CN110592080A - 优化的麦芽糖启动子突变体及其应用 - Google Patents

优化的麦芽糖启动子突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明以芽孢杆菌为出发菌株，以麦芽糖启动子中的碳代谢响应元件cre改造靶点，同时融合赖氨酸核糖开关，构建麦芽糖启动子突变体，获得可降低麦芽糖启动子渗漏表达并提高其诱导表达强度的突变体，构建了含有上述启动子突变体的表达载体及宿主细胞，从而有利于麦芽糖启动子在蛋白表达中的应用。

Description

优化的麦芽糖启动子突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及麦芽糖启动子突变体，及含有麦芽糖启动子突变体的表达载体与宿主菌株。
背景技术
枯草芽孢杆菌启动子是实现基因高效表达的关键元件之一。近年来，在启动子的研究方面开展了大量的工作并取得了长足的进展，克隆获得了一批可以应用于枯草芽孢杆菌的启动子。但是，枯草芽孢杆菌的现有启动子在数量、表达量和调控方式等方面存在着诸多问题。需要进一步研究和完善，获得更多表达强度高，诱导调控方便的启动子元件。在枯草芽孢杆菌中常用的启动子系统有Pspac、Pxyl和PsacB系统，这三个启动子系统在枯草杆菌研究工作中应用很广，但它们也有自己的缺点：Pspac启动子的诱导物IPTG不仅成本高，而且有毒性；Pxyl启动子的诱导物木糖价格高，易增加生产成本；PsacB启动子的表达量相对较低。这些缺陷使得它们在工业生产中有一定的局限性。
相对于IPTG和木糖来说，麦芽糖作为诱导物价格便宜，成本低，且对细菌本身无毒性，是绝大多数细菌的偏好碳源，因此在工业上很有实用价值。在大规模多肽及重组蛋白工业生产中，应用枯草芽孢杆菌中的麦芽糖启动子，也具有很好的应用潜力。整个麦芽糖操纵子的转录过程是由结构基因上游的麦芽糖启动子PmalA控制，该操纵子包括三个结构基因malA、malR、malP，这三个基因在调控上起到重要作用。malA基因是编码水解通过磷酸烯醇式丙酮酸转移酶系统(PTS)转运到细胞内的磷酸化的麦芽糖的6-磷酸-α葡萄糖苷酶。malR基因则是整个操纵子的关键基因，该基因编码的调控蛋白可通过结合磷酸化的麦芽糖而被激活，激活的调控蛋白的N末端与麦芽糖启动子序列结合，促进了该启动子的转录表达，起到了正向调控的作用。malP编码的渗透蛋白是组成磷酸烯醇式丙酮酸系统组件，在转运麦芽糖过程中起到渗透作用。
然而，由于枯草芽孢杆菌中碳代谢阻遏(CCR)效应的存在，麦芽糖启动子PmalA受葡萄糖的负反馈抑制，从而制约了基于麦芽糖启动子PmalA的表达系统在含有葡萄糖碳源发酵时的应用。因此，通过优化麦芽糖启动子PmalA，解除葡萄糖对麦芽糖启动子PmalA的抑制，进而提高麦芽糖启动子PmalA的表达强度，是拓展其应用价值的有效策略。目前解除CCR效应的分子改造一般是通过敲除菌株中CCR效应的核心阻遏蛋白CcpA来实现，但是解除抑制效应的结果普遍较差，且CcpA为具有全局调控作用的转录因子，敲除CcpA后对菌株的碳源代谢利用和菌株生长均有负面影响，因此不适于工业菌株的改造。而针对CcpA在启动子区域的结合位点的突变改造同样不能有效解除CCR抑制效应，且常常对启动子强度有所影响。如何通过对启动子序列和菌株的改造有效消除CCR效应，同时不影响菌株的生理代谢状态是此方向的核心问题。
