KR20000041583A - 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 분리한 신규한 메티오닌생합성 유전자 meta - Google Patents

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Abstract

본 발명은 메티오닌 생합성 경로 중 첫 번째 과정을 매개하는 효소인 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제(homoserine acetyl transferase)를 발현하는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로부터 분리한 신규한 유전자 metA에 관한 것으로 E.coli metA 변이균의 컴플리멘테이션에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰의 metA 유전자를 분리하고 분리된 유전자의 정체성을 E.coli metA 변이균의 컴플리멘테이션과 분리된 유전자에 의한 코리네박테리움 글루타미쿰에서 호모세린 아세틸트랜스퍼라제의 발현, 분리된 유전자에 의한 코리네박테리움에서의 특정 부위 유전자 파괴(site-specific gene disruption) 달성 및 염기서열 분석에 의해 확인된 다른 균들의 metA 유전자 산물과의 유사성을 비교한 결과, 본 발명은 metA 변이균의 컴플리멘테이션에 의해 신규한 코리네박테리움 글루타미쿰의 metA 유전자를 분리 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 분리한 신규한 메티오닌 생합성 유전자 ｍｅｔＡ
본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로부터 분리한 신규한 메티오닌 생합성 유전자 metA에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 메티오닌 생합성 경로 중 첫 번째 과정을 매개하는 효소인 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제(homoserine acetyl transferase)를 발현하는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 분리한 신규한 유전자 metA에 관한 것이다.
코리네박테리움 글루타미쿰은 아미노산과 핵산 등의 공업적 생산에 가장 광범위하게 이용되는 산업용 미생물의 하나로서, 특히 사료첨가물로서 이용되는 라이신(lysine) 등의 아스파테이트(aspartate) 계통 아미노산과 조미료의 원료인 글루타메이트(glutamate)의 생산에 중추적인 역할을 담당해 왔다 (Kinoshita, 1985). 식품업계나 사료업계에서는 아미노산 외에도 공업적 유용성이 높은 대사 중간 물질이나 최종 산물의 양을 증가시키기 위해 고전적인 변이방법과 유전자 조작을 통한 균주 개량을 코리네박테리아 및 유사 균주를 중심으로 많은 노력을 기울여 왔다.
현재까지 코리네박테리아에 적용된 균주개량은 대부분이 화학약품 처리에 의한 돌연변이유발(random mutagenesis) 후 각 용도에 알맞은 선별법을 적용하여 이루어 졌다(Liebl, 1991). 이러한 경로를 통해 개발된 균주들의 아미노산 대량 생산 이유는 일반적으로 세포내 피드백 조절 메카니즘(feedback control mechanism)의 기능상실에 의한다. 이러한 접근방법은 비교적 빠르고 손쉽게 원하는 균주를 얻을 수 있는 장점때문에 현재까지 균주개량에 광범위하게 이용되었지만, 동시에 변이자체의 불투명성이나 바람직하지 못한 변이의 축적으로 말미암아 생산균주들에 대한 생화학적, 생리학적 연구와 각 대사경로의 아미노산 생산에의 기여도 측정을 어렵게 하여 더 이상의 균주개량을 어렵게 하는 단점도 있다.
근래의 유전자 재조합기술의 비약적인 발전은 코리네박테리아의 균주개량에도 유전공학적 방법이 적용될 수 있는 터전을 마련하는 계기가 되었다. 지난 10년간 코리네박테리아를 대상으로 일련의 분자유전학적 도구들이 개발되었는데 그 대표적인 예로는 유전자-파괴 벡터(gene disruption vector)와 E.coli, 코리네박테리움 사이를 자유롭게 내왕할 수 있는 셔틀벡터(shuttle vector) 등을 들 수 있다(Jetten and Sinskey, 1995; Wohlleben et al., 1992). 최근에는 이러한 도구들을 이용하여 유전자 클로닝(gene cloning), 유전자 증폭(gene amplification), 유전자 불활성(gene inactivation) 등의 기술적 적용이 가능하게 되었고 이러한 진보에 힘입어 코리네박테리움에 있어서도 주로 아미노산 등의 세포내 대사경로 연구 및 아미노산 생산균주의 유전적 배경파악 등에 관하여 분자유전학 수준에서 연구의 진행이 가능하게 되었다 (Jetten and Sinskey, 1995; Kim et al., 1997; Kim and Lee, 1996; Malumbres and Martin, 1996; Sahm et al., 1995). 유전공학 방법을 이용한 균주개량은 목표 대사경로를 정확하게 분석 및 평가할 수 있는 점에서 고전적인 돌연변이 유발에 의한 방법의 한계점을 극복할 수 있을 것으로 여겨진다. 이러한 접근법의 궁극적인 목표는 세포내 대사경로를 정확하게 조절 및 통제하여 물질 대사상의 병목현상을 제거함과 동시에 중간물질의 공급을 원활하게 하여 원하는 대사산물의 생산량 및 속도를 극대화하는 것이다. 이러한 방법은 일차적으로 목표로 하는 대사경로에 관여하는 유전자를 분리하여 유전자 자원을 확보한 후 도구화하여 이루어진다. 현재까지 코리네박테리아(Corynebacteria)의 아미노산 생합성 경로 연구는 라이신(lysine)과 쓰레오닌(threonine)을 중심으로 분자유전학 측면에서 활발한 연구가 이루어 졌다 (Leibl, 1991). 라이신(Lysine), 쓰레오닌(threonine) 및 메티오닌(methionine) 등의 아스파테이트(aspartate) 계통 아미노산은 그 탄소골격의 대부분이 TCA회로 중간물질인 옥살로아세테이트(oxaloacetate)로 부터 유래한다. 옥살로아세테이트로 부터 생성된 아스파테이트(aspartate)는 일련의 과정을 거치면서 아스파토세미알데하이드(aspartosemialdehyde)로 전환되어 라이신(lysine)과 메티오닌(methionine) 등의 생합성 경로로 진입한다. 쓰레오닌 생합성 경로 중의 호모세린(homoserine)으로부터 메티오닌 생합성 경로가 시작되는데 E.coli 및 유사균의 경우 도 1에 나타낸 바와 같이 일반적으로 3종류의 중간물질을 거쳐 최종적으로 메티오닌(methionine)을 생성한다
