CN116670157A - 用于抗淋病奈瑟球菌的疫苗接种的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本披露提供了用于治疗淋球菌和/或脑膜炎球菌感染的疫苗的组合物及其使用方法，这些疫苗包含来源于细菌的含有淋球菌蛋白的天然外膜囊泡(NOMV)，该淋球菌蛋白是脂蛋白或被修饰为脂蛋白。还提供了含有编码淋球菌蛋白的基因的脑膜炎球菌菌株，该淋球菌蛋白是脂蛋白或被修饰为脂蛋白。

Description

用于抗淋病奈瑟球菌的疫苗接种的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年10月23日提交的美国临时专利申请号63/104,819的权益，该临时专利申请的披露内容通过引用以其全文并入本文。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明以由美国国立卫生研究院、美国国家过敏与传染病研究所授予的授予号R01AI046464，在政府支持下完成。政府在本发明中享有一定的权利。
序列表的并入
含有在名为“OMV0002-401-PC_ST25”的文件(如在Microsoft Windows操作系统中测量的为248千字节)中的序列表于2021年10月22日创建，在此以电子方式提交，并通过引用并入本文。
技术领域
本披露涉及来源于细菌外膜囊泡的重组细菌和疫苗。
背景技术
淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae，Ng)是一种专性人细菌病原体，最常定植于生殖道(包括女性的子宫颈、子宫和输卵管以及男性和女性两者的尿道)的粘膜表面。然而，包括直肠、鼻咽和眼睛的其他组织也可能藏有淋球菌。该细菌最常通过粘膜分泌物中个体之间的直接身体接触传播，并且可能在嗜中性粒细胞中。尽管进行了超过25年的研究，但仍没有针对Ng的许可疫苗，其每年在全球范围内导致约8000万例感染，并且在美国导致超过50万例病例。2013年至2018年，美国Ng疾病的病例数量增加了67％。在女性中，Ng感染最常发生为宫颈炎或盆腔炎性疾病，其可能导致不孕。仅约一半的受感染女性有临床表现使她们意识到感染，这导致疾病的进一步传播。受感染母亲所生的婴儿可能会患上新生儿眼炎，如果不治疗，可能导致失明。在男性中，大多数Ng感染表现为尿道炎。Ng还导致咽部和肛门直肠感染，尤其是在与男性发生性关系的男性中。在一些情况下，Ng感染可能发展为伴有菌血症的播散性感染，从而导致关节炎、心内膜炎或脑膜炎。多重抗生素耐药性使得Ng疾病的抗生素疗法的选择更少，并带来普遍耐药病原体的威胁。所有这些方面都强调了一个重大的全球公共卫生问题和对有效Ng疫苗的需求。
Ng感染不会引发保护性免疫，这可能导致多次再感染。因此，开发针对Ng的成功疫苗接种策略需要引发比自然感染更强的保护性免疫。这将取决于增加在自然感染中免疫原性差的一种或多种保护性抗原的免疫原性和/或删除提供免疫屏蔽的Ng抗原。例如，产生针对Ng还原可修饰蛋白(Rmp)的抗体的商业性的性工作者比缺乏这些抗体的性工作者接触Ng感染的可能性高3.4倍。针对Rmp和脂寡糖(LOS)变体的抗体已被证明阻断了由抗PorB介导的功能活性。然而，Nm Rmp似乎没有引发类似的封闭性抗体。因此，在Nm中表达Ng抗原以消除封闭性Rmp抗体并敲除导致不引发封闭性抗体的LOS变体的基因是有利的。
由于Ng利用了不同的免疫抑制机制，因此基于灭活细菌、外膜囊泡(OMV)或菌毛的疫苗方法尚未成功。虽然在几种Ng重组蛋白抗原方面取得了进展，包括粘附素复合蛋白(ACP)、甲硫氨酸结合蛋白MetQ和通过蛋白质组策略发现的其他抗原，以及截短的LOS，但这些方法都没有广泛的保护性，并且可能需要新的疫苗方法来限制这种重要病原体的疾病负担。
