CN114716527A - 转录调控蛋白突变株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了转录调控蛋白突变株及应用，属于生物技术领域，其技术方案要点是：转录调控蛋白突变株包括C154‑Muts调控蛋白，C154‑Muts调控蛋白不需要阿拉伯糖诱导能够直接启动PBAD启动子下游基因表达；转录调控蛋白突变株还包括AraC‑Muts调控蛋白；步骤S3的筛选体系由1个表达质粒和1个报告质粒组成，表达质粒为pHY‑01质粒，报告质粒为ReporterPlasmid质粒；将转录调控蛋白突变株应用于正反馈基因线路构建。本发明将获得的突变位点引入AraC蛋白后提高了对pBAD下游基因的调控效率，相同的阿拉伯糖诱导剂可以获得更高的表达强度，从而降低了蛋白表达的成本；还利用一系列不同强度的启动子构建了具有不同表达模式的正反馈线路，满足不同的基因表达需求。

Description

转录调控蛋白突变株及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及转录调控蛋白突变株及应用。

背景技术

合成生物学是一门新型的交叉学科，以工程化的理念，对生物系统进行重设 计、改造和优化的过程。基因线路的设计和合成是合成生物学非常重要和核心的 一部分内容，在基因线路的设计和合成过程中基因元件就像是每一块积木，选择 不同的基因元件以特定的方式组合，导入活细胞后可以行驶特定的生物功能。因 此，丰富基因元件的组成以及探索每一个元件对基因线路的影响对合成生物学的 发展非常重要。

启动子是基因线路设计中使用到的非常重要的一种基因元件，而转录因子则 像“开关”决定着启动子下游基因的表达。常用的用于原核生物基因表达的启动 子大都是诱导型，例如T7启动子需要IPTG诱导，PBAD启动子需要阿拉伯糖诱 导。诱导型启动子的优点是可以让蛋白更好的在体内表达，但是同时增加了蛋白 表达的成本；并且，目前还具有更多的蛋白表达和基因线路设计的需求亟待满足； 此外，转录调控强度对基因线路表达的影响目前也仍不清楚。

为了解决上述问题，在现有技术的基础上提供了转录调控蛋白突变株及应 用。

发明内容

本发明的目的是提供转录调控蛋白突变株及应用，本发明首先构建了转录调 控蛋白突变株AraC的截短蛋白C154，并证明了C154可以在没有阿拉伯糖诱导 的情况下启动PBAD启动子下游基因的表达，但是调控强度非常弱，不适合用于 基因元件的构建；在C154的基础上，我们通过蛋白质定向演化的手段以及本发 明构建的筛选体系筛选获得了一系列不同调控强度的可以直接启动PBAD下游基 因表达的调控蛋白。

并且，本发明利用这一系列的强度的转录调控蛋白突变株构建正反馈的基因 线路，但是得到的表达模式(双稳态或单稳态)却是不同的，证明了本发明获得 的调控蛋白可以作为基因元件应用于合成生物学中更复杂的基因线路的构建，且 可以用于研究转录调控强度对基因线路表达效果的影响。

此外，本发明进一步将C154-Muts中部分突变位点引入AraC蛋白中获得AraC-Muts，该系列蛋白相比于野生型AraC-Muts具有更高的调控效率，在相同 的阿拉伯糖诱导下可以更强的启动PBAD下游基因的表达，同时在没有阿拉伯糖 诱导下的本底表达水平低，该系列转录因子可以用于更有效的蛋白表达，同时节 约了蛋白表达的成本，证明了本发明具有重要的意义。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

转录调控蛋白突变株，所述转录调控蛋白突变株包括C154-Muts调控蛋白和AraC-Muts调控蛋白，所述C154-Muts调控蛋白不需要阿拉伯糖诱导能够直接启 动PBAD启动子下游基因表达；且所述C154-Muts调控蛋白和AraC-Muts调控蛋 白的制备方法如下：

S1、以AraC调控蛋白Ⅰ为模板通过分子克隆获得N端153个氨基酸缺失的 片段，并将所述片段进行表达，获得C154蛋白；

S2、验证所述C154蛋白可以在没有阿拉伯糖诱导的情况下启动PBAD启动子 下游基因的表达；

S3、以C154蛋白为起始模板进行蛋白定向演化，通过构建的筛选体系筛选 出PBAD启动子的转录调控蛋白突变株，即为C154-Muts调控蛋白；

S4、所述C154-Muts调控蛋白经测序后确定突变位点，通过融合PCR的方法 将突变位点引入AraC蛋白Ⅱ中从而获得AraC-Muts调控蛋白。

进一步地：步骤S3所述的筛选体系由1个表达质粒和1个报告质粒组成， 所述表达质粒为pHY-01质粒，所述报告质粒为Reporter Plasmid质粒；所述 pHY-01质粒和Reporterplasmid质粒的构建方法分别如下：

1)pHY-01质粒的构建：以pBAD-Myc-HisA质粒为模板、以c154-F-NcoI和araC-R-BamHI为引物扩增出C154基因片段利用NcoI和BamHI酶切位点插入到pACYC-duet质粒中，从而得到pHY-01质粒；

2)Reporter plasmid质粒的构建：首先设计引物Pbad-expect araC-F和Pbad-expect araC-R；通过PCR将所述pBAD-Myc-HisA质粒中的araC基因片段 敲除；再通过BglⅡ和EcoRⅠ酶切位点插入gfpuv片段，即得到Reporter plasmid 质粒。

本发明还提供了转录调控蛋白突变株的应用，将所述转录调控蛋白突变株应 用于正反馈基因路线构建，所述正反馈基因线路构建包括PFL质粒和non-PFL 质粒的构建；所述PFL质粒和non-PFL质粒的构建方法分别如下：

Ⅰ.PFL质粒的构建：以所述Reporter plasmid为基础，首先在所述Reporterplasmid质粒的gfpuv基因后面插入终止子；然后以所述pHY-01为模板扩增出 PBAD-C154/Muts片段，并插入到两个终止子之间；所述PBAD-C154/Muts片段包 含PBAD启动子序列和C154序列或PBAD启动子序列和C154-Muts序列；