이 중 첫 번째 대사 과정은 metA유전자의 발현산물인 호모세린 석시닐트랜스퍼라제(homoserine succinyltransferase)(EC 2.3.1.46)에 의해 수행된다. 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) 및 렙토스피라 마이에리(Leptospira myeri) 등의 균은 아실기 공여체로서 석시닐 CoA(succinylCoA) 대신에 아세틸 CoA(acetylCoA)를 이용하는 것으로 보고되어 E. coli와는 차이점을 보인다(Bourhy et al., 1997; Miyajima and Shiio, 1973; Wyman and Paulus, 1975). 두 번째 과정과 세 번째 과정은 metB 유전자의 발현산물인 cystathionine-γ-synthase(EC 4.2.99.9)와 metC 유전자의 발현산물인 cyctathionine-β-lyase (EC 4.4.1.8)에 의해 각각 수행된다. 최종과정인 호모시스테인(homocysteine)으로부터의 메티오닌(methionine) 합성은 호모시스테인 메틸라제(homocysteine methylase)에 의해 수행되며 이 효소는 metE (비타민 B12비의존성효소 생성) 유전자와 metH유전자 (비타민 B12의존성효소 생성)로 부터 발현된다. 위에 언급된 5개의 유전자외에도 메티오닌의 생합성에는 E. coli의 경우 metF, metK, metL, metQ 및 metX의 5개 유전자가 추가적으로 관여하여 중간물질의 공급 등에 역할을 담당하며, 조절단백질로서는 metJ와 metR이, methionyl tRNA의 합성에는 metG가 각각 관여해 전체 13개 유전자로 구성된 met regulon을 형성한다 (Old et al., 1993). 코리네박테리아의 메티오닌 생합성과정도 E. coli의 것과 유사한 것으로 알려져 있고 일부 관여 효소들에 관한 부분적인 연구도 진척되어 있지만 아직 관여 유전자 수준에서의 연구는 전혀 이루어지지 않고 있다.
메티오닌은 공업적으로 화학합성법 (D,L-methionine)이나 전구물질 전환법 (L-methionine)에 의해 생산되는데 세계 연간 생산량은 전자의 경우 7만톤, 후자의 경우 150톤에 이른다. 화학 합성법에 의해 생산되는 D,L-메티오닌은 사료의 영양성 향상을 위한 첨가물로서 주로 이용되며 전구물질 전환법에 의해 생산되는 L-메티오닌은 식품첨가물 또는 의약제제로서 이용된다. L-메티오닌은 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용한 직접발효에 의한 생산법도 개발되어 대량생산에의 가능성이 열렸지만 생산효율이 2g/L에 그쳐 직접발효법이 갖는 많은 장점에도 불구하고 실용화에 장애요인이 되고있다 (Kase and Nakayama, 1975).
본 발명은 근래에 개발된 분자유전학적 도구들을 이용하여 메티오닌 생합성 경로 중 첫 번째 과정을 매개하는 효소인 호모세린 아세틸 트랜스퍼라제(homoserine acetyl transferase)를 발현하는 유전자인 metA를 클로닝하여 유전자 자원을 확보하고 분리된 유전자를 이용하여 메티오닌 생합성 경로를 생화학적 분자유전학적 수준에서 분석하여 메티오닌과 라이신을 포함하는 아스파테이트 계통 아미노산 생산균주를 개발하고자 하였다.
본 발명의 목적은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로부터 분리한 신규한 메티오닌 생합성 유전자 metA의 염기서열을 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 E.coli metA 변이균의 컴플리멘테이션에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰의 metA 유전자를 분리하고 분리된 유전자의 정체성을 E.coli metA 균의 컴플리멘테이션과 분리된 유전자에 의한 코리네박테리움 글루타미쿰에서 호모세린 아세틸트랜스퍼라제의 7배 증폭에 의해 증명된 발현, 분리된 유전자에 의한 코리네박테리움에서의 특정 부위 유전자 파괴(site-specific gene disruption) 달성 및 염기서열 분석에 의해 확인된 다른 균들의 metA 유전자 산물과의 유사성에 의해 증명하므로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 상세히 설명한다.
도 1은 E.coli의 메틴오닌(methionine) 생합성 경로를 나타낸다.
도 2은 플라스미드 pSL72와 pSL73의 제한효소지도 및 서브클론(subclone)에 의한 호모세린 아실트랜스퍼라제(HAT)발현 및 컴플리멘테이션 유무를 나타낸다.
도 3는 코리네박테리움 글루타미쿰 염색체 metA 유전자의 특정 부위 유전자 파괴과정을 나타낸 사진도이다.
도 4은 유전자 파괴에 의해 얻어진 코리네박테리움 글루타미쿰 ASO19E12 metA균을 나타낸 사진도이다.
도 5은 코리네박테리움 글루타미쿰 ASO19E12에서의 호모세린 아세틸트랜스퍼라제의 발현을 나타낸 전기영동 결과이다.
도 6a, 6b는 코리네박테리움 글루타미쿰 ASO19E12의 metA 염기서열과 아미노산 서열을 나타낸다.
도 7a, 7b는 코리네박테리움 글루타미쿰 ASO19E12의 metA 염기서열로부터 유추된 아미노산 서열과 렙토스피라 마이에리의 metA 유전자 산물과를 비교한 결과를 나타낸다.