疫苗引发的抗体可以防止细菌粘附和粘膜组织的定植，这对预防由Nm和Ng两者引起的疾病是至关重要的。Nm和Ng是专性人病原体，它们利用附着(CEACAM1、CD46)、侵袭和免疫屏蔽的机制，与人系统特异性地相互作用。由疫苗引发的抗体(例如，IgA和IgG)存在于包裹上皮细胞的分泌物中，这些上皮细胞在感染的最早阶段与Nm和Ng直接接触，并且可以防止定植和侵袭。
引发针对粘附和免疫屏蔽机制的抗体的疫苗可以通过限制个体之间的传播，在感染的初始阶段保护个体免受疾病的更晚期阶段和未接种疫苗的影响。最具成本效益和最广泛使用的疫苗为个体和社区两者提供保护。
OMVax已开发了一种基于脑膜炎奈瑟球菌(Nm)天然外膜囊泡(NOMV)的多功能疫苗平台，用于以天然构象向免疫系统呈递蛋白质抗原。天然外膜囊泡(NOMV)由脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)(Nm)细菌天然形成。先前已经将疫苗菌株进行遗传修饰以：(a)过表达通常以低丰度存在的因子H结合蛋白(FHbp)，(b)表达与宿主因子H低结合的突变体FHbp来提高抗体应答，从而阻断导致FH结合的相互作用，以及(c)减弱内毒素，使得能够在没有通常用于降低反应原性的清洁剂处理的情况下使用NOMV，而且还能导致潜在保护性抗原的去除或改变。敲除LpxL1(LpxL1 KO)导致含有五酰化脂寡糖(LOS)的NOMV-FHbp降低人外周血单核细胞(PBMC)中的细胞因子应答，这与已安全施用于数万人受试者的清洁剂提取的OMV疫苗所引发的细胞因子应答相似或更低。为了进一步增强NOMV-FHbp疫苗的安全性，用于制备疫苗的菌株包含消除其他不期望的抗原(包括B组荚膜多糖、和LOS的衍生物)表达的另外的基因缺失，这些抗原已知与具有相似结构的人聚糖进行交叉反应。
与相当量单独的重组蛋白相比，在NOMV中存在的抗原的免疫原性大大提高。然而，产生最有效的抗体应答需要阈值水平的表达，这已经通过使用工程化的启动子产生高转录率、在细菌基因组中插入多个拷贝，并且用多拷贝质粒转化来实现。
特异性结合宿主蛋白、脂质或聚糖的抗原可能无法刺激抗体对发生结合的抗原表面的应答，因为最重要的表位可能被宿主蛋白结合所掩盖，并且因此无法被免疫识别。与宿主分子结合的抗原是疫苗特别感兴趣的，因为它们典型地在发病机制中起关键作用。
含有六酰基化脂寡糖的脑膜炎球菌OMV产生炎性应答。清洁剂提取可以降低反应原性。然而，清洁剂处理可以导致脂蛋白抗原的损失和蛋白质结构的改变。用于产生NOMV的Nm菌株具有被破坏的lpxL1基因座，导致五酰基化和六酰基化LOS的产生，从而导致内毒素活性减弱。
NOMV平台还具有增强抗体应答的佐剂特性。总的来说，基于NOMV的疫苗比相应的重组蛋白引发更高的抗体滴度和更广泛的反应性，并且可能更耐受，因为提供有效的保护性抗体应答可能需要更少的蛋白质。
在Ng中也高度保守的几种Nm蛋白已经被提议作为Ng疫苗的抗原。例如，GNA1220(99％相同；也称为NMB1220和NGO0788)与红细胞膜整合蛋白(stomatin)样蛋白家族有关。根据亚家族内的序列相似性，该家族的单个成员有几个名称。这些名称包括paraslipin或slipin-2、红细胞膜整合蛋白、抗增殖蛋白(prohibitin)、筏蛋白(flotillin)和HflK/C。红细胞膜整合蛋白样蛋白是古老来源的单程、寡聚膜蛋白，在生命的所有三个领域都已被鉴定。尽管在每种情况下它们的功能作用还不完全清楚，但它们大多定位于膜域；并且在许多情况下，它们被证明能调节离子通道活性。这些家族共有的保守结构域也被称为带7结构域。该家族的单个蛋白质可能聚集形成膜微区，这进而可能募集多蛋白复合物。红细胞膜整合蛋白样蛋白的这一亚组在很大程度上仍未被表征。它包括人红细胞膜整合蛋白样蛋白-2，该蛋白上调并参与几种类型癌症的进展和发展，包括食管鳞状细胞癌、子宫内膜腺癌、乳腺癌和神经胶质瘤。GNA1220似乎在增加人血清中的Ng存活方面起作用，并且被认为在表面定植中作为启动从不粘附至粘附转变的传感器起关键作用。GNA1220被鉴定为有希望的脑膜炎球菌疫苗候选物。与通过基因组测序鉴定的其他蛋白质相比，由重组GNA1220引发的针对Nm的血清杀菌活性滴度相对较低，并且GNA1220作为疫苗抗原的探索后来被放弃，因为它也难以作为重组蛋白产生。