Ⅱ.non-PFL质粒的构建：以所述Reporter plasmid为基础，首先在所述 Reporterplasmid质粒的gfpuv基因后面插入终止子；然后以所述pHY-01为模 板扩增出Plac-C154/Muts片段；所述Plac-C154/Muts片段包含PLac启动子序 列和C154序列或者PLac启动子序列和C154-Muts序列。

通过上述技术方案，本发明中使用的定向演化技术是合成生物学中的一种方 法，通过设计合理的筛选体系可以获得具有预期功能的蛋白。

通过定向演化的方法在AraC调控蛋白基础上获得了一系列不同转录调控强 度的转录因子。其中，一部分(C154-Muts)不需要阿拉伯糖可以直接启动PBAD 下游基因的表达，该部分转录因子可以用于研究转录因子调控强度这一单一因素 对基因线路表达的影响，排除了诱导物与转录因子之间作用的干扰，本发明利用 该系列调控蛋白突变株(C154-Muts)和PBAD启动子构建的正反馈基因线路可以 呈现不同的表达模式，说明了转录因子调控强度对该基因线路设计的重要性。

另一部分突变转录因子(AraC-Muts)相比于野生型的AraC具有更高的调控 效率，相同浓度的阿拉伯糖可以产生更高的PBAD下游基因的表达，且保持了PBAD 启动子的严谨型调控，即没有诱导物时下游基因的本地表达很低，该系列转录因 子(AraC-Muts)的使用可以节约蛋白表达的成本。

本发明的筛选体系由一个表达质粒(pHY-01)和一个报告质粒(ReporterPlasmid)组成。

表达质粒是T7启动子控制突变文库的表达，报告质粒是PBAD启动子控制报 告基因gfpuv的表达，突变蛋白如果可以启动PBAD启动子下游gfpuv的表达筛 选宿主菌则会发出荧光，通过荧光定量检测即可筛选出具有不同调控强度的转录 调控蛋白突变株突变株(C154-Muts)。本发明中突变文库是以C154为模板通过 易错PCR或定点饱和突变的方法获得，总共进行了五轮筛选，获得一系列不同调 控强度的不需要阿拉伯糖直接启动PBAD下游基因表达的转录调控蛋白突变株 (C154-Muts)。

总之，本发明所获得的转录调控蛋白突变株进一步丰富了合成生物学的元件 组成，可以用于研究基因线路中转录调控强度这一因素的重要性，另外，Ara-Muts的使用相比于野生型AraC降低了蛋白表达的成本，提高了蛋白表达的效率。

正反馈基因线路是构建复杂基因线路中常用到的一种基因线路模块，也在生 物体内的调控中占有非常重要的作用。已有研究表明正反馈基因线路之所以在基 因调控中应用广泛主要是因为该基因线路的双稳态性质。双稳态在理解细胞基本 功能中起到关键作用，例如细胞周期、细胞分化以及凋亡等，正反馈是双稳态系 统形成的必要条件之一，但是正反馈并不是只有双稳态这一种输出方式，尤其是 越简单的正反馈线路越容易受到很多因素的影响不能保证双稳态的输出。

本发明利用获得的转录调控蛋白突变株突变株(C154-Muts)可以用于构建 具有不同表达模式的正反馈路基因路线，并对比研究了不同调控强度对该基因线 路输出的影响，结果显示不同强度转录因子可以产生不同的输出模式，证明了转 录因子的重要性，也说明了本发明的意义之一。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1.本发明首先构建了转录调控蛋白突变株AraC的截短蛋白C154，并证明了 C154可以在没有阿拉伯糖诱导的情况下启动PBAD启动子下游基因的表达，但是 调控强度非常弱，不适合用于基因元件的构建；在C154的基础上，我们通过蛋 白质定向演化的手段以及本发明构建的筛选体系筛选获得了一系列不同调控强 度的可以直接启动PBAD下游基因表达的调控蛋白。

2.本发明利用这一系列的强度的转录调控蛋白突变株构建正反馈的基因线 路，但是得到的表达模式(双稳态或单稳态)却是不同的，证明了本发明获得的 调控蛋白可以作为基因元件应用于合成生物学中更复杂的基因线路的构建，且可 以用于研究转录调控强度对基因线路表达效果的影响。

3.本发明进一步将C154-Muts中部分突变位点引入AraC蛋白中获得AraC-Muts，该系列蛋白相比于野生型AraC-Muts具有更高的调控效率，在相同 的阿拉伯糖诱导下可以更强的启动PBAD下游基因的表达，同时在没有阿拉伯糖 诱导下的本底表达水平低，该系列转录因子可以用于更有效的蛋白表达，同时节 约了蛋白表达的成本，证明了本发明具有重要的意义。

附图说明

图1是本发明中构建的质粒图谱(pHY-01，Reporter plasmid，non-PFL， PFL)；

图2是本发明中定向演化宿主菌的构建及验证；

图3是本发明中定向演化筛选及结果；

图4是正反馈基因线路的设计和表达；

图5是正反馈基因线路表达模式鉴定；

图6是AraC-Muts调控PBAD下游基因表达。

具体实施方式

下面结合附图和实施方式对本发明作进一步的详细说明：

试剂和菌株：本发明中的所有试剂均是市场购买的试剂级以上的试剂。其中， 木糖，葡萄糖，酵母基本氮源，胶回收试剂盒，T4连接酶及所有的限制性内切 酶均来源于上海生工生物工程公司。大肠杆菌JM109(DE3)菌株作为分子克隆时 使用的宿主菌(Promega公司)，Luria-Bertani(LB)培养基用作培养E.coli。

实施例1：转录调控蛋白突变株，所述转录调控蛋白突变株包括C154-Muts 调控蛋白，所述C154-Muts调控蛋白不需要阿拉伯糖诱导能够直接启动PBAD启 动子下游基因表达；且所述C154-Muts调控蛋白的制备方法如下：

