CN111269925B - 携带自杀基因的robo1 car-nk细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种携带自杀基因的ROBO1 CAR‑NK细胞及其制备方法和应用，为了增加CAR‑NK疗法的安全性和可控性，我们在目前ROBO1 CAR‑NK细胞的基础上，通过慢病毒转染的技术，将一个自杀基因开关原件整合至基因组中，形成带有自杀基因的CAR‑NK。通过自杀基因的加入，可以更好地控制CAR‑NK细胞，进一步增加临床上的安全性。

Description

携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种NK细胞及其制备方法和应用，具体涉及一种携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，基于CAR-T细胞的免疫疗法受到了界内的广泛关注，作为一种“活的”药物，CAR-T疗法与传统药物有着很大的区别。首先，该疗法需要从患者体内分离出T细胞，在体外利用嵌合抗原受体(CAR)修饰T细胞，使其能够特异性识别癌细胞，然后再将改造后的T细胞扩增、回输至患者体内。例如，CD19 CAR-T细胞在CD19阳性恶性肿瘤患者的成功应用，证明这种方法用于癌症免疫治疗(Grupp et al.,2013)的可行性。并且，CAR-T细胞靶向多种不同的肿瘤抗原正在积极的进行临床开发(Kalosetal.,2013)。
尽管CAR-T疗法已经展现出巨大的潜力，但是有明显的局限性。首先，细胞必须分离出体外(这一过程耗时长且费用高)。而且，由于T细胞是针对特定患者进行修改，但是一些患者可能无法采集T细胞，或者没有足够的时间等待T细胞的准备过程，虽然目前CAR-T在向通用型的CAR-T发展，但其实又增加了临床风险以及操作难度。并且，由于T细胞是针对特定患者进行修改，但是一些患者可能无法采集T细胞，或者没有足够的时间等待T细胞的准备过程；此外，面对CAR-T的高额费用(参考目前上市的两家公司，诺华和凯特)，这些局限性可能会导致一些有望受益的患者无法接受CAR-T免疫疗法。另外，CAR-T疗法还存在严重的毒性或副作用，包括细胞因子释放综合征CRS、神经毒性等。
自然杀伤(NK)细胞是用于过继癌症免疫治疗的重要效应细胞类型。类似于T细胞，NK细胞可修饰以表达嵌合抗原受体(CARs)，以增强抗肿瘤活性。NK细胞在癌症免疫监视中起重要作用，并且代表用于过继癌症免疫疗法的重要效应细胞类型。与T细胞相比，它们不需要事先活化和识别复合体MHC分子呈递的肽抗原。相反，通过编码的细胞表面受体偶联CD3ζ分子，在适当的刺激下，NK细胞可表现出杀伤活性。因此，CAR-NK疗法有望成为肿瘤细胞治疗的重要发展方向。
我们通过对NK92细胞进行改造，装上CAR后，大大增加了它的靶向性；同时装上自杀基因开关原件，进一步增加CAR-NK细胞的安全性和可控性以及临床前的实验也证明我们的CAR-NK确实没有明显的毒副作用。但是为了进一步增加CAR-NK疗法的安全性和有效性，需要进一步研发改进。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种携带自杀基因的核苷酸序列，本发明的另一个目的是提供一种携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞，本发明的又一个目的是提供一种携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞的应用，通过在ROBO1 CAR-NK细胞的基础上增加自杀基因开关原件，可以更好地控制CAR-NK细胞，进一步增加临床上的安全性。
本发明提供一种携带自杀基因的核苷酸序列，包括编码嵌合抗原受体的基因，还包括诱导自杀基因；所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活NK细胞，所述肿瘤特异性抗原为ROBO1。
在本发明的一个优选实施例中，所述诱导自杀基因为iCaspase9、EGFRt、CD20、雷帕霉素和/或RQR8。
在本发明的一个优选实施例中，所述诱导自杀基因为iCaspase9，所述iCaspase9包括FKBP12-F36V和ΔCaspase9，所述FKBP12-F36V的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，所述ΔCaspase9的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。
在本发明的一个优选实施例中，所述FKBP12-F36V和ΔCaspase9通过Linker连接，所述Linker的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示；接头序列(Linker)设计是基因融合技术能否成功的关键技术之一，通过适当的接头序列将不同的目的基因连接起来，使其在适当的生物体内表达成为一条单一的肽链，其中起连接作用的氨基酸称为Linker。它不影响目的蛋白各自的功能，而且能够使融合蛋白形成正确的空间结构，更好的发挥生物学活性。
在本发明的一个优选实施例中，所述iCaspase9自杀基因上还设有标签基因所述标签基因优选为CD19、Myc、Flag、HA或His，通过对标签基因的检测来证明目的蛋白是否得到了正确的表达。
在本发明的一个优选实施例中，所述标签基因可为CD19、Myc、Flag、HA或His，优选为CD19；所述iCaspase9自杀基因上还设有剪切基因，所述剪切基因为T2A或P2A，优选为T2A；所述CD19标签的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述T2A的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。通过标签基因CD19，能够识别胞内表达的Caspase9蛋白，此外，在剪切基因的作用下，能够成功将mRNA翻译后的融合蛋白的标签与iCaspase9剪切开。CD19是一段截短的CD19，包括CD19的胞外段，跨膜区和胞内截短的一段序列(不含胞内信号传导区域)，只是作为检测自杀基因的标签，不具有其他任何的功能，并且CD19作为自杀基因的检测标签也已经在临床病人上显示比较好的检测效果，比其它标签具有更高的安全性；两个基因通过T2A多肽连接成为一个ORF，mRNA翻译成为一个融合蛋白，但这个融合蛋白会被识别2A的蛋白酶切成两个蛋白，这两个蛋白分别各自表达，功能互不影响，T2A的优点在于它序列很短，对蛋白功能基本上不会造成什么影响。
在本发明的一个优选实施例中，所述iCaspase9的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在本发明的一个优选实施例中，所述诱导自杀基因为EGFRt，所述EGFRt包括EGFR的胞外结构域III、胞外结构域IV和跨膜区。
在本发明的一个优选实施例中，所述EGFRt的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。
在本发明的一个优选实施例中，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的Ig1、Ig2、Ig3、Ig4、Ig5、FN1、FN2和FN3结构域中的一种或多种。
在本发明的一个优选实施例中，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的FN3结构域。
在本发明的一个优选实施例中，所述的抗原结合结构域为特异性结合ROBO1的FN3结构域的抗体或其抗原结合片段，所述抗原结合片段为Fab或ScFv。
在本发明的一个优选实施例中，所述的跨膜结构域选自CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154中的一种或多种；优选地，所述的跨膜结构域为CD8跨膜结构域；和/或，
所述的共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，所述的共刺激分子选自CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB和OX40中的一种或多种；优选地，所述的共刺激信号传导区包含4-1BB和CD3ζ胞内结构域。
在本发明的一个优选实施例中，所述嵌合抗原受体是结构为ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ的融合蛋白，其中所述的ScFv能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的FN3结构域。
在本发明的一个优选实施例中，所述ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9所示。
在本发明的一个优选实施例中，所述ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11所示。
本发明还提供一种携带自杀基因的构建体，包括上述的核苷酸序列。
在本发明的一个优选实施例中，所述构建体为慢病毒构建体；优选地，当所述自杀基因为iCaspase9时，所述构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；或
当所述自杀基因为EGFRt时，所述构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
本发明还提供一种携带自杀基因的嵌合抗原受体，由上述的核苷酸序列编码。
本发明还提供一种携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞，所述ROBO1 CAR-NK细胞表达嵌合抗原受体。
在本发明的一个优选实施例中，所述的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞能够有效地杀伤或杀死肺癌细胞、胰腺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞或胃癌细胞。
本发明还提供一种上述携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞的制备方法，包括如下步骤：
(1)合成和扩增上述的核苷酸序列中的自杀基因，并将所述核苷酸序列克隆到慢病毒表达载体上，得到携带自杀基因的慢病毒载体；
(2)再通过慢病毒包装细胞系和包括步骤(1)得到携带自杀基因的慢病毒载体的三质粒系统进行慢病毒的包装，得到携带自杀基因的慢病毒，然后通过所述携带自杀基因的慢病毒侵染ROBO1 CAR-NK细胞，使自杀基因整合到其基因组上，得到携带自杀基因的ROBO1CAR-NK细胞，即得。
在本发明的一个优选实施例中，所述ROBO1-NK细胞通过包括以下步骤的方法制得：
a.合成和扩增编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列，并将所述核苷酸序列克隆到慢病毒表达载体上；优选地，合成上述的ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的编码核苷酸序列，得到含有ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的编码核苷酸序列的慢病毒载体；
b.利用慢病毒包装所必需的质粒和步骤a得到的慢病毒表达载体在慢病毒包装细胞系中进行包装，从而制备慢病毒；
c.利用步骤b得到的慢病毒感染NK细胞，得到ROBO1 CAR-NK细胞。
本发明还提供一种药物组合物，包含上述的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞或上述方法制备的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞；优选地，所述药物组合物还包括诱导物，当所述自杀基因为iCaspase9时，所述诱导物优选为AP1903或AP20187；所述小分子化学诱导物的浓度为0～50nM；或
当所述自杀基因为EGFRt时，所述诱导物优选为西妥昔单抗，其作用浓度为1μg/ml。
在本发明的一个优选实施例中，当所述携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞用于杀伤肿瘤时，所述携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞与肿瘤细胞的效靶比为(0.5～5)：1；优选地，所述效靶比为(0.5～1)：1。
在本发明的一个优选实施例中，所述药物组合物还包括药学上可接受的盐、载体、赋型剂和辅料。
按照本发明所属技术领域的一些通用方法，本发明的药物可制成药学上可接受的各种剂型，如片剂、胶囊剂、口服液剂、锭剂、注射剂、软膏剂、颗粒剂或各种缓控释制剂等。优选为注射剂，可经皮下注射给药。
本发明药物的载体可以是药学领域中可得到的常见类型，包括：黏合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂或基质等。
本发明还提供一种上述携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞，或上述制备方法制备的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞在制备用于治疗和/或预防癌症的药物中的应用；优选地，所述的癌症为高表达ROBO1的肿瘤及相关疾病。
在本发明的一个优选实施例中，所述癌症为肝癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌或肺癌。
在本发明的一个优选实施例中，所述药物为瘤内施用剂型的药物，例如瘤内注射剂型的药物或静脉输注剂型的药物。
本发明还提供上述携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞，或所制备的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞，或所述的药物组合物用于治疗和/或预防癌症的方法，所述方法包括将有效量的含有携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞的药物组合物摄入患者体内。
在本发明的一个优选实施例中，所述的癌症为高表达ROBO1的肿瘤及相关疾病。
在本发明的一个优选实施例中，所述癌症为肝癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌或肺癌，优选地，所述癌症为乳腺癌、结直肠癌或肝癌。
在本发明的一个优选实施例中，所述携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞的摄入量为(0.5～5)×109细胞/次。
在本发明的一个优选实施例中，所述携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞的摄入方法为瘤内注射、静脉注射、胸腔内注射或局部介入。
在本发明的一个优选实施例中，所述携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞的摄入方法为静脉注射。
本发明的有益效果为：
首先，ROBO1 CAR-NK细胞可作为肿瘤类疾病的治疗药物，用于ROBO1分子高表达的肿瘤的治疗，且无细胞因子风暴等不良现象，为对传统手术、化疗和放疗无效的肿瘤提供了新的治疗方法；并且通过对NK92细胞进行改造，装上CAR后，又大大增加了它的靶向性，且CAR中的靶点为抗肿瘤靶点ROBO1，在提高靶向性地同时，大大地提高其抗肿瘤性能；此外,通过我们临床前的实验发现，我们目前所用的ROBO1CAR-NK的毒副作用相比较CAR-T较小，并且杀伤效果更好；也就是说本发明构建的ROBO1 CAR-NK细胞，首先通过对NK92细胞进行改造，装上CAR后增加了其靶向性；其次，由于NK92细胞是从一名淋巴瘤患者外周血分离并成功建系，虽然其能够识别靶细胞无MHC限制性，可以在无预先致敏的情况下杀伤肿瘤细胞，同时还可以产生一系列的细胞因子，进而对机体的获得性免疫进行调节，所以ROBO1CAR-NK还具有可以调节继发性免疫的作用，但是用于人体后可能还会存在一定的成瘤风险。
因此，为了进一步增加CAR-NK疗法的安全性和可控性，我们在目前的ROBO1 CAR-NK细胞的基础上，通过慢病毒转染的技术，将自杀基因整合至基因组中，形成带有不同作用机制的自杀基因的CAR-NK。当体外加小分子化学诱导物，如AP1903药物后，它可以和自杀基因中的FKBP12-F36V上的domain结合，接着形成二聚体的iCaspase9，从而激活Caspase3，6，7，诱发细胞凋亡；当体外添加诱导物西妥昔单抗后，携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK在杀伤/效应细胞(NK92-CD16即高表达CD16分子的NK92细胞株)或者PBMC的作用下，西妥昔单抗和EGFRt结合，其Fc段与NK92-CD16或者PBMC表面的FcR结合，从而启动抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)，介导杀伤/效应细胞直接杀伤靶细胞，从而可以更好地控制CAR-NK细胞，进一步增加临床上的安全性和可控性，推动了CAR-NK疗法的发展。
附图说明
参照附图，根据下面的详细描述，可以更加清楚地理解本发明，其中：
图1为本发明实施例1提供的慢病毒质粒载体pRRLSIN-ScFv(anti ROBO1-FN3)的结构示意图；
图2为本发明实施例4中携带有iCaspase9自杀基因的慢病毒质粒载体(1942-3-IC9)的结构示意图；
图3a-3b为本发明实施例3提供的ROBO1 CAR-NK细胞流式检测CAR阳性率的结果图；
图4a-4b所示为本发明实施例3提供的ROBO1 CAR-NK细胞流式检测CD56分子阳性率的结果图；
图5为本发明实施例4提供的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞通过流式检测iCaspase9和ROBO1的阳性率的结果图，其中，PE是检测Flag标签的通道，Flag-PE通道内的阳性率表示ROBO1 CAR阳性率的结果，APC是检测CD19的通道，APC-CD19通道内的阳性率表示iCaspase9阳性率的结果，Flag/CD19表示检测的双阳的结果，其双阳的阳性率表示iCaspase9和ROBO1同时表达的阳性率的结果；
图6为本发明实施例4提供的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞的RT-PCR mRNA水平检测结果，其中，1为NK-92细胞，2为ROBO1 CAR-NK细胞，3为ROBO1-iCaspase9细胞，图中的iCas9表示iCaspase9；
图7为本发明实施例5中的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞的全基因组测序结果，结果为分析的插入基因组位点的信息；
图8为本发明实施例6中的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞的稳定性检测结果；
图9为AP1903诱导本发明实施例6中的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞凋亡的结果；