MetQ(在Nm中也称为GNA1946或NMB1946，并且在Ng中称为NGO2139)在Nm与Ng之间是97％相同的，也被鉴定为潜在的Ng疫苗候选物。MetQ是细菌表面上的多功能脂蛋白，其参与甲硫氨酸转运和Ng与宫颈上皮细胞和单核细胞的粘附。MetQ对人血清中的Ng存活也很重要。MetQ在模拟感染的生长条件下组成型地表达。最近，有报道称，用CpG核苷酸配制的重组MetQ在小鼠中引起高血清抗体滴度以及分泌型IgA，并且在雌激素治疗的淋球菌感染雌性小鼠模型中减少Ng阴道定植的时间。那些先前的研究，虽然将MetQ称为脂蛋白，但实际上使用了大肠杆菌(E.coli)中产生的重组蛋白，无脂质附着。另一方面，本披露使用重组MetQ构建体，其是在Nm中产生的脂蛋白，如本文所述。在一些实施例中，根据本披露，还可以使用MetQ的突变体。例如，如本文所述，可用于本披露的MetQ的新突变体可以是MetQ的天然存在突变体，在本文中称为MetQSM。MetQ和MetQSM可以用作治疗淋球菌和/或脑膜炎球菌感染的疫苗，因为如本文所述，MetQ在淋球菌与脑膜炎球菌之间是高度保守的。
奈瑟球菌肝素结合抗原(NHBA，也称为NGO1220和GNA2132)是一种结合肝素和硫酸软骨素的脂蛋白。NHBA在淋球菌菌株中是高度保守的(>93％)，但与脑膜炎球菌NHBA同源性较低(约67％-80％)。虽然NHBA的功能是未知的，但淋球菌NHBA似乎在Ng定植方面起作用。
GNA1220、MetQ和/或NHBA的疫苗免疫原性研究使用了在NOMV中不表达的纯化重组蛋白。如本文所述，通过在NOMV或含有这两种蛋白质的NOMV混合物中呈递GNA1220、MetQ、MetQSM和/或NHBA、及其衍生物，保护性抗体应答得到极大改善，需要较少的蛋白质以在小鼠中产生相同或更高的抗体滴度，并鉴定这两种蛋白质的衍生物，这可能有利于引发防止Ng定植的抗体，从而防止淋球菌的获得和传播。
发明内容
因此，在一个方面，本披露提供了一种药物疫苗组合物，其包含多个细菌天然外膜囊泡(NOMV)，这些细菌天然外膜囊泡包含至少一种来自淋病奈瑟球菌的重组蛋白，其中该淋球菌重组蛋白是脂蛋白或被修饰为脂蛋白。在一个实施例中，通过消除蛋白质中未暴露于表面的部分并向剩余的C-末端部分添加脂蛋白信号序列来修饰淋球菌重组蛋白，其中淋球菌重组蛋白展示在细菌表面上，并且NOMV作为脂蛋白由该细菌产生。在另一个实施例中，该至少一种淋球菌重组蛋白是GNA1220、MetQ、MetQSM或NHBA、或其衍生物或片段、或其组合。在另一个方面，NOMV来源于脑膜炎奈瑟球菌。在另一个实施例中，脑膜炎球菌菌株是H44/76。
在另一个方面，本披露提供了一种脑膜炎奈瑟球菌菌株，其包含至少一种编码至少一种来自淋病奈瑟球菌的重组蛋白的基因，其中该至少一种淋球菌重组蛋白是脂蛋白或被修饰为脂蛋白。在一个实施例中，该至少一种淋球菌重组蛋白是GNA1220、MetQ、MetQSM或NHBA、或其衍生物或片段、或其组合。在另一个实施例中，该至少一种淋球菌重组蛋白由质粒中的转基因表达。在另一个方面，该至少一种淋球菌重组蛋白由插入细菌基因组的转基因表达。在另一个方面，脑膜炎球菌菌株是H44/76。在另一个实施例中，脑膜炎球菌菌株H44/76不表达孔蛋白PorA。在另一个实施例中，编码该至少一种淋球菌重组蛋白的转基因的表达由强启动子序列驱动，该强启动子序列在脑膜炎奈瑟球菌中产生高基因转录率。在另一个实施例中，强启动子包括PorA启动子或其衍生物。在另一个实施例中，该启动子包含图2-4所示的序列。