본 발명은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배양하고 이로부터 염색체 DNA(Chromosomal DNA)를 분리한 후 상기 염색체 DNA가 도입된 플라스미드로 E.coli DH5α를 형질전환시킨 후 형질전환체의 플라스미드를 회수해 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 라이브러리를 제조하는 단계; 상기 제조한 코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 라이브러리를 E.coli metA 변이균에 도입하여 형질전환시킨 후 메티오닌을 함유하지 않은 최소배지에서 배양하여 콜로니를 얻고 플라스미드를 분리하여 유전자 metA 클로닝 단계; 클로닝된 유전자 metA 산물의 호모세린 아세틸트랜스퍼라제 활성을 측정하는 단계; 상기 유전자 metA의 클로닝에 의해 얻어진 플라스미드 pSL72와 pSL73을 제한효소 처리하여 호모세린 아세틸트랜스퍼라제의 발현에 필요한 최소한의 DNA를 서브클로닝하는 단계; 상기 서브 클로닝하여 얻어진 최소 크기의 DNA 단편을 갖는 플라스미드를 제한효소처리 후 유전자 파괴 벡터(gene-distruption vector)내에 삽입하고 트랜스컨쥬게이션(transconjugation) 시켜 특정 유전자를 파괴한 후 호모세린아세틸트랜스퍼라제 활성을 측정하고 컴플리멘테이션을 확인하는 단계; 각기 다른 서브클론을 함유하는 플라스미드가 도입된 균주와 유전자 파괴에 의해 유도된 metA 변이균에서의 호모세린아세틸트랜스퍼라제의 발현을 SDS-PAGE 방법으로 확인하는 단계; 플라스미드 pSL75와 그 주변 DNA의 염기서열을 자동 염기서열 분석기를 이용하여 결정히하는 단계 및; 상기 단계에서 결정한 염기서열로부터 유추된 아미노산 서열을 Altschul 등의 알고리즘을 이용한 Blast 프로그램을 이용하여 분석하는 단계로 구성된다.
본 발명에서 사용한 플라스미드 및 균주는 하기 표 1과 같으며 코리네박테리움 글루타미쿰(C. gutamicum)과 E.coli 균주는 일상적으로 각각 MB(Gubler et al., 1993)와 LB(Maniatis et al., 1982)배지에서 배양했고, 항생제는 암피실린(ampicillin) 50㎍/mL ; kanamycin, 25㎍/mL 양으로 첨가했다. 필요한 경우 E. coli은 M9 (Maniatis et al., 1982) 최소 배지를 사용했으며, 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum)은 MCGC(Gubler et al., 1993; van der Osten et al., 1989) 최소 배지를 사용했다. E.coli와 코리네박테리움 글루타미쿰은 각각 37℃, 30℃에서 배양했다.
미생물 균주와 플라스미드
균주 또는 플라스미드 관련 유전형질 또는 표현형질a 출처
대장균 CGSC2569 △(gpt-proA)62, lacY1, hisG4, argE3, thi-1, metA28 CGSCb
JE6892 metA, argH, str NIG, Japanc
S17-1 염색체내로 도입된 RP4-2로부터 얻은 tra Schwartzer 등,1991
DH5α F-Ф 80dlacZDM15 △(lacZYA-argF)U169 deoRendA1 hsdR17 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 λ- Bethesda Research Laboratories
코리네박테리움 글루타미쿰 ASO19 ATCC 13059d의 자발적 리팜피신 내성 변이주 Yoshihama 등 1985
ASO19E12 ASO19의 리스트릭션 결핍 변이주 Follettie 등 1993
플라스미드 pUC19 Apr Yanish-Peron 등 1985
pUC119 Apr Yanish-Peron 등 1985
pMT1 셔틀벡터; Apr(대장균), Kmr(코리네박테리움 글루타미쿰) Follettie 등1993
pSUP301 pACYC177 유도체 Apr,Kmr, mob Schwartzer 등 1991
pMG107 pMT1 유도된 Apr,Kmr, mob Kim과 Lee, 1996
pSL18 코리네박테리움내 복제가 불가능한 pMG107의 유도체코리네박테리움 유전자 파괴 벡터 kim과 Lee, 1996
pSL72 metA 유전자를 포함하는 5.3kb 도입부를 지닌 pMT1 본 발명
pSL73 metA 유전자를 포함하는 5.3kb 도입부를 지닌 pMT1 본 발명
pSL74 pSL72의 3.5kb XhoI-BamHI 단편을 지닌 pMT1 본 발명
pSL75 pSL73의 2 kb XhoI-SalI 단편을 지닌 pMT1 본 발명
pSL77 pSL72의 4.2kb EcoRI-SalI 단편을 지닌 pMT1 본 발명
pSL79 pSL72의 4.2kb EcoRI-SalI 단편을 지닌 pMT1 본 발명
pSL83 pSL74의 1.1kb XhoI-EcoRI 단편을 지닌 pMT1 본 발명
pSL84 pSL74의 1.3kb XhoI-HindⅢ 단편을 지닌 pMT1 본 발명
pSL90 pSL74의 2kb XhoI-ScaI 단편을 지닌 pMT1 본 발명
pSL92 pSL73의 2.3kb EcoO109I-SalI 단편을 지닌 pMT1 본 발명
pSL103 pSL75의 ScaI-HindⅢ 단편(0.8kb)이 삽입된 pUC119 본 발명
pSL104 pSL75의 XhoI-HindⅢ 단편(0.5kb)이 삽입된 pUC119 본 발명
pSL105 pSL75의 ScaI-SalI 단편(0.75kb)이 삽입된 pUC119 본 발명
pSL113 pSL75의 StuI-EcoRI 단편(0.8kb)이 삽입된 pUC119 본 발명
pSL114 pSL74의 EcoRI-HindⅢ 단편(0.3kb)이 삽입된 pUC119 본 발명
pSL119 pSL75의 EcoRI-EcoRI 단편이 삽입된 pUC119 본 발명
pSL120 pSL75의 StuI-EcoRI 단편이 삽입된 pUC119 본 발명
[주]ar은 Ap, 암피실린, Km 및 카나마이신 내성을 나타낸다.bE. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, Conn., USAcNational Institute of Genetics Stock Research Center, Mishima, 411JapandATCC(American Type culture Collection), Rockvile Md., USA
이하 본 발명에서 사용한 구체적인 실험방법들은 하기와 같다.
