). Estes dados destacaram o papel importante do TCR em mediar o reconhecimento de célula MR1T das células de tumor, e sugeriram que a transferência de gene de TCR de célula MR1T pode redirecionar efetivamente a reatividade de células T selecionadas para células de tumor que expressam MR1.

RECONHECIMENTO DIFERENCIAL DE CÉLULAS DE TUMOR POR CLONES DE CÉLULA MR1T

[0104] Tendo gerado um grande painel de clones de célula MR1T que reagem às células de melanoma A375 que expressam MR1, os inventores investigaram a seguir se também poderiam reconhecer outros tipos de células de tumor que expressam constitutivamente MR1 de superfície, incluindo células mielomonocíticas THP-1,

células de hepatoma Huh7, células de carcinoma de cólon HCT116 e células de adenocarcinoma de cólon do tipo taça LS 174T. Todas estes tipos de célula apoiaram a ativação de célula MAIT na presença de antígenos microbianos e de uma maneira dependente de MR1 (Figura 5A). As mesmas células foram capazes de induzir a ativação estéril de selecionar clones de célula MR1T em várias extensões. As células THP-1 foram reconhecidas pela maioria dos clones de célula MR1T testados, seguido pelas células de hepatoma Huh7, as células do tipo taça LS 174T e as células de carcinoma de cólon HCT116 (Figura 5B). De maneira importante, todas as respostas foram bloqueadas por mAbs anti-MR1.

[0105] Estes dados confirmaram adicionalmente que as células MR1T são uma população inédito e heterogênea de células T reativas ao tumor restritas à molécula MR1, que apresenta antígeno não polimórfico. CÉLULAS MR1T RECONHECE ANTÍGENOS LIGADOS À MR1

PRESENTES EM CÉLULAS DE TUMOR

[0106] Os inventores estudaram a seguir as bases de reatividade de célula MR1T com as células de tumor. Primeiro, procuraram descartar definitivamente a possibilidade e que os clones de célula MR1T pudessem reconhecer antígenos microbianos, em analogia às células MAIT. Enquanto um clone de célula MAIT controle reagiu com células A375-MR1 apenas na presença de lisado de E. coli, a ativação de diferentes clones de célula MR1T não foi aumentada pelo lisado de E. coli (Figura 6A). Consistente com estes dados, células MR1-negativo A375-WT não conseguiram estimular nenhum tipo das células T, independente se o lisado de E. coli foi adicionado, (Figura 6A), e de maneira importante mAbs anti-MR1 bloqueou eficientemente tanto as respostas de célula MR1T quanto de MAIT (Figura 6A). Estes achados confirmaram que os ligantes microbianos presentes em E. coli e que estimulam células MAIT não estimulam as células MR1T testadas.

[0107] Os inventores então testaram a resposta de células MR1T para os ligantes 6-FP e Ac-6-FP de MR1 conhecidos, que foram previamente relatados por estimular um subconjunto raro de células T negativas para TRAV1-2, e inibir a ativação de célula

MAIT por antígenos microbianos. O estímulo de célula MR1T foi prejudicado na presença de ligantes de 6-FP ou Ac-6-FP, que também prejudicaram a estimulação de E. coli de células MAIT controle, mas não interromperam o controle das respostas de célula TCR γδ ao antígeno cognato apresentado pelas mesmas APCs, excluindo assim a toxicidade do composto (Figura 6B,C e 7A-C). De maneira notável, 6-FP ou Ac-6-FP não conseguiram inibir a ativação de células MR1T ou células MAIT quando as células A375 alvo foram transduzidas para expressar moléculas MR1 mutantes, com capacidade de ligação ao ligante deficiente (bloqueio de formação de base de Schiff com ligantes por mutação de Lisina 43 em Alanina, A375-MR1 K34A; Figura 6B,C e 7D,E). A inibição específica observada com 6-FP ou Ac-6-FP indicou que células MR1T i) não reconhecem 6-FP e Ac-6-FP, ii) reagem com antígenos celulares ligados à MR1, e iii) são estimuladas por ligantes que não exigem a formação de uma base de Schiff com MR1.

[0108] Para obter informação adicional na origem dos antígenos reconhecidos, os inventores questionaram se a capacidade estimulatória de células de tumor alvo eram dependentes dos constituintes do meio de cultura, uma vez que alguns ligantes de MR1, por exemplo, 6-FP, podem derivar do folato presente no meio RPMI 1640, usado para cultura de células. Tanto as células THP-1 quanto A375-MR1 foram lavadas extensivamente e cultivadas 4 dias em solução de salina tamponada com fosfato (PBS), suplementada exclusivamente com 5 % de soro humano. As células foram lavadas diariamente antes de serem usadas para estimular células DGB129 MR1T, e os ensaios de ativação de célula T foram realizados em PBS. As células THP-1 e A375-MR1 crescidas em RPMI 1640 ou em PBS mostraram a mesma capacidade estimulatória (Figura 8A,B), indicando assim que os constituintes do meio não são responsáveis pela ativação de célula MR1T. Para investigar diretamente se os antígenos estimulatórios estavam presentes em células de tumor alvo, os inventores realizaram então ensaios de ativação de célula T usando como fonte de antígeno dois tipos de lisados de tumor. O primeiro lisado foi obtido a partir de células THP-1 cultivadas in vitro, enquanto o segundo foi preparado a partir de tumores de mama de camundongo, imediatamente após a ressecção. Duas frações hidrofóbicas e quatro hidrofílicas foram obtidas e testadas usando como APCs as células THP-1, que expressam níveis constitutivamente baixos de MR1. O clone DGB129 reagiu apenas com a fração N4, contendo compostos altamente hidrofílicos isolados tanto de tumor de camundongo recentemente explantado, quanto de células THP-1 cultivadas in vitro (Figura 8C,D). Estes resultados descartaram a possibilidade de antígenos estimulatórios serem derivados de componentes de RPMI 1640, e indicaram sua origem celular. Os inventores também testaram as frações geradas de lisados THP-1 com DGB70, um outro clone de célula MR1T representativo. As células DGB70 reconheceram fração N3 e não N4, (Figura 8E), sugerindo que pelo menos dois compostos distintos estimularam de maneira diferente os dois clones de MR1T. As mesmas frações também foram preenchidas em moléculas MR1 ligadas ao plástico, e mostraram capacidade estimulatória alternativa e específica, isto é, N3 estimulou apenas células DGB70, enquanto N4 estimulou apenas células DGB129 (Figura 8F). Na ausência de frações N3 e N4, os dois clones não reagiram ao MR1, indicando adicionalmente a exigência de antígenos específicos.