图10a为本发明实施例6中的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞ATCG427B-1F7通过流式检测阳性率的结果；
图10b为本发明实施例6中的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞ATCG427B-2D5通过流式检测阳性率的结果；
图11为本发明实施例7中将携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞通过不同浓度的AP1903诱导凋亡的结果；
图12为本发明实施例7中通过不同浓度的AP1903分别处理2h、4h和24h的细胞换新鲜培养基继续培养三天后，统计细胞存活率的结果；
图13为本发明实施例7中处理4h后的实验组，换新鲜培养基培养24h的结果；
图14a为本发明实施例8中不同细胞乳腺癌细胞中ROBO1的蛋白表达情况的检测结果，其中，HCC1187、HCC1937、HCC38、MDAMB-231、MDAMB-453、MDAMB-468为三阴乳腺癌细胞系；
图14b为图14a中测定检测的ROBO1的光密度与GAPDH的光密度的比值的结果；
图15为本发明实施例9中携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞用于乳腺癌细胞的杀伤结果；
图16a-c为本发明实施例9中携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞用于不同癌细胞的杀伤结果；
图17a为本发明实施例9中正常乳腺细胞和PBMC中的ROBO1表达情况的检测结果；
图17b为本发明实施例9中携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞对正常乳腺细胞和PBMC的杀伤的实验结果；
图18为本发明实施例9中的PBMC对携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞的杀伤结果；
图19为本发明实施例10提供的慢病毒质粒载体1942-3-hEGFRt的结构示意图；
图20为本发明实施例10中的EFGRt的结构示意图；
图21a为本发明实施例10中的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞ROBO1-EGFRt-3C10-2D10通过流式检测阳性率的结果；
图21b为本发明实施例10中的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞ROBO1-EGFRt-3C10-1F11通过流式检测阳性率的结果；
图22为本发明实施例11中的不同类型的癌细胞中的ROBO1蛋白表达水平的检测结果；
图23a为本发明实施例11中的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞用于杀伤实验的杀伤结果实验图；
图23b为本发明实施例11中的通过过表达ROBO1的单克隆细胞株(HCT116-ROBO1)模型测定携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞用于杀伤实验的特异性杀伤结果实验图；
图23c为本发明实施例11中的通过过表达ROBO1的单克隆细胞株(MDAMB-231-ROBO1)模型测定携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞用于杀伤实验的特异性杀伤结果实验图；
图24为本发明实施例12中通过体外构建的NK92-CD16(高亲和力)效应细胞来评价携带自杀基因的ROBO1-EGFRt-CAR-NK细胞中自杀开关的有效性的实验结果图；
图25为本发明实施例12中通过PBMC效应细胞来评价携带自杀基因的ROBO1-EGFRt-CAR-NK细胞中自杀开关的有效性的实验结果图；
其中，ATCG427A-2h、ATCG427A-4h、ATCG427A-24h分别表示用AP1903诱导处理ATCG427A2h、4h和24h的结果，ATCG427B-1F7-2h、ATCG427B-1F7-4h、ATCG427B-1F7-24h分别表示用AP1903诱导处理ATCG427B-1F7 2h、4h和24h的结果，ATCG427B-2D5-2h、ATCG427B-2D5-4h、ATCG427B-2D5-24h分别表示用AP1903诱导处理ATCG427B-2D5 2h、4h和24h的结果；
T47D-2h、HCC1187-2h、MCF-2h、HepG2-2h、Huh7-2h、HCT116-2h、HCT116-Flag.ROBO1.Full-1C11-2h、HCT116-Flag.ROBO1.Full-1D11-2h、MDAMB-231-2h、MDAMB-231-Flag.ROBO1.Full-1C11-2h、MDAMB-231-Flag.ROBO1.Full-1D11-2h、均表示将对应的癌细胞诱导杀伤2h的癌细胞，其中，HCT116-Flag.ROBO1.Full-1C11-2h、HCT116-Flag.ROBO1.Full-1D11-2h分别表示过表达ROBO1的HCT116-ROBO1模型的不同克隆诱导杀伤两小时；MDAMB-231-Flag.ROBO1.Full-1C11-2h、MDAMB-231-Flag.ROBO1.Full-1D11-2h，分别表示过表达ROBO1的MDAMB-231-ROBO1模型的不同克隆诱导杀伤两小时。
具体实施方式
现在将参照附图来详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的方法和步骤的参数数值不限制本发明的范围。
以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。
对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法当被视为说明书的一部分。
除非特别指明，本文中的“NK细胞”包括“外周血NK细胞、NK92细胞和其他NK细胞”。
除非特别指明，本文中的“NK-92细胞”和“NK细胞”意义相同。
除非特别指明，本文中的“ROBO1 CAR-NK”是指“以ROBO1为靶点的嵌合抗原受体细胞，特别是一种以ROBO1为靶点的加强型CAR-T细胞和CAR-NK细胞”，且本文中出现的英文名称不区分大小写，如ROBO1、Robo1、robo1等表示的含义相同；Robo1 CAR-NK、Robo1-CAR NK表示的含义相同；其具体制备过程参见下述实施例。
除非特别指明，本文中的“ATCG427A”是指“ROBO1 CAR-NK细胞”或“ROBO1MCAR-NK”。
除非特别指明，本文中的“iCaspase9”、“iCas9”均是指“诱导自杀基因Caspase9”。
除非特别指明，本文中的“ROBO1-iCaspase9 CAR-NK细胞”是指“携带自杀基因的ROBO1CAR-NK细胞”。
除非特别指明，本文中的“ATCG427B”是指“携带自杀基因iCaspase9的ROBO1 CAR-NK细胞，即ROBO1-iCaspase9 CAR-NK细胞”。
除非特别指明，本文中的“FKBP12”是指“FKBP12-F36V”。
除非特别指明，本文中的“CMV”是指“CMV启动子”。
除非特别指明，本文中的“ATCG427E”是指“携带自杀基因EGFRt的ROBO1 CAR-NK细胞，即ROBO1-EGFRt CAR-NK细胞”。
除非特别指明，本文中的“ATCG427A-KO”是指“是用Crisp Cas9基因编辑的形式，敲除CAR中ROBO1-scFV靶点的基因序列，其它信号传导序列保留，再将其敲入NK92细胞中，即与427A中CAR同样的基因组插入位点上敲入没有ROBO1靶点的CAR序列的NK细胞”。
除非特别指明，本发明所述的“NK”为“人体正常NK细胞或NKT细胞或NK细胞系，其包括NK92细胞，YT细胞，NKL细胞，HANK-1细胞，NK-YS细胞，KHYG-1细胞，SNK-6细胞和IMC-1细胞等”。本发明的具体实施例中以NK92细胞为例进行说明。
除非特别指明，本文中的“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递分离的核酸至细胞内部。很多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两性分子化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应被解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等等。病毒载体的例子包括但不限于，腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体等等。
除非特别指明，本文中的“抗体”包括整个抗体及其任意抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或单链。
除非特别指明，本文中的试剂均为分析级纯，且可从正规渠道商购获得。
下述实施例中的材料来源：
NK-92细胞(CRL-2407)，乳腺癌BT474、T47D、HCC1187、HCC1937、MCF7、MDAMB-231、MDAMB-453、MDAMB-468、ZR-75-1；肺癌细胞A549、H1299；肝癌细胞Huh7、SMMC7721和HEPG2；胰腺癌细胞BxPC3、PANC1、Capan-2，及Lenti-X-293T细胞；结直肠癌如HT-29、LoVo和HCT116均购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。
实施例1.慢病毒载体的制备
分别合成ScFv(Anti ROBO1-FN3)-CD8(CD8TM)-4-1BB-CD3ζ融合基因序列(其氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，基因序列如SEQ ID NO：10所示)和突变型ScFv(Anti ROBO1-FN3)-CD8(CD8TM)-4-1BB-CD3ζ融合基因序列(其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，基因序列如SEQ ID NO：11所示，其突变位点GCC还可为GCG)。以ScFV(Anti ROBO1-FN3)-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合基因为例说明ROBO1 CAR-NK细胞的制备过程，突变型ScFV(Anti ROBO1-FN3)-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合基因制备ROBO1M CAR-NK细胞的过程与其相同。
通过酶切，将ScFv(Anti ROBO1-FN3)-CD8-4-1BB-CD3ζ融合基因序列转化连接到pRRLSIN载体中，基因上游为EF-1α启动子。载体转化Stbl3大肠杆菌菌株，氨苄青霉素筛选，获得阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定克隆，获得pRRLSIN-ScFv(anti ROBO1-FN3)慢病毒转染载体(如图1所示)。
实施例2.慢病毒的制备
(1)转染前24小时，以每皿约8×106个细胞将Lenti-X-293T细胞接种至15cm培养皿中。确保转染时细胞在80％左右的汇合度且均匀分布于培养皿中。
(2)准备溶液A和溶液B
溶液A：6.25ml 2×HEPES buffer缓冲液(5个大皿一起包装的量，效果最好)。
溶液B为分别加入以下质粒的混合物：112.5μg pRRLSIN-ScFv(anti ROBO1-FN3)(target plasmid)；39.5μg pMD2.G(VSV-G envelop)；73μg pCMVR8.74(gag，pol，tat，rev)；625μl 2M钙离子溶液。溶液B总体积：6.25ml。
充分混匀溶液B，轻轻涡旋溶液A的同时，逐滴加入溶液B，得到A和B的混合溶液，静置5-15分钟。轻轻涡旋上述A和B的混合溶液，逐滴加入含Lenti-X-293T细胞的培养皿中，每皿2.5ml，轻轻前后晃动培养皿使DNA与钙离子的混合物均匀分布，再将该培养皿(不要旋转培养皿)放置于培养箱中培养16-18小时。更换新鲜培养基，继续培养，分别在48小时和72小时后收集含病毒的上清液。500g，25℃离心10分钟。PES膜(0.45μm)过滤。将已过滤的含慢病毒的上清液转移至病毒超离管中。每管体积不超过管子体积2/3处，25000rpm，4℃离心2小时。小心取出离心管，倒掉上清液，倒置离心管去掉残余液体。加入100μl新鲜培养基，密封离心管，在4℃放置2小时，每20分钟轻轻涡旋一次，500g离心1分钟(25℃)，收集病毒上清。再将收集的病毒上清，冰上冷却后，置于-80℃保存。
实施例3.ROBO1 CAR-NK细胞的制备
将NK92细胞密度调整至(2～3)×105个/ml，按体积比(V/V)病毒：细胞培养基＝1:5比例添加实施例2制得的病毒，同时添加聚凝胺8μg/ml。4h之后，补加等量的新鲜的完全培养基将细胞密度调整至1×105个/ml继续培养。次日，将所有的细胞离心，加入新鲜的培养基，继续培养。每隔1～2天进行补液，使维持细胞密度在(2～3)×105个/ml。72h后进行CAR抗体染色，同时流式分选ROBO1 CAR NK-92阳性细胞并扩大培养。每天观察培养基的颜色变化、细胞密度、细胞形态并作相应记录。
流式分选后，阳性ROBO1 CAR NK-92细胞在GMP车间进行持续培养，将其扩增到临床使用所需计量后，进行离心和三次洗涤(PBS溶液)，最终将ROBO1 CAR-NK 92重悬在生理盐水中，用于临床治疗。
临床治疗前，参考药典的检测方法，对ROBO1 CAR-NK 92进行质量检测，保证细胞质量的安全性。检测结果如表1所示。
表1 ROBO1 CAR NK-92细胞质量检测
放行参数 GMP放行标准 实际检测结果
无菌检测(液体培养法) 阴性 阴性
无菌检测(革兰氏染色法) 阴性 阴性
细胞活率(台酚蓝染色) >95％ 98％
内毒素(鲎试剂法) <5EU/kg/h <5EU/kg/h
CAR阳性率(流式检测) >90％ 96.31％(见图3a-b)
支原体DNA(PCR法) 阴性 阴性
CD56+(流式检测) 阳性 阳性(见图4a-b)
利用流式检测CAR NK-92细胞阳性率，流式检测结果如图3a和图3b所示。图3a和图3b中，所采用的抗体为APC荧光标记，在横坐标上进行表示，NK-92细胞若成功表达CAR分子，该信号值将显著升高。从图3a和图3b中可以看出，APC荧光标记的信号值显著升高，表明NK-92细胞成功表达出CAR分子，CAR-NK92阳性率为98.89％。
图4a和图4b为ROBO1 CAR-NK流式检测CD56分子阳性率的结果图。图4a为对照组，图4b为实验组。从图4a和4b中可以看出，CD56分子为阳性，说明制备的CAR-NK92细胞未丢失CD56分子，未发生其它形式的分化，保存NK细胞的基本特性。
以同样的方法制备ROBO1M CAR-NK细胞。
实施例4.ROBO1-iCaspase9CAR-NK细胞的制备
合成iCaspase9自杀基因[SEQ ID NO:6:ATGGGAGTGCAGGTGGAAACCATCTCCCCAGGAGACGGGCGCACCTTCCCCAAGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAAGTTGATTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCTAGGCAAGCAGGAGGTGATCCGAGGCTGGGAAGAAGGGGTTGCCCAGATGAGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTATGGTGCCACTGGGCACCCAGGCATCATCCCACCACATGCCACTCTCGTCTTCGATGTGGAGCTTCTAAAACTGGAA(FKBP12-F36V:SEQ ID NO:1)TCCGGAGGAGGATCCGGAGTCGAC(Linker:SEQ ID NO:3)GGATTTGGTGATGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAATGTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACATCGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGCTGGCGCAGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTCTCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGGGACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGGCCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTTCCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCCCACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACATCTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGTCGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTTAATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCA(ΔCasepase9：SEQ ID NO:2)GAATTCGGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGA ATCCTGGCCCA(T2A：SEQ ID NO:5)ATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATAACGCTGTGCTGCAGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAACTCAGCCTGGGGCTGCCAGGCCTGGGAATCCACATGAGGCCCCTGGCCATCTGGCTTTTCATCTTCAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCAGGACCTCACCATGGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGAGACGGGTCTGTTGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTATTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCAGTACTATGGCACTGGCTGCTGAGGACTGGTGGCTGGAAGGTCTCAGCTGTGACTTTGGCTTATCTGATCTTCTGCCTGTGTTCCCTTGTGGGCATTCTTCATCTTCAAAGAGCCCTGGTCCTGAGGAGGAAAAGAAAGCGAATGACTGACCCCACCAGGAGATTCTTCAAAGTGACGCCTCCCCCAGGAAGCGGGTGA(CD19：SEQ ID NO:4)]，再将其克隆至慢病毒载体中，得到携带有iCaspase9自杀基因的慢病毒质粒载体(1942-3-IC9)(如图2所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)，再通过三质粒系统(辅助质粒pMD2.G和pCMVR8.74)包装病毒(包装病毒的核苷酸序列为SEQ ID NO:7所示)，然后通过病毒侵染的方式侵染实施例3制得的ROBO1CAR-NK细胞(或ROBO1M CAR-NK细胞，以下实施例所用的为ROBO1M CAR-NK细胞)，然后通过流式分选出ROBO1和iCaspase9双阳的细胞，即携带自杀基因的ROBO1CAR-NK细胞(ROBO1-iCaspase9 CAR-NK细胞)，并将筛选的细胞进行培养，然后将培养后的细胞通过流式检测携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞的阳性率，结果如图5所示，从图中可以看出，APC和PE荧光标记的信号值均显著升高，成功获得携带自杀基因的ROBO1CAR-NK细胞(即ROBO1-iCaspase9 CAR-NK细胞)。