1. DNA 조작
본 발명에서 DNA 조작은 기본적인 분자 클로닝(molecular cloning), 형질전환(transformation), 전기영동(electrophoresis)과정을 수행하였다(Maniatis et al., 1982). E.coli와 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum)내로의 플라스미드 도입은 각각 CaCl2방법(Maniatis et al., 1982)과, 일렉트로포레이션(electroporation)을 사용했고, E.coli 배양으로부터 플라스미드의 분리는 알카라인 라이시스(alkaline lysis)(Maniatis et al., 1982) 방법을 사용했다.
2. 일렉트로포레이션(electroporation)
본 발명에서 일렉트로포레이션(Electroporation)은 MB 배지에서 하루동안 배양한 배양액 2mL을 100mL MB 배지에 접종한 후, O.D.600이 0.6에 이를 때 까지 배양하였다. 배양후 5,000rpm에서 10분간 원심분리하여 세포를 모아서 EPB1(20mM Hepes pH7.2, 5% glycerol) 10mL으로 3회 세척하였다. 세척한 세포를 같은 조건에서 원심분리하여 모은 후, EPB2(5mM Hepes pH7.2, 15% glycerol) 1.5mL에 현탁하여 일렉트로포레이션을 위한 컴피턴트 세포(competent cell)로 사용하였다. 플라스미드 DNA 1-2㎕을 컴피턴트 세포 150㎕에 섞은 후, 얼음속에서 5분간 배양하였다. 이 혼합액을 일렉트로포레이션 큐벳(electroporation cuvette)(0.2㎝, Bio-Rad)에 옮긴 후, 일렉트로포레이터(E. coli pulser, Bio-Rad)로 2.5㎸에서 펄스를 가하여 DNA를 도입시켰다.
3. 트랜스콘쥬게이션(Transconjugation)
본 발명에서 사용한 트랜스콘쥬게이션(Transconjugation)방법은 LB 배지에서 정지기까지 자란 코리네박테리움 균주(Corynebacterium strain)를 50mL LB 배지에 1-2mL 접종하여 O.D.600이 1-1.5가 될 때까지 배양시키고 배양액 30mL을 5,000rpm으로 10분간 원심분리하여 LB 배지 3mL에 현탁시켜 리십언트 세포(Recipient cell)를 준비하였다. 도너 세포(Donor cell)는 암피실린이 첨가된 LB 배지에서 정지기까지 자란 E.coli를 50mL LB 배지에 1mL 접종하여 O.D.600이 1-1.5가 될때까지 배양시키고 배양액 10mL을 5,000rpm, 10분간 원심분리하여 1mL LB 배지에 현탁시켜 준비하였다. 리십언트 세포(recipient cell) 800㎕를 열처리한 후 도너 세포(donor cell) 200㎕를 첨가하고 3,000rpm으로 10분간 원심분리하여 침전물을 LB 배지로 조심스럽게 현탁시켰다. 현탁액을 살균된 니트로셀룰로오스 필터(nitrocellulose filter)에 한방울 떨어뜨리고 10분간 건조시킨 후 30℃에서 하루동안 배양시켰다. 하루동안 배양된 니트로셀룰로오스 필터를 제거하여 살균된 튜브에 넣고 LB 배지 1-2mL을 첨가하여 현탁시킨 후 항생제를 함유하는 MB 고체배지에서 30℃, 2-3일간 배양시킨 후 트랜스콘쥬건트를 분리하였다.
4. 조추출물(Crude extract)의 제조
정지기까지 자란 세포 배양액을 5,000rpm에서 10분간 원심 분리한 후, 침전된 세포를 Buffer A(20mM Tris·Cl pH 7.5, 20mM KCl, 33mM MgCl2, 10mM MnCl2,5% glycerol) 10mL로 세척한 후, 같은 방법으로 세포를 모아서 배양액 50mL당 (O.D.600÷10)×2mL의 Buffer A에 녹였다. 세포 현탁액에 0.1㎎/mL농도로 라이소자임(lysozyme)을 첨가하여 37℃에서 30분간 반응 후, 초음파분해처리(sonication)를 위한 세포 현탁액으로 사용하였다. 세포 현탁액을 초음파 처리기(Ultrasonic processor VCX400, Sonic & Materials INC.)로 15분간 초음파 처리하였다. 파쇄한 혼합액을 12,000rpm에서 15분간 원심 분리한 후, 상층액을 채취하여 12,000rpm에서 15분간 다시 원심 분리하여 침전물을 완전히 제거하고, 효소활성 측정을 위한 조추출물로 사용하였다.
이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 유전자 metA 분리 및 염기서열 결정
제 1단계; 게놈 라이브러리의 제조
코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 유전자(C. glutamicum genomic DNA)의 분리는 Tomioka 등의 방법(1981)에 따랐다. 코리네박테리움 글루타미쿰을 100mL TSY(Gubler at al., 1993) 배지에서 배양한 후(30℃) 원심분리하여 세포 펠렛(cell pellet)을 회수하였다. 0.5M 솔비톨(sorbitol)을 함유하는 4mL의 TE에 녹인 후 80mg의 라이소자임(lysozyme)을 첨가하고 37℃에서 3시간 배양하였다. 세포 펠렛(Cell pellet)을 원심분리에 의해 회수해 800㎍의 프로테이나아제K(proteinaseK)와 50mg의 SDS를 함유하는 8mL의 TE에 녹인 후 37℃에서 3시간 배양하였다. 소듐퍼크로레이트(Sodiumperchlorate)를 최종 농도가 1M되게 첨가한 후 상온에서 30분간 배양하였다. 페놀/클로로포름/아이소아밀알콜(Phenol/chloroform/isoamylalcohol(PCI
)로 추출한 후 에탄올을 첨가해 침전상태의 염색체 DNA(chromosomal DNA)를 분리하였다. RNAse(50 ㎍/mL)를 함유하는 TE에 녹여 37℃에서 30분간 배양한 후 PCI로 추출하였다. 에탄올을 첨가해 침전시킨 후 침전물을 TE에 녹여 마무리하였다. 분리된 코리네박테리움 글루타미쿰 AS019 염색체 DNA(C. glutamicum ASO19 chromosomal DNA)를 MboI으로 부분적으로 절단한 후, 10-40% 슈크로즈 그레디언트 원심분리(sucrose gradient centrifugation)에 의해 4-13kb 단편을 크기-분획(size-fractionation)하여 BamHI에 의해 절단되고 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)에 의해 디포스포리레이션(dephosphorylation)된 pMT1에 라이게이션(ligation)시켰다. E.coli DH5α에게로 형질전환한 후 약 6,000 개의 형질전환체로부터 플라스미드를 회수해 게놈 라이브러리를 완성하였다.