[0109] Em conclusão, estes dados indicaram que as células MR1T reconhecem MR1 complexadas com ligantes não derivados do meio de cultura, e presentes também em células de tumor crescidas in vivo. CÉLULAS MR1T EXIBEM RESPOSTAS ANTITUMOR DIFERENCIAIS

[0110] Para avaliar a atividade antitumor de células MR1T, os inventores testaram sua capacidade de matar diretamente células de tumor in vitro. Dois clones de célula MR1T representativos (DGB129 e DGB70) mataram de maneira eficiente tanto células THP-1 que expressam MR1 quanto A375, em várias razões efetor:alvo (Figura 9A,B). Um clone de célula MAIT controle não conseguiu matar estes dois tipos de célula, embora tenha sido completamente capaz de matar quando os alvos eram infectados por E. coli (não mostrado). Estes resultados indicaram que as células MR1T exibem atividade citotóxica específica contra células de tumor que expressam MR1.

[0111] Observou-se que as células MR1T reconheceram e mataram linhagem celular de tumor mielomonocítico THP-1, os inventores abordaram também se poderiam reconhecer células mieloides normais, incluindo monócitos e células dendríticas derivadas de monócito (Mo-DC) de diferentes doadores. Os monócitos não foram reconhecidos por nenhum dos clones de célula MR1T testados (não mostrado). Em contraste, alguns clones de célula MR1T reagiram com Mo-DC de uma maneira dependente de MR1 (Figura 9C). De maneira interessante, os experimentos realizados com o clone de célula DGB129 MR1T representativo revelaram que o reconhecimento de Mo-DC não resultou na morte de Mo-DC (não mostrado), mas promoveu suprarregulação de marcadores de ativação CD83 e CD86 por Mo-DC (Figura 9D). Notavelmente, a ativação de Mo-DC induzida por células DGB129 foi inibida completamente por mAbs anti-MR1 (Figura 9D). Estes dados sugeriram que algumas células MR1T reativas ao tumor elicitam atividade antitumoral direta, e também promovem a ativação de células imunes inatas, com importantes implicações no estabelecimento de respostas imunes antitumor eficientes.

[0112] Uma vez que os inventores observaram que alguns clones de célula MR1T reagiram com células de tumor intestinal HCT116 e LS 174T, estes investigaram a seguir se também poderiam reconhecer células epiteliais intestinais normais (GEC), preparadas a partir de biópsia intestinal. As células GEC não foram estimulatórias para nenhum dos clones de célula MR1T reativos a HCT116 ou LS 174T testados (Figura 9F,G), sugerindo assim que os clones de célula MR1T podem exibir reconhecimento específico de células de tumor gastrointestinal, embora não reajam às células epiteliais intestinais normais.

[0113] Para avaliar adicionalmente a especificidade de reconhecimento tumoral por células MR1T, os inventores finalmente investigaram se estas podem reagir com outros tipos de células normais, incluindo neutrófilos, células NK, células B e células T. Nenhuma destas células foram reconhecidas pelas células MR1T testadas (não mostrado).

[0114] Coletivamente, estes dados identificam células MR1T como uma população inédita e heterogênea de linfócitos T restritos à MR1 de humano que i)

reagem diferentemente a vários tipos de células de tumor, ii) exibem atividade citotóxica contra células de tumor, iii) não reconhecem células normais com exceção de Mo-DC diferenciado in vitro, e iv) não matam Mo-DC, mas induzem em vez disso sua ativação. Estes achados sugeriram que as células MR1T exibem importantes propriedades antitumor e merecem ser exploradas em relação ao seu potencial imunoterapêutico. CÉLULAS MR1T SÃO FUNCIONALMENTE HETEROGÊNEAS

[0115] Os inventores analisaram finalmente o perfil de secreção de citocina dos clones representativos de célula MR1T, mediante estímulo por células de tumor A375- MR1. Todos os clones testados liberaram IFN-γ (Figura 10A). Entretanto, os inventores também observaram diversos perfis de expressão de citocinas Th1 (IL-2, TNF-α e TNF-β), Th2 (IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13) e Th17 (IL-17A, G-CSF, GM- CSF), e outros fatores solúveis (MIP-1β, CD40L PDGF-AA solúvel e VEGF; Figura 10B). As combinações e quantidades variáveis de citocinas expressas por células MR1T sugeriram plasticidade funcional considerável nesta população. Por exemplo, clone DGA4 secretou grandes quantidades de IL-17A, IL-6, TNF-α e GM-CSF, mas não conseguiu secretar as citocinas prototípicas Th2 IL-4, IL-5, IL-10 ou IL-13, e exibiram assim um fenótipo do tipo Th17 “atípico”. Ao contrário, clone TC5A87 liberou quantidades substanciais de VEGF e PGDF-AA, mas apenas poucas citocinas Th1 ou Th2, e nenhuma IL-17A. De maneira notável, quatro dos sete clones estudados (DGB129, CH9A3, DGB70, JMA) exibiram um perfil distorcido de Th2 de liberação de citocina, um fenótipo funcional que foi recentemente associado à imunidade antitumoral protetora.

[0116] Os inventores investigaram a seguir a expressão de três receptores de quimiocina selecionados, conhecidos por serem expressos diferencialmente por subconjuntos de célula T com funções distintas, e cuja expressão combinada alternativa regula recirculação e migração de célula T para diversos sítios de permanência. De todos os clones de célula MR1T, somente DGA4 exibiu altos níveis de CXCR3 (Figura 11). Além do mais, os inventores observaram padrões de expressão divergentes de CCR4 e CCR6 (Figura 11), que sugeriram adicionalmente que células MR1T são heterogêneas.