此外，诱导型强启动子常常存在着渗漏表达的情况，即在未添加诱导剂的条件下，启动子就已经部分开启表达，从而造成最终表达体系的不严谨性。在表达某些对宿主细胞有毒害的蛋白或是代谢途径基因时，甚至会造成细胞裂解死亡等情况。目前针对启动子渗漏表达的改造策略主要采用突变启动子-35/-10区核心区序列、增强阻遏因子蛋白结合位点(如lacO、xylO)、增强阻遏因子蛋白表达水平(如LacI、XylR)、降低激活因子蛋白表达水平(如在大肠杆菌BL21中利用T7RNAP蛋白酶来抑制T7RNAP的表达水平)、突变相应转录因子等方面。然而上述策略改造后常常会造成启动子渗漏表达和诱导表达强度的同时下降。因此，如何在保持原诱导表达强度的同时消除渗漏表达，是启动子改造中必需考虑的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明以芽孢杆菌为出发菌株，以麦芽糖启动子中的碳代谢响应元件cre改造靶点，同时融合赖氨酸核糖开关，构建麦芽糖启动子突变体，获得可降低麦芽糖启动子渗漏表达并提高其诱导表达强度的突变体，从而有利于麦芽糖启动子在蛋白表达中的应用。
第一方面，本发明提供了一种麦芽糖启动子突变体，其与原始麦芽糖启动子PmalA相比，碳代谢响应元件cre发生突变和/或含有赖氨酸核糖体开关序列。
优选地，所述碳代谢响应元件cre发生突变的方式为其核苷酸序列完全删除或部分删除或替换为其互补序列。
示例性地，碳代谢响应元件cre发生突变后的麦芽糖启动子突变体核苷酸序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3所示。
示例性地，含有赖氨酸核糖体开关的麦芽糖启动子突变体核苷酸序列如SEQ IDNO：4-SEQ ID NO：5所示。
示例性地，碳代谢响应元件cre发生突变和含有赖氨酸核糖体开关序列后的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
第二方面，本发明提供了一种表达载体，该表达载体含有第一方面所述的麦芽糖启动子突变体。
第三方面，本发明提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有第一方面所述的麦芽糖启动子突变体或第二方面所述的表达载体。
优选地，宿主细胞为芽孢杆菌；进一步优选地，为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌；更优选为枯草芽孢杆菌。
第四方面，本发明提供第一方面所述的麦芽糖启动子突变体第二方面所述表达载体或第三方面所述宿主细胞在多肽及重组蛋白制备中的应用。
附图说明
图1：不同麦芽糖启动子碳代谢响应元件突变体在添加葡萄糖条件下绿色荧光蛋白荧光信号强度(RFU)作图。
图2：麦芽糖启动子与赖氨酸核糖开关的联合突变体在表达绿色荧光蛋白GFP基因的荧光信号强度(RFU)作图。
图3：麦芽糖启动子与赖氨酸核糖开关、碳代谢阻遏元件联合突变体在表达绿色荧光蛋白GFP基因的荧光信号强度(RFU)作图。
具体实施方式
1.细菌菌株和生长条件：
大肠杆菌DH5α和枯草芽抱杆菌1A751(BGSC，USA)用作主要宿主，用于克隆和表达。大肠杆菌于37℃生长于LB液体培养基(Luria S.E.等人,Virology12,1960,348-390)和LB琼脂平板，其中补充了100μg/ml氨苄青霉素。枯草芽孢杆菌于37℃生长于LB液体培养基和SR发酵培养基。液体培养基和琼脂平板分别补充了20μg/ml卡那霉素或5μg/ml氯霉素。为了诱导麦芽糖启动子，加入无菌过滤的或高压灭菌的D-麦芽糖至1％(w/v)的最终浓度。
2.实验材料：
所有的化学品都获自Sigma-Aldrich或Merck。合成的DNA寡核昔酸购自金唯智Genewiz。限制性酶和DNA修饰酶购自New England Biolabs.。以来自Fermentas的高保真DNA聚合酶在来自Eppendorf的热循环仪上进行PCR。
3.DNA的制备和转化：
使用Tiangen或Omega的DNA制备试剂盒，根据生产商的说明书，从大肠杆菌和枯草芽抱杆菌或从琼脂糖凝胶分离DNA。在所有实施例中均使用标准的分子技术。使用如ChungC.T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,1989,21722175描述的质粒DNA转化大肠杆菌。根据改进的“Paris方法”(Harwood C.R.Molecular Biological Methods for Bacillus,1990,John Wiley&Sons Ltd.,England)，使用质粒DNA或DNA片段转化枯草芽抱杆菌。