在另一个实施例中，将编码该至少一种淋球菌重组蛋白的转基因插入细菌基因组的lpxL1基因座中，其中该插入破坏酰基转移酶基因的表达，并且其中该破坏导致细菌产生五酰化而非六酰化的脂寡糖。在另一个实施例中，将编码该至少一种淋球菌重组蛋白的转基因插入细菌基因组的siaD-galE基因座中，并且其中该插入破坏荚膜多糖的表达和脂寡糖宿主抗原的唾液酸化。在另一个实施例中，将编码至少一种淋球菌重组蛋白的转基因插入siaA基因座中。在另一个实施例中，将编码该至少一种淋球菌重组蛋白的转基因插入fhbp基因座(因子H结合蛋白)中。在另一个实施例中，将编码该至少一种淋球菌重组蛋白的转基因插入porA基因座中。
在一些实施例中，本披露提供了一种药物疫苗组合物，其包含多个细菌天然外膜囊泡(NOMV)，这些细菌天然外膜囊泡包含至少一种来自淋病奈瑟球菌的重组蛋白，其中该淋球菌重组蛋白是脂蛋白或被修饰为脂蛋白。
在一些实施例中，通过消除蛋白质中未暴露于表面的部分并向剩余的C-末端部分添加脂蛋白信号序列来修饰淋球菌重组蛋白，其中淋球菌重组蛋白展示在细菌表面上，并且NOMV作为脂蛋白由该细菌产生。
在一些实施例中，该至少一种淋球菌重组蛋白是GNA1220、MetQ、MetQSM或NHBA、或其衍生物或片段、或其组合。
在一些实施例中，NOMV来源于脑膜炎奈瑟球菌。
在一些实施例中，脑膜炎球菌菌株是H44/76。
在一些实施例中，本披露提供了一种脑膜炎奈瑟球菌菌株，其包含至少一种编码至少一种来自淋病奈瑟球菌的重组蛋白的基因，其中该至少一种淋球菌重组蛋白是脂蛋白或被修饰为脂蛋白。
在一些实施例中，该至少一种淋球菌重组蛋白是GNA1220、MetQ、MetQSM或NHBA、或其衍生物或片段、或其组合。
在一些实施例中，该至少一种淋球菌重组蛋白由质粒中的转基因表达。
在一些实施例中，该至少一种淋球菌重组蛋白由插入细菌基因组的转基因表达。
在一些实施例中，脑膜炎球菌菌株是H44/76。
在一些实施例中，脑膜炎球菌菌株H44/76不表达孔蛋白PorA。
在一些实施例中，编码该至少一种淋球菌重组蛋白的转基因的表达由强启动子序列驱动，该强启动子序列在脑膜炎奈瑟球菌中产生高基因转录率。
在一些实施例中，强启动子包括PorA启动子或其衍生物。
在一些实施例中，该启动子包含图2-4所示的序列。
在一些实施例中，将编码该至少一种淋球菌重组蛋白的转基因插入细菌基因组的lpxL1基因座中，其中该插入破坏酰基转移酶基因的表达，并且其中该破坏导致细菌产生五酰化而非六酰化的脂寡糖。
在一些实施例中，将编码该至少一种淋球菌重组蛋白的转基因插入细菌基因组的siaD-galE基因座中，并且其中该插入破坏荚膜多糖的表达和脂寡糖宿主抗原的唾液酸化。
在一些实施例中，将编码该至少一种淋球菌重组蛋白的转基因插入siaA基因座中。
在一些实施例中，将编码该至少一种淋球菌重组蛋白的转基因插入fhbp基因座中。
在一些实施例中，将编码该至少一种淋球菌重组蛋白的转基因插入porA基因座中。
本披露的这些和其他实施例在以下详细描述。
序列简要说明
SEQ ID NO:1–MetQ蛋白的序列。
SEQ ID NO:2–MetQ的DNA序列。
SEQ ID NO:3–MetQSM蛋白的序列。
SEQ ID NO:4–MetQSM的DNA序列。
SEQ ID NO:5–GNA1220蛋白的序列。
SEQ ID NO:6–GNA1220的DNA序列。
SEQ ID NO:7–GNA1220αβα蛋白的序列。
SEQ ID NO:8–GNA1220_螺旋-αβα的DNA序列。
SEQ ID NO:9–MetQ_奈瑟球菌正向引物的序列。
SEQ ID NO:10–MetQ_SbfI反向引物的序列。
SEQ ID NO:11–MetQ_奈瑟球菌反向引物的序列。
SEQ ID NO:12–MetQ_SpeI反向引物的序列。
SEQ ID NO:13–GNA1220_StuI反向引物的序列。
