CN113061608A - 一种诱导型启动子的进化方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导型启动子的进化方法及其应用，属于生物技术领域。本发明通过易错PCR对麦芽糖诱导型启动子进行突变获得启动子突变体库，再通过偶联细胞生长的方式高通量筛选突变体，获得不同响应灵敏度和强度的启动子突变体；所述麦芽糖诱导型启动子后连有编码融合蛋白的基因，所述融合蛋白能够同时发挥双重筛选标记和定量报告基因表达量的作用。本发明进化得到的诱导型启动子对诱导剂麦芽糖的响应阈值范围从0‑3g/L扩展至0‑25g/L，最高诱导表达强度较原始启动子提高约3.5倍。

Description

一种诱导型启动子的进化方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种诱导型启动子的进化方法及其应用，尤其是一种麦芽糖诱导型启动子的进化方法及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
启动子是RNA聚合酶的识别序列，可以起始DNA的转录，对于外源蛋白的表达具有重要作用。由于诱导型的启动子具有操作简单、可调控等优点，近年来，人们对诱导型启动子的诱导表达进行了广泛的研究，开发了不同的诱导型表达系统，实现异源蛋白的高效表达或基因表达的精确调控，已经广泛应用于酶工程、蛋白质工程以及代谢工程等领域。例如，在大肠杆菌中，T7表达系统在非诱导条件下能使目标基因处于沉默状态，诱导表达后仅几个小时，目的蛋白即可占细胞总蛋白的50％以上；枯草芽孢杆菌中常用的诱导型启动子包括受IPTG诱导的Pspac启动子，受木糖的诱导的Pxyl启动子及受蔗糖诱导的PsacB启动子。虽然诱导型启动子存在上述优势，但在应用中也有自己的缺陷，例如诱导表达强度过低，诱导剂响应阈值不合适(灵敏度偏高或偏低)等问题，需要进一步研究和完善，获得更多表达效果好及诱导调控灵敏的启动子，以满足不同的表达条件。
根据突变体库的构建方法，进化可以分为体外进化和体内进化。体外进化运用最多的突变方法是易错PCR和DNA重排技术，模拟自然状态下的基因突变和同源重组，可以有效控制突变率等参数。基于易错PCR方法在体外快速构建突变库，经分子克隆、转化、高通量筛选等循环操作，产生符合要求的启动子突变体库。近些年来发展起来的细胞分选系统，如流式细胞仪和微流控，为超高通量筛选提供了高效方法。
发明内容
[技术问题]
本发明所要解决的技术问题是现有的诱导型启动子在应用过程中存在诱导表达强度过低、诱导剂响应阈值不合适(灵敏度偏高或偏低)的问题。
[技术方案]
本发明提供一种诱导型启动子进化的方法，该方法通过易错PCR对目标麦芽糖诱导型启动子Pglvc(Pglvc是含碳代谢元件cre序列发生突变的麦芽糖诱导启动子，有利于提高麦芽糖对该启动子的诱导，降低葡萄糖对该启动子的抑制)进行突变获得启动子突变体库，再通过偶联细胞生长的进化方法进行高通量筛选，获得不同响应灵敏度和强度的启动子突变体。
所述诱导型启动子进化的方法，是在麦芽糖诱导型启动子Pglvc后面设计一个双筛选标记的融合蛋白，融合蛋白能够同时发挥双重筛选标记和基因表达的定量报告的作用，从而反映麦芽糖诱导型启动子Pglvc及其突变体在不同条件下的转录强度；其中，tetA蛋白有将四环素转运出细胞保持耐四环素抗性和转运Ni2+进入细胞的功能，荧光蛋白作为报告蛋白用于对基因表达量进行定量。
所述诱导型启动子进化的方法，步骤包括：突变体库的构建、突变体库的筛选以及发酵验证，具体地：
(1)将绿色荧光蛋白基因EGFP连接到pHT01质粒上，获得质粒pHT01-EGFP；再将质粒pHT01-EGFP上的Pgrac启动子替换成启动子Pglv，得到质粒PHT01M1；
(2)对质粒pHT01M1进行线性PCR，以将Pglv启动子上的碳代谢元件cre序列上的GC突变为AT，得到携带突变启动子Pglvc的质粒pHT01M11；
(3)将四环素蛋白tetA基因C末端加上(GS)3柔性linker编码基因连接在质粒pHT01M11的绿色荧光蛋白基因EGFP之前，得到质粒pHT01MT；
(4)分别扩增pHT01MT质粒上的Pglvc、载体pHT01MT，通过易错PCR对启动子Pglvc进行随机突变得到启动子突变体库Pglvc*，常规PCR获得载体pHT01MT，将Pglvc*与载体进行一步克隆组装获得体外突变体库，得到质粒PHT01MT*；
(5)将质粒PHT01MT*转入宿主菌WB600，利用96孔板进行阳性筛选与阴性筛选，阳性筛选中添加2μg/mL的四环素，阴性筛选中添加6μM的NiCl2，其中，一次阳性筛选与阴性筛选被定义为一轮筛选，总共分三轮进行筛选；第一轮阳性筛选添加4g/L麦芽糖，阴性筛选添加2g/L麦芽糖；第二轮阳性筛选添加8g/L麦芽糖，阴性筛选添加4g/L麦芽糖；第三轮阳性筛选添加12g/L麦芽糖，阴性筛选8g/L麦芽糖；
(6)将三轮筛选中得到的携带启动子突变体的菌种进行孔板发酵验证，检测启动子突变体对诱导剂麦芽糖的响应阈值与响应强度。