4.绿色荧光蛋白荧光强度RFU的测定：
将培养至OD600约为0.6-0.8的待测菌株于4℃，4000rpm离心10分钟收集菌体，用预冷的PBS溶液洗涤菌体2次，转移150μL至96孔黑色底透酶标板(Corning,USA)中，放置于微孔板SpectraMax M2酶标仪(Molecular Devices,USA)于室温条件下483nm/525nm激发并检测荧光发射光强度RFU，于600nm测定菌体浓度，荧光强度计算按照RFU/OD600计算。
5.枯草芽孢杆菌基因无痕敲除：
根据改进的“基于AraR的枯草芽孢杆菌基因敲除方法”(Liu S,Endo K,etal.Microbiology.2008；154(Pt 9):2562–2570.)进行基因无痕敲除。首先利用同源重组原理将携带同源臂的受阿拉伯糖启动子调控的壮观霉素抗性基因片段“Para-spc”通过转化方法转入枯草芽孢杆菌1A751菌株中，替换基因组上的AraR基因，构建原始的基因敲除原始菌，其带有壮观霉素抗性。需要敲除基因X时，分别克隆X基因的上游1Kb片段(命名为UP)、下游1Kb片段(命名为DN)、待敲除基因X片段(命名为G)以及带有AraR基因和氯霉素抗性基因cat的筛选片段(命名为CR)，利用overlap-PCR方法将上述4个片段以“UP-DN-CR-G”的顺序融合为一个片段，并通过转化方法转入枯草芽孢杆菌1A751中进行同源重组，以氯霉素抗性筛选转化子。将得到的转化子在壮观霉素抗性LB平板上验证，选取在氯霉素上生长、而在壮观霉素上不生长的转化子作为阳性转化子。将阳性转化子在无抗性的LB培养基中以37℃，200rpm培养16小时，取10uL菌液涂布于壮观霉素抗性平板上进行筛选，将得到的转化子通过菌落PCR进行验证，确定基因是否敲除。将菌落PCR验证正确的菌株作为敲除X基因的菌株进行保存。
表1
表2
实施例1麦芽糖启动子中碳代谢响应元件的突变体构建
由于枯草芽孢杆菌麦芽糖代谢途径中CCR效应的存在，制约了基于麦芽糖启动子PmalA的表达系统在含有葡萄糖碳源发酵时的应用。为了解除CCR效应，通过将麦芽糖启动子PmalA中负责与碳代谢阻遏蛋白ccpA相作用的碳代谢响应元件cre(cataboliteresponse element,cre)进行突变，可部分解除CCR效应，构建方法如下。将GFP荧光蛋白基因通过NdeI/BamHI酶切位点插入pMATE载体上，构建出pMATE-GFP载体。进而以pMATE-GFP载体为模板，cre-del1.for/cre-del1.rev及cre-del2.for/cre-del2.rev为引物，将枯草芽孢杆菌麦芽糖启动子PmalA中13bp的cre元件序列(GTAAAATTTATCA)通过反向PCR的方法进行完全删除(del1)或部分删除(del2)，或者以cre-comp.for/cre-comp.rev为引物，将cre元件替换为其互补序列，而后通过体外T4磷酸化激酶和T4连接酶进行PCR片段的磷酸化及环化连接，构建缺失碳代谢响应元件的麦芽糖表达载体突变体pMATE-cre-del1-GFP、pMATE-cre-del2-GFP和pMATE-cre-comp-GFP，其所携带的麦芽糖启动子突变体序列如SEQID NO：1-SEQ ID NO：3所示。将上述构建的突变体质粒转化导入枯草芽孢表达宿主菌1A751中，利用带有卡那霉素抗性的LB固体培养基平板进行筛选，所获得的转化子经过PCR验证正确后保存，分别获得遗传改造菌株cre-del1、cre-del2和cre-comp。将上述3种麦芽糖启动子PmalA突变菌株接种LB培养基，以转化了野生型麦芽糖启动子PmalA表达载体pMATE-GFP的菌株为对照组，于37℃，220rpm，在1％麦芽糖并添加梯度浓度(0.25-2％)的葡萄糖条件下诱导培养，而后利用酶标仪测量GFP荧光强度，评价不同碳代谢响应元件缺失突变体对解除CCR效应的效果。