[0117] Em uma série final de estudos, foi investigado se células MR1T mantêm sua capacidade de matar tumor in vivo, usando um modelo de tumor sólido de pulmão. Camundongos injetados intravenosamente com células de melanoma A375 que expressam MR1 receberam células DGB129, ou foram deixados sem tratamento. No dia 14, os camundongos foram sacrificados e o número de nódulos de tumor no pulmão foi contado. Enquanto camundongos não tratados mostraram 200-250 nódulos, aqueles tratados com as células MR1T mostraram 1-6 nódulos (Figura 12). Estes resultados confirmaram que as células de tumor que crescem in vivo produzem as células MR1T estimuladoras de antígenos. De maneira importante, estes proveem forte evidência da capacidade eficiente de células MR1T em matar células de tumor sólido in vivo.

[0118] Obtidos juntos, estes dados indicaram que os clones T reativos à MR1 tumoral aqui testados são fenotipicamente e funcionalmente diversos, sugerindo assim que as células MR1T incluem múltiplos subconjuntos com padrões de recirculação distintos e capacidade de permanência tecidual, e provavelmente diferente papeis na imunidade tumoral. Em conclusão, estes dados identificam células MR1T como uma população inédita de linfócitos T de humano que reconhece MR1:complexos de antígeno associado ao tumor, e pode participar de respostas imunes antitumorais com múltiplas funções efetoras. Tabela 1. Fenótipo de selecionar clones de célula T reativos à MR1. Clone CD4 CD8α CD161 TCRβ DGB129 - + - TRBV12-4 DGB70 - - - TRBV28 DGA28 - + + TRBV29-1 DGA4 - - + TRBV6-1 JMA - + - TRBV25-1 TC5A87 - + - TRBV25-1

CH9A3 - + - TRBV5-5 Tabela 2. Linhagens de célula de tumor reconhecidas por células MR1T de humano. Linhagem Origem de célula A375 Melanoma humano CCRF-SB Leucemia linfoblástica B de humano Huh7 Carcinoma hepatocelular humano HCT116 Carcinoma de cólon humano LS 174T Adenocarcinoma de cólon humano THP-1 Leucemia mielomonocítica humana

[0119] Os seguintes exemplos ilustram adicionalmente o fluxo de trabalho clínico, no qual a invenção é aplicada: SELEÇÃO DE CÂNCERES QUE EXPRESSAM MR1

[0120] Um tecido recente de paciente com câncer ou biópsias de tecido recém congeladas são analisadas em relação à expressão de MR1 usando mAbs específico para MR1 de humano, e amplificação por PCR de RNAm de MR1. TERAPIA DE CÂNCER, EXEMPLO 1: Seleção de melhores genes de MRT1 TCR para reconhecimento de células cancerígenas primárias que expressam MR1. I. Células cancerígenas MR1+ primárias isoladas ex vivo são usadas para estimular uma biblioteca de clones de célula MR1T previamente caracterizados. Cada clone expressa diferentes genes de TCR e reconhece diferentes tipos de células cancerígenas. II. Os melhores clones de células MR1T que respondem às células cancerígenas do paciente são selecionados, e seus genes de TCR são usados para terapia de gene de TCR. A resposta é ensaiada como uma função de liberação de citocina e/ou expressão de marcador superficial. As células são ensaiadas por coloração com marcador interno (citocina) ou de superfície, com anticorpos reativos aos marcadores de ativação ensaiados, exemplificados, mas não restritos a CD3, CD69, CD137, CD150 e/ou ICOS (marcadores de superfície) e INF-γ e GM-CSF (citocina). III. Quando disponível, MR1T TCR solúvel será multimerizado e usado para corar células de tumor isoladas a partir de biópsias de tumor. Os multímeros MR1T TCR que se ligam às células de tumor permitirão rápida seleção de MR1T TCRs, adequados para terapia gênica neste paciente. IV. Diversas populações de células T de paciente circulante podem ser usadas como células T receptora (células T naïve, memória central, memória efetora, CD4+, CD8+, ou CD4, CD8 duplo negativo). As células T naïve são selecionadas para permitir que linfócitos T não preparados amadureçam na presença de células de tumor, quando são transduzidas com genes dos antígenos de tumor MR1 que reconhecem TCR. Células de memória central e efetoras são usadas em virtude de fornecerem proliferação imediata, e funções efetoras (morte do tumor) mediante reconhecimento de células de tumor que expressam MR1. Células CD4 são selecionadas para prover números suficientes de células T auxiliares que facilitam o recrutamento e a expansão de outras células com funções antitumor. Células T CD8 são selecionadas para facilitar o extermínio de células de tumor. Células T CD4-CD8 duplo negativo são selecionadas por suas funções do tipo inata, tal como liberação imediata de grandes quantidades de moléculas efetoras exterminadoras (TNFα, granzimas e granulisina). V. Células T que expressam os genes de TCR transduzidos e com funções efetoras selecionadas são usadas para terapia de célula adotiva (ACT).

[0121] Células T do sangue periférico de pacientes são coradas com anticorpos monoclonais específicos para marcadores de superfície (CD4, CD8, CD27, CD45RA, CD57) e classificadas. Cada população classificada é ativada com Dynabeads® Human T-Activator CD3/CD28 (ThermoFisher), e 24 horas depois foi transfectada com os genes de TCR que codificam o MR1T TCR selecionado para o paciente individual. Isto rende uma preparação de célula T modificada (células T receptora). Em alguns casos, as células T receptoras também são modificadas por métodos de edição de gene para inativar genes inibitórios de PD1, ILT2 e ILT4, ou são transduzidas com genes CD137 e CD134 para promover a sobrevivência da célula, expansão da célula e melhorar a função efetora anticâncer.

[0122] Linfodepleção é realizada em pacientes com câncer receptores, usando um regime preparatório de quimioterapia não-mieloablativa (60 mg/kg de ciclofosfamida por 2 dias, e 25 mg/m2 de fludarabina administrada por 5 dias), seguido por transferência de células T e IL-2 fornecidas em 720.000 IU/kg para tolerância. Em alguns exemplos, 200 ou 1200 centigray (cGy; 1 Gy = 100 rads) de irradiação do corpo total é adicionada ao regime preparatório. Células T que expressam os genes de TCR exógenos de MR1T (a preparação de célula T modificada) são transferidas para o receptor.