此外，还提取培养后的ROBO1-iCaspase9CAR-NK细胞的RNA，对自杀基因片段进行RT-PCR mRNA水平的检测，同时将NK-92细胞和ROBO1 CAR-NK细胞作为对照，结果如图6所示，从图中可以看出携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞(ROBO1-iCaspase9CAR-NK细胞)在mRNA水平上可以得到验证。
实施例5.ROBO1-iCaspase9CAR-NK细胞的测序
将实施例4制得的ROBO1-iCaspase9CAR-NK细胞进行全基因组测序，检测其在NK-92细胞基因组中的插入位点，测序结果如图7所示，后经PCR方法验证测序结果表明，iCaspase9基因插入了2号染色体，ROBO1基因插入了10号染色体。
实施例6.ROBO1-iCaspase9 CAR-NK细胞的稳定性筛选
将实施例4构建的ROBO1-iCaspase9CAR-NK细胞进行培养，不同克隆的ROBO1-iCaspase9CAR-NK细胞分别命名为ATCG427B-1D11、ATCG427B-1E1、ATCG427B-1F5、ATCG427B-1F7、ATCG427B-1F9、ATCG427B-2C3、ATCG427B-2D5，然后通过流式检测这些细胞中标签抗体Flag和CD19的阳性率(具体地,分别用流式抗体Flag和CD19对细胞进行避光染色15min后，PBS清洗两遍，上机检测)，作为细胞的稳定性的指标，结果如图8所示。
分别将不同量的AP1903药物加入实施例4制得的ROBO1-iCaspase9CAR-NK细胞(AP1903药物的终浓度为0nM和10nM)中处理4h，检测其对ROBO1-iCaspase9CAR-NK细胞凋亡的影响，结果如图9所示。
从上述图8-9可以看出，ATCG427B-1F7和2D5是体外比较稳定以及安全性比较好的两株亚克隆。
再将通过流式检测阳性率后的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞挑选出两株最好的亚克隆进行后续实验以及连续培养，以及同时对这两株亚克隆细胞进行测序验证，测序结果正确；最后将鉴定后的亚克隆通过流式分别检测ROBO1和iCaspase 9的阳性率，结果如图10a-10b所示，从图中可以看出ATCG427B-1F7和2D5是筛选的稳定的两株亚克隆。
实施例7.AP1903药物诱导ROBO1-iCaspase9CAR-NK细胞凋亡的检定
将不同量的AP1903药物加入实施例6筛选后的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞(ATCG427B-1F7和2D5)中，检测其对携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞(记为ATCG427B)凋亡的影响，同时将AP1903药物加入ROBO1 CAR-NK细胞中作为对照，分为三个实验组，即不同浓度的AP1903药物(0nM、10nM、50nM)处理2h、4h和24h的细胞，然后检测细胞凋亡的情况，结果如图11所示；并将分别处理4h和24h后的实验组，换新鲜培养基继续培养，三天后统计细胞活率，结果如图12所示；此外，还将处理4h后的0nM、10nM实验组，换新鲜培养基培养24h后拍照，结果如图13所示。
从图11可以看出，AP1903药物在体外10nM的浓度下处理细胞2h，ROBO1-iCaspase9细胞即可以达到60％的凋亡效率，4h达到80％，24h细胞95％以上凋亡，而ROBO1CAR-NK细胞基本没有凋亡。
从图12可以看出，AP1903药物处理后，ROBO1CAR-NK细胞的存活率在80％以上，而本发明的ROBO1-iCaspase9 CAR-NK细胞基本上全部凋亡。
从图13可以看出，10nM的AP1903药物处理后，24h观察，细胞基本上已凋亡。
上述结果说明，AP1903药物在24小时内能够有效杀伤ROBO1-iCaspase9CAR-NK细胞，而对ROBO1CAR-NK细胞没有作用，说明将ROBO1-iCaspase9CAR-NK细胞用于治疗癌症，能够在AP1903药物诱导下细胞发生凋亡，从而可以更好地控制CAR-NK细胞，进一步增加临床上的安全性。
实施例8.不同乳腺癌细胞株中ROBO1表达的检测
将不同的乳腺癌细胞BT474、T47D、HCC1187、HH1937、HCC38、MCF7、MDAMB-231、MDAMB-453、MDAMB-468和ZR-75-1培养后，然后通过Western Blot检测不同乳腺癌细胞中ROBO1的表达情况，结果如图14a所示，并通过ImageJ软件分析Western Blot测定的ROBO1的光密度与对照GAPDH的光密度的比值，结果如图14b所示。
结果表明，ROBO1在不同的乳腺癌细胞株中的表达有所差异，其中，在T47D中的表达量最高。
实施例9.ROBO1-iCaspase9 CAR-NK细胞杀伤试验
1.携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞用于乳腺癌细胞的杀伤
利用CFSE染色方法(参见：A Mathematical Model of Natural Killer CellActivity,Anna Scherbakova,1,2Helen Lust,1,2Hele Everaus,1,2,3Alar Aints1,2,4*)检测实施例5筛选的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞(ATCG427B-1F7、ATCG427B-2D5)的杀伤效果，同时用ROBO1 CAR-NK和NK-92细胞作为对照，不同的乳腺癌细胞包括BT474、T47D、HCC1187、HCC1937、MCF7、MDAMB-231、MDAMB-453、MDAMB-468和ZR-75-1。
实验操作方法如下：
(1)提前处理靶细胞，按照1×106个细胞加入1μl的CFSE，避光培养箱中孵育15min，10％的BSA终止，PBS清洗两次，在24孔板中加入配制好的500μl肿瘤细胞悬液(8×104个细胞/孔)。将培养板在培养箱预培养12h。
(2)按照效应细胞与靶细胞为0.5:1和1:1的比例加入500μl的效应细胞，每个实验置三个复孔，效应细胞与靶细胞共孵育2小时。
(3)2小时后，吸取上清转移到1.5的EP管中，同时每孔加入200μl的胰酶，消化1min后，用对应转移出来的上清吹打细胞，离心，PBS重悬，加入1ul的7-AAD，避光孵育15min，上机检测。
(4)杀伤率＝(靶细胞的杀伤率-自发死亡率)/(1-自发死亡率)×100％；
结果如图15所示，从图中可以看出，不同的癌细胞体外杀伤效果不同，ROBO1表达量高的细胞杀伤效果比较好，如T47D细胞；而ROBO1不表达的细胞如HCC1937的杀伤效果比较差；而MDAMB-231中虽然表达了ROBO1，但是杀伤效果相对较差，可能原因如下：一是MDAMB-231本身表达ROBO1蛋白比较低；二是MDAMB-231细胞中高表达PDL1分子，在杀伤过程中PD1-PD-L1信号通路会抑制效应细胞的杀伤；三是MDAMB-231本身中MICA/B基本上不表达，而NK细胞发挥杀伤作用一部分要依赖于活化性的受体比如NKG2D与配体MICA/B结合来发挥效果，所以MICA/B的不表达也会减弱对MDAMB-231细胞的杀伤；另外，还有可能有其它的免疫机制调控效应细胞对MDAMB-231的杀伤。总之，ROBO1-iCaspase9CAR-NK细胞对MDAMB-231细胞杀伤调控的机制还有待于进一步的验证。
因此，上述实验结果说明，本发明的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞用于杀伤，其特异性杀伤效果与ROBO1表达水平呈正相关。
2.携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞用于不同癌细胞的杀伤
用与上述1中同样的方法杀伤其它类型不同的肿瘤细胞2h，检测实施例5筛选的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞(ATCG427B-1F7、ATCG427B-2D5)对不同肿瘤细胞的杀伤效果，不同的肿瘤细胞包括肺癌细胞A549、H1299；肝癌细胞Huh7、SMMC7721；胰腺癌细胞BxPC3、PANC1、Capan-2培养，然后进行杀伤，结果如图16a-c所示，从图中可以看出，ROBO1-iCaspase9细胞对肺癌和肝癌的杀伤效果比较好。
3.携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞对正常乳腺细胞和PBMC的杀伤
随机选3个正常人，每人抽取50ml新鲜血液，用PBS进行1:1的稀释，取新的离心管加入Ficoll(淋巴细胞分离液)，管倾斜45度，将稀释好的血液按照Ficoll：血液为2:1的比例缓慢加入到Ficoll液面上方，离心2000rpm，30min后将移液管直接插入云雾层，轻轻吸出云雾层(即单个核细胞层)，放入到新的离心管中，进行洗涤，弃上清，加1ml RPMI-1640培养基，吹打混匀，制备成PBMC细胞悬液，并将其分别记为PBMC-1、PBMC-2、PBMC-3，检测正常乳腺细胞和PBMC中的ROBO1表达情况，结果如图17a所示；并且用与上述1中同样的方法，检测ROBO1-iCaspase9细胞对PBMC-1、PBMC-2、PBMC-3和MDA-kb2正常乳腺细胞的杀伤效率，并且在杀伤过程中同时比较NK92和ROBO1 CAR-NK对PBMC-1、PBMC-2、PBMC-3和MDA-kb2细胞的杀伤率，结果如图17b所示，从图中可以看出，ROBO1-iCaspase9CAR-NK细胞体外对正常乳腺和PBMC杀伤不显著；从而进一步证明了携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞药物的安全性。
4.PBMC对携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞的杀伤
考虑到ROBO1 CAR-NK细胞作为异体细胞输注人体内后，可能体内PBMC免疫细胞会对异体来源的细胞发挥杀伤的效果。为了验证ROBO1 CAR-NK细胞是否会被PBMC清除，在体外，随机选3个正常人，取血，通过分离后制得PBMC细胞(制备方法同上)，分别记为PBMC-4、PBMC-5、PBMC-6，并且用与上述1中同样的方法检测PBMC-4、PBMC-5、PBMC-6对ROBO1-iCaspase9CAR-NK细胞的杀伤并且在每组实验中同时对比PBMC对NK92和ROBO1 CAR-NK细胞的杀伤，结果如图18所示，从图18可以看出，PBMC体外对ROBO1-iCaspase9细胞的杀伤也不显著；从而进一步证明了携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞药物在体内可以更好地去发挥特异性杀伤的作用。
上述实验结果说明，本发明的ROBO1-iCaspase9 CAR-NK细胞的杀伤效果与ROBO1CAR-NK细胞的杀伤效果相当，能够有效地杀伤肿瘤细胞，而且相比CAR-T细胞毒性小，杀伤效果好；并且由于增加了自杀基因(iCaspase9开关原件)，能够进一步提高安全性；此外，还通过实验表明该细胞对正常细胞没有杀伤，正常细胞对该细胞也没有杀伤，从而进一步说明ROBO1-iCaspase9 CAR-NK细胞的安全性。
实施例10.ROBO1-EGFRt-CAR-NK细胞的制备及单克隆细胞株的筛选
合成EGFRt自杀基因TCTAGAATGTTGCTGCTTGTAACTTCTCTCCTTCTTTGCGAGTTGCCCCATCCTGCGTTCCTCCTTATTCCCAGGAAGGTATGCAATGGGATCGGTATAGGAGAGTTCAAGGATTCCCTTTCTATCAACGCTACGAATATAAAGCACTTCAAGAACTGTACGTCCATCAGTGGAGACCTGCATATATTGCCGGTGGCGTTCCGAGGGGACAGTTTTACCCACACGCCCCCTCTCGACCCACAGGAGCTGGATATCTTGAAGACCGTGAAGGAGATAACTGGCTTTCTTCTCATTCAGGCGTGGCCGGAAAATAGGACAGACTTGCACGCCTTTGAAAACTTGGAAATTATACGAGGGCGGACAAAACAACACGGTCAATTCAGCCTGGCCGTTGTATCCCTCAATATCACTAGCTTGGGTCTCCGAAGTCTGAAAGAAATAAGTGACGGGGACGTTATAATTTCTGGGAACAAGAACCTCTGCTACGCAAACACAATAAACTGGAAAAAATTGTTTGGAACTAGCGGGCAGAAAACTAAGATCATTAGTAACAGAGGCGAGAATAGTTGCAAAGCCACCGGACAAGTGTGCCATGCACTTTGCAGCCCCGAGGGTTGTTGGGGCCCTGAACCACGGGATTGCGTGTCATGCAGAAACGTCTCACGAGGTCGCGAGTGTGTCGACAAATGTAACCTGCTTGAAGGGGAGCCTCGCGAATTCGTAGAAAACAGCGAGTGCATTCAATGCCACCCAGAGTGTCTCCCCCAGGCCATGAACATCACCTGTACAGGACGGGGGCCAGATAACTGTATTCAATGCGCACACTATATAGATGGACCACATTGTGTGAAAACATGTCCCGCAGGGGTCATGGGTGAGAACAACACGCTCGTTTGGAAATATGCAGATGCCGGGCATGTATGCCACCTCTGTCACCCGAACTGCACTTATGGGTGCACTGGGCCCGGCCTGGAAGGATGCCCCACCAACGGACCCAAGATTCCCTCCATAGCGACCGGAATGGTTGGAGCCTTGCTTCTTCTTCTGGTAGTGGCGCTCGGGATCGGGTTGTTCATGTAAGGATCC(SEQ ID NO:12，其中首末斜体带下划线的部分为酶切位点)(其简化结构如图20所示)，再将其克隆至慢病毒载体中，得到如图19所示的慢病毒载体(我们称之为1942-3-hEGFRt)(其核苷酸序列为SEQ ID NO:13所示)，再通过三质粒系统(辅助质粒pMD2.G和pCMVR8.74)包装病毒，然后通过病毒侵染的方式侵染实施例3制得的ROBO1CAR-NK细胞(或ROBO1M CAR-NK细胞，以下实施例所用的为ROBO1MCAR-NK细胞)，然后通过流式分选出ROBO1和EGFRt双阳的细胞，即携带自杀基因的ROBO1CAR-NK细胞(ROBO1-EGFRt CAR-NK细胞，也称为427E)，并将筛选的细胞进行单克隆筛选培养，然后将培养后的细胞通过流式检测携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞的阳性率，结果如图21a-b所示，从图中可以看出，APC和PE荧光标记的信号值均显著升高，成功筛选得到两株携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK单克隆细胞(即ROBO1-EGFRt CAR-NK细胞，即427E)，分别命名为ROBO1-EGFRt-3C10-2D10和ROBO1-EGFRt-3C10-1F11(也分别称为427E-3C10-2D10和427E-3C10-1F11)，这两株单克隆细胞的母克隆为ROBO1-EGFRt-3C10(427E-3C10)。
实施例11.ROBO1-EGFRt-CAR-NK细胞的杀伤实验
对实施例10制得的单克隆细胞株和这两个单克隆细胞株的母克隆进行了肿瘤特异性杀伤的实验，实验过程如下：首先通过Western检测了除了乳腺癌细胞类型外其它不同类型癌细胞中的ROBO1蛋白表达水平，具体步骤为：搜集不同的癌细胞株，提取总蛋白进行裂解，用BCA试剂盒对总蛋白进行定量，随后SDS-PAGE胶进行ROBO1蛋白的电泳，转膜，最后通过显影对ROBO1蛋白进行检测，部分乳腺癌细胞中ROBO1的表达情况，参照图14a中的检测结果，而结直肠癌如HT-29、LoVo和HCT116，肝癌如SMMC7721、Huh7和HEPG2的检测结果如图22所示，结果显示不同类型的癌细胞中ROBO1蛋白的表达确实有明显的区别。
取不同的癌细胞，包括T47D、HCC1187、MCF7、HepG2和Huh7进行培养，同时培养ROBO1-EGFRt-3C10，ROBO1-EGFRt-3C10-2D10和ROBO1-EGFRt-3C10-1F11，分别按照效靶为0.5：1和1：1在体外杀伤2小时，并且添加NK92和427A作为对照组，其中HCC1187、MCF7、HepG2的杀伤实验还增设427A-KO实验组(427A-KO是用Crisp Cas9基因编辑的形式，敲除CAR中ROBO1-scFV靶点的基因序列，其它信号传导序列保留，再将其敲入NK92细胞中，即与427A中CAR同样的基因组插入位点上敲入没有ROBO1靶点的CAR序列的NK细胞)，按照中检院《免疫细胞治疗制剂体外杀伤效力评价方法的分析研究》RTCASystems实时细胞分析系统是一种新型的细胞检测系统艾森，结果如图23a所示，通过杀伤分析可以发现，ROBO1-EGFRt-CAR-NK细胞表现了较强的杀伤效果，其对实体瘤的杀伤效果很明显，并且该细胞的特异性杀伤效果与ROBO1表达水平呈正相关，从而证明了ROBO1-EGFRt CAR-NK细胞药物的有效性。
同时，为了证明ROBO1 CAR的特异性，在体外我们也构建了过表达ROBO1的单克隆细胞株(HCT116-ROBO1)模型，并用HCT116作为对照，然后按照上述方法进行杀伤实验，结果如图23b所示，从图中可以看出，在野生型的HCT116中，可以看出427E杀伤比NK92杀伤稍有增强，其中427A-KO敲除ROBO1靶点后，与NK92、427A无差异；但在过表达ROBO1的HCT116单克隆细胞株中，427A-KO相比较427A和E杀伤明显减弱；同时427E在过表达HCT116细胞株中的杀伤也比野生型的HCT116杀伤活性明显增强，从而有效地证明了本发明的ROBO1-EGFRt-CAR-NK细胞中的ROBO1的靶向性与特异性。
此外，还用同样的方法构建了过表达ROBO1的单克隆细胞株(MDAMB-231-ROBO1)模型，并用MDAMB-231作为对照组，然后按照上述方法进行杀伤实验，结果如图23c所示，相比MDAMB-231作为对照组，过表达ROBO1的单克隆细胞株(MDAMB-231-ROBO1)模型的杀伤活性和特异性明显增强。