제 2단계: 유전자 metA 클로닝
코리네박테리움 글루타미쿰 게놈 라이브러리를 metA 변이균인 E.coli CGSC2569와 E.coli JE6892에 형질전환시킨 후 메티오닌이 함유되어 있지 않은 M9 최소배지에 도말하였다. 플레이트를 37℃에서 3일정도 배양한 후, 성장하는 콜로니(colony)를 획득하여 플라스미드를 분리하였다. 실험결과, 약 6,000 재조합체(recombinant)(transformation frequency → 1.6 x 105cell/㎍ DNA)중 메티오닌(methionine)을 함유하지 않는 M9 최소배지상에서 자라는 2개의 콜로니를 확인할 수 있었다. 이들 콜로니를 분석한 결과 두 종류의 플라스미드를 확인할 수 있었고 이들을 각각 플라스미드 pSL72와 pSL73으로 명명하였다. 라이브러리의 평균 도입부분의 길이가 4-13 kb이고 코리네박테리움 글루타미쿰의 평균적인 게놈 크기가 약 2,000 kb인 점에 비교해 볼 때 이론적으로 약 2,500 형질전환체에 한 개의 빈도로 평균적인 크기의 유전자들이 확인되어야 하고 본 연구에서 확인한 1/3,000은 이와같은 이론값에 근접함을 알 수 있었다. 즉 이러한 사실을 제작된 라이브러리가 성공적으로 각 유전자들을 대변하는 것으로 볼 수 있다. 얻어진 두 종류의 클론을 E.coli metA 변이주인 E.coli CGSC2569와 E.coli JE6892에 재도입하여 컴플리멘테이션(complementation) 여부를 재확인하였다.
제 3단계: 호모세린 트랜스퍼라제 활성 측정
코리네박테리움 글루타미쿰의 유사균인 브레비박테리움 프라붐(Brevibacterium flavum)은 metA 유전자의 산물로서 호모세린 아세틸트랜스퍼라제(homoserine acetyl transferase)를 발현한다 (Miyajima and Shiio, 1973). 본 단계에서는 이러한 점에 착안하여 코리네박테리움 글루타미쿰의 metA 유전자도 같은 종류의 효소를 발현하는지 분석하였다. 상기 2단계에서 분리된 포지티브 클론인 pSL72와 pSL73을 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰내로 도입한 후 최소배지인 MCGC 배지에서 배양하고 조추출물(crude extract)을 준비하였다. 컴플리멘테이션(Complementation)에 의해 분리된 DNA가 호모세린 아세틸랜스퍼라제(homoserine acetyltransferase)를 발현하는 지의 여부를 효소활성을 측정하였다. 즉, 큐벳에 1M Tris·MgCl2(pH7.4)용액 55㎕, 물 890㎕, 100mM 호모세린 20㎕, 20mM acetyl-CoA 5㎕, 10㎎/mL DTNB 20㎕를 넣어 혼합한 후, 조추출물(crude extract) 20㎕를 첨가하여 반응을 시작하였다. 호모세린 아세틸트랜스퍼라제(Homoserine acetyltransferase)활성은 분광광도계(spectrophotometer) (UV-1601PC, SHIMADZU)를 사용하여 412nm, 상온에서 측정하였다. 반응 후, 직선구간에서 분당 O.D.412변화량(ΔO.D.412/min)을 측정하여 계산하였다 (Kase and Nakayama, 1974; Miyajima and Shiio, 1973).
· HAT 활성 (μmol/mg·min) = (ΔO.D.412/min)/[14.2 × vol. of crude extract × 단백질농도 (㎎/mL)]
실험결과, 표 2에 나타낸 것처럼 코리네박테리움 글루타미쿰 ASO19E12내로 플라스미드 pSL72와 pSL73을 도입한 경우 대조군으로서 도입된 pMT1에 비해 호모세린 아세틸트랜스퍼라제의 활성이 약 7배 증가함을 확인할 수 있었다. 효소 활성측정을 위한 기질로서 아세틸 CoA대신에 석시닐 CoA를 공급하는 경우 활성의 증가가 전혀 탐지되지 않았다. 이러한 사실을 E.coli의 metA 유전자의 산물이 호모세린 석시닐트랜스퍼라제(homoserine succinylltransferase)이고 그 기질이 석시닐 CoA인 점과 비교가 된다. 동시에 코리네박테리움 글루타미쿰의 경우 metA 유전자의 산물이 브레비박테리움 프라붐(Brevibacterium flavum) 등과 유사한 호모세린 아세틸트랜스퍼라제임을 의미한다. 이와 같은 차이점에도 불구하고 E.coli의 metA 변이가 코리네박테리움 글루타미쿰 metA 유전자에 의해 컴플리멘테이션이 가능했던 이유는 E.coli의 경우 세포내 주요 전구물질의 하나인 아세틸 CoA의 세포내 농도가 코리네박테리움 글루타미쿰에서와 유사할 것이고 그 결과 코리네박테리움 글루타미쿰의 metA 유전자의 발현산물인 호모세린 아세틸트랜스퍼라제가 성공적으로 기능을 할 수 있었을 것으로 예상된다.