[0123] Genes de TCR são clonados em vetores de lentivírus recombinantes seguros (vide, por exemplo, Provasi et al., Nat Med 18, 807-815 (2012)), os quais contêm genes suicidas e não podem produzir partículas virais maduras na ausência de outros vírus auxiliares. Em alguns casos, genes de TCR são clonados em vetores contendo genes suicidas (por exemplo, vide Greco et al., Front Pharmacol 6, 95 (2015)), reduzindo assim os riscos derivados da inserção indesejada de gene. Em alguns casos, RNA que codifica os genes de TCR MR1T é transfectado em células receptoras (vide, por exemplo, Zhao et al. Molecular therapy 13, 151, 2006)). TERAPIA DE CÂNCER, EXEMPLO 2: Isolamento de células MR1T a partir de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) de paciente a ser tratado. I. TILs autólogos são preparados das biópsias de tecido de câncer, de acordo com protocolo previamente estabelecido (De Libero, ibidem). II. Células T são expandidas in vitro por 2-3 semanas usando meio suplementado com IL-2, IL-7, e IL-15. III. Células T expandidas são testadas em relação à reatividade contra células cancerígenas MR1+ autólogas. Células T que aumentam a expressão superficial de marcadores de ativação (CD137, CD150, CD69, ICOS) são consideradas específicas para câncer, e se forem inibidas pela presença de anticorpos monoclonais anti-MR1, são consideradas dependentes de MR1.

[0124] Células T reativas ao câncer são classificadas de acordo com a expressão de um dos marcadores de ativação anteriores, e expandidas e usadas para ACT, da maneira descrita anteriormente.

SEQUÊNCIAS

[0125] No evento que há uma discrepância entre a sequência contida nas páginas de especificação a seguir, e o protocolo de sequência submetido em paralelo como arquivo de texto, as sequências a seguir nesta especificação prevalecerão.

SEQUÊNCIAS DE PROTEÍNA Α E Β DE TCR DE TAMANHO COMPLETO, INCLUINDO SEQUÊNCIAS PRINCIPAIS.

[0126] As sequências CDR3 são mostradas sublinhadas SEQ ID 001 Novo clone de TCR alfa 1

MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILN CDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPS QPGDSAVYFCAAQIYNQGGKLIFGQGTELSVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVC LFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFN NSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLR

LWSS SEQ ID 003 Novo clone de TCR alfa 2

MISLRVLLVILWLQLSWVWSQRKEVEQDPGPFNVPEGATVAFNCTYSNS ASQSFFWYRQDCRKEPKLLMSVYSSGNEDGRFTAQLNRASQYISLLIRDSKLSDSA TYLCVVTGNQFYFGTGTSLTVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNV SQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSP

ESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID 005 Novo clone de TCR alfa 3

MLTASLLRAVIASICVVSSMAQKVTQAQTEISVVEKEDVTLDCVYETRDTT YYLFWYKQPPSGELVFLIRRNSFDEQNEISGRYSWNFQKSTSSFNFTITASQVVDSA VYFCALSEEPSNTGKLIFGQGTTLQVKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFD SQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPED

TFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID 002 Novo clone de TCR beta 1

MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHE NMFWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTS MYLCASSFSSGKQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLA TGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFW QNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQG

VLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID 004 Novo clone de TCR beta 2

MASLLFFCGAFYLLGTGSMDADVTQTPRNRITKTGKRIMLECSQTKGHD RMYWYRQDPGLGLRLIYYSFDVKDINKGEISDGYSVSRQAQAKFSLSLESAIPNQTA LYFCATSDVGTGDTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSA TFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESY

QQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID 006 Novo clone de TCR beta 3

MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHE NMFWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTS MYLCASSRLLAGGQNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL VCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSA TFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESY QQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQUÊNCIAS DE PROTEÍNA DE TCR Α E Β DE TAMANHO COMPLETO

INCLUINDO SEQUÊNCIAS PRINCIPAIS SEQ ID NO 013 Clone de TCR alfa 4

MWGVFLLYVSMKMGGTTGQNIDQPTEMTATEGAIVQINCTYQTSGFNG LFWYQQHAGEAPTFLSYNVLDGLEEKGRFSSFLSRSKGYSYLLLKELQMKDSASYL CAVMDSSYKLIFGSGTRLLVRPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNV SQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSP

ESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO 014 Clone de TCR alfa 5

MLLITSMLVLWMQLSQVNGQQVMQIPQYQHVQEGEDFTTYCNSSTTLS NIQWYKQRPGGHPVFLIQLVKSGEVKKQKRLTFQFGEAKKNSSLHITATQTTDVGTY FCAAAGGTSYGKLTFGQGTILTVHPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQ TNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFF

PSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO 015 Clone de TCR alfa 6

MKTFAGFSFLFLWLQLDCMSRGEDVEQSLFLSVREGDSSVINCTYTDSS STYLYWYKQEPGAGLQLLTYIFSNMDMKQDQRLTVLLNKKDKHLSLRIADTQTGDS AIYFCAETWTDRGSTLGRLYFGRGTQLTVWPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLF TDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSI IPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLW

SS SEQ ID NO 016 Clone de TCR alfa 7

MAMLLGASVLILWLQTDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSLSVQEGRISILNC DYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLISISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQ PGDSAVYFCAASLYNQGGKLIFGQGTELSVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCL FTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNN SIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRL

WSS SEQ ID NO 017 Clone de TCR alfa 8

MEKNPLAAPLLILWFHLDCVSSILNVEQSPQSLHVQEGDSTNFTCSFPSS NFYALHWYRWETAKSPEALFVMTLNGDEKKKGRISATLNTKEGYSYLYIKGSQPED SATYLCASGDSGYALNFGKGTSLLVTPHIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFD SQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPED

TFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO 018 Clone de TCR alfa 9

MNYSPGLVSLILLLLGRTRGNSVTQMEGPVTLSEEAFLTINCTYTATGYP SLFWYVQYPGEGLQLLLKATKADDKGSNKGFEATYRKETTSFHLEKGSVQVSDSAV YFCALTIWDYGGSQGNLIFGKGTKLSVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF DSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPE

DTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO 019 Clone de TCR alfa 10