实施例12.ROBO1-EGFRt-CAR-NK细胞的安全性实验
安全性研究是考察ROBO1-EGFRt CAR-NK细胞对自杀开关诱导物(西妥昔单抗)在杀伤/效应细胞存在下的敏感程度。我们通过诱导剂西妥昔单抗诱导ROBO1-EGFRt CAR-NK细胞(实施例10制得的单克隆细胞株和这两个单克隆细胞株的母克隆)凋亡，并添加通过体外构建的NK92-CD16(高亲和力)效应细胞，从而来评价自杀开关的有效性。分别通过对效应细胞作用浓度、效靶比例、作用时间、作用体系等方面进行考察。最终得出的诱导物西妥昔单抗的最优化的作用条件为体外作用4小时，作用浓度为1μg/ml，NK92-CD16(高亲和力)与ROBO1-EGFRt CAR-NK细胞的效靶比例为25:1(E:T)，检测方法为CFSE(参见：AMathematical Model of Natural Killer Cell Activity,Anna Scherbakova,1,2HelenLust,1,2Hele Everaus,1,2,3 Alar Aints1,2,4*)，通过7-AAD/CFSE双染检测细胞凋亡效率。具体方法为：提前将构建的NK92-CD16效应细胞用CFSE进行标记，然后按照效靶比例将ROBO1-EGFR CAR-NK和NK92-CD16细胞进行铺板后，分别加入作用浓度为0、1和10μg/ml的西妥昔单抗，作用4小时后，通过7-AAD染色10min，然后通过流式细胞仪进行检测(三次平行重复实验)。检测结果如图24所示，从结果可以看出，在筛选的亚克隆细胞株中，被西妥昔单抗诱导的凋亡效率在40％～50％之间。
为了更好地模拟体内ADCC的作用机制，从而更准确地评价自杀开关的有效性，在体外，我们抽取了2位正常人来源的外周血，进行了PBMC的分离，分别记为PBMC-ZF和PBMC-CQ。按照上述实验方法与条件，将PBMC-ZF和PBMC-CQ与NK92/427A/427E细胞株共孵育，同时加入西妥昔单抗(作用浓度分别为0、1和10μg/ml)，效靶比为25：1，作用4小时后流式检测在西妥昔单抗的作用下，427E细胞株被PBMC杀伤的效率(见图25)。从结果中可以看出，在同等效靶比例和作用浓度下，不同人的PBMC诱导细胞杀伤的效率会有所差异，是由于不同人的免疫细胞成分和功能有所差异所造成。但是427E与427A、NK92细胞相比，诱导细胞杀伤的效率明显增强。整体而言，在PBMC作为效应细胞(效靶比例为25:1)，ATCG427E-3C10-1F11和ATCG427E-3C10-2D10被西妥昔单抗(作用浓度为1μg/ml)诱导的凋亡效率在30％～40％之间，稍差于NK92-CD16作为效应细胞时诱导的凋亡效率，这也与现有文献以及专利报道的数据相一致，甚至我们的作用效果要更加明显。
综上，通过体外对ADCC作用效果的评价可以看出，无论NK92-CD16还是PBMC作为杀伤/效应细胞，都可以被西妥昔单抗有效地诱导427E启动自杀开关元件，从而引起细胞的死亡，增加细胞的可控性。
上述实验结果表明，首先，本发明的无论是ROBO1-iCaspase9 CAR-NK还是ROBO1-EGFRt CAR-NK细胞的杀伤效果与ROBO1 CAR-NK细胞的杀伤效果相当，相比NK92细胞，特异性杀伤效果显著增强，能够有效地靶向肿瘤细胞进行杀伤；其次，CAR-NK细胞相比CAR-T细胞毒性小，作用时间短，杀伤效果快；最后，由于本发明的CAR-NK细胞中还增加了自杀基因(如iCaspase9或EGFRt诱导自杀开关原件)，能够进一步提高CAR-NK细胞的安全性和可控性，使得临床用药更加安全可控。
本发明的描述是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显然的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。
序列表
<110> 阿思科力（苏州）生物科技有限公司
<120> 携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞及其制备方法和应用
<130> 1047
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:1
<400> 1
atgggagtgc aggtggaaac catctcccca ggagacgggc gcaccttccc caagcgcggc 60
cagacctgcg tggtgcacta caccgggatg cttgaagatg gaaagaaagt tgattcctcc 120
cgggacagaa acaagccctt taagtttatg ctaggcaagc aggaggtgat ccgaggctgg 180
gaagaagggg ttgcccagat gagtgtgggt cagagagcca aactgactat atctccagat 240
tatgcctatg gtgccactgg gcacccaggc atcatcccac cacatgccac tctcgtcttc 300
gatgtggagc ttctaaaact ggaa 324
<210> 2
<211> 846
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:2
<400> 2
ggatttggtg atgtcggtgc tcttgagagt ttgaggggaa atgcagattt ggcttacatc 60
ctgagcatgg agccctgtgg ccactgcctc attatcaaca atgtgaactt ctgccgtgag 120
tccgggctcc gcacccgcac tggctccaac atcgactgtg agaagttgcg gcgtcgcttc 180
tcctcgctgc atttcatggt ggaggtgaag ggcgacctga ctgccaagaa aatggtgctg 240
gctttgctgg agctggcgca gcaggaccac ggtgctctgg actgctgcgt ggtggtcatt 300
ctctctcacg gctgtcaggc cagccacctg cagttcccag gggctgtcta cggcacagat 360
ggatgccctg tgtcggtcga gaagattgtg aacatcttca atgggaccag ctgccccagc 420
ctgggaggga agcccaagct ctttttcatc caggcctgtg gtggggagca gaaagaccat 480
gggtttgagg tggcctccac ttcccctgaa gacgagtccc ctggcagtaa ccccgagcca 540
gatgccaccc cgttccagga aggtttgagg accttcgacc agctggacgc catatctagt 600
ttgcccacac ccagtgacat ctttgtgtcc tactctactt tcccaggttt tgtttcctgg 660
agggacccca agagtggctc ctggtacgtt gagaccctgg acgacatctt tgagcagtgg 720
gctcactctg aagacctgca gtccctcctg cttagggtcg ctaatgctgt ttcggtgaaa 780
gggatttata aacagatgcc tggttgcttt aatttcctcc ggaaaaaact tttctttaaa 840
acatca 846
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:3
<400> 3
tccggaggag gatccggagt cgac 24
<210> 4
<211> 1032
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:4
<400> 4
atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60
gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataacg ctgtgctgca gtgcctcaag 120
gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 180
ttcttaaaac tcagcctggg gctgccaggc ctgggaatcc acatgaggcc cctggccatc 240
tggcttttca tcttcaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 300
cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 360
ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc 420
tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc 480
aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag cctccgtgtc tcccaccgag ggacagcctg 540
aaccagagcc tcagccagga cctcaccatg gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt 600
ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag 660
gggcctaagt cattgctgag cctagagctg aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg 720
gtaatggaga cgggtctgtt gttgccccgg gccacagctc aagacgctgg aaagtattat 780
tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc cacctggaga tcactgctcg gccagtacta 840
tggcactggc tgctgaggac tggtggctgg aaggtctcag ctgtgacttt ggcttatctg 900
atcttctgcc tgtgttccct tgtgggcatt cttcatcttc aaagagccct ggtcctgagg 960
aggaaaagaa agcgaatgac tgaccccacc aggagattct tcaaagtgac gcctccccca 1020
ggaagcgggt ga 1032
<210> 5
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:5
<400> 5
gaattcggca gtggagaggg cagaggaagt ctgctaacat gcggtgacgt cgaggagaat 60
cctggccca 69
<210> 6
<211> 2295
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:6
<400> 6
atgggagtgc aggtggaaac catctcccca ggagacgggc gcaccttccc caagcgcggc 60
cagacctgcg tggtgcacta caccgggatg cttgaagatg gaaagaaagt tgattcctcc 120
cgggacagaa acaagccctt taagtttatg ctaggcaagc aggaggtgat ccgaggctgg 180
gaagaagggg ttgcccagat gagtgtgggt cagagagcca aactgactat atctccagat 240
tatgcctatg gtgccactgg gcacccaggc atcatcccac cacatgccac tctcgtcttc 300
gatgtggagc ttctaaaact ggaatccgga ggaggatccg gagtcgacgg atttggtgat 360
gtcggtgctc ttgagagttt gaggggaaat gcagatttgg cttacatcct gagcatggag 420
ccctgtggcc actgcctcat tatcaacaat gtgaacttct gccgtgagtc cgggctccgc 480
acccgcactg gctccaacat cgactgtgag aagttgcggc gtcgcttctc ctcgctgcat 540
ttcatggtgg aggtgaaggg cgacctgact gccaagaaaa tggtgctggc tttgctggag 600
ctggcgcagc aggaccacgg tgctctggac tgctgcgtgg tggtcattct ctctcacggc 660
tgtcaggcca gccacctgca gttcccaggg gctgtctacg gcacagatgg atgccctgtg 720
tcggtcgaga agattgtgaa catcttcaat gggaccagct gccccagcct gggagggaag 780
cccaagctct ttttcatcca ggcctgtggt ggggagcaga aagaccatgg gtttgaggtg 840
gcctccactt cccctgaaga cgagtcccct ggcagtaacc ccgagccaga tgccaccccg 900
ttccaggaag gtttgaggac cttcgaccag ctggacgcca tatctagttt gcccacaccc 960
agtgacatct ttgtgtccta ctctactttc ccaggttttg tttcctggag ggaccccaag 1020
agtggctcct ggtacgttga gaccctggac gacatctttg agcagtgggc tcactctgaa 1080
gacctgcagt ccctcctgct tagggtcgct aatgctgttt cggtgaaagg gatttataaa 1140
cagatgcctg gttgctttaa tttcctccgg aaaaaacttt tctttaaaac atcagaattc 1200
ggcagtggag agggcagagg aagtctgcta acatgcggtg acgtcgagga gaatcctggc 1260
ccaatgccac ctcctcgcct cctcttcttc ctcctcttcc tcacccccat ggaagtcagg 1320
cccgaggaac ctctagtggt gaaggtggaa gagggagata acgctgtgct gcagtgcctc 1380
aaggggacct cagatggccc cactcagcag ctgacctggt ctcgggagtc cccgcttaaa 1440
cccttcttaa aactcagcct ggggctgcca ggcctgggaa tccacatgag gcccctggcc 1500
atctggcttt tcatcttcaa cgtctctcaa cagatggggg gcttctacct gtgccagccg 1560
gggcccccct ctgagaaggc ctggcagcct ggctggacag tcaatgtgga gggcagcggg 1620
gagctgttcc ggtggaatgt ttcggaccta ggtggcctgg gctgtggcct gaagaacagg 1680
tcctcagagg gccccagctc cccttccggg aagctcatga gccccaagct gtatgtgtgg 1740
gccaaagacc gccctgagat ctgggaggga gagcctccgt gtctcccacc gagggacagc 1800
ctgaaccaga gcctcagcca ggacctcacc atggcccctg gctccacact ctggctgtcc 1860
tgtggggtac cccctgactc tgtgtccagg ggccccctct cctggaccca tgtgcacccc 1920
aaggggccta agtcattgct gagcctagag ctgaaggacg atcgcccggc cagagatatg 1980
tgggtaatgg agacgggtct gttgttgccc cgggccacag ctcaagacgc tggaaagtat 2040
tattgtcacc gtggcaacct gaccatgtca ttccacctgg agatcactgc tcggccagta 2100
ctatggcact ggctgctgag gactggtggc tggaaggtct cagctgtgac tttggcttat 2160
ctgatcttct gcctgtgttc ccttgtgggc attcttcatc ttcaaagagc cctggtcctg 2220
aggaggaaaa gaaagcgaat gactgacccc accaggagat tcttcaaagt gacgcctccc 2280
ccaggaagcg ggtga 2295
<210> 7
<211> 9624
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:7
<400> 7
agcttaatgt agtcttatgc aatactcttg tagtcttgca acatggtaac gatgagttag 60
caacatgcct tacaaggaga gaaaaagcac cgtgcatgcc gattggtgga agtaaggtgg 120
tacgatcgtg ccttattagg aaggcaacag acgggtctga catggattgg acgaaccact 180
gaattgccgc attgcagaga tattgtattt aagtgcctag ctcgatacat aaacgggtct 240
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 300
aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 360
tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc 420
gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc 480
ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa 540
ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg 600
ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata 660
aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc 720
tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga 780
caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc 840
aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca 900
aaagtaagac caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg 960
agggacaatt ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga 1020
gtagcaccca ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata 1080
ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg 1140
acgctgacgg tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg 1200
ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag 1260
ctccaggcaa gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt 1320
tggggttgct ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt 1380
aataaatctc tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt 1440
aacaattaca caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag 1500
aatgaacaag aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata 1560
acaaattggc tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta 1620
agaatagttt ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta 1680
tcgtttcaga cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa 1740
gaaggtggag agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc tcgacggtat 1800
cggttaactt ttaaaagaaa aggggggatt ggggggtaca gtgcagggga aagaatagta 1860
gacataatag caacagacat acaaactaaa gaattacaaa aacaaattac aaaaattcaa 1920
aattttatcg atcacgagac tagcctcgag aagcttgata tcgaattcca ccgtgaggct 1980
ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag 2040
gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg 2100
tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag 2160
tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggta agtgccgtgt 2220
gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg gttatggccc ttgcgtgcct tgaattactt 2280
ccacctggct gcagtacgtg attcttgatc ccgagcttcg ggttggaagt gggtgggaga 2340
gttcgaggcc ttgcgcttaa ggagcccctt cgcctcgtgc ttgagttgag gcctggcctg 2400
ggcgctgggg ccgccgcgtg cgaatctggt ggcaccttcg cgcctgtctc gctgctttcg 2460
ataagtctct agccatttaa aatttttgat gacctgctgc gacgcttttt ttctggcaag 2520
atagtcttgt aaatgcgggc caagatctgc acactggtat ttcggttttt ggggccgcgg 2580
gcggcgacgg ggcccgtgcg tcccagcgca catgttcggc gaggcggggc ctgcgagcgc 2640
ggccaccgag aatcggacgg gggtagtctc aagctggccg gcctgctctg gtgcctggcc 2700
tcgcgccgcc gtgtatcgcc ccgccctggg cggcaaggct ggcccggtcg gcaccagttg 2760
cgtgagcgga aagatggccg cttcccggcc ctgctgcagg gagctcaaaa tggaggacgc 2820
ggcgctcggg agagcgggcg ggtgagtcac ccacacaaag gaaaagggcc tttccgtcct 2880
cagccgtcgc ttcatgtgac tccacggagt accgggcgcc gtccaggcac ctcgattagt 2940
tctcgagctt ttggagtacg tcgtctttag gttgggggga ggggttttat gcgatggagt 3000
ttccccacac tgagtgggtg gagactgaag ttaggccagc ttggcacttg atgtaattct 3060
ccttggaatt tgcccttttt gagtttggat cttggttcat tctcaagcct cagacagtgg 3120
ttcaaagttt ttttcttcca tttcaggtgt cgtgagctag cactagttct agaatgggag 3180
tgcaggtgga aaccatctcc ccaggagacg ggcgcacctt ccccaagcgc ggccagacct 3240
gcgtggtgca ctacaccggg atgcttgaag atggaaagaa agttgattcc tcccgggaca 3300
gaaacaagcc ctttaagttt atgctaggca agcaggaggt gatccgaggc tgggaagaag 3360
gggttgccca gatgagtgtg ggtcagagag ccaaactgac tatatctcca gattatgcct 3420
atggtgccac tgggcaccca ggcatcatcc caccacatgc cactctcgtc ttcgatgtgg 3480
agcttctaaa actggaatcc ggaggaggat ccggagtcga cggatttggt gatgtcggtg 3540
ctcttgagag tttgagggga aatgcagatt tggcttacat cctgagcatg gagccctgtg 3600
gccactgcct cattatcaac aatgtgaact tctgccgtga gtccgggctc cgcacccgca 3660
ctggctccaa catcgactgt gagaagttgc ggcgtcgctt ctcctcgctg catttcatgg 3720
tggaggtgaa gggcgacctg actgccaaga aaatggtgct ggctttgctg gagctggcgc 3780
agcaggacca cggtgctctg gactgctgcg tggtggtcat tctctctcac ggctgtcagg 3840
ccagccacct gcagttccca ggggctgtct acggcacaga tggatgccct gtgtcggtcg 3900
agaagattgt gaacatcttc aatgggacca gctgccccag cctgggaggg aagcccaagc 3960
tctttttcat ccaggcctgt ggtggggagc agaaagacca tgggtttgag gtggcctcca 4020
cttcccctga agacgagtcc cctggcagta accccgagcc agatgccacc ccgttccagg 4080
aaggtttgag gaccttcgac cagctggacg ccatatctag tttgcccaca cccagtgaca 4140
tctttgtgtc ctactctact ttcccaggtt ttgtttcctg gagggacccc aagagtggct 4200
cctggtacgt tgagaccctg gacgacatct ttgagcagtg ggctcactct gaagacctgc 4260
agtccctcct gcttagggtc gctaatgctg tttcggtgaa agggatttat aaacagatgc 4320
ctggttgctt taatttcctc cggaaaaaac ttttctttaa aacatcagaa ttcggcagtg 4380
gagagggcag aggaagtctg ctaacatgcg gtgacgtcga ggagaatcct ggcccaatgc 4440
cacctcctcg cctcctcttc ttcctcctct tcctcacccc catggaagtc aggcccgagg 4500
aacctctagt ggtgaaggtg gaagagggag ataacgctgt gctgcagtgc ctcaagggga 4560
cctcagatgg ccccactcag cagctgacct ggtctcggga gtccccgctt aaacccttct 4620
taaaactcag cctggggctg ccaggcctgg gaatccacat gaggcccctg gccatctggc 4680
ttttcatctt caacgtctct caacagatgg ggggcttcta cctgtgccag ccggggcccc 4740
cctctgagaa ggcctggcag cctggctgga cagtcaatgt ggagggcagc ggggagctgt 4800
tccggtggaa tgtttcggac ctaggtggcc tgggctgtgg cctgaagaac aggtcctcag 4860
agggccccag ctccccttcc gggaagctca tgagccccaa gctgtatgtg tgggccaaag 4920
accgccctga gatctgggag ggagagcctc cgtgtctccc accgagggac agcctgaacc 4980
agagcctcag ccaggacctc accatggccc ctggctccac actctggctg tcctgtgggg 5040
taccccctga ctctgtgtcc aggggccccc tctcctggac ccatgtgcac cccaaggggc 5100
ctaagtcatt gctgagccta gagctgaagg acgatcgccc ggccagagat atgtgggtaa 5160
tggagacggg tctgttgttg ccccgggcca cagctcaaga cgctggaaag tattattgtc 5220
accgtggcaa cctgaccatg tcattccacc tggagatcac tgctcggcca gtactatggc 5280
actggctgct gaggactggt ggctggaagg tctcagctgt gactttggct tatctgatct 5340
tctgcctgtg ttcccttgtg ggcattcttc atcttcaaag agccctggtc ctgaggagga 5400
aaagaaagcg aatgactgac cccaccagga gattcttcaa agtgacgcct cccccaggaa 5460
gcgggtgagt cgacaatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc 5520
ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg 5580
ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc 5640
tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg 5700
acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg 5760
ctttccccct ccctattgcc acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga 5820
caggggctcg gctgttgggc actgacaatt ccgtggtgtt gtcggggaag ctgacgtcct 5880
ttccatggct gctcgcctgt gttgccacct ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg 5940
tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc 6000
ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc 6060
cgcctggaat tcgagctcgg tacctttaag accaatgact tacaaggcag ctgtagatct 6120
tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta attcactccc aacgaagaca 6180
agatctgctt tttgcttgta ctgggtctct ctggttagac cagatctgag cctgggagct 6240
ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca 6300
agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc tggtaactag agatccctca gaccctttta 6360
gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtagtag ttcatgtcat cttattattc agtatttata 6420
acttgcaaag aaatgaatat cagagagtga gaggaacttg tttattgcag cttataatgg 6480
ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc 6540
tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggctct agctatcccg 6600
cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat 6660
ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc 6720
cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctagggacgt acccaattcg ccctatagtg 6780
agtcgtatta cgcgcgctca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg 6840
gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg 6900
aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatgggacg 6960
cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta 7020
cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt 7080
tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg 7140
ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat 7200
cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac 7260
tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag 7320
ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg 7380
cgaattttaa caaaatatta acgcttacaa tttaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg 7440
cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca 7500
ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt 7560
ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga 7620
aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga 7680
actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat 7740
gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca 7800
agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt 7860
cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac 7920
catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct 7980
aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga 8040
gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac 8100
aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat 8160
agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg 8220
ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc 8280
actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc 8340
aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg 8400
gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta 8460
atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg 8520
tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga 8580
tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt 8640
ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag 8700
agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa 8760
ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag 8820
tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca 8880
gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac 8940
cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa 9000
ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc 9060
agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg 9120
tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc 9180
ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc 9240
ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag 9300
ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa 9360
accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga 9420
ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc 9480
ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca 9540
atttcacaca ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag cgcgcaatta accctcacta 9600
aagggaacaa aagctggagc tgca 9624
<210> 8
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:8
<400> 8
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Ser Asn Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Lys Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn
100 105 110
Thr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gln
130 135 140
Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser
145 150 155 160
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val
165 170 175
Lys Leu Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Val Pro
180 185 190
Asn Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Asn Phe Arg Gly Lys Ala Thr
195 200 205
Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser
210 215 220
Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Ser Asn
225 230 235 240
Tyr Val Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Ile Thr Val
245 250 255
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
260 265 270
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
275 280 285
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
290 295 300
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
305 310 315 320
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
325 330 335
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
340 345 350
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
355 360 365
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
370 375 380
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
385 390 395 400
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
405 410 415
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
420 425 430
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
435 440 445
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
450 455 460
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470 475 480
<210> 9
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:9
<400> 9
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Ser Asn Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Lys Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn
100 105 110
Thr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gln
130 135 140
Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser
145 150 155 160
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val
165 170 175
Lys Leu Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Val Pro
180 185 190
Asn Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Asn Phe Arg Gly Lys Ala Thr
195 200 205
Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser
210 215 220
Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Ser Asn
225 230 235 240
Tyr Val Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Ile Thr Val
245 250 255
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
260 265 270
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
275 280 285
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
290 295 300
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
305 310 315 320
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
325 330 335
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
340 345 350
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
355 360 365
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
370 375 380
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
385 390 395 400
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
405 410 415
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
420 425 430
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
435 440 445
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
450 455 460
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470 475 480
<210> 10
<211> 1440
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:10
<400> 10
atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60
cccatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 120
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattttttaa actggtatca gcagaaacca 180
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacattctgg agtcccatca 240
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat ttttctctca ccattagcaa actggagcaa 300
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccacttac gttcggcgct 360
gggacaaagt tggaacttaa aggtggtggt ggttctggcg gcggcggctc cggaggagga 420
ggatcgctgc aacagtctgg acctgagttg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatttcc 480
tgcaaggctt ctggatacac attcactgac tactacatga attgggtgaa gcttagccat 540
ggaaagagcc ttgagtggat tggagatatt gttcctaaca atggtgatac tacttacaac 600
cagaatttca gaggcaaggc cacattgact gtagacaagt cctccagcac agcctacatg 660
gagctccgca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag attcagtaat 720
tacgtttacc cttttgacta ctggggccaa ggcaccacta tcacagtctc caccacgacg 780
ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc 840
ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc 900
tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg 960
gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca 1020
tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 1080
gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 1140
taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 1200
gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag 1260
aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 1320
gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 1380
ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1440
<210> 11
<211> 1440
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:11
<400> 11
atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60
cccatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 120
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattttttaa actggtatca gcagaaacca 180
gatggaactg ttaaactcct gatctacgcc acatcaagat tacattctgg agtcccatca 240
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat ttttctctca ccattagcaa actggagcaa 300
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccacttac gttcggcgct 360
gggacaaagt tggaacttaa aggtggtggt ggttctggcg gcggcggctc cggaggagga 420
ggatcgctgc aacagtctgg acctgagttg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatttcc 480
tgcaaggctt ctggatacac attcactgac tactacatga attgggtgaa gcttagccat 540
ggaaagagcc ttgagtggat tggagatatt gttcctaaca atggtgatac tacttacaac 600
cagaatttca gaggcaaggc cacattgact gtagacaagt cctccagcac agcctacatg 660
gagctccgca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag attcagtaat 720
tacgtttacc cttttgacta ctggggccaa ggcaccacta tcacagtctc caccacgacg 780
ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc 840
ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc 900
tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg 960
gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca 1020
tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 1080
gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 1140
taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 1200
gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag 1260
aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 1320
gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 1380
ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1440
<210> 12
<211> 1086
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:12
<400> 12
tctagaatgt tgctgcttgt aacttctctc cttctttgcg agttgcccca tcctgcgttc 60
ctccttattc ccaggaaggt atgcaatggg atcggtatag gagagttcaa ggattccctt 120
tctatcaacg ctacgaatat aaagcacttc aagaactgta cgtccatcag tggagacctg 180
catatattgc cggtggcgtt ccgaggggac agttttaccc acacgccccc tctcgaccca 240
caggagctgg atatcttgaa gaccgtgaag gagataactg gctttcttct cattcaggcg 300
tggccggaaa ataggacaga cttgcacgcc tttgaaaact tggaaattat acgagggcgg 360
acaaaacaac acggtcaatt cagcctggcc gttgtatccc tcaatatcac tagcttgggt 420
ctccgaagtc tgaaagaaat aagtgacggg gacgttataa tttctgggaa caagaacctc 480
tgctacgcaa acacaataaa ctggaaaaaa ttgtttggaa ctagcgggca gaaaactaag 540
atcattagta acagaggcga gaatagttgc aaagccaccg gacaagtgtg ccatgcactt 600
tgcagccccg agggttgttg gggccctgaa ccacgggatt gcgtgtcatg cagaaacgtc 660
tcacgaggtc gcgagtgtgt cgacaaatgt aacctgcttg aaggggagcc tcgcgaattc 720
gtagaaaaca gcgagtgcat tcaatgccac ccagagtgtc tcccccaggc catgaacatc 780
acctgtacag gacgggggcc agataactgt attcaatgcg cacactatat agatggacca 840
cattgtgtga aaacatgtcc cgcaggggtc atgggtgaga acaacacgct cgtttggaaa 900
tatgcagatg ccgggcatgt atgccacctc tgtcacccga actgcactta tgggtgcact 960
gggcccggcc tggaaggatg ccccaccaac ggacccaaga ttccctccat agcgaccgga 1020
atggttggag ccttgcttct tcttctggta gtggcgctcg ggatcgggtt gttcatgtaa 1080
ggatcc 1086
<210> 13
<211> 8431
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO:13
<400> 13
agcttaatgt agtcttatgc aatactcttg tagtcttgca acatggtaac gatgagttag 60
caacatgcct tacaaggaga gaaaaagcac cgtgcatgcc gattggtgga agtaaggtgg 120
tacgatcgtg ccttattagg aaggcaacag acgggtctga catggattgg acgaaccact 180
gaattgccgc attgcagaga tattgtattt aagtgcctag ctcgatacat aaacgggtct 240
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 300
aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 360
tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc 420
gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc 480
ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa 540
ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg 600
ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata 660
aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc 720
tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga 780
caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc 840
aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca 900
aaagtaagac caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg 960
agggacaatt ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga 1020
gtagcaccca ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata 1080
ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg 1140
acgctgacgg tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg 1200
ctgagggcta ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag 1260
ctccaggcaa gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt 1320
tggggttgct ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt 1380
aataaatctc tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt 1440
aacaattaca caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag 1500
aatgaacaag aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata 1560
acaaattggc tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta 1620
agaatagttt ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta 1680
tcgtttcaga cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa 1740
gaaggtggag agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc tcgacggtat 1800
cggttaactt ttaaaagaaa aggggggatt ggggggtaca gtgcagggga aagaatagta 1860
gacataatag caacagacat acaaactaaa gaattacaaa aacaaattac aaaaattcaa 1920
aattttatcg atcacgagac tagcctcgag aagcttgata tcgaattcca ccgtgaggct 1980
ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag 2040
gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg 2100
tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag 2160
tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggta agtgccgtgt 2220
gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg gttatggccc ttgcgtgcct tgaattactt 2280
ccacctggct gcagtacgtg attcttgatc ccgagcttcg ggttggaagt gggtgggaga 2340
gttcgaggcc ttgcgcttaa ggagcccctt cgcctcgtgc ttgagttgag gcctggcctg 2400
ggcgctgggg ccgccgcgtg cgaatctggt ggcaccttcg cgcctgtctc gctgctttcg 2460
ataagtctct agccatttaa aatttttgat gacctgctgc gacgcttttt ttctggcaag 2520
atagtcttgt aaatgcgggc caagatctgc acactggtat ttcggttttt ggggccgcgg 2580
gcggcgacgg ggcccgtgcg tcccagcgca catgttcggc gaggcggggc ctgcgagcgc 2640
ggccaccgag aatcggacgg gggtagtctc aagctggccg gcctgctctg gtgcctggcc 2700
tcgcgccgcc gtgtatcgcc ccgccctggg cggcaaggct ggcccggtcg gcaccagttg 2760
cgtgagcgga aagatggccg cttcccggcc ctgctgcagg gagctcaaaa tggaggacgc 2820
ggcgctcggg agagcgggcg ggtgagtcac ccacacaaag gaaaagggcc tttccgtcct 2880
cagccgtcgc ttcatgtgac tccacggagt accgggcgcc gtccaggcac ctcgattagt 2940
tctcgagctt ttggagtacg tcgtctttag gttgggggga ggggttttat gcgatggagt 3000
ttccccacac tgagtgggtg gagactgaag ttaggccagc ttggcacttg atgtaattct 3060
ccttggaatt tgcccttttt gagtttggat cttggttcat tctcaagcct cagacagtgg 3120
ttcaaagttt ttttcttcca tttcaggtgt cgtgagctag cactagttct agaatgttgc 3180
tgcttgtaac ttctctcctt ctttgcgagt tgccccatcc tgcgttcctc cttattccca 3240
ggaaggtatg caatgggatc ggtataggag agttcaagga ttccctttct atcaacgcta 3300
cgaatataaa gcacttcaag aactgtacgt ccatcagtgg agacctgcat atattgccgg 3360
tggcgttccg aggggacagt tttacccaca cgccccctct cgacccacag gagctggata 3420
tcttgaagac cgtgaaggag ataactggct ttcttctcat tcaggcgtgg ccggaaaata 3480
ggacagactt gcacgccttt gaaaacttgg aaattatacg agggcggaca aaacaacacg 3540
gtcaattcag cctggccgtt gtatccctca atatcactag cttgggtctc cgaagtctga 3600
aagaaataag tgacggggac gttataattt ctgggaacaa gaacctctgc tacgcaaaca 3660
caataaactg gaaaaaattg tttggaacta gcgggcagaa aactaagatc attagtaaca 3720
gaggcgagaa tagttgcaaa gccaccggac aagtgtgcca tgcactttgc agccccgagg 3780
gttgttgggg ccctgaacca cgggattgcg tgtcatgcag aaacgtctca cgaggtcgcg 3840
agtgtgtcga caaatgtaac ctgcttgaag gggagcctcg cgaattcgta gaaaacagcg 3900
agtgcattca atgccaccca gagtgtctcc cccaggccat gaacatcacc tgtacaggac 3960
gggggccaga taactgtatt caatgcgcac actatataga tggaccacat tgtgtgaaaa 4020
catgtcccgc aggggtcatg ggtgagaaca acacgctcgt ttggaaatat gcagatgccg 4080
ggcatgtatg ccacctctgt cacccgaact gcacttatgg gtgcactggg cccggcctgg 4140
aaggatgccc caccaacgga cccaagattc cctccatagc gaccggaatg gttggagcct 4200
tgcttcttct tctggtagtg gcgctcggga tcgggttgtt catgtaagga tccaccggtc 4260
gccaccagcg gccgcgtcga caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact 4320
ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg 4380
tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg 4440
ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg 4500
tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg 4560
actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc 4620
tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaagctg 4680
acgtcctttc catggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc 4740
tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct 4800
ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc 4860
gcctccccgc ctggaattcg agctcggtac ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg 4920
tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggctaatt cactcccaac 4980
gaagacaaga tctgcttttt gcttgtactg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct 5040
gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag 5100
tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac 5160
ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca gtagtagttc atgtcatctt attattcagt 5220
atttataact tgcaaagaaa tgaatatcag agagtgagag gaacttgttt attgcagctt 5280
ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac 5340
tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggctctagc 5400
tatcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc 5460
gccccatggc tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga 5520
gctattccag aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta gggacgtacc caattcgccc 5580
tatagtgagt cgtattacgc gcgctcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa 5640
aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt 5700
aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa 5760
tgggacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg 5820
accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc 5880
gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga 5940
tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt 6000
gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat 6060