S1、以AraC调控蛋白Ⅰ为模板通过分子克隆获得N端153个氨基酸缺失的 片段，并将所述片段进行表达，获得C154蛋白；

S2、验证所述C154蛋白可以在没有阿拉伯糖诱导的情况下启动PBAD启动子 下游基因的表达，调控强度非常弱；

S3、以C154蛋白为起始模板进行蛋白定向演化，通过构建的筛选体系筛选 出具有不同表达强度的PBAD启动子的转录调控蛋白突变株，即为C154-Muts调 控蛋白。

所述筛选体系所使用的宿主菌株为菌株HYB-3；筛选宿主菌株HYB-3的构建 方法如下：

以JM109(DE3)为出发菌株，进行araC的敲除，具体步骤和方法如下：

1)首先制备JM109(DE3)感受态细胞(本发明所有感受态细胞制备方法一 致，整个操作尽量在冰上完成)：

①按照1：100比例将过夜培养的大肠杆菌接种到500ml新鲜的LB培养基种， 37℃，转速250rpm培养至OD600＝0.5-0.7；

②培养好的大肠杆菌分装至50ml离心管，并在冰上静置20min后在低温冷 冻离心机中离心15min，转速4000g；

③弃去离心好的上清，用500mL预冷的10％甘油溶液重悬离心后的沉淀，在 低温冷冻离心机中离心15min，转速4000g；

④离心结束后再次弃上清，用250mL预冷的10％甘油溶液重悬离心后的沉淀， 在低温冷冻离心机中离心15min，转速4000g；

⑤离心结束后再次弃上清，用20mL预冷的10％甘油溶液重悬所有的沉淀并 汇于一管；在低温冷冻离心机中离心15min，转速4000g；

⑥离心结束后再次弃上清，用1.5mL预冷的10％甘油溶液重悬沉淀，并分装 50ul/离心管，-80℃保存。

2)将pKD46质粒通过电转的方式转入JM109(DE3)(本发明电转方法一致)：

①从-80℃冰箱取出冻存的感受态细胞置于冰上，待融化后加入2ul待转质 粒，轻轻混匀并在冰上放置1min；

②用移液枪将感受态细胞和质粒混合物转移至预冷干净的电击杯中，使用电 穿孔仪器进行电击转化；

③电击完成后，迅速取出电击杯，加入1mL液体LB培养基并重悬菌体，然 后置于摇床培养1h(30℃，250rpm)

④培养好的大肠杆菌培养液稀释至合适倍数，涂布于含有氨苄抗生素的培养 皿中倒置过夜30℃培养。

⑤第二天在平板上挑取单克隆即为含有pKD46的JM109(ED3)。

3)利用转入pKD46质粒的JM109(DE3)制备感受态细胞

4)准备待转化的PCR片段，该片段以pKD13为模板，正向和反向引物包含 敲除基因上下游各50bp加上pKD13中FRT位点的上下游各20bp，PCR产物使用 胶回收并用DpnI进行酶切去除模板，

5)将4)获得的PCR产物通过电转的方式转入3)制备的含有pKD46的JM109 (DE3)感受态细胞中，通过氨苄霉素和卡那霉素筛选，选择可以在卡那霉素培 养基上生长但是无氨苄抗性的菌株，说明pKD46丢失，成功转入PCR片段的菌株， 再通过菌落PCR以及进一步的测序确认片段DNA上的抗性基因成功置换需敲除的araC基因，此时获得菌株HYB-1；

6)消除HYB-1的卡那霉素抗性：

①制备HYB-1的感受态细胞；

②然后转入pCP20质粒，转化后涂布于只有氨苄抗性的固体培养基上，30℃ 倒置过夜培养；

③第二天，选取一些培养基上的克隆接种于没有抗性的LB液体培养基中， 37℃，250rpm过夜培养；

④第二天，吸取同一试管的菌液分别划线在含有氨苄青霉素、卡那霉素以及 没有抗生素的固体培养基中，37℃倒置培养过夜；

⑤挑去只能在无抗性的培养基上生长的菌落(无氨苄抗性说明pCP20丢失， 无卡那霉素抗性说明细菌重组的卡那霉素抗性丢失)获得HYB-2菌株；

⑥基因敲除的验证：测序。

7)再通过电转的方式将Reporter Plasmid转入HYB-2菌株，即获得定向演 化筛选时用的宿主菌株HYB-3。

实施例2：转录调控蛋白突变株，所述转录调控蛋白突变株还包括AraC-Muts调控蛋白，且所述AraC-Muts调控蛋白的制备方法如下：

C154-Muts调控蛋白经测序后确定突变位点，通过融合PCR的方法将突变位 点引入AraC蛋白Ⅱ中从而获得AraC-Muts调控蛋白。

本发明通过易错PCR或定点饱和突变PCR的方法建立突变库，再将突变株 通过电转的方式转入筛选用的宿主菌，具体步骤和方法如下：

1)制备HYB-3的感受态细胞；

2)本发明建立突变库主要采取易错PCR的方法，(引物为Lib-F和Lib-R， 如表3所示)但是由于本发明第1轮筛选结果获得的三个突变株的第98个氨基 酸都发生了突变，因此第2轮筛选是在C154的基础上进行了第98个氨基酸的定 点饱和突变建立筛选库(引物为SSM-F和SSM-R，如表3所示)。

3)将突变库通过电转的方式转入HYB-3感受态细胞中，涂布于含有氨苄和 卡那霉素两种抗性的固体培养板上，37℃培养过夜；

4)第二天取出平板，将所有单克隆挑到96深孔板进行培养，37℃，250rpm 培养过夜；

5)第三天，将96深孔板里的菌液按照1：10的比例转移到含有180ul新鲜 培养基的96深孔板里，37℃，250rpm培养3h后加入IPTG(终浓度0.5mM)诱 导表达，继续培养3h；

6)培养好的96深孔板离心，加入200ulPBS重悬，吸取100ul转移至96 浅孔板，进行荧光读取(Molecular Devices,SpectraMax Gemini，激发光395nm， 发射光509nm)和菌体浓度测定(Molecular Devices,SpectraMax Plus384， OD600)