코리네박테리움에서 호모세린 아세틸트랜스퍼라제이 발현
균 주 플라스미드 특이활성a(nmol min-1mg-1)
코리네박테리움 글루타미쿰 ASO19E12 pMT1pSL72pSL73 65465450
a호모세린 아세틸트랜스퍼라제의 활성은 1% 글루코스를 함유하는 MCGC 배지상에서 정지기까지 성장한 세포로부터 준비된 조추출물을 이용해 측정함
제 4단계; 서브클로닝
플라스미드 pSL74와 pSL77은 각각 pSL72의 3.5 kb XhoI-BamHI fragment와 4.2 kb EcoRI-SalI fragment를 pMT1에 ligation시켜 만들었다. 플라스미드 pSL75와 pSL79은 각각 pSL73의 2 kb XhoI-SalI fragment와 3 kb SphI-SalI fragment를 pMT1에 라이게이션시켜 만들었다. 플라스미드 pSL83, pSL84, pSL90은 pSL74의 1.1 kb XhoI-EcoRI, 1.3 kb XhoI-HindIII, 2 kb XhoI-ScaI 단편을 각각 pMT1에 라이게이션시켜 만들었다. 플라스미드 pSL92은 pSL73의 2.3 kb EcoO109I-SalI 단편을 pMT1에 라이게이션시켜 만들었다. metA 유전자 존재여부는 컴플리멘테이션 테스트(complementation test)와 단백질 발현, 단백질 활성조사를 통해 확인하였다. 염기서열 분석을 위한 주형(template)으로서는 아래의 plasmid를 제조하여 이용하였다. 클로닝 벡터(Cloning vector)로는 멀티클로닝 부위(multicloning site)를 가진 pUC119를 이용하였다. pSL103은 pSL75의 0.8kb ScaI-HindⅢ 단편을 pUC119의 SmaⅠ-HindⅢ부위와, pSL104는 pSL75의 XhoⅠ위치를 XhoⅠ으로 절단한 후 Klenow 단편을 처리하여 평활말단(blunt end) 만든 후 HindⅢ를 이용하여 0.5kb 단편을 형성시켜 pUC119의 SmaⅠ-HindⅢ위치와 결합하여 만들었다. pSL105는 pSL75의 0.75kb ScaⅠ-SalⅠ 단편을 pUC119의 SmaⅠ-SalⅠ부위와, pSL113은 pSL75의 0.8kb StuⅠ-EcoRⅠ단편을 pUC119의 SmaⅠ-EcoRⅠ위치에 삽입시켜 만들었다. pSL114은 pSL74의 EcoRⅠ-HindⅢ 단편(0.3kb)을 pUC119의 EcoRⅠ-HindⅢ부위와, pSL115는 pSL74의 EcoRV -StuⅠ단편(0.95kb)을 pUC119의 SmaⅠ에 라이게이션하여 만들었다. pSL74의 EcoRⅤ위치는 EcoRⅤ으로 절단한 후 송아지 장 알카라인 포스파테이즈(calf intestinal alkaline phosphatase;C.I.A.P.)를 처리한 뒤 다시 StuⅠ으로 처리하여 삽입할 작은 절편을 형성하였고 C.I.A.P. 처리한 pUC119의 SmaⅠ부위와 결합시켰다. pSL116과 117은 pSL74의 0.4kb SalⅠ-EcoRⅠ 단편과 0.7kb StuⅠ-SalⅠ단편을 pUC119의SalⅠ-EcoRⅠ, SmaⅠ-SalⅠ부위와 결합시켜 만들었다. pSL118은 pSL75의 0.55kb ScaⅠ-EcoRV fragment를 pUC119의 SmaⅠ위치에 삽입시켜 만들었다. 셀프-라이게이션(Self-ligation)을 방지하기 위하여 pSL75의 EcoRⅤ부위를 절단한 후 C.I.A.P.를 처리한뒤 ScaⅠ으로 처리하여 pUC119에 삽입할 작은 절편을 형성하였고 C.I.A.P. 처리한 pUC119의 SmaⅠ부위와 결합시켰다. pSL119는 pSL75의 0.5kb EcoRV-EcoRⅠ 단편을 pUC119의 SmaⅠ-EcoRⅠ부위와, pSL120은 pSL75의 0.7kb StuⅠ-EcoRⅠ 단편을 pUC119의 SmaⅠ-EcoRⅠ위치에 결합시켜 만들었다. 이와같이 플라스미드 pSL72와 pSL73을 EcoRI, HindIII, XhoI 등의 제한효소로 절단한 후 전기영동을 실시하여 제한지도를 작성한 결과, 도 3에 나타낸 것처럼 일정 부위에서 서로 겹치는 모습을 나타냈다. 플라스미드 pSL72와 pSL73은 각각 5.3 kb와 4.3 kb의 DNA 절편을 갖는 것으로 확인되었다. metA 유전자가 플라스미드 pSL72와 pSL73의 2.8 kb 동일 부위 내에 위치 할 것임을 예상하고, 제한지도를 기초로 서브클로닝을 통해 호모세린 아세틸트랜스퍼라제의 발현에 필요한 최소한의 DNA를 서브클로닝을 통해 결정하였다. 그 결과 플라스미드 pSL72의 3.5 kb XhoI-BamHI 단편을 지닌 pSL74와 플라스미드 pSL73의 3kb SphI-SalI 단편을 지닌 pSL79가 metA 변이를 컴플리멘테이션함을 확인하였다(도 2). pSL79와 pSL73의 2kb XhoI-SalI 단편을 지닌 pSL75는 metA 변이주를 불완전하게 컴플리멘테이션하였고 이러한 사실은 이 들 DNA의 한 쪽 끝이 metA 유전자의 일부분을 유실하고 있음을 의미한다. pSL90의 경우 컴플리멘테이션과 단백질 발현이 전혀 관찰되지 않는 것에 비추어 metA 유전자가 1.5 kb의 ScaI-EcoRI 단편을 중심으로 위치함을 의미한다.