本发明提供诱导型启动子突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供携带所述诱导型启动子突变体的载体，是pP43NMK、pHT01、pMA5、pHY300等用于枯草芽孢杆菌表达蛋白的质粒。
本发明还提供应用所述诱导型启动子突变体的表达系统，宿主是枯草芽孢杆菌WB600、枯草芽孢杆菌168或枯草芽孢杆菌800，可用于表达蛋白。
所述表达系统的使用方法是通过对荧光蛋白的表达量的检测来反应培养体系中诱导剂麦芽糖的浓度，进而能反映出以麦芽糖为产物的相关酶的活性；也可通过不同荧光蛋白的响应强度筛选出不同表达强度的麦芽糖启动子突变体。
[有益效果]
本发明在进化启动子时，在麦芽糖诱导型启动子Pglvc后面设计一个双筛选标记的融合蛋白，其中，tetA蛋白有将四环素转运出细胞保持耐四环素抗性和转运Ni2+进入细胞的功能，荧光蛋白用于定量基因的表达，因此，融合蛋白能够同时发挥双重筛选标记和基因表达的定量报告的作用，从而反映麦芽糖诱导型启动子Pglvc及其突变体在不同条件下的转录强度。
本发明的进化方法用四环素作为阳性筛选标记，去除那些阈值过高或者无反应的启动子，这些启动子在高浓度麦芽糖存在时无法有效表达tetA蛋白，就不能在含有四环素的条件下正常生长；用Ni2+进行阴性筛选，去除低阈值的启动子，因为这些启动子在低浓度麦芽糖存在时就能有效表达tetA蛋白，向胞内转运Ni2+，导致细菌生长缓慢。
本发明的诱导型启动子的进化方法，通过易错PCR获得目标启动子突变体库，操作简单而高效，同时配合偶联细胞生长的高通量筛选能直观、快速地从足够大的突变体库中快速筛选出符合目标的突变体，实现目标启动子的快速进化。
本发明进化得到的诱导型启动子对诱导剂麦芽糖的响应阈值范围从0-3g/L扩展至0-25g/L，最高诱导表达强度较原始启动子提高约3.5倍。
附图说明
图1：融合蛋白表达质粒与质粒突变体库的构建
图2：进化筛选方法示意图
图3：进化方法验证
图4：原始启动子的阈值
图5：24孔板发酵验证
具体实施方式
本发明通过易错PCR进化方法将目标启动子进行随机突变，获得突变体库，再利用偶联细胞生长的方法进行高通量筛选，获得不同诱导强度与响应灵敏度的启动子突变体。
LB：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，调节pH至7.2-7.4，121℃高温高压灭菌20min。
实施例1：突变体库的构建
1、融合蛋白(双筛选标记)表达质粒的构建：
(1)引物设计：
EGFP01-F：TAAAGGAGGAAGGATCCatgggtaagggagaagaacttttcactg(SEQ ID NO.7)
EGFP01-R：GACGTCGACTCTAGAttatttgtatagttcatccatgccatgtgtaatc(SEQ IDNO.8)
PHT01-F:taaTCTAGAGTCGACGTCCCCG(SEQ ID NO.9)
PHT01-R:GGATCCTTCCTCCTTTAATTGGGAATTGTTATC(SEQ ID NO.10)
Pglv-F：CACCGGAATTAGCTTGGTACCCCCCTGCCTTTTCTAAATTCACGC(SEQ ID NO.11)
Pglv-R：cttctcccttacccatGGATCCTTCCTCCTTTTTATGGAGTGAAAGTGCTC(SEQ IDNO.12)
PGLV-M1-F：GAATTGTAAAATTTATCAAGGAGGTCGTCATATGAAGAAAAAATCATTCTCAATCGT(SEQ ID NO.13)
PGLV-M1-R：CTCCTTGATAAATTTTACAATTCCATTTATACCATGAGATAGCTCGTC(SEQ IDNO.14)
TET-F:CATAAAAAGGAGGAAGGATCCgtgaatacatcctattcacaatcgaatttacgacac(SEQID NO.15)
TET-R:CAGAACCACCACCACCAGAACCGCCACCgaaatccctttgagaatgtttatatacattcaaggtaac cag(SEQ ID NO.16)
PTV-F:GTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGCGGTTCTatgggtaagggagaagaacttttcactg(SEQ ID NO.17)
PTV-R:GGATCCTTCCTCCTTTTTATGGAGTGAAAG(SEQ ID NO.18)
(2)使用引物PHT01-F/PHT01-R、EGFP01-F/EGFP01-R扩增载体PHT01与EGFP基因，采用Seamless cloning master连接载体PHT01与EGFP基因获得质粒PHT01-EGFP。
(3)利用酶KpnI(酶切位点：GGTACC)与BamHI(酶切位点：GGATCC)对质粒PHT01-EGFP进行酶切，得到PHT01载体片段，用引物Pglv-F/Pglv-R从B.subtilis 168菌株基因组扩增得到启动子Pglv，采用Seamless cloning master连接PHT01载体片段与启动子Pglv获得质粒PHT01M1。