从图1结果可知，麦芽糖启动子PmalA的碳代谢响应元件缺失突变体cre-del1、cre-del2和cre-comp在1％麦芽糖添加0.25％葡萄糖条件下，部分解除了CCR效应。且3个麦芽糖启动子的碳代谢响应元件缺失突变体cre-del1、cre-del2和cre-comp在未诱导条件下均表现出更低的渗漏表达水平，其中cre-comp突变体的渗漏表达最低，与对照相比下降了22倍；与对照相比诱导后强度也发生了提高(约16.6％)，此时诱导倍数(诱导后/诱导前)达到44倍。
实施例2枯草芽孢杆菌ptsG敲除菌株的构建
此外，通过敲除枯草芽孢杆菌中葡萄糖转运蛋白基因ptsG，可以弱化葡萄糖的胞内运输，达到解除CCR效应的作用。通过利用基于AraR的枯草芽孢杆菌无痕敲除技术，将枯草芽孢杆菌1A751表达宿主菌中的ptsG基因进行敲除，构建了1A751△ptsG基因工程菌株。将野生型麦芽糖启动子表达载体pMATE-GFP及上述构建的碳代谢响应元件缺失突变体pMATE-cre-del1-GFP、pMATE-cre-del2-GFP和pMATE-cre-comp-GFP转化至1A751△ptsG基因工程菌株中，于37℃，220rpm，1％麦芽糖并添加梯度浓度(0.25-2％)的葡萄糖条件下诱导培养，而后利用酶标仪测量GFP荧光强度，评价敲除葡萄糖转运蛋白基因ptsG的基因工程菌株对解除CCR效应的效果。
从图1结果可知，在敲除葡萄糖转运蛋白基因ptsG的基因工程菌株中，对照组与突变体cre-del1、cre-del2在不同浓度的葡萄糖存在下均解除了CCR效应，突变体cre-comp在0.25％的低浓度葡萄糖条件下CCR效应有所解除。上述实验结果表明，麦芽糖启动子PmalA缺失碳代谢响应元件后，在0.25％的低浓度葡萄糖存在的条件下，能够部分缓解碳代谢阻遏效应(即CCR效应)，配合使用敲除葡萄糖转运蛋白基因ptsG的基因工程菌株△ptsG后，启动子碳代谢响应元件缺失突变体cre-del1、cre-del2和改造前对照启动子在不同浓度葡萄糖存在下，CCR效应均被解除。
实施例3融合赖氨酸核糖开关的麦芽糖启动子的构建
在长时间发酵过程中，诱导型启动子的渗漏表达往往会提前启动目的蛋白质或寡肽的表达，从而影响宿主细胞的生长状态，尤其是在表达对宿主细胞具有毒性的目的蛋白质或寡肽时尤为明显。核糖开关(riboswitch)是一类位于mRNA3'-或5'-UTR上的能够结合小分子代谢物以调控基因的转录和翻译的mRNA顺时作用元件。为了获得更为严谨的、渗漏表达水平更低的麦芽糖启动子突变体，我们将受赖氨酸激活调控的核糖开关riboswitch(ACS Synthetic Biology.2015,DOI:10.1021/acssynbio.5b00075)连接至麦芽糖启动子3’末端，利用赖氨酸核糖开关在转录或翻译水平上的调控作用降低麦芽糖启动子突变体的渗漏表达水平，即只有在同时添加麦芽糖和赖氨酸两种诱导物的条件下，启动子才开启目的基因的转录，从而达到降低渗漏表达水平的目的。
我们以麦芽糖启动子表达载体pMATE-GFP为基础，选取并扩增了10种不同的赖氨酸诱导激活型riboswitch序列(所用引物序列如表1所示)，克隆连接至麦芽糖启动子3’末端，构建出10种具有赖氨酸核糖开关riboswitch的麦芽糖启动子突变载体pMATE-GFP-lysM03/07/16/17/22/28/34/42/59/69。将上述突变表达载体转化至枯草芽孢杆菌1A751后，在不添加诱导物、添加1％麦芽糖诱导物、添加1％麦芽糖及2mM赖氨酸诱导物条件下，对上述载体突变体菌株进行GFP诱导表达及荧光测定。图2结果显示，在不添加诱导物条件下，pMATE-GFP-lysM16/59两个突变体具有较低的渗漏表达，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO：4-5，且添加1％麦芽糖及2mM赖氨酸诱导物后，M59诱导后表达强度更高，因此选择pMATE-GFP-lysM59赖氨酸riboswitch作为低渗漏型麦芽糖诱导表达载体。