제 5단계: 유전자 파괴에 의한 코리네박테리움 글루타미쿰의 metA 변이주 분리
분리된 DNA의 정체성을 확인하기 위하여 유전자 파괴(gene disruption)을 시도하였다. 유전자 파괴(Gene disruption)의 이론적 배경은 타켓(target) 유전자의 내부 단편(internal fragment)을 유전자 파괴 벡터(gene disruption vector)의 멀티클로닝 부위(multicloning site)에 삽입하였다. 이를 적절한 E.coli 도너내로 형질전환시킨 후 콘주게이션(conjugation)에 의해서 코리네박테리움 리십언트 세포(Corynebacterium recipient cell)에게로 전달시켰다. 이 과정 중 낮은 확률이지만 유전자 파괴 벡터(gene disruption vector)내의 클로닝된 내부 단편(internal fragment)과 염색체 유전자(chromosomal gene)와의 상동 재조합(homologous recombination)에 의해 전달된 DNA가 염색체의 타겟 유전자(target gene)내로 삽입될 수 있다. 이 경우 타겟 유전자(target gene)는 이등분되어 기능을 상실하게되고 유전자 파괴 벡터(gene disruption vector)에서 유래된 항생제 내성에 의해서 도너 세포(donor cell)와 재조합(recombination)이 안된 리십언트 세포(recipient cell)로부터 구분이 가능해진다. 유전자-파괴 벡터(Gene-disruption vector)는 코리네박테리움에서의 복제능력이 없기 때문에 항생제 내성은 염색체내로 도입되어 염색체의 일부가 된 플라스미드로부터 유래하였다. 세부적인 과정은 다음과 같다. metA 유전자가 위치할 것으로 예상되는 지역을 유전자 파괴 벡터(gene disruption vector)인 pSL18내로 삽입하여 코리네박테리움 글루타미쿰 metA(C. glutamicum의 chromosomal metA) 유전자를 파괴하는 실험을 행하였다(도 3). 서브클로닝에 의해 얻어진 최소 크기의 DNA 단편을 갖는 pSL75에서 0.8kb의 HindIII-ScaI 단편를 유전자-파괴 벡터(gene-disruption vector)인 pSL18내로 삽입하였다. 항생제를 함유하는 적절한 배지를 이용하여 전달된 벡터가 균일한 재조합(homologous recombination)에 의해 염색체 내로 도입된 균을 다수 선별할 수 있었으나 이들 모두 정상적으로 호모세린 아세틸트랜스퍼라제 활성을 나타냈으며 메티오닌이 첨가되지 않은 MCGC 최소배지 상에서의 성장능력도 영향을 받지 않았다. 이는 0.8kb HindIII-ScaI내에 metA 유전자의 내부 부위가 존재할 가능성이 적음을 의미한다. 두 번째로 pSL75에서 0.75 kb ScaI-SalI 단편을 pSL18의 멀티 클로닝 부위(multiple cloning site)에 삽입하여 이를 코리네박테리움 글루타미쿰 AS019E12내로 트랜스콘쥬게이션(transconjugation)을 통해서 삽입하였다. 그 결과 얻어진 다수의 트랜스콘쥬건트는 메티오닌이 함유되지 않은 MCGC 최소배지에서의 성장능력을 모두 상실하였다(도 4). 이는 pSL75의 0.75kb ScaI-SalI 단편내에 metA 유전자의 내부(internal) 부위가 존재하고 유전자 파괴 벡터(gene disruption vector)내에 삽입된 metA 유전자의 내부 부위가 코리네박테리움 글루타미쿰 AS019E12의 염색체 metA 유전자와 상동 재조합(homologous recombination)에 의해서 염색체 metA 유전자가 파괴되었음을 의미한다 (도 3).
본 발명에서 신규한 metA 유전자가 발현된 코리네박테리움 글루타미쿰 AS019E12 변이주를 1998년 12월 5일 한국 종균협회에 수탁번호 KFCC 11065로 수탁하였다.
제 6단계: 단백질 정량과 SDS-PAGE
용액내 단백질의 정량분석은 Bradford(Bradford, 1976)의 방법에 따라 Bio-Rad 단백질 분석 키트를 사용하여 시행하였다. 표준 단백질은 우혈청 알부민(bovine serum albumin)을 사용하였다. SDS-PAGE는 기본적으로 Lamemmli(Lamemmli, 1970)의 방법을 따랐다. Bio-Rad Mini Protein Ⅱ Kit를 사용하였으며 분리 겔(separating gel)은 12% 폴리아크릴아미드로, 적층 겔(stacking gel)은 1.3% 폴리아크릴아미드(polyacrylamide)로 제조하였다. 전기영동 후, 겔은 쿠마시 블루(Coomassie blue)용액 (per liter, CoomassieⓡBrilliant Blue R-250 1g, methyl alcohol 400mL, acetic acid 100mL, water 500mL)으로 염색한 후, 10% 아세트산으로 탈색하였다. SDS-PAGE 분석결과, 분자량 약 40,000 Dalton의 단백질이 발현되는 것이 탐지가 되었다(도 5). 염기서열 분석결과 1,134 bp의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)이 발견된 것과 이것이 분자량 41,313 Dalton의 단백질을 발현할 수 있는 것에 비추어 SDS-PAGE에 의해 탐지된 단백질이 코리네박테리움 글루타미쿰의 metA 유전자 산물인 호모세린 아세틸트랜스퍼라제임을 알 수 있었다.