(4)用引物PGLV-M1-F/PGLV-M1-R对质粒PHT01M1进行线性PCR，以将Pglv启动子上的碳代谢元件cre序列上的GC突变为AT，得到携带突变后的启动子Pglvc的质粒PHT01M11。
(5)用引物TET-F/TET-R扩增四环素蛋白tetA基因，用引物、PTV-F/PTV-R扩增质粒PHT01M11载体片段，再通过一步克隆将四环素蛋白tetA基因与PHT01M11载体连接起来，得到融合蛋白的表达质粒PHT01MT。
2、突变体库的构建：
(6)引物设计：
PG-F：GTTTCCACCGGAATTAGCTTGGTACC(SEQ ID NO.19)
PG-R:gatgtattcacGGATCCTTCCTCCTTTTTATG(SEQ ID NO.20)
PGV-F:CATAAAAAGGAGGAAGGATCCgtgaatacatc(SEQ ID NO.21)
PGV-R:GCTAATTCCGGTGGAAACGAGGTC(SEQ ID NO.22)
(7)用引物PG-F/PG-R、PGV-F/PGV-R分别扩增Pglvc基因与载体PHT01MT用内切酶DpnI对PCR产物进行消化后回收。
(8)以回收得到的Pglvc基因为模板，使用易错试剂盒对Pglvc进行随机突变，得到启动子突变体库Pglvc*，然后将基因与载体PHT01MT进行一步克隆组装，如图1，得到质粒突变库PHT01MT*。
(9)将(8)中得到的PHT01MT*质粒转化JM109，获得突变体库，随机挑取转化子进行测序，计算平均突变率，约2.6mutations/1kb，再从JM109中提取质粒库，转化至宿主菌枯草芽孢杆菌WB600，获得突变体库。
实施例2：突变体库的筛选
1、进化方法的验证
在LB培养基中分别添加0g/L、1g/L、3g/L、5g/L、7g/L、10g/L麦芽糖对含Pglvc启动子的菌株进行培养，在30℃、220r/min条件下培养12h后通过细胞的荧光强度来检测不同浓度麦芽糖对启动子Pglvc的响应阈值。结果如图4，在添加麦芽糖后的荧光响应值显示该启动子的阈值在0-3g/L范围内。
将Pglvc启动子用于筛选方法的验证，先将转入质粒PHT01MT的枯草芽孢杆菌WB600培养至OD600约1.0左右，添加不同浓度的麦芽糖与筛选标记，培养6h后，检测OD600，菌体生长情况如图3，结果显示，添加四环素时，浓度在2μg/mL效果明显，随着诱导剂浓度的增加，菌体生长增强；而添加Ni2+6μmol的效果比较明显，随着诱导剂浓度的增加，菌体生长受到抑制。证明该进化方法可行。
2、突变体库的筛选
将实施例1步骤(9)中得到的突变体库中的转化菌株用96孔板进行阳性筛选与阴性筛选(图2)。
阳性筛选中，将菌株培养至OD600约1.0左右后，添加2μg/mL的四环素和每一轮对应浓度的麦芽糖(第一轮筛选4g/L，第二轮筛选8g/L，第三轮筛选12g/L)，培养6h后，检测OD600，筛选生长较好的菌株进入阴性筛选。
阴性筛选中，将菌株培养至OD600约1.0左右，添加6μmol Ni2+和每一轮对应浓度的麦芽糖(第一轮筛选2g/L，第二轮筛选4g/L，第三轮筛选8g/L)，培养6h后，检测OD600，筛选生长较好的菌株进行发酵验证。
挑选出八株生长情况较好的菌株，编号为MT1、MT2、MT3、MT4、MT5、MT6、MT7、MT8，用24孔板进行发酵验证。
以含PHT01MT质粒的WB600菌株为对照(control)，与挑选的八株菌一起进行发酵。挑取单菌落至24孔板(3mL液体LB)中，以3％的接种量接种，于30℃培养至OD600约1.0左右，再分别加入不同浓度诱导剂麦芽糖(浓度分别为0g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L)，30℃培养6h后，取样检测单位细胞OD所表达的荧光强度。
如图5，筛选到的突变体MT2、MT3、MT4、MT5，较对照菌株诱导阈值扩大，灵敏度更高，能用于检测浓度为0-25(20)g/L的麦芽糖；突变体MT6的荧光强度比对照菌株提升了3.15倍，MT8荧光强度比对照菌株提升了2倍，较对照菌株，其诱导强度更高，可作为枯草芽孢杆菌中高效诱导异源蛋白表达的诱导表达系统。
将发酵验证筛选得到的突变体MT2、MT3、MT4、MT5、MT6、MT8进行测序，其DNA序列与易错PCR之前的模板(Pglvc)序列均有1处变化，即MT2的突变为T280C，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示；MT3的突变为C215T，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；MT4的突变为T183A，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；MT5的突变为G363A，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；MT6的突变为T382C，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；MT8的突变为G32A，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