SEQ ID NO:14–Blue script质粒(FHbp KO+MetQ)的序列。
SEQ ID NO:15–MetQ pBS下游正向引物的序列。
SEQ ID NO:16–RBD pBS下游反向引物的序列。
SEQ ID NO:17–FHbp上游正向引物的序列。
SEQ ID NO:18–FHbp上游反向引物的序列。
SEQ ID NO:19–pGEM质粒(荚膜KO+MetQ)的序列。
SEQ ID NO:20–荚膜KO GalE正向引物的序列。
SEQ ID NO:21–荚膜KO上游MetQ反向引物的序列。
SEQ ID NO:22–荚膜KO Spc下游正向引物的序列。
SEQ ID NO:23–荚膜KO SiaD反向引物的序列。
SEQ ID NO:24–pUC18质粒(lpxL1 KO+MetQ)的序列。
SEQ ID NO:25–Lpxl1上游正向引物的序列。
SEQ ID NO:26–Lpxl1上游反向引物的序列。
SEQ ID NO:27–Lpxl1下游反向引物的序列。
SEQ ID NO:28–Blue script质粒(FHbp KO+GNA1220)的序列。
SEQ ID NO:29–GNA1220 pBS下游正向引物的序列。
SEQ ID NO:30–pGEM质粒(荚膜KO+GNA1220)的序列。
SEQ ID NO:31–荚膜KO上游GNA1220反向引物的序列。
SEQ ID NO:32–pUC18质粒(lpxL1 KO+GNA1220)的序列。
SEQ ID NO:33–pFP12-MetQ质粒的序列。
SEQ ID NO:34–pFP12-MetQSM质粒的序列。
SEQ ID NO:35–pFP12-GNA1220质粒的序列(示于图2)。
SEQ ID NO:36–pFP12-GNA1220_螺旋-αβα质粒的序列。
SEQ ID NO:37–NHBA蛋白的序列。
SEQ ID NO:38–pFP12-NHBA质粒的序列。
SEQ ID NO:39–pFP12-NHBA质粒的序列。
SEQ ID NO:40–pBS-FHbpKO-MetQ质粒的序列(对应于图12)。
SEQ ID NO:41–pBS-FHbpKO-MetQSM质粒的序列(对应于图13)。
SEQ ID NO:42–pBS-FHbpKO-GNA1220质粒的序列(对应于图14)。
SEQ ID NO:43–pBS-FHbpKO-NHba质粒的序列(对应于图15)。
SEQ ID NO:44–pUC18-LpxL1KO-MetQ质粒的序列(对应于图16)。
SEQ ID NO:45–pUC18-LpxL1KO-MetQSM质粒的序列(对应于图17)。
SEQ ID NO:46–pUC18-LpxL1KO-GNA1220质粒的序列(对应于图18)。
SEQ ID NO:47–pUC18-LpxL1KO-NHba质粒的序列(对应于图19)。
SEQ ID NO:48–pGEM-SiaD-GalEKO-MetQ质粒的序列(对应于图20)。
SEQ ID NO:49–pGEM-SiaD-GalEKO-MetQSM质粒的序列(对应于图21)。
SEQ ID NO:50–pGEM-SiaD-GalEKO-GNA1220质粒的序列(对应于图22)。
SEQ ID NO:51–pGEM-SiaD-GalEKO-NHba质粒的序列(对应于图23)。
SEQ ID NO:52–pFP12-MetQ质粒的序列(对应于图24)。
SEQ ID NO:53–pFP12-MetQSM质粒的序列(对应于图25)。
SEQ ID NO:54–pFP12-GNA1220质粒的序列(对应于图26)。
SEQ ID NO:55–pFP12-GNA1220αβα质粒的序列(对应于图27)。
SEQ ID NO:56–pFP12-NHba质粒的序列(对应于图28)。
附图说明