MVLKFSVSILWIQLAWVSTQLLEQSPQFLSIQEGENLTVYCNSSSVFSSL QWYRQEPGEGPVLLVTVVTGGEVKKLKRLTFQFGDARKDSSLHITAAQPGDTGLYL CAGENSGYALNFGKGTSLLVTPHIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNV SQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSP

ESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO 020 Clone de TCR alfa 11

MMKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQDPGPLSVPEGAIVSLNCTYSN SAFQYFMWYRQYSRKGPELLMYTYSSGNKEDGRFTAQVDKSSKYISLFIRDSQPSD SATYLCAMSLSGGSYIPTFGRGTSLIVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDF DSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPE

DTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO 021 Clone de TCR alfa 12

MLLEHLLIILWMQLTWVSGQQLNQSPQSMFIQEGEDVSMNCTSSSIFNT WLWYKQDPGEGPVLLIALYKAGELTSNGRLTAQFGITRKDSFLNISASIPSDVGIYFC AGQLGGAGGTSYGKLTFGQGTILTVHPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFD SQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPED

TFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO 022 Clone de TCR alfa 13

MTSIRAVFIFLWLQLDLVNGENVEQHPSTLSVQEGDSAVIKCTYSDSASN YFPWYKQELGKGPQLIIDIRSNVGEKKDQRIAVTLNKTAKHFSLHITETQPEDSAVYF CAANWSPQGNEKLTFGTGTRLTIIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQT NVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFF PSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS

SEQ ID NO 023 Clone de TCR alfa 14

MWGVFLLYVSMKMGGTTGQNIDQPTEMTATEGAIVQINCTYQTSGFNG LFWYQQHAGEAPTFLSYNVLDGLEEKGRFSSFLSRSKGYSYLLLKELQMKDSASYL CASMDSNYQLIWGAGTKLIIKPDIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVS QSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPE

SSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO 024 Clone de TCR alfa 15

MISLRVLLVILWLQLSWVWSQRKEVEQDPGPFNVPEGATVAFNCTYSNS ASQSFFWYRQDCRKEPKLLMSVYSSGNEDGRFTAQLNRASQYISLLIRDSKLSDSA TYLCVVNRFTRDGNKLVFGAGTILRVKSYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFD SQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPED

TFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS SEQ ID NO 025 Clone de TCR beta 4

MSIGLLCCVAFSLLWASPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNH NSMYWYRQDPGMGLRLIYYSASEGTTDKGEVPNGYNVSRLNKREFSLRLESAAPS QTSVYFCASSEVTGGYNEQFFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQK ATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLR VSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTS

ESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID NO 026 Clone de TCR beta 5

MLSLLLLLLGLGSVFSAVISQKPSRDICQRGTSLTIQCQVDSQVTMMFWY RQQPGQSLTLIATANQGSEATYESGFVIDKFPISRPNLTFSTLTVSNMSPEDSSIYLC SVGAGQGPYTDTQYFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLA TGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFW QNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQG

VLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID NO 027 Clone de TCR beta 6

MGIRLLCRVAFCFLAVGLVDVKVTQSSRYLVKRTGEKVFLECVQDMDHE NMFWYRQDPGLGLRLIYFSYDVKMKEKGDIPEGYSVSREKKERFSLILESASTNQTS MYLCASSLGATGANEKLFFGSGTQLSVLEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL VCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSA TFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSY

QQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF SEQ ID NO 028 Clone de TCR beta 7

MGSWTLCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHD YLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRD SAVYFCASSYRGTEAFFGQGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVC LATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATF WQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQ

QGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF SEQ ID NO 029 Clone de TCR beta 8

MGPGLLCWVLLCLLGAGPVDAGVTQSPTHLIKTRGQHVTLRCSPISGHK SVSWYQQVLGQGPQFIFQYYEKEERGRGNFPDRFSARQFPNYSSELNVNALLLGD SALYLCASSFDVGLPPLHFGNGTRLTVTEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL VCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSA TFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSY

QQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF SEQ ID NO 030 Clone de TCR beta 9

MGPGLLHWMALCLLGTGHGDAMVIQNPRYQVTQFGKPVTLSCSQTLNH NVMYWYQQKSSQAPKLLFHYYDKDFNNEADTPDNFQSRRPNTSFCFLDIRSPGLG DAAMYLCATSREWETQYFGPGTRLLVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLV CLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSAT FWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQ

QGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID NO 031 Clone de TCR beta 10

MTIRLLCYMGFYFLGAGLMEADIYQTPRYLVIGTGKKITLECSQTMGHDK MYWYQQDPGMELHLIHYSYGVNSTEKGDLSSESTVSRIRTEHFPLTLESARPSHTS QYLCASSQLYRDTSNTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKA TLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRV SATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSE

SYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID NO 032 Clone de TCR beta 11

MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNH EYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPS QTSVYFCASGISGTASSYNSPLHFGNGTRLTVTEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHT QKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSR LRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGF

TSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF SEQ ID NO 033 Clone de TCR beta 12

MGFRLLCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLS VYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSA LYFCASSVGGGLADTQYFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLV CLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSAT FWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQ

QGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID NO 034 Clone de TCR beta 13

MTIRLLCYMGFYFLGAGLMEADIYQTPRYLVIGTGKKITLECSQTMGHDK MYWYQQDPGMELHLIHYSYGVNSTEKGDLSSESTVSRIRTEHFPLTLESARPSHTS QYLCASSEYIQYSGNTIYFGEGSWLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATL VCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSA TFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSY

QQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF SEQ ID NO 035 Clone de TCR beta 14

MLLLLLLLGPGSGLGAVVSQHPSWVICKSGTSVKIECRSLDFQATTMFW YRQFPKQSLMLMATSNEGSKATYEQGVEKDKFLINHASLTLSTLTVTSAHPEDSSFY ICSAKVTSGQHQGTTDTQYFGPGTRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKAT LVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVS ATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSES

YQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG SEQ ID NO 036 Clone de TCR beta 15

MLSLLLLLLGLGSVFSAVISQKPSRDICQRGTSLTIQCQVDSQVTMMFWY RQQPGQSLTLIATANQGSEATYESGFVIDKFPISRPNLTFSTLTVSNMSPEDSSIYLC SVEGRGYEQYFGPGTRLTVTEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFY PDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPR NHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSA TILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG

SEQUÊNCIAS DE PROTEÍNA DE TCR Γ E Δ DE TAMANHO COMPLETO, INCLUINDO SEQUÊNCIAS PRINCIPAIS SEQ ID NO 061 Clone de TCR gama 1

MQWALAVLLAFLSPASQKSSNLEGRTKSVIRQTGSSAEITCDLAEGSTG YIHWYLHQEGKAPQRLLYYDSYTSSVVLESGISPGKYDTYGSTRKNLRMILRNLIEN DSGVYYCATWETQELGKKIKVFGPGTKLIITDKQLDADVSPKPTIFLPSIAETKLQKA GTYLCLLEKFFPDVIKIHWQEKKSNTILGSQEGNTMKTNDTYMKFSWLTVPEKSLDK EHRCIVRHENNKNGVDQEIIFPPIKTDVITMDPKDNCSKDANDTLLLQLTNTSAYYMY

LLLLLKSVVYFAIITCCLLRRTAFCCNGEKS SEQ ID NO 062 Clone de TCR delta 1

MLFSSLLCVFVAFSYSGSSVAQKVTQAQSSVSMPVRKAVTLNCLYETSW WSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAVKSVALTISALQLEDS AKYFCALGVQALLPILGDTTDKLIFGKGTRVTVEPRSQPHTKPSVFVMKNGTNVACL VKEFYPKDIRINLVSSKKITEFDPAIVISPSGKYNAVKLGKYEDSNSVTCSVQHDNKT VHSTDFEVKTDSTDHVKPKETENTKQPSKSCHKPKAIVHTEKVNMMSLTVLGLRML

FAKTVAVNFLLTAKLFFL Tabela X Designação de ID Nos de sequência Proteína Ácido nucleico Clone α β α β α β

CDR3 CDR3 1 1 2 65 80 7 8 2 3 4 66 81 9 10 3 5 6 67 82 11 12 4 13 25 68 83 37 49 5 14 26 69 84 38 50 6 15 27 70 85 39 51 7 16 28 71 86 40 52 8 17 29 72 87 41 53 9 18 30 73 88 42 54 10 19 31 74 89 43 55 11 20 32 75 90 44 56 12 21 33 76 91 45 57 13 22 34 77 92 46 58 14 23 35 78 93 47 59 15 24 36 79 94 48 60 Clone γ δ γCDR3 δ γ δ CDR3 (1) 61 62 95 96 63 64

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de preparação de uma preparação de células MR1T que expressam um receptor de célula T capaz de se ligar a um antígeno apresentado por uma célula cancerígena em associação com uma molécula MR1, caracterizado por compreender as etapas de: a. prover uma amostra do tumor obtida a partir de um paciente; b. colocar a dita amostra do tumor em contato com i. uma pluralidade de clones de célula T, em que cada clone de célula T é caracterizado por um receptor de célula MR1T capaz de se ligar especificamente a um antígeno apresentado por uma célula cancerígena em associação com uma molécula MR1; ou ii. uma pluralidade de receptores de célula T solúveis isolados, rotulados e multimerizados isolados das moléculas do receptor de célula MR1T; em que cada um dos ditos clones de célula T ou cada um dos ditos receptores de célula T solúveis isolados, rotulados e multimerizados é caracterizado por - um trecho de sequência CDR3 selecionado a partir de qualquer uma de SEQ ID NO 065 até SEQ ID NO 096, ou um trecho de sequência CDR3 caracterizado por uma sequência idêntica a uma sequência selecionada a partir de qualquer uma de SEQ ID NO 065 até SEQ ID NO 096 com uma ou duas substituições de aminoácido, particularmente em que as ditas substituições são selecionadas de acordo com as regras de substituição dadas a seguir; mais particularmente, o clone de célula T ou TCR solúvel é caracterizado por uma sequência CDR3 selecionada a partir de qualquer uma de SEQ ID NO 065 até SEQ ID NO 096 em que a sequência compreende um total máximo de 0, 1 ou 2 substituições em uma posição localizada entre o quarto aminoácido N-terminal e o quinto aminoácido C-terminal das ditas sequências CDR3 alfa, gama ou delta, ou o quarto aminoácido N-terminal e o sexto aminoácido C-terminal da dita sequência CDR3 beta, de acordo com as regras de substituição:

- glicina (G) e alanina (A) são intercambiáveis; valina (V), leucina (L), e isoleucina (I) são intercambiáveis, A e V são intercambiáveis; - triptofano (W) e fenilalanina (F) são intercambiáveis, tirosina (Y) e F são intercambiáveis; - serina (S) e treonina (T) são intercambiáveis; - ácido aspártico (D) e ácido glutâmico (E) são intercambiáveis - asparagina (N) e glutamina (Q) são intercambiáveis; N e S são intercambiáveis; N e D são intercambiáveis; E e Q são intercambiáveis; - metionina (M) e Q são intercambiáveis; - cisteína (C), A e S são intercambiáveis; - prolina (P), G e A são intercambiáveis; - arginina (R) e lisina (K) são intercambiáveis; ou - em que cada um dos ditos clones de célula T ou ditos receptores de célula T solúveis isolados, rotulados e multimerizados é caracterizado por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir de SEQ ID NO 007 até SEQ ID NO 012 ou SEQ ID NO 037 até SEQ ID NO 060 ou SEQ ID NO 063 até SEQ ID NO 064 e/ou uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NO 001 até SEQ ID 006 ou SEQ ID NO 013 até SEQ ID NO 036 ou SEQ ID NO 061 até SEQ ID NO 062; ou - uma sequência de ácido nucleico de cadeia α do receptor de célula T selecionada a partir de SEQ ID NO 007, 009 até 011 ou SEQ ID NO 037 até SEQ ID NO 048 e/ou uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NO 001, 003 até 005 ou SEQ ID NO 013 até SEQ ID NO 024; ou uma sequência de aminoácido pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98 %) idêntica à SEQ ID NO 001, 003 até 005 ou SEQ ID NO 013 até SEQ ID NO 024 e com a mesma atividade biológica, particularmente uma sequência de aminoácido pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98 %) idêntica à SEQ ID NO 001, 003 até 005 ou SEQ ID NO 013 até SEQ ID NO 024 compreendendo uma sequência CDR selecionada a partir de SEQ ID NO 065 até SEQ ID NO 079 e/ou