SEQ ID NO.1
CCCCTGCCTTTTCTAAATTCACGCACAATTGGATGTTTTATATAAATGATTATAAATAATTCGGCATGTATCCGAATCGTACAAAAGAACCTTTTCATAAGAATTGGAAGGGCGTATATTCACTTAAAATTCACAGTTGGTGAGACTTTAAGATTACAAAAAAGGTAAAAAAACCAAATCTCTCAGACATAAGGCAAATGAGAAATTTCCCGCTCTATGGGAAAAAACACTAAAGTTGATCAAATGACCTAAGTGCGCCAAACGTGTTACGGGACGAGCCATCTCATGGTATAAATGGAATTGTAAAATTTATCAAGGAGGTCGTCATATGAAGAAAAAATCATTCTCAATCGTAATAGCGGGCGGAGGGAGCACTTTCACTCCA
SEQ ID NO.2
CCCCTGCCTTTTCTAAATTCACGCACAATTGGATGTTTTATATAAATGATTATAAATAATTCGGCATGTATCCGAATCGTACAAAAGAACCTTTTCATAAGAATTGGAAGGGCGTATATTCACTTAAAATTCACAGTTGGTGAGACTTTAAGATTACAAAAAAGGTAAAAAAACCAAATCTCTCAGACATAAGGCAAATGAGAAATTTCCCGCTTTATGGGAAAAAACACTAAAGTTGATCAAATGACCTAAGTGCGCCAAACGTGTTACGGGACGAGCTATCTCATGGTATAAATGGAATTGTAAAATTTATCAAGGAGGTCGTCATATGAAGAAAAAATCATTCTCAATCGTAATAGCGGGCGGAGGGAGCACTTTCACTCCA
SEQ ID NO.3
CCCCTGCCTTTTCTAAATTCACGCACAATTGGATGTTTTATATAAATGATTATAAATAATTCGGCATGTATCCGAATCGTACAAAAGAACCTTTTCATAAGAATTGGAAGGGCGTATATTCACTTAAAATTCACAGTTGGTGAGACTTTAAGATTACAAAAAAGGTAAAAAAACCAAATCTCACAGACATAAGGCAAATGAGAAATTTCCCGCTCTATGGGAAAAAACACTAAAGTTGATCAAATGACCTAAGTGCGCCAAACGTGTTACGGGACGAGCTATCTCATGGTATAAATGGAATTGTAAAATTTATCAAGGAGGTCGTCATATGAAGAAAAAATCATTCTCAATCGTAATAGCGGGCGGAGGGAGCACTTTCACTCCA
SEQ ID NO.4
CCCCTGCCTTTTCTAAATTCACGCACAATTGGATGTTTTATATAAATGATTATAAATAATTCGGCATGTATCCGAATCGTACAAAAGAACCTTTTCATAAGAATTGGAAGGGCGTATATTCACTTAAAATTCACAGTTGGTGAGACTTTAAGATTACAAAAAAGGTAAAAAAACCAAATCTCTCAGACATAAGGCAAATGAGAAATTTCCCGCTCTATGGGAAAAAACACTAAAGTTGATCAAATGACCTAAGTGCGCCAAACGTGTTACGGGACGAGCTATCTCATGGTATAAATGGAATTGTAAAATTTATCAAGGAGGTCGTCATATGAAGAAAAAATCATTCTCAATCGTAATAGCGGACGGAGGGAGCACTTTCACTCCA
SEQ ID NO.5
CCCCTGCCTTTTCTAAATTCACGCACAATTGGATGTTTTATATAAATGATTATAAATAATTCGGCATGTATCCGAATCGTACAAAAGAACCTTTTCATAAGAATTGGAAGGGCGTATATTCACTTAAAATTCACAGTTGGTGAGACTTTAAGATTACAAAAAAGGTAAAAAAACCAAATCTCTCAGACATAAGGCAAATGAGAAATTTCCCGCTCTATGGGAAAAAACACTAAAGTTGATCAAATGACCTAAGTGCGCCAAACGTGTTACGGGACGAGCTATCTCATGGTATAAATGGAATTGTAAAATTTATCAAGGAGGTCGTCATATGAAGAAAAAATCATTCTCAATCGTAATAGCGGGCGGAGGGAGCACTTTCACCCCA
SEQ ID NO.6