7)结果处理：每个克隆最终测量的荧光值除以菌体浓度，从而校正由于菌 体浓度差异导致的荧光差异，最后选择荧光值高的克隆作为本轮初筛的结果；

8)将初筛获得的每个菌株分别接种到三个试管中进行培养以及荧光测定， 进一步验证初筛结果的可靠性，从而得到本轮筛选的突变株。

实施例3：转录调控蛋白突变株的应用，将所述转录调控蛋白突变株应用于 正反馈基因路线构建，并对基因路线进行性质鉴定。

本发明构建的正反馈基因线路是比较简单的一种，如图5所示，同时以Plac启动子代替Pbad构建了对照组即非正反馈系统，Plac的本地表达强于Pbad，若正反馈基因线路并未启动，只是本地表达导致的下游gfpuv表达，则正 反馈系统的荧光表达应该低于对照非正反馈系统；反之，若正反馈系统正常启动 了则其荧光表达会比对照组更高。

此外，本发明的正反馈线路的表达性质使用显微镜观察以及ImageJ统计单 细胞荧光表达情况来鉴定，若为双稳态表达则统计结果会出现双峰，若为单稳态， 则统计结果是单峰。基因线路构建包括PFL质粒和non-PFL质粒的构建，具体操 作和步骤如下：

1、PFL的构建

1)以pBAD-mycHisA为模板，Ter-F-MfeI和Ter-R-EcoRI为引物扩增出终 止子，然后利用MfeI和EcoRI酶切位点插入Reporter Plasmid中，获得质粒A

2)以pHY01为模板，将C154/C154-Muts扩增出来并通过BglII和EcoRI酶切位点插入pBAD-myc-HisA质粒中，然后以该质粒为模板，PBAD-F-EcoRI和araC-R-HindIII为引物扩增出PBAD-C154/Muts(包含PBAD启动子序列和C154 或者C154-Muts序列)；

3)将PBAD-C154/Muts片段通过EcoRI和HindIII插入1)构建的质粒A中， 从而获得PFL质粒。

2、non-PFL的构建：

1)以pBAD-mycHisA为模板，Ter-F-MfeI和Ter-R-EcoRI为引物扩增出终 止子，然后利用MfeI和EcoRI酶切位点插入Reporter Plasmid中，获得质粒A；

2)以pHY01为模板，将C154/C154-Muts扩增出来并通过HindIII酶切位点 插入pUC19质粒中，然后以该质粒为模板，PLac-F-EcoRI和araC-R-HindIII为引物扩增出PLac-C154/Muts(包含PLac启动子序列和C154或者C154-Muts 序列)

3)将PLac-C154/Muts片段通过EcoRI和HindIII酶切位点插入1)构建的 质粒A中，从而获得non-PFL质粒。

3、将PFL和non-PFL分别转入HYB-2即可获得正反馈表达系统和对照非正 反馈表达系统。

4、两种基因线路表达系统性质鉴定

1)将含有PFL和non-PFL质粒的菌株过夜培养

2)第二天，吸取50ul菌液加入到5ml新鲜培养基的试管，37℃继续培 养；

3)每隔1h取10ul菌液，使用Leica DMI600显微镜下观察并拍照，另 外最后7h取100ul菌液，使用PBS洗一次，然后用100ulPBS重悬起来用于荧光 值测定，如图5所示；

4)最后使用ImageJ软件对结果进行统计分析，如图6所示。

实施例4：AraC-Muts的获得和调控能力鉴定

本发明使用融合PCR的方法将C154-Muts(D1/E2/E7/E10)与AraC蛋白的N 端153个氨基酸融合在一起从而获得对应的AraC-Muts，具体步骤和方法如下：

1)以c154-F-NcoI和Fusion-a为引物，含有C154-Muts(D1/E2/E7/E10) 的质粒为模板扩增出片段A；

2)以Fusion-b和araC-R-BamHI为引物，pBAD-myc-hisA为模板扩增出片 段B；

3)以片段A和片段B等比例混合为模板，c154-F-NcoI和araC-R-BamHI为 引物进行扩增获得片段AraC-Muts；

4)通过NcoI和BamHI酶切位点将AraC-Muts片段插入pACYC-duet质粒中 获得可表达AraC-Muts系列蛋白的质粒；

5)将该系列质粒分别转入筛选宿主菌HYB-3中；

6)将6)获得的菌株过夜培养，第二天1：100接种到新鲜培养基中37℃， 250rpm培养3h后，加入IPTG或/和阿拉伯糖诱导；继续培养3h后收细菌进行 荧光的定量测量；对照组既不加IPTG也不加阿拉伯糖；

7)获得的结果通过软件处理作图，通过荧光蛋白的表达情况分析AraC-Mut的调控能力。

表1本专利中涉及的菌株

表2本专利中筛选获得C154-Muts的突变信息

表3：本专利使用的引物序列信息

AraC蛋白序列为SEQ ID NO：1；

C154蛋白序列为SEQ ID NO：2；

Non-PFL质粒序列为SEQ ID NO：3；

PFL质粒序列为SEQ ID NO：4；

pHY-01质粒序列为SEQ ID NO：5；

Reporter plasmid质粒序列为SEQ ID NO：6。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技 术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修 改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

序列表

<110> 华艳 李明

<120> 转录调控蛋白突变株及应用

<130> 2022

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 879

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(ARaC 蛋白)

<400> 1

atggctgaag cgcaaaatga tcccctgctg ccgggatact cgtttaatgc ccatctggtg 60

gcgggtttaa cgccgattga ggccaacggt tatctcgatt tttttatcga ccgaccgctg 120

ggaatgaaag gttatattct caatctcacc attcgcggtc agggggtggt gaaaaatcag 180

ggacgagaat ttgtttgccg accgggtgat attttgctgt tcccgccagg agagattcat 240

cactacggtc gtcatccgga ggctcgcgaa tggtatcacc agtgggttta ctttcgtccg 300

cgcgcctact ggcatgaatg gcttaactgg ccgtcaatat ttgccaatac ggggttcttt 360

cgcccggatg aagcgcacca gccgcatttc agcgacctgt ttgggcaaat cattaacgcc 420

gggcaagggg aagggcgcta ttcggagctg ctggcgataa atctgcttga gcaattgtta 480

ctgcggcgca tggaagcgat taacgagtcg ctccatccac cgatggataa tcgggtacgc 540

gaggcttgtc agtacatcag cgatcacctg gcagacagca attttgatat cgccagcgtc 600

gcacagcatg tttgcttgtc gccgtcgcgt ctgtcacatc ttttccgcca gcagttaggg 660

attagcgtct taagctggcg cgaggaccaa cgtatcagcc aggcgaagct gcttttgagc 720

accacccgga tgcctatcgc caccgtcggt cgcaatgttg gttttgacga tcaactctat 780

ttctcgcggg tatttaaaaa atgcaccggg gccagcccga gcgagttccg tgccggttgt 840

gaagaaaaag tgaatgatgt agccgtcaag ttgtcataa 879

<210> 2

<211> 426

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(C154 蛋白)