图1描绘了与野生型菌株(灰色阴影直方图)相比，MetQ、MetQSM和NHBA的过表达，其中MetQ或MetQSM的三个染色体拷贝插入siaD-galE、lpxL1和fhbp基因座(虚线直方图)中，以及如实例1中所述的三个拷贝加上多拷贝质粒(黑色实线直方图)；以及与分别用抗rMetQ或抗NHBA多克隆抗体通过流式细胞术测量的野生型NHBA表达(实线直方图)相比，NHBA在siaD-galE、lpxL1和fhbp基因座失活的菌株中过表达，加上具有Ng NHBA的多拷贝质粒(虚线直方图)。
图2描绘了pFP12-GNA1220WT质粒。
图3描绘了pFP12-GNA1220_螺旋-αβα质粒。
图4描绘了pFP12-MetQWT质粒。
图5描绘了来自小鼠(左)和兔(右)的抗MetQ多克隆抗血清与含有重组MetQ的NOMV结合的ELISA结果，该重组MetQ具有1个染色体拷贝(两条线中的下面那条)，或3个拷贝+pFP12质粒，其中每个质粒一个拷贝(两条线中的上面那条)。在该实验中，包被在板上的NOMV恒定在10μg/ml，并且多克隆抗体被连续稀释，如图所示。
图6描绘了与单独用10μg重组MetQ或铝佐剂(明矾)免疫的小鼠相比，用3种剂量10μg、5μg或2.5μg过表达MetQ或MetQSM的NOMV免疫的小鼠个体血清中的IgG滴度。
图7通过流式细胞术描绘了通过用重组MetQ(rMetQ)、rNHBA(最右边图中的实线)或含有过表达MetQ、MetQSM、GNA1220或NHBA的NOMV免疫产生的1:200稀释的多克隆抗体与淋球菌菌株FA1090和MS11的结合。
图8描绘了与10μg重组MetQ(rMetQ)或重组NHBA(rNHBA)相比，通过用5μg来自三重敲除亲本菌株或含有过表达MetQ、MetQSM、GNA1220或NHBA的NOMV免疫小鼠产生的多克隆抗体的血清杀菌活性(SBA)滴度。
图9描绘了通过用rMetQ、rNHBA、NOMV-MetQ、NOMV-MetQSM、NOMV-GNA1220或NOMV-NHBA免疫小鼠产生的多克隆抗体对在ME180人宫颈细胞的两种营养条件下生长的淋球菌菌株FA1090和MS11的定植的抑制作用。
图10描绘了通过流式细胞术用来自小鼠的抗血清(1:200稀释)与脑膜炎奈瑟球菌血清组B菌株MD1244结合的抗体，该小鼠用2个剂量的10μg重组MetQ或5μg NOMV-MetQ、NOMV-MetQSM、NOMV-GNA1220或由fhbp、siaD-galE和lpxL1基因已被敲除的相同菌株制成的NOMV免疫。
图11描绘了来自小鼠的抗血清的血清杀菌活性(SBA)，该小鼠用2个剂量的10μg重组MetQ或5μg NOMV-MetQ、NOMV-MetQSM、NOMV-GNA1220或由fhbp、siaD-galE和lpxL1基因已被敲除的相同菌株制成的NOMV免疫。
图12描绘了pBS-FHbpKO-MetQ质粒(对应于SEQ ID NO:40)。
图13描绘了pBS-FHbpKO-MetQSM质粒(对应于SEQ ID NO:41)。
图14描绘了pBS-FHbpKO-GNA1220质粒(对应于SEQ ID NO:42)。
图15描绘了pBS-FHbpKO-NHba质粒(对应于SEQ ID NO:43)。
图16描绘了pUC18-LpxL1KO-MetQ质粒(对应于SEQ ID NO:44)。
图17描绘了pUC18-LpxL1KO-MetQSM质粒(对应于SEQ ID NO:45)。
图18描绘了pUC18-LpxL1KO-GNA1220质粒(对应于SEQ ID NO:46)。
图19描绘了pUC18-LpxL1KO-NHba质粒(对应于SEQ ID NO:47)。
图20描绘了pGEM-SiaD-GalEKO-MetQ质粒(对应于SEQ ID NO:48)。
图21描绘了pGEM-SiaD-GalEKO-MetQSM质粒(对应于SEQ ID NO:49)。