CCCCTGCCTTTTCTAAATTCACGCACAATTGAATGTTTTATATAAATGATTATAAATAATTCGGCATGTATCCGAATCGTACAAAAGAACCTTTTCATAAGAATTGGAAGGGCGTATATTCACTTAAAATTCACAGTTGGTGAGACTTTAAGATTACAAAAAAGGTAAAAAAACCAAATCTCTCAGACATAAGGCAAATGAGAAATTTCCCGCTCTATGGGAAAAAACACTAAAGTTGATCAAATGACCTAAGTGCGCCAAACGTGTTACGGGACGAGCTATCTCATGGTATAAATGGAATTGTAAAATTTATCAAGGAGGTCGTCATATGAAGAAAAAATCATTCTCAATCGTAATAGCGGGCGGAGGGAGCACTTTCACTCCA
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种诱导型启动子的进化方法及其应用
<130> BAA210173A
<160> 22
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 385
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cccctgcctt ttctaaattc acgcacaatt ggatgtttta tataaatgat tataaataat 60
tcggcatgta tccgaatcgt acaaaagaac cttttcataa gaattggaag ggcgtatatt 120
cacttaaaat tcacagttgg tgagacttta agattacaaa aaaggtaaaa aaaccaaatc 180
tctcagacat aaggcaaatg agaaatttcc cgctctatgg gaaaaaacac taaagttgat 240
caaatgacct aagtgcgcca aacgtgttac gggacgagcc atctcatggt ataaatggaa 300
ttgtaaaatt tatcaaggag gtcgtcatat gaagaaaaaa tcattctcaa tcgtaatagc 360
gggcggaggg agcactttca ctcca 385
<210> 2
<211> 385
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cccctgcctt ttctaaattc acgcacaatt ggatgtttta tataaatgat tataaataat 60
tcggcatgta tccgaatcgt acaaaagaac cttttcataa gaattggaag ggcgtatatt 120
cacttaaaat tcacagttgg tgagacttta agattacaaa aaaggtaaaa aaaccaaatc 180
tctcagacat aaggcaaatg agaaatttcc cgctttatgg gaaaaaacac taaagttgat 240
caaatgacct aagtgcgcca aacgtgttac gggacgagct atctcatggt ataaatggaa 300
ttgtaaaatt tatcaaggag gtcgtcatat gaagaaaaaa tcattctcaa tcgtaatagc 360
gggcggaggg agcactttca ctcca 385
<210> 3
<211> 385
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cccctgcctt ttctaaattc acgcacaatt ggatgtttta tataaatgat tataaataat 60
tcggcatgta tccgaatcgt acaaaagaac cttttcataa gaattggaag ggcgtatatt 120
cacttaaaat tcacagttgg tgagacttta agattacaaa aaaggtaaaa aaaccaaatc 180
tcacagacat aaggcaaatg agaaatttcc cgctctatgg gaaaaaacac taaagttgat 240
caaatgacct aagtgcgcca aacgtgttac gggacgagct atctcatggt ataaatggaa 300
ttgtaaaatt tatcaaggag gtcgtcatat gaagaaaaaa tcattctcaa tcgtaatagc 360
gggcggaggg agcactttca ctcca 385
<210> 4
<211> 385
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cccctgcctt ttctaaattc acgcacaatt ggatgtttta tataaatgat tataaataat 60
tcggcatgta tccgaatcgt acaaaagaac cttttcataa gaattggaag ggcgtatatt 120
cacttaaaat tcacagttgg tgagacttta agattacaaa aaaggtaaaa aaaccaaatc 180