<400> 2

atgggcaatc tgcttgagca attgttactg cggcgcatgg aagcgattaa cgagtcgctc 60

catccaccga tggataatcg ggtacgcgag gcttgtcagt acatcagcga tcacctggca 120

gacagcaatt ttgatatcgc cagcgtcgca cagcatgttt gcttgtcgcc gtcgcgtctg 180

tcacatcttt tccgccagca gttagggatt agcgtcttaa gctggcgcga ggaccaacgt 240

atcagccagg cgaagctgct tttgagcacc acccggatgc ctatcgccac cgtcggtcgc 300

aatgttggtt ttgacgatca actctatttc tcgcgggtat ttaaaaaatg caccggggcc 360

agcccgagcg agttccgtgc cggttgtgaa gaaaaagtga atgatgtagc cgtcaagttg 420

tcataa 426

<210> 3

<211> 4696

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60

tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120

aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180

attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg 240

atcctacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccatacccg ttttttgggc 300

taacaggagg aattaaccag atctatgagt aaaggagaag aacttttcac tggagttgtc 360

ccaattcttg ttgaattaga tggtgatgtt aatgggcaca aattttctgt cagtggagag 420

ggtgaaggtg atgcaacata cggaaaactt acccttaaat ttatttgcac tactggaaaa 480

ctacctgttc catggccaac acttgtcact actttctctt atggtgttca atgcttttcc 540

cgttatccgg atcatatgaa acggcatgac tttttcaaga gtgccatgcc cgaaggttat 600

gtacaggaac gcactatatc tttcaaagat gacgggaact acaagacgcg tgctgaagtc 660

aagtttgaag gtgataccct tgttaatcgt atcgagttaa aaggtattga ttttaaagaa 720

gatggaaaca ttctcggaca caaactcgag tacaactata actcacacaa tgtatacatc 780

acggcagaca aacaaaagaa tggaatcaaa gctaacttca aaattcgcca caacattgaa 840

gatggatccg ttcaactagc agaccattat caacaaaata ctccaattgg cgatggccct 900

gtccttttac cagacaacca ttacctgtcg acacaatctg ccctttcgaa agatcccaac 960

gaaaagcgtg accacatggt ccttcttgag tttgtaactg ctgctgggat tacacatggc 1020

atggatgagc tctacaaata agaattggcg gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga 1080

ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa aacagaattt gcctggcggc agtagcgcgg 1140

tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg 1200

tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag 1260

tcgaaagact gggccttgaa ttcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag 1320

gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 1380

cacagaattc attaaagagg agaaaggtac catgggcaat ctgcttgagc aattgttact 1440

gcggcgcatg gaagcgatta acgagtcgct ccatccaccg atggataatc gggtacgcga 1500

ggcttgtcag tacatcagcg atcacctggc agacagcaat tttgatatcg ccagcgtcgc 1560

acagcatgtt tgcttgtcgc cgtcgcgtct gtcacatctt ttccgccagc agttagggat 1620

tagcgtctta agctggcgcg aggaccaacg tatcagccag gcgaagctgc ttttgagcac 1680

cacccggatg cctatcgcca ccgtcggtcg caatgttggt tttgacgatc aactctattt 1740

ctcgcgggta tttaaaaaat gcaccggggc cagcccgagc gagttccgtg ccggttgtga 1800

agaaaaagtg aatgatgtag ccgtcaagtt gtcataaaag cttgggcccg aacaaaaact 1860

catctcagaa gaggatctga atagcgccgt cgaccatcat catcatcatc attgagttta 1920

aacggtctcc agcttggctg ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt 1980

aaatcagaac gcagaagcgg tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg 2040

gtcccacctg accccatgcc gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg 2100

gggtctcccc atgcgagagt agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc 2160

gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac 2220

aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgc gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg 2280

acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaat taagcagaag gccatcctga cggatggcct 2340

ttttgcgttt ctacaaactc ttttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc 2400

tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta 2460

ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg 2520

ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg 2580

gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac 2640

gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtgttg 2700

acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt 2760

actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg 2820

ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac 2880

cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt 2940

gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag 3000

caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc 3060

aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc 3120

ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta 3180

tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg 3240

ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga 3300

ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac 3360

ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 3420

tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 3480

cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 3540

taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 3600

gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc 3660

acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 3720

ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 3780

ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 3840

cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 3900

aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 3960

gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 4020

gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 4080

gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc 4140

ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg 4200

ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc 4260

tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc 4320

tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagta tacactccgc tatcgctacg 4380

tgactgggtc atggctgcgc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc 4440

ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg 4500

tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgaggcag cagatcaatt cgcgcgcgaa 4560

ggcgaagcgg catgcataat gtgcctgtca aatggacgaa gcagggattc tgcaaaccct 4620

atgctactcc gtcaagccgt caattgtctg attcgttacc aagcggccgc acttttcata 4680

ctcccgccat tcagag 4696

<210> 4

<211> 4886

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60

tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120

aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180

attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg 240

atcctacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccatacccg ttttttgggc 300