图22描绘了pGEM-SiaD-GalEKO-GNA1220质粒(对应于SEQ ID NO:50)。
图23描绘了pGEM-SiaD-GalEKO-NHba质粒(对应于SEQ ID NO:51)。
图24描绘了pFP12-MetQ质粒(对应于SEQ ID NO:52)。
图25描绘了pFP12-MetQSM质粒(对应于SEQ ID NO:53)。
图26描绘了pFP12-GNA1220质粒(对应于SEQ ID NO:54)。
图27描绘了pFP12-GNA1220αβα质粒(对应于SEQ ID NO:55)。
图28描绘了pFP12-NHba质粒(对应于SEQ ID NO:56)。
具体实施方式
概述
本披露描述了抗淋病奈瑟球菌(Ng)或脑膜炎奈瑟球菌(Nm)的抗体通过以下的增强保护性作用：(a)在多拷贝质粒上过表达具有新启动子的基因，并在染色体中插入另外的基因以敲除FHbp、荚膜多糖和LOS唾液酸化，(b)展示脑膜炎奈瑟球菌(Nm)NOMV表面上的蛋白质部分，(c)在缺乏孔蛋白PorA的细菌菌株中产生NOMV，该孔蛋白PorA是一种免疫显性抗原，其可以与荚膜多糖一起降低淋球菌蛋白对免疫系统的可及性，以及(d)在脑膜炎球菌NOMV中高度过表达保守的淋球菌蛋白，这些蛋白通常是淋球菌中的次要抗原。由于尚不清楚的原因，但可能在一定程度上取决于上述Rmp和LOS衍生物的免疫屏蔽机制，在淋球菌NOMV中表达的相同抗原的免疫原性差，并且不引发保护免受由Ng引起的疾病的抗体。然而，由Ng NOMV引发的Rmp和LOS封闭性抗体未由通过如上所述敲除galE基因座而修饰的NmNOMV引发。
脑膜炎球菌孔蛋白PorA是Nm中高度表达的蛋白之一，并引发抗PorA抗体的高滴度。然而，驱动基因表达的PorA启动子是相可变的，使得在复制过程中插入或缺失聚G段中的碱基可以导致表达的增加或减少。本文诸位发明人已经发现在含有6个有潜力的启动子的Nm中的PorA基因的上游区，其中只有一个含有聚G段。基于这一分析，PorA启动子通过去除含有聚G段的序列进行工程化，从而消除相变异的潜力同时保留驱动高转录水平的能力。工程化启动子构建体用于驱动插入染色体和多拷贝质粒中的淋球菌基因的表达。将启动子基因构建体插入涵盖siaD和galE基因的区域以消除荚膜多糖的产生以及LOS、fhbp和lpxL1的唾液酸化，以及染色体外质粒中。选择缺少PorA表达的Nm菌株H44/76的变体以提高淋球菌抗原的可及性，并且消除具有对Ng无保护价值的免疫显性抗原的潜在免疫竞争。
在NOMV表面上显示的蛋白质是具有一个或多个跨膜区段的整合膜蛋白或者通过脂肪酸附着于蛋白质的氨基末端进行修饰，从而产生脂蛋白，其中该附着的脂肪酸充当对膜的锚。脂蛋白最初转化为前体脂蛋白，其拥有大约20个氨基酸的氨基末端信号肽，其中具有分泌蛋白的信号肽的典型特征。具有共有氨基酸序列[LVI][ASTVI][GAS]C的信号肽的保守序列(称为脂盒)通过二酰基甘油部分共价附接至不可或缺的半胱氨酸残基的侧链上的硫醇基团进行修饰。这一修饰通过酶脂蛋白二酰基甘油基转移酶(Lgt)催化，产生由通过硫酯键连接至蛋白质的二酰基甘油部分组成的前脂蛋白。脂化后，脂蛋白信号肽酶(Lsp或SPase II)负责切割脂化的前脂蛋白的信号序列并且保留脂盒的半胱氨酸作为新的氨基末端残基。在革兰氏阴性细菌(如脑膜炎奈瑟球菌)中，切割的前脂蛋白通过酰胺连接的酰基基团附接至通过脂蛋白N-酰基转移酶(Lnt)的N-末端半胱氨酸残基进行另外的修饰。二酰基甘油基基团和氨基末端酰基基团源自膜磷脂并且为脂蛋白提供紧密的膜锚定。
特异性结合宿主蛋白、脂质或聚糖的抗原可能无法刺激抗体对发生结合的抗原表面的应答，因为它们被各自宿主蛋白质的结合所掩盖，并且因此不能被抗原特异性B细胞上的受体所接近。与宿主分子结合的抗原是疫苗特别感兴趣的，因为它们典型地在发病机制中起关键作用，并且因此尽管有免疫选择压力，也可能被保留下来。
淋病奈瑟球菌(Ng)蛋白GNA1220