tctcagacat aaggcaaatg agaaatttcc cgctctatgg gaaaaaacac taaagttgat 240
caaatgacct aagtgcgcca aacgtgttac gggacgagct atctcatggt ataaatggaa 300
ttgtaaaatt tatcaaggag gtcgtcatat gaagaaaaaa tcattctcaa tcgtaatagc 360
ggacggaggg agcactttca ctcca 385
<210> 5
<211> 385
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cccctgcctt ttctaaattc acgcacaatt ggatgtttta tataaatgat tataaataat 60
tcggcatgta tccgaatcgt acaaaagaac cttttcataa gaattggaag ggcgtatatt 120
cacttaaaat tcacagttgg tgagacttta agattacaaa aaaggtaaaa aaaccaaatc 180
tctcagacat aaggcaaatg agaaatttcc cgctctatgg gaaaaaacac taaagttgat 240
caaatgacct aagtgcgcca aacgtgttac gggacgagct atctcatggt ataaatggaa 300
ttgtaaaatt tatcaaggag gtcgtcatat gaagaaaaaa tcattctcaa tcgtaatagc 360
gggcggaggg agcactttca cccca 385
<210> 6
<211> 385
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cccctgcctt ttctaaattc acgcacaatt gaatgtttta tataaatgat tataaataat 60
tcggcatgta tccgaatcgt acaaaagaac cttttcataa gaattggaag ggcgtatatt 120
cacttaaaat tcacagttgg tgagacttta agattacaaa aaaggtaaaa aaaccaaatc 180
tctcagacat aaggcaaatg agaaatttcc cgctctatgg gaaaaaacac taaagttgat 240
caaatgacct aagtgcgcca aacgtgttac gggacgagct atctcatggt ataaatggaa 300
ttgtaaaatt tatcaaggag gtcgtcatat gaagaaaaaa tcattctcaa tcgtaatagc 360
gggcggaggg agcactttca ctcca 385
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
taaaggagga aggatccatg ggtaagggag aagaactttt cactg 45
<210> 8
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gacgtcgact ctagattatt tgtatagttc atccatgcca tgtgtaatc 49
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
taatctagag tcgacgtccc cg 22
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggatccttcc tcctttaatt gggaattgtt atc 33
<210> 11
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
caccggaatt agcttggtac ccccctgcct tttctaaatt cacgc 45
<210> 12
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cttctccctt acccatggat ccttcctcct ttttatggag tgaaagtgct c 51
<210> 13
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gaattgtaaa atttatcaag gaggtcgtca tatgaagaaa aaatcattct caatcgt 57
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctccttgata aattttacaa ttccatttat accatgagat agctcgtc 48
<210> 15
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cataaaaagg aggaaggatc cgtgaataca tcctattcac aatcgaattt acgacac 57