제 7단계: 유전자 metA의 염기서열 결정
서브클로닝한 플라스미드를 주형으로 하여 두가닥의 DNA로부터 단일가닥을 분리하였다. 우선 주형의 농도를 5∼10㎍/32㎕로 조절한 후 여기에 2M NaOH 8㎕를 넣어 총 부피를 40㎕로 조절하고 상온에서 10분간 두었다. 에탄올에 의한 침전후 펠렛을 10㎕의 증류수에 녹였다. 단일가닥으로 분리된 DNA를 10㎕를 튜브에 넣고 라벨링된 프라이머를 알맞게 맞추어서 2㎕(4∼10p㏖)를 넣은 뒤 다시 여기에 어닐링 버퍼(annealing buffer)를 2㎕를 넣어서 총 14㎕로 조절하였다. 어닐링 반응(Annealing reaction)를 65℃에서 5분동안 예열시킨 후 바로 37℃에서 10분 동안 반응시켰다. 그리고 상온에서 적어도 10분 동안 둔 뒤 원심분리를 하였다. 그 동안 새로운 튜브에 각각의 주형을 위해 4개씩 A, C, G, T라고 라벨링한 후 A Mix, C Mix, G Mix, T Mix를 2.5㎕씩 넣었다. 그리고 필요할 때까지 얼음에 묻어 두었다. 효소 희석 버퍼(Enzyme dilution buffer)를 이용하여 T7 DNA 폴리머라아제를 6∼8units/2㎕로 희석시켜 놓았다. 그리고 어닐링 혼합물(annealing mixture)에 1㎕의 신장버퍼(extention buffer)와 3㎕의 DMSO를 넣고 섞은 후 간단히 원심분리를 하였다. 이와 함께 얼음에 넣어 두었던 각각의 4개씩의 시퀀싱 믹스(sequencing mix)들을 37℃에서 적어도 1분 정도 반응을 시켰다. 어닐링 혼합물(Annealing mixture)에 희석시킨 T7 DNA 폴리머라아제(polymerase)를 2㎕ 씩 넣은 후 37℃에서 반응중인 시퀀싱 믹스(sequencing mix)들에 4.5㎕씩 넣고 37℃에서 5분 동안 반응시켰다. 마지막으로 5㎕의 정지 용액(stop solution)을 넣고 반응을 정지시켰다. 이렇게 준비된 염기서열결정 반응액은 85∼90℃에서 3분 가열한 후 얼음에 넣었다가 4∼6㎕씩을 겔의 웰에 로딩하였다. 염기서열 자동분석 장치로는 ALF-express(Pharmacia Biotech.)를 이용하였다. Prerun은 1500V에서 글라스 플레이트(glass plate)의 온도가 55℃까지 올라갈 때까지 하였다. Prerun이 끝난 후 85∼90℃정도로 가열한 염기서열결정 반응물 6-8㎕을 웰에 로딩하고 8시간 이상 전기영동을 하였다. 전기영동이 끝난 후 제공된 ALFwin 프로그램을 이용해서 염기서열을 결정하였다. 실험결과, 1,134 염기쌍의 길이를 갖는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)이 발견되었다(도 6a, 6b). pSL75는 metA 유전자의 카복시 터미날(carboxy terminal) 부분의 일부 DNA를 갖고 있지 않는 것이 확인되었다. 이러한 사실을 pSL75와 일부 서브클론(subclone)의 경우 최소 배지에서 부분적인 성장을 보이는 결과와 일치하였다(도 2). 탐지된 ORF는 378 아미노산으로 구성된 분자량이 41,313 Dalton인 단백질을 발현하는 것으로 유추되었다. 이는 현재까지 알려진 E. coli, Leptospira, Haemophillus, 및 Bacillus등 다른 균들의 metA 유전자들의 산물과 크기가 거의 일치하는 것으로 밝혀졌다 (Bourhy et al., 1997; Duclos et al., 1989; Fleischmann et al., 1995; Wyman and Paulus, 1975). 아미노산 서열로부터 유추된 등전점 pI는 6.2로서 다른 종에서 발견된 metA 유전자의 산물과 유사한 값을 나타내었다. 코돈 프리퍼런스( Codon preference)를 분석하여 본 결과 이미 알려진 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum)유전자들의 코돈 이용 유형과 높은 유사성을 보였다 (Eikmanns, 1992). 유전자내의 GC의 함량은 54%로 코리네박테리움 속의 전형적인 모습을 보였다 (Liebl, 1991). 또한 다른 코리네박테리움 속에서처럼 TAA가 정지 코돈으로서 사용되었다.
제 8단계: 유전자 metA의 염기서열 비교
염기서열 분석에는 인터넷과 DNASIS, PROSIS, PC Gene 프로그램을 이용하여 이미 알려져 있는 metA 유전자 산물과 아미노산 서열의 유사성을 비교하였다. 즉, 염기서열로부터 유추된 아미노산서열을 Altschul et al.의 알고리즘을 이용한 Blast program을 이용하여 분석하였다. 유전자 데이타베이스(database)로는 인터넷상의 유전자은행(Genebank)를 이용하였다. E.coli metA 유전자 산물과의 전체적인 유사성은 낮았고 사카로마이세스 세레비지에(Sacharomyces cerevisiae) (Messenguy et al., 1986), 해모필루스 인푸루엔제(Haemophillus influenzae) (Fleischmann et al., 1995) 및 렙토스피라 마이에리(Leptospira myeri) (Bourhy et al., 1997)의 metA 유전자 산물과의 유사성이 상대적으로 높게 나타났다. 상기 렙토스피라 마이에리(Leptospira myeri)와의 비교를 도 7a, 7b에 나타내었다.
본 발명에서 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 분리한 신규의 metA 유전자의 염기서열과 동 유전자가 코딩(coding) 하는 호모세린아세틸트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 미국의 유전자 은행(GeneBank Database)에 등록하였다.(Accession No. AF052652)
이상의 실험예와 실시예를 통하여 명백한 바와 같이 본 발명은 E.coli metA 변이균의 컴플리멘테이션에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰의 metA 유전자를 최초로 분리하여 제공하는 뛰어난 효과가 있고 상기 분리된 본 발명의 신규한 metA 유전자는 메티오닌 생합성 과정의 분석 및 메티오닌 대량 생산 균주 개발을 위한 도구로 이용할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 메티오닌을 필요로하는 식품 및 사료 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (5)

  1. 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 호모세린아세틸트랜스퍼라제 효소를 암호화하는 metA 유전자.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 유전자가 하기 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 호모세린아세틸트랜스퍼라제 효소를 암호화 하는 metA 유전자.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 유전자가 하기 아미노산서열을 갖는 것을 특징으로 하는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 호모세린아세틸트랜스퍼라제 효소를 암호화 하는 metA 유전자.
  4. 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 호모세린아세틸트랜스퍼라제 효소를 암호화하는 metA 유전자 및 그 일부의 단편을 함유하는 재조합 플라스미드 pSL72.
  5. metA 유전자를 포함하는 pSL72가 도입된 신규한 코리네박테리움 글루타미쿰 AS019E12 변이주 (KFCC 11065).
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