实施例4融合赖氨酸核糖开关的麦芽糖启动子突变体的构建
根据实施例1和实施例2中的结果，麦芽糖启动子的碳代谢响应元件缺失突变体cre-comp具有更低的渗漏表达和更高的诱导表达水平。因此在实施例3的基础上，以cre-comp.for/cre-comp.rev为引物进行反向PCR，将pMATE-GFP-lysM59载体上麦芽糖启动子上的碳代谢响应元件替换为其互补序列，而后通过体外T4磷酸化激酶和T4连接酶进行PCR片段的磷酸化及环化连接，构建出融合突变体pMATE-GFP-lysM59-comp，其所携带的麦芽糖启动子突变体序列为SEQ ID NO：6，将上述整合突变体转化枯草芽孢杆菌1A751后，于37℃，220rpm，1％麦芽糖及2mM赖氨酸作为诱导物条件下诱导培养，而后利用酶标仪测量GFP荧光强度，评价融合赖氨酸核糖开关的麦芽糖启动子突变体的表达效果。从图3结果可知，与pMATE-GFP和pMATE-GFP-lysM59对照组相比，整合突变体pMATE-GFP-lysM59-comp在未诱导条件下具有更低的渗漏表达，诱导后强度未发生明显变化，诱导倍数明显提升，达到了140倍。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 优化的麦芽糖启动子突变体及其应用
<130> 2018
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
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ggtggagcac ttctgccaaa tcgaagtagt cacgttcgta aacagacac 589
<210> 6
<211> 589
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 6
cttttgtccc ctgccttttc taaattcacg cacaattgga tgttttatat aaatgattat 60
aaataattcg gcatgtatcc gaatcgtaca aaagaacctt ttcataagaa ttggaagggc 120
gtatattcac ttaaaattca cagttggtga gactttaaga ttacaaaaaa ggtaaaaaaa 180
ccaaatctct cagacataag gcaaatgaga aatttctcgt gcttggtgaa aaaacactaa 240
agttgatcaa atgacctaag tgcgccaaac gtgttacggg acgagctatc tcatggtata 300
aatggaattg taaaatttat caaggaggtc gtcatggtac ctaaagtact acctgcgcta 360
gcgcaggcca gaagaggcgc gttgcccaag taacggtgtt ggaggagcca gtcctgtgat 420
aacacctgag ggggtgcatc gccgaggtga ttgaacggct ggccacgttc atcatcggct 480
acaggggctg aatcccctgg gttgtcacca gaagcgttcg cagtcgggcg tttcgcaagt 540
ggtggagcac ttcttgttta cgaacgtgac tacttcgatt tggcgacac 589