- uma sequência de ácido nucleico de cadeia β do receptor de célula T selecionada a partir de SEQ ID NO 008, 010 até 012 ou SEQ ID NO 049 até SEQ ID NO 060 e/ou uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NO 002, 004 até 006 ou SEQ ID NO 025 até SEQ ID NO 036 ou uma sequência de aminoácido pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98 %) idêntica à SEQ ID SEQ ID NO 002, 004 até 006 ou SEQ ID NO 025 até SEQ ID NO 036 e com a mesma atividade biológica, particularmente uma sequência de aminoácido pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98 %) idêntica à SEQ ID NO 002, 004 até 006 ou SEQ ID NO 025 até SEQ ID NO 036 compreendendo uma sequência CDR selecionada a partir de SEQ ID NO 080 até SEQ ID NO 094; ou - uma sequência de ácido nucleico de cadeia γ do receptor de célula T SEQ ID NO 61 e/ou uma sequência de aminoácido SEQ ID NO 063 ou uma sequência pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98 %) idêntica às mesmas e com a mesma atividade biológica, particularmente uma sequência de aminoácido pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98 %) idêntica à SEQ ID NO 063 e compreendendo uma CDR3 de SEQ ID NO 095; e/ou - uma sequência de ácido nucleico de cadeia δ do receptor de célula T SEQ ID NO 64 e/ou uma sequência de aminoácido SEQ ID NO 062, ou uma sequência de aminoácido pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98 %) idêntica à SEQ ID NO 062 e compreendendo uma CDR3 de SEQ ID NO 096; ou em que cada um dos ditos clones de célula T ou ditos receptores de célula T solúveis isolados, rotulados e multimerizados é caracterizado por um par de sequência de ácido nucleico de cadeia α e cadeia β do receptor de célula T selecionado a partir dos pares: - SEQ ID NO 007 e SEQ ID NO 008; ou SEQ ID NO 009 e SEQ ID NO 010; ou SEQ ID NO 011 e SEQ ID NO 012, - SEQ ID NO 037 e SEQ ID NO 049; ou SEQ ID NO 038 e SEQ ID NO 050;

ou SEQ ID NO 039 e SEQ ID NO 051; ou SEQ ID NO 040 e SEQ ID NO 052; ou SEQ ID NO 041 e SEQ ID NO 053; ou SEQ ID NO 042 e SEQ ID NO 054; ou SEQ ID NO 043 e SEQ ID NO 055; ou SEQ ID NO 044 e SEQ ID NO 056; ou SEQ ID NO 045 e SEQ ID NO 057; ou SEQ ID NO 046 e SEQ ID NO 058; ou SEQ ID NO 047 e SEQ ID NO 059; ou SEQ ID NO 048 e SEQ ID NO 060; ou em que cada um dos ditos clones de célula T ou ditos receptores de célula T solúveis isolados, rotulados e multimerizados é caracterizado por um par de sequência de ácido nucleico de cadeia γ e cadeia δ do receptor de célula T selecionada a partir de SEQ ID NO 063 e SEQ ID NO 064; ou em que cada um dos ditos clones de célula T ou ditos receptores de célula T solúveis isolados, rotulados e multimerizados é caracterizado por um par de sequência de aminoácido de cadeia α e cadeia β do receptor de célula T selecionado a partir de: - SEQ ID NO 001 e SEQ ID NO 002; ou, SEQ ID NO 003 e SEQ ID NO 004; ou SEQ ID NO 005 e SEQ ID NO 006, - SEQ ID NO 013 e SEQ ID NO 025; ou SEQ ID NO 014 e SEQ ID NO 026; ou SEQ ID NO 015 e SEQ ID NO 027; ou SEQ ID NO 016 e SEQ ID NO 028; ou SEQ ID NO 017 e SEQ ID NO 029; ou SEQ ID NO 018 e SEQ ID NO 030; ou SEQ ID NO 019 e SEQ ID NO 031; ou SEQ ID NO 20 e SEQ ID NO 032; ou SEQ ID NO 021 e SEQ ID NO 033; ou SEQ ID NO 022 e SEQ ID NO 034; ou SEQ ID NO 023 e SEQ ID NO 035; ou SEQ ID NO 024 e SEQ ID NO 036; ou um par selecionado a partir dos pares dados nos dois parágrafos prévios, em que cada um dos parceiros pode ter uma sequência pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98 %) idêntica à SEQ ID NO indicada e o par tem a mesma atividade biológica do par inalterado; ou em que cada um dos ditos clones de célula T ou ditos receptores de célula

T solúveis isolados, rotulados e multimerizados é caracterizado por uma cadeia γ do receptor de célula T SEQ ID NO 061 e uma sequência de aminoácido de cadeia δ SEQ ID NO 062, ou um par em que cada um dos parceiros pode ter uma sequência pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98 %) idêntica às mesmas e o par tem a mesma atividade biológica do par inalterado; iii. identificar um receptor de célula MR1T especificamente reativo à dita amostra do tumor; c. prover uma preparação de célula T; d. introduzir na dita preparação de célula T uma construção de expressão de ácido nucleico que codifica um receptor de célula T reativo a MR1 identificado como sendo especificamente reativo à dita amostra do tumor na etapa iii., produzindo uma preparação de célula T transgene.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita preparação de célula T ser obtida a partir do mesmo paciente (terapia de célula T adotiva autóloga).

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita preparação de célula T ser obtida a partir de um outro sujeito, particularmente um sujeito correspondente ao HLA (terapia de célula T adotiva alogênica).

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a dita preparação de célula T ser obtida a partir de sangue periférico, particularmente em que a dita preparação de célula T é obtida pela seleção de PBMC para a expressão de um ou diversos marcadores de célula T selecionados a partir do grupo que contêm CD4, CD8, CD27, CD45RA e CD57, particularmente selecionando as células T CD3+ CD4+, ou CD3+ CD8+, ou CD3+ CD27+ CD45RA+, ou CD3+ CD27+ CD45RA-, ou CD3+ CD27- CD45RA-, ou CD3+ CD57- ou CD3+ CD57+ .

5. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a dita preparação de célula T ser obtida a partir de uma biópsia de tumor seguida pela subsequente expansão in vitro.