taacaggagg aattaaccag atctatgagt aaaggagaag aacttttcac tggagttgtc 360

ccaattcttg ttgaattaga tggtgatgtt aatgggcaca aattttctgt cagtggagag 420

ggtgaaggtg atgcaacata cggaaaactt acccttaaat ttatttgcac tactggaaaa 480

ctacctgttc catggccaac acttgtcact actttctctt atggtgttca atgcttttcc 540

cgttatccgg atcatatgaa acggcatgac tttttcaaga gtgccatgcc cgaaggttat 600

gtacaggaac gcactatatc tttcaaagat gacgggaact acaagacgcg tgctgaagtc 660

aagtttgaag gtgataccct tgttaatcgt atcgagttaa aaggtattga ttttaaagaa 720

gatggaaaca ttctcggaca caaactcgag tacaactata actcacacaa tgtatacatc 780

acggcagaca aacaaaagaa tggaatcaaa gctaacttca aaattcgcca caacattgaa 840

gatggatccg ttcaactagc agaccattat caacaaaata ctccaattgg cgatggccct 900

gtccttttac cagacaacca ttacctgtcg acacaatctg ccctttcgaa agatcccaac 960

gaaaagcgtg accacatggt ccttcttgag tttgtaactg ctgctgggat tacacatggc 1020

atggatgagc tctacaaata agaattggcg gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga 1080

ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa aacagaattt gcctggcggc agtagcgcgg 1140

tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg 1200

tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag 1260

tcgaaagact gggccttgaa ttcaagaaac caattgtcca tattgcatca gacattgccg 1320

tcactgcgtc ttttactggc tcttctcgct aaccaaaccg gtaaccccgc ttattaaaag 1380

cattctgtaa caaagcggga ccaaagccat gacaaaaacg cgtaacaaaa gtgtctataa 1440

tcacggcaga aaagtccaca ttgattattt gcacggcgtc acactttgct atgccatagc 1500

atttttatcc ataagattag cggatcctac ctgacgcttt ttatcgcaac tctctactgt 1560

ttctccatac ccgttttttg ggctaacagg aggaattaac catgggcaat ctgcttgagc 1620

aattgttact gcggcgcatg gaagcgatta acgagtcgct ccatccaccg atggataatc 1680

gggtacgcga ggcttgtcag tacatcagcg atcacctggc agacagcaat tttgatatcg 1740

ccagcgtcgc acagcatgtt tgcttgtcgc cgtcgcgtct gtcacatctt ttccgccagc 1800

agttagggat tagcgtctta agctggcgcg aggaccaacg tatcagccag gcgaagctgc 1860

ttttgagcac cacccggatg cctatcgcca ccgtcggtcg caatgttggt tttgacgatc 1920

aactctattt ctcgcgggta tttaaaaaat gcaccggggc cagcccgagc gagttccgtg 1980

ccggttgtga agaaaaagtg aatgatgtag ccgtcaagtt gtcataaaag cttgggcccg 2040

aacaaaaact catctcagaa gaggatctga atagcgccgt cgaccatcat catcatcatc 2100

attgagttta aacggtctcc agcttggctg ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct 2160

gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag 2220

tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga 2280

tggtagtgtg gggtctcccc atgcgagagt agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa 2340

aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc 2400

tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt tgaacgttgc gaagcaacgg cccggagggt 2460

ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca ggcatcaaat taagcagaag gccatcctga 2520

cggatggcct ttttgcgttt ctacaaactc ttttgtttat ttttctaaat acattcaaat 2580

atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag 2640

agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt 2700

cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt 2760

gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc 2820

cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta 2880

tcccgtgttg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac 2940

ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa 3000

ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg 3060

atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc 3120

cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg 3180

atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta 3240

gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg 3300

cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg 3360

tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc 3420

tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt 3480

gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt 3540

gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 3600

atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 3660

atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 3720

aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 3780

aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 3840

ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 3900

ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 3960

tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 4020

ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 4080

acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 4140

gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 4200

cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 4260

aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac 4320

atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga 4380

gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg 4440

gaagagcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata 4500

tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagta tacactccgc 4560

tatcgctacg tgactgggtc atggctgcgc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc 4620

cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga 4680

gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgaggcag cagatcaatt 4740

cgcgcgcgaa ggcgaagcgg catgcataat gtgcctgtca aatggacgaa gcagggattc 4800

tgcaaaccct atgctactcc gtcaagccgt caattgtctg attcgttacc aagcggccgc 4860

acttttcata ctcccgccat tcagag 4886

<210> 5

<211> 4399

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

ggggaattgt gagcggataa caattcccct gtagaaataa ttttgtttaa ctttaataag 60

gagatatacc atgggcaatc tgcttgagca attgttactg cggcgcatgg aagcgattaa 120

cgagtcgctc catccaccga tggataatcg ggtacgcgag gcttgtcagt acatcagcga 180

tcacctggca gacagcaatt ttgatatcgc cagcgtcgca cagcatgttt gcttgtcgcc 240

gtcgcgtctg tcacatcttt tccgccagca gttagggatt agcgtcttaa gctggcgcga 300

ggaccaacgt atcagccagg cgaagctgct tttgagcacc acccggatgc ctatcgccac 360

cgtcggtcgc aatgttggtt ttgacgatca actctatttc tcgcgggtat ttaaaaaatg 420

caccggggcc agcccgagcg agttccgtgc cggttgtgaa gaaaaagtga atgatgtagc 480

cgtcaagttg tcataaggat ccgaattcga gctcggcgcg cctgcaggtc gacaagcttg 540

cggccgcata atgcttaagt cgaacagaaa gtaatcgtat tgtacacggc cgcataatcg 600

aaattaatac gactcactat aggggaattg tgagcggata acaattcccc atcttagtat 660

attagttaag tataagaagg agatatacat atggcagatc tcaattggat atcggccggc 720

cacgcgatcg ctgacgtcgg taccctcgag tctggtaaag aaaccgctgc tgcgaaattt 780

gaacgccagc acatggactc gtctactagc gcagcttaat taacctaggc tgctgccacc 840

gctgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg 900

ctgaaacctc aggcatttga gaagcacacg gtcacactgc ttccggtagt caataaaccg 960

gtaaaccagc aatagacata agcggctatt taacgaccct gccctgaacc gacgaccggg 1020

tcgaatttgc tttcgaattt ctgccattca tccgcttatt atcacttatt caggcgtagc 1080

accaggcgtt taagggcacc aataactgcc ttaaaaaaat tacgccccgc cctgccactc 1140

atcgcagtac tgttgtaatt cattaagcat tctgccgaca tggaagccat cacagacggc 1200

atgatgaacc tgaatcgcca gcggcatcag caccttgtcg ccttgcgtat aatatttgcc 1260

catagtgaaa acgggggcga agaagttgtc catattggcc acgtttaaat caaaactggt 1320

gaaactcacc cagggattgg ctgagacgaa aaacatattc tcaataaacc ctttagggaa 1380

ataggccagg ttttcaccgt aacacgccac atcttgcgaa tatatgtgta gaaactgccg 1440

gaaatcgtcg tggtattcac tccagagcga tgaaaacgtt tcagtttgct catggaaaac 1500

ggtgtaacaa gggtgaacac tatcccatat caccagctca ccgtctttca ttgccatacg 1560

gaactccgga tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt 1620

gtgcttattt ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt 1680

ataggtacat tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga 1740

tatatcaacg gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga 1800

aaatctcgat aactcaaaaa atacgcccgg tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt 1860

ggaacctctt acgtgccgat caacgtctca ttttcgccaa aagttggccc agggcttccc 1920

ggtatcaaca gggacaccag gatttattta ttctgcgaag tgatcttccg tcacaggtat 1980

ttattcggcg caaagtgcgt cgggtgatgc tgccaactta ctgatttagt gtatgatggt 2040

gtttttgagg tgctccagtg gcttctgttt ctatcagctg tccctcctgt tcagctactg 2100

acggggtggt gcgtaacggc aaaagcaccg ccggacatca gcgctagcgg agtgtatact 2160

ggcttactat gttggcactg atgagggtgt cagtgaagtg cttcatgtgg caggagaaaa 2220

aaggctgcac cggtgcgtca gcagaatatg tgatacagga tatattccgc ttcctcgctc 2280

actgactcgc tacgctcggt cgttcgactg cggcgagcgg aaatggctta cgaacggggc 2340

ggagatttcc tggaagatgc caggaagata cttaacaggg aagtgagagg gccgcggcaa 2400

agccgttttt ccataggctc cgcccccctg acaagcatca cgaaatctga cgctcaaatc 2460

agtggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttcccctg gcggctccct 2520

cgtgcgctct cctgttcctg cctttcggtt taccggtgtc attccgctgt tatggccgcg 2580

tttgtctcat tccacgcctg acactcagtt ccgggtaggc agttcgctcc aagctggact 2640

gtatgcacga accccccgtt cagtccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 2700

agtccaaccc ggaaagacat gcaaaagcac cactggcagc agccactggt aattgattta 2760

gaggagttag tcttgaagtc atgcgccggt taaggctaaa ctgaaaggac aagttttggt 2820

gactgcgctc ctccaagcca gttacctcgg ttcaaagagt tggtagctca gagaaccttc 2880

gaaaaaccgc cctgcaaggc ggttttttcg ttttcagagc aagagattac gcgcagacca 2940

aaacgatctc aagaagatca tcttattaat cagataaaat atttctagat ttcagtgcaa 3000

tttatctctt caaatgtagc acctgaagtc agccccatac gatataagtt gtaattctca 3060

tgttagtcat gccccgcgcc caccggaagg agctgactgg gttgaaggct ctcaagggca 3120

tcggtcgaga tcccggtgcc taatgagtga gctaacttac attaattgcg ttgcgctcac 3180

tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 3240

cggggagagg cggtttgcgt attgggcgcc agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg 3300

ggcaacagct gattgccctt caccgcctgg ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg 3360

ctggtttgcc ccagcaggcg aaaatcctgt ttgatggtgg ttaacggcgg gatataacat 3420

gagctgtctt cggtatcgtc gtatcccact accgagatgt ccgcaccaac gcgcagcccg 3480

gactcggtaa tggcgcgcat tgcgcccagc gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca 3540

gtgggaacga tgccctcatt cagcatttgc atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc 3600

cagtcgcctt cccgttccgc tatcggctga atttgattgc gagtgagata tttatgccag 3660

ccagccagac gcagacgcgc cgagacagaa cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc 3720

tggtgaccca atgcgaccag atgctccacg cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa 3780

ataatactgt tgatgggtgt ctggtcagag acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg 3840

caggcagctt ccacagcaat ggcatcctgg tcatccagcg gatagttaat gatcagccca 3900

ctgacgcgtt gcgcgagaag attgtgcacc gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt 3960

tctaccatcg acaccaccac gctggcaccc agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg 4020

acaatttgcg acggcgcgtg cagggccaga ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac 4080

tgtttgcccg ccagttgttg tgccacgcgg ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc 4140

gcttccactt tttcccgcgt tttcgcagaa acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa 4200

acggtctgat aagagacacc ggcatactct gcgacatcgt ataacgttac tggtttcaca 4260

ttcaccaccc tgaattgact ctcttccggg cgctatcatg ccataccgcg aaaggttttg 4320

cgccattcga tggtgtccgg gatctcgacg ctctccctta tgcgactcct gcattaggaa 4380

attaatacga ctcactata 4399

<210> 6

<211> 4143

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct 60

tctcgctaac caaaccggta accccgctta ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca 120

aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg tctataatca cggcagaaaa gtccacattg 180

attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg ccatagcatt tttatccata agattagcgg 240

atcctacctg acgcttttta tcgcaactct ctactgtttc tccatacccg ttttttgggc 300

taacaggagg aattaaccag atctatgagt aaaggagaag aacttttcac tggagttgtc 360

ccaattcttg ttgaattaga tggtgatgtt aatgggcaca aattttctgt cagtggagag 420

ggtgaaggtg atgcaacata cggaaaactt acccttaaat ttatttgcac tactggaaaa 480

ctacctgttc catggccaac acttgtcact actttctctt atggtgttca atgcttttcc 540

cgttatccgg atcatatgaa acggcatgac tttttcaaga gtgccatgcc cgaaggttat 600

gtacaggaac gcactatatc tttcaaagat gacgggaact acaagacgcg tgctgaagtc 660

aagtttgaag gtgataccct tgttaatcgt atcgagttaa aaggtattga ttttaaagaa 720

gatggaaaca ttctcggaca caaactcgag tacaactata actcacacaa tgtatacatc 780

acggcagaca aacaaaagaa tggaatcaaa gctaacttca aaattcgcca caacattgaa 840

gatggatccg ttcaactagc agaccattat caacaaaata ctccaattgg cgatggccct 900

gtccttttac cagacaacca ttacctgtcg acacaatctg ccctttcgaa agatcccaac 960

gaaaagcgtg accacatggt ccttcttgag tttgtaactg ctgctgggat tacacatggc 1020

atggatgagc tctacaaata agaattggcg gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga 1080

ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa aacagaattt gcctggcggc agtagcgcgg 1140

tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg 1200

tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag 1260

tcgaaagact gggccttgaa ttcgaagctt gggcccgaac aaaaactcat ctcagaagag 1320

gatctgaata gcgccgtcga ccatcatcat catcatcatt gagtttaaac ggtctccagc 1380

ttggctgttt tggcggatga gagaagattt tcagcctgat acagattaaa tcagaacgca 1440

gaagcggtct gataaaacag aatttgcctg gcggcagtag cgcggtggtc ccacctgacc 1500

ccatgccgaa ctcagaagtg aaacgccgta gcgccgatgg tagtgtgggg tctccccatg 1560

cgagagtagg gaactgccag gcatcaaata aaacgaaagg ctcagtcgaa agactgggcc 1620

tttcgtttta tctgttgttt gtcggtgaac gctctcctga gtaggacaaa tccgccggga 1680

gcggatttga acgttgcgaa gcaacggccc ggagggtggc gggcaggacg cccgccataa 1740

actgccaggc atcaaattaa gcagaaggcc atcctgacgg atggcctttt tgcgtttcta 1800

caaactcttt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata 1860

accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg 1920

tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac 1980

gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact 2040

ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat 2100

gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtgttgacg ccgggcaaga 2160

gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac 2220

agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat 2280

gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac 2340

cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct 2400

gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac 2460

gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga 2520

ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg 2580

gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact 2640

ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac 2700

tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta 2760

actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt 2820

taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 2880

gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 2940

tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 3000

ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 3060

gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 3120

tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 3180

cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 3240

gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 3300

actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 3360

ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 3420

gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 3480

atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 3540

tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 3600

tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 3660

aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcctga tgcggtattt 3720

tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca gtacaatctg 3780

ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg 3840

gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg 3900

gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca 3960

ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagcag atcaattcgc gcgcgaaggc gaagcggcat 4020

gcataatgtg cctgtcaaat ggacgaagca gggattctgc aaaccctatg ctactccgtc 4080

aagccgtcaa ttgtctgatt cgttaccaag cggccgcact tttcatactc ccgccattca 4140

gag 4143

Claims (3)

1.转录调控蛋白突变株，其特征是：所述转录调控蛋白突变株包括C154-Muts调控蛋白和AraC-Muts调控蛋白，所述C154-Muts调控蛋白不需要阿拉伯糖诱导能够直接启动PBAD启动子下游基因表达；且所述C154-Muts调控蛋白和AraC-Muts调控蛋白的制备方法如下：

S1、以AraC调控蛋白Ⅰ为模板通过分子克隆获得N端153个氨基酸缺失的片段，并将所述片段进行表达，获得C154蛋白；

S2、验证所述C154蛋白可以在没有阿拉伯糖诱导的情况下启动PBAD启动子下游基因的表达；

S3、以C154蛋白为起始模板进行蛋白定向演化，通过构建的筛选体系筛选出PBAD启动子的转录调控蛋白突变株，即为C154-Muts调控蛋白；

S4、所述C154-Muts调控蛋白经测序后确定突变位点，通过融合PCR的方法将突变位点引入AraC蛋白Ⅱ中从而获得AraC-Muts调控蛋白。

2.根据权利要求1所述的转录调控蛋白突变株，其特征是：步骤S3所述的筛选体系由1个表达质粒和1个报告质粒组成，所述表达质粒为pHY-01质粒，所述报告质粒为ReporterPlasmid质粒；所述pHY-01质粒和Reporter plasmid质粒的构建方法分别如下：

1)pHY-01质粒的构建：以pBAD-Myc-HisA质粒为模板、以c154-F-NcoI和araC-R-BamHI为引物扩增出C154基因片段利用NcoI和BamHI酶切位点插入到pACYC-duet质粒中，从而得到pHY-01质粒；

2)Reporter plasmid质粒的构建：首先设计引物Pbad-expect araC-F和Pbad-expectaraC-R；通过PCR将所述pBAD-Myc-HisA质粒中的araC基因片段敲除；再通过BglⅡ和EcoRⅠ酶切位点插入gfpuv片段，即得到Reporter plasmid质粒。

3.根据权利要求2所述的转录调控蛋白突变株的应用，其特征是：将所述转录调控蛋白突变株应用于正反馈基因路线构建，所述正反馈基因线路构建包括PFL质粒和non-PFL质粒的构建；所述PFL质粒和non-PFL质粒的构建方法分别如下：

Ⅰ.PFL质粒的构建：以所述Reporter plasmid为基础，首先在所述Reporter plasmid质粒的gfpuv基因后面插入终止子；然后以所述pHY-01为模板扩增出PBAD-C154/Muts片段，并插入到两个终止子之间；所述PBAD-C154/Muts片段包含PBAD启动子序列和C154序列或PBAD启动子序列和C154-Muts序列；

Ⅱ.non-PFL质粒的构建：以所述Reporter plasmid为基础，首先在所述Reporterplasmid质粒的gfpuv基因后面插入终止子；然后以所述pHY-01为模板扩增出Plac-C154/Muts片段；所述Plac-C154/Muts片段包含PLac启动子序列和C154序列或者PLac启动子序列和C154-Muts序列。

Images