Claims (9)

1.一种麦芽糖启动子突变体，其特征在于，与原始麦芽糖启动子PmalA相比，碳代谢响应元件cre发生突变和/或含有赖氨酸核糖体开关序列。
2.如权利要求1所述的麦芽糖启动子突变体，其特征在于，所述碳代谢响应元件cre发生突变的方式为其核苷酸序列完全删除或部分删除或替换为其互补序列。
3.如权利要求1或2所述的麦芽糖启动子突变体，其特征在于，碳代谢响应元件cre发生突变后的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3所示。
4.如权利要求1所述的麦芽糖启动子突变体，其特征在于，所述含有赖氨酸核糖体开关的麦芽糖启动子突变体核苷酸序列如SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：5所示。
5.如权利要求1所述的麦芽糖启动子突变体，碳代谢响应元件cre发生突变和含有赖氨酸核糖体开关序列后的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1-5所述的麦芽糖启动子突变体。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求6所述的表达载体。
8.如权利要求7所述的宿主细胞为芽孢杆菌；优选地，为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌；更优选为枯草芽孢杆菌。
9.权利要求1-5任一所述的麦芽糖启动子突变体或权利要求6所述表达载体或权利要求7-8所述宿主细胞在多肽及重组蛋白制备中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113061608A (zh) * 2021-03-23 2021-07-02 江南大学 一种诱导型启动子的进化方法及其应用
CN113278620A (zh) * 2021-07-26 2021-08-20 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种突变的高渗诱导型启动子PproP及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110152215A1 (en) * 2002-09-20 2011-06-23 Yale University Riboswitches, methods for their use, and compositions for use with riboswitches
CN106591309A (zh) * 2016-12-07 2017-04-26 江南大学 一种茶碱诱导型基因表达系统
CN106676125A (zh) * 2015-11-05 2017-05-17 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种包含麦芽糖启动子的载体以及麦芽糖启动子突变体
CN108474009A (zh) * 2015-06-25 2018-08-31 阿迈瑞斯公司 麦芽糖依赖性降解决定子、麦芽糖响应型启动子、稳定化构建体及其在生成非分解代谢化合物中的用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110152215A1 (en) * 2002-09-20 2011-06-23 Yale University Riboswitches, methods for their use, and compositions for use with riboswitches
CN108474009A (zh) * 2015-06-25 2018-08-31 阿迈瑞斯公司 麦芽糖依赖性降解决定子、麦芽糖响应型启动子、稳定化构建体及其在生成非分解代谢化合物中的用途
CN106676125A (zh) * 2015-11-05 2017-05-17 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种包含麦芽糖启动子的载体以及麦芽糖启动子突变体
CN106591309A (zh) * 2016-12-07 2017-04-26 江南大学 一种茶碱诱导型基因表达系统

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIE YUE等: "A new maltose-inducible high-performance heterologous expression system in Bacillus subtilis", 《BIOTECHNOLOGY LETTERS》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113061608A (zh) * 2021-03-23 2021-07-02 江南大学 一种诱导型启动子的进化方法及其应用
CN113061608B (zh) * 2021-03-23 2022-12-13 江南大学 一种诱导型启动子的进化方法及其应用
CN113278620A (zh) * 2021-07-26 2021-08-20 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种突变的高渗诱导型启动子PproP及其应用
CN113278620B (zh) * 2021-07-26 2021-10-08 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种突变的高渗诱导型启动子PproP及其应用

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Assignee: Tianjin Chunyao Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: TIANJIN INSTITUTE OF INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES

Contract record no.: X2023980036854

Denomination of invention: Optimized Maltose promoter mutant and its application

Granted publication date: 20211123

License type: Common License

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