6. Preparação de células T específicas de MR1, caracterizada por ser obtida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 até 5 para uso em um método de terapia ou prevenção de câncer, em particular um câncer caracterizado pela expressão de MR1.

7. Vetor de expressão, caracterizado por compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica: a. um heterodímero do receptor de célula T funcional, ou b. uma cadeia α do receptor de célula T capaz de formar um heterodímero do receptor de célula T funcional juntamente com uma cadeia β do receptor de célula T, e/ou c. uma cadeia β do receptor de célula T capaz de formar um heterodímero do receptor de célula T funcional juntamente com uma cadeia α do receptor de célula T, em que o dito heterodímero do receptor de célula T é capaz de se ligar especificamente a uma molécula MR1, em que a dita molécula MR1 é expressa em uma célula de tumor e apresenta um antígeno associado ao tumor, e em que a dita sequência de ácido nucleico é ou compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir de SEQ ID NO 007 até SEQ ID NO 012, e/ou codifica uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NO 001 até SEQ ID 006; ou uma sequência de aminoácido pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98 %) idêntica à SEQ ID NO 001, 003 até 005 e com a mesma atividade biológica, particularmente uma sequência de aminoácido pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98 %) idêntica à SEQ ID NO 001, 003 até 005 compreendendo uma sequência CDR selecionada a partir de SEQ ID NO 065 até SEQ ID NO 067; ou é ou compreende uma sequência de ácido nucleico de cadeia α do receptor de célula T selecionada a partir de SEQ ID NO 007, SEQ ID NO 009 ou SEQ ID NO 011, e/ou codifica as sequências de aminoácido selecionadas a partir de SEQ ID NO 001, SEQ ID NO 003 ou SEQ ID NO 005; ou é ou compreende uma sequência de ácido nucleico de cadeia β do receptor de célula T selecionada a partir de uma de SEQ ID NO 008, SEQ ID NO 010 ou SEQ ID NO 012, e/ou codifica uma das sequências de aminoácido selecionadas a partir de SEQ ID NO 002, SEQ ID NO 004 ou SEQ ID NO 006; ou é ou compreende um par de sequência de ácido nucleico de cadeia α e cadeia β do receptor de célula T selecionado a partir dos pares: SEQ ID NO 007 e SEQ ID NO 008; ou SEQ ID NO 009 e SEQ ID NO 010; ou SEQ ID NO 011 e SEQ ID NO 012; ou codifica um par de sequência de aminoácido de cadeia α e cadeia β do receptor de célula T selecionado a partir dos pares: SEQ ID NO 001 e SEQ ID NO 002; ou SEQ ID NO 003 e SEQ ID NO 004; ou SEQ ID NO 005 e SEQ ID NO 006.

8. Heterodímero da proteína do receptor de célula T isolada, caracterizado por compreender uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NOs 001 até 006, ou uma sequência pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98 %) idêntica a uma sequência de aminoácido selecionada a partir de SEQ ID NOs 001 até 006 e com a mesma atividade biológica, particularmente em que a sequência compreende uma sequência CDR3 selecionada a partir de SEQ ID 65, 66, 67, 80, 81 e 82.

9. Heterodímero da proteína do receptor de célula T isolada, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a dita proteína do receptor de célula T isolada compreender um par de sequência de aminoácido selecionada a partir de: - SEQ ID NO 001 e SEQ ID NO 002, - SEQ ID NO 003 e SEQ ID NO 004, - SEQ ID NO 005 e SEQ ID NO 006 ou um par selecionado a partir dos pares fornecidos anteriormente, em que cada um dos parceiros pode ter uma sequência pelo menos 85 % (≥ 90 %, 95 %, 98 %) idêntica à SEQ ID NO indicada e o par tem a mesma atividade biológica do par inalterado; particularmente em que cada uma das sequências de aminoácido compreende uma sequência CDR3 idêntica à SEQ ID NO indicada.

10. Heterodímero da proteína do receptor de célula T isolada que se liga a uma molécula MR1, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado por a dita molécula MR1 apresentar um antígeno associado ao tumor.

11. Célula recombinante, caracterizada por compreender o vetor de expressão como definido na reivindicação 0 ou o heterodímero da proteína do receptor de célula T como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 10, em que a dita célula recombinante é uma célula T derivada a partir de: a. sangue periférico ou b. um linfócito infiltrante de tumor.

12. Célula recombinante, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por ser para uso em um método de terapia ou prevenção de câncer, em particular um câncer caracterizado pela expressão de MR1.

13. Célula recombinante para uso em um método de terapia ou prevenção de câncer, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por a dita célula ser administrada por imunoterapia com célula T adotiva.

14. Coleção de sequências de ácido nucleico, caracterizada por cada elemento da coleção facilitar a expressão de uma combinação de uma cadeia α do receptor de célula T, uma cadeia β do receptor de célula T, ou uma cadeia α do receptor de célula T e uma cadeia β diferente em uma célula de mamífero, em que a dita combinação é capaz de se ligar especificamente a uma molécula MR1 que apresenta um antígeno do câncer, em que a coleção compreende uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NO 007 até SEQ ID NO 012 e/ou a coleção compreende sequências que codificam uma molécula do receptor de célula T (ou um receptor de célula T que constitui uma cadeia alfa ou beta) selecionadas a partir de SEQ ID NO 001 até SEQ ID 006.

15. Coleção de células T recombinantes, caracterizada por cada elemento da coleção expressar como um transgene um receptor de célula T capaz de se ligar especificamente a uma molécula MR1 que apresenta um antígeno do câncer como definido nas reivindicações 8 a 10.

16. MR1, caracterizado por expressar um vetor de expressão do ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica MR1 sob o controle de uma sequência promotora operável em uma célula de mamífero, para uso no tratamento do câncer, em que o dito MR1 que expressa o vetor de expressão do ácido nucleico é administrado antes da, concomitante com a ou depois da administração de: a. uma célula recombinante que compreende o vetor de expressão como definido na reivindicação 7 ou o heterodímero da proteína do receptor de célula T como definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 10, e/ou b. uma preparação de células T específicas de MR1 obtidas pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e/ou c. um vetor de expressão como definido na reivindicação 7.