agtggactct tgttccaaac tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat 6120
ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa 6180
tttaacgcga attttaacaa aatattaacg cttacaattt aggtggcact tttcggggaa 6240
atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 6300
tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc 6360
aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc 6420
acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt 6480
acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt 6540
ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg 6600
ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact 6660
caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg 6720
ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga 6780
aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg 6840
aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa 6900
tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac 6960
aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc 7020
cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca 7080
ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga 7140
gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta 7200
agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc 7260
atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 7320
cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 7380
cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 7440
cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 7500
tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 7560
tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 7620
ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 7680
aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 7740
cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 7800
ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 7860
agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 7920
ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 7980
acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg 8040
cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc 8100
gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa 8160
tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt 8220
ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt 8280
aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg 8340
gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta cgccaagcgc gcaattaacc 8400
ctcactaaag ggaacaaaag ctggagctgc a 8431

Claims (22)

1.一种携带自杀基因的核苷酸，包括编码嵌合抗原受体的基因和诱导自杀基因；所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区，所述的抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活NK细胞；
所述的跨膜结构域为CD8跨膜结构域；所述的共刺激信号传导区为4-1BB和CD3ζ胞内结构域；
所述嵌合抗原受体结构为ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ的融合蛋白，其中所述的ScFv能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的FN3结构域；所述ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；
所述诱导自杀基因为iCaspase9；
所述iCaspase9的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
2. 根据权利要求1所述的携带自杀基因的核苷酸，其特征在于，所述iCaspase9包括FKBP12-F36V和ΔCaspase9，所述FKBP12-F36V的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，所述ΔCaspase9的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。
3. 根据权利要求2所述的携带自杀基因的核苷酸，其特征在于，所述FKBP12-F36V和ΔCaspase9通过Linker连接，所述Linker的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。
4. 根据权利要求2所述的携带自杀基因的核苷酸，其特征在于，所述iCaspase9上还设有标签基因，所述标签基因为CD19；所述iCaspase9上还设有剪切基因，所述剪切基因为T2A；所述CD19的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述T2A的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
5. 根据权利要求1至4中所述的携带自杀基因的核苷酸，其特征在于，所述ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
6.一种携带自杀基因的构建体，包括权利要求1至5中任一项所述的核苷酸。
7. 根据权利要求6所述的构建体，其特征在于，当所述自杀基因为iCaspase9时，所述构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
8.一种携带自杀基因的嵌合抗原受体，由权利要求1至5中任一项所述的核苷酸编码。
9.一种携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞，所述细胞表达权利要求8所述的嵌合抗原受体。
10. 根据权利要求9所述的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞，其特征在于，所述的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞能够有效地杀伤或杀死肺癌细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞。
11.权利要求9或10所述的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞的制备方法，包括如下步骤：
（1）合成和扩增权利要求1至5中任一项所述的携带自杀基因的核苷酸中的自杀基因，并将所述核苷酸克隆到慢病毒表达载体上，得到携带自杀基因的慢病毒载体；
（2）再通过慢病毒包装细胞系和包括步骤（1）得到携带自杀基因的慢病毒载体的三质粒系统进行慢病毒的包装，得到携带自杀基因的慢病毒，然后通过所述携带自杀基因的慢病毒侵染ROBO1 CAR-NK细胞，使自杀基因整合到其基因组上，得到携带自杀基因的ROBO1CAR-NK细胞，即得。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述ROBO1CAR-NK细胞通过包括以下步骤的方法制得：
a. 合成和扩增编码所述嵌合抗原受体的核苷酸，并将所述核苷酸克隆到慢病毒表达载体上；
b. 利用慢病毒包装质粒和步骤a得到的慢病毒表达载体在包装细胞系中进行包装，从而制备慢病毒；
c. 利用步骤b得到的慢病毒感染NK细胞，得到ROBO1 CAR-NK细胞。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a包括：合成权利要求1-5中任一项所述的ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的编码核苷酸，得到含有ScFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的编码核苷酸的慢病毒载体。
14. 一种药物组合物，包含权利要求9或10所述的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞或权利要求11-13中任一项所述的方法制备的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括诱导物；当所述自杀基因为iCaspase9时，所述诱导物为AP1903或AP20187；所述诱导物的浓度为0～50nM。
16. 根据权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述携带自杀基因的ROBO1CAR-NK细胞与肿瘤细胞的效靶比为（0.5~5）：1。
17. 根据权利要求16所述的药物组合物，其特征在于，所述携带自杀基因的ROBO1CAR-NK细胞与肿瘤细胞的效靶比为（0.5~1）：1。
18.根据权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括辅料。
19. 权利要求9或10所述的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞，或权利要求11-13中任一项所述的方法制备的携带自杀基因的ROBO1 CAR-NK细胞在制备用于治疗癌症的药物中的应用，所述癌症为肝癌、乳腺癌或肺癌。
20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所述药物为瘤内施用剂型的药物。
21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述药物为瘤内注射剂型的药物。
22.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述药物为静脉输注剂型的药物。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113462652A (zh) * 2021-09-06 2021-10-01 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 细胞、免疫治疗产品、基因编辑方法、细胞制备方法及应用
WO2023078288A1 (en) * 2021-11-03 2023-05-11 Hangzhou Qihan Biotechnology Co., Ltd. Systems and methods for enhanced immunotherapies
CN113980907B (zh) * 2021-12-24 2022-03-15 山东兴瑞生物科技有限公司 一种抗flt3嵌合抗原受体修饰的t细胞及其在制备治疗aml药物中的应用
CN114921411A (zh) * 2022-03-08 2022-08-19 闫书印 一种nk细胞的培育方法及应用
CN115873133B (zh) * 2023-01-18 2023-09-29 汕头普罗凯融生物医药科技有限公司 一种用于治疗结肠癌的特异性识别抗原robo1的嵌合抗原受体

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015066551A2 (en) * 2013-10-31 2015-05-07 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modified hematopoietic stem/progenitor and non-t effector cells, and uses thereof
CN105907719A (zh) * 2016-04-18 2016-08-31 李华顺 Anti ROBO1 CAR-T细胞及其制备和应用
CN107365798A (zh) * 2017-07-13 2017-11-21 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 一种携带iCasp9自杀基因的CD19‑CAR‑T细胞及其应用
CN108341881A (zh) * 2018-01-31 2018-07-31 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 带安全开关的嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
CN108977453A (zh) * 2017-06-02 2018-12-11 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 一种以robo1为靶点的嵌合抗原受体细胞及其制备和应用
CN109136244A (zh) * 2018-08-31 2019-01-04 河北璋达生物科技有限公司 一种可诱导凋亡的携带检测标签的cd20嵌合抗原受体t淋巴细胞及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2010315243B2 (en) * 2009-11-03 2016-08-25 City Of Hope Truncated epidermal growth factor receptor (EGFRt) for transduced T cell selection
US20130071414A1 (en) * 2011-04-27 2013-03-21 Gianpietro Dotti Engineered cd19-specific t lymphocytes that coexpress il-15 and an inducible caspase-9 based suicide gene for the treatment of b-cell malignancies
US9434935B2 (en) * 2013-03-10 2016-09-06 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Modified caspase polypeptides and uses thereof
AU2015362748A1 (en) * 2014-12-15 2017-04-27 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for controlled elimination of therapeutic cells

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015066551A2 (en) * 2013-10-31 2015-05-07 Fred Hutchinson Cancer Research Center Modified hematopoietic stem/progenitor and non-t effector cells, and uses thereof
CN105907719A (zh) * 2016-04-18 2016-08-31 李华顺 Anti ROBO1 CAR-T细胞及其制备和应用
CN108977453A (zh) * 2017-06-02 2018-12-11 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 一种以robo1为靶点的嵌合抗原受体细胞及其制备和应用
CN107365798A (zh) * 2017-07-13 2017-11-21 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司 一种携带iCasp9自杀基因的CD19‑CAR‑T细胞及其应用
CN108341881A (zh) * 2018-01-31 2018-07-31 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 带安全开关的嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
CN109136244A (zh) * 2018-08-31 2019-01-04 河北璋达生物科技有限公司 一种可诱导凋亡的携带检测标签的cd20嵌合抗原受体t淋巴细胞及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAR-NK抗肿瘤研究的现状与发展趋势;殷书磊等;《中国肿瘤生物治疗杂志》;20160229;第23卷(第1期);第4.2节 *

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