<210> 16
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cagaaccacc accaccagaa ccgccaccga aatccctttg agaatgttta tatacattca 60
aggtaac 67
<210> 17
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gttctggtgg tggtggttct ggtggcggtt ctatgggtaa gggagaagaa cttttcactg 60
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ggatccttcc tcctttttat ggagtgaaag 30
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gtttccaccg gaattagctt ggtacc 26
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
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gatgtattca cggatccttc ctccttttta tg 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
cataaaaagg aggaaggatc cgtgaataca tc 32
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gctaattccg gtggaaacga ggtc 24

Claims (10)

1.一种诱导型启动子进化的方法，其特征在于，通过易错PCR对麦芽糖诱导型启动子进行突变获得启动子突变体库，再通过偶联细胞生长的方式高通量筛选突变体，获得不同响应灵敏度和强度的启动子突变体；
所述麦芽糖诱导型启动子后连有编码融合蛋白的基因，所述融合蛋白能够同时发挥双重筛选标记和定量报告基因表达量的作用，从而反映麦芽糖诱导型启动子及其突变体在不同条件下的转录强度；融合蛋白之中的tetA蛋白有将四环素转运出细胞保持耐四环素抗性和转运Ni2+进入细胞的功能，荧光蛋白作为报告蛋白用于对基因表达量进行定量。
2.根据权利要求1所述的一种诱导型启动子进化的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)将绿色荧光蛋白基因连接到pHT01质粒上，获得质粒pHT01-EGFP；再将质粒pHT01-EGFP上的Pgrac启动子替换成启动子Pglv，得到质粒PHT01M1；
(2)对质粒pHT01M1进行线性PCR，以将Pglv启动子上的碳代谢元件cre序列上的GC突变为AT，得到携带突变启动子Pglvc的质粒pHT01M11；
(3)将四环素蛋白tetA基因C末端加上(GS)3柔性linker编码基因，然后连接在质粒pHT01M11的绿色荧光蛋白基因之前，得到质粒pHT01MT；
(4)分别扩增pHT01MT质粒上的Pglvc、载体pHT01MT，通过易错PCR对启动子Pglvc进行随机突变得到启动子突变体库Pglvc*，常规PCR获得载体pHT01MT，将Pglvc*与载体pHT01MT进行一步克隆组装获得体外突变体库，得到质粒PHT01MT*；
(5)将质粒PHT01MT*转入宿主菌WB600，利用96孔板进行阳性筛选与阴性筛选，阳性筛选中添加四环素，阴性筛选中添加NiCl2，其中，一次阳性筛选与阴性筛选被定义为一轮筛选，总共分三轮进行筛选；第一轮阳性筛选添加4g/L麦芽糖，阴性筛选添加2g/L麦芽糖；第二轮阳性筛选添加8g/L麦芽糖，阴性筛选添加4g/L麦芽糖；第三轮阳性筛选添加12g/L麦芽糖，阴性筛选8g/L麦芽糖；
(6)将三轮筛选中得到的携带启动子突变体的菌种进行孔板发酵验证，检测启动子突变体对诱导剂麦芽糖的响应阈值与响应强度。
3.诱导型启动子突变体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
4.携带权利要求3所述诱导型启动子突变体的载体。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，是用于在枯草芽孢杆菌中表达蛋白的载体。
6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于，是pP43NMK、pHT01、pMA5或pHY300。
7.应用权利要求3所述诱导型启动子的表达系统。
8.根据权利要求7所述的表达系统，其特征在于，宿主包括但不限于枯草芽孢杆菌WB600、枯草芽孢杆菌168或枯草芽孢杆菌800。
9.权利要求7所述的表达系统在表达异源蛋白中的应用。
10.权利要求8所述的表达系统在表达异源蛋白中的应用。
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