GNA1220的结构建模已经鉴定了4个结构域，如下图所示。它们包括N-末端处的膜锚定区段、红细胞膜整合蛋白样结构域(已知可形成环状结构)、延伸螺旋区段和C-末端处的α-β-α结构域(αβα)。螺旋和αβα结构域是特别重要的，因为它们可能位于细菌的外表面上，并且是保护性抗体的靶标。本发明人已经构建了GNA1220的脂蛋白变体，其由融合到GNA1220的螺旋加上αβα结构域的FHbp ID9的脂蛋白信号序列组成，其中螺旋结构域恰好在红细胞膜整合蛋白样结构域的C-末端处的可能的蛋白水解切割位点(RK)之后开始。
淋病奈瑟球菌(Ng)蛋白MetQ
MetQ的天然存在突变体，在本文中称为MetQSM，通过稳定蛋白质的开放构象来防止甲硫氨酸结合。由锁定在开放构象中的MetQ疫苗抗原引发的抗体与由Ng表达的野生型蛋白的开放形式结合，可能不能结合甲硫氨酸或经历与甲硫氨酸结合相关的构象变化，导致MetQ不能介导与血清和细菌粘附抗性相关的多种功能。
淋病奈瑟球菌(Ng)蛋白奈瑟球菌肝素结合抗原(NHBA)
NHBA是一种与肝素和硫酸软骨素结合的脂蛋白，并且在Ng中是高度保守的(97％-100％同一性)，并可能参与淋球菌与宿主上皮细胞的粘附。
天然外膜囊泡(NOMV)及其疫苗
在一些实施例中，NOMV可以用作疫苗来治疗或预防如本文所述的患者或受试者的淋球菌和/或脑膜炎球菌感染。NOMV可以以治疗有效剂量或量施用于经历淋球菌和/或脑膜炎球菌感染症状的患者或受试者，或者可以以治疗有效剂量或量施用于淋球菌和/或脑膜炎球菌感染检测呈阳性的无症状患者。
脑膜炎奈瑟球菌的外膜，主要由脂寡糖(LOS)、外膜蛋白(OMP)和磷脂组成，并且通常非常松散地附着于细胞壁。在细菌的稳定生长期间，外膜的囊泡或气泡被释放到周围介质中。这些天然外膜囊泡(NOMV)由完整的外膜组成，包括所有相关蛋白和LOS，但缺乏周质和细胞质组分。如本文所述，本披露的发明人已经工程化了脑膜炎奈瑟球菌(Nm)菌株，以表达淋球菌蛋白，如GNA1220、MetQ、突变蛋白MetQSM和/或NHBA。如本文所述，当以治疗有效量或预防有效量施用于患者时，NOMV疫苗能够治疗和预防淋球菌和/或脑膜炎球菌感染，以及感染症状。表达淋球菌蛋白(如GNA1220、MetQ、MetQSM和/或NHBA)的NOMV疫苗的制备描述于实例中并在本文中详细描述。
用于治疗或预防淋球菌和/或脑膜炎球菌感染的方法
在一些实施例中，本披露提供了一种治疗淋球菌和/或脑膜炎球菌感染的方法，该方法包括向感染了淋球菌菌株或脑膜炎球菌菌株的患者施用治疗有效量的如本文所述的NOMV疫苗。在一些实施例中，NOMV疫苗的这种施用可以是治疗性的，并导致患者与淋球菌和/或脑膜炎球菌感染相关的症状的改善。在其他实施例中，NOMV疫苗的这种施用可以是预防性的，并导致预防感染和疾病的发展。
如本文所述，本披露的方法可以治疗或预防受试者或患者感染淋球菌和/或脑膜炎球菌感染。如本文所述的包含NOMV的组合物的施用可以在如本文所述的临床环境中，或可以在如临床医生或从业者认为适当的替代环境中。用于施用此类NOMV疫苗的其他实施例在本文别处描述。
在一些实施例中，这种包含如本文所述NOMV疫苗的组合物可以与用于治疗患者淋球菌和/或脑膜炎球菌感染的其他疗法或治疗组合。任何适当的药物治疗或治疗方式均可以在临床医生认为适当的情况下使用。
施用如本文所述的NOMV疫苗可以将淋球菌和/或脑膜炎球菌症状的天数减少一天或多天，如将症状减少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天等。如本文所述的NOMV疫苗的施用可以是单次施用或剂量，或者可以是多于一次施用或剂量，如包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多剂量。如本领域技术人员将理解的，一些患者或受试者可以受益于用本披露的NOMV疫苗进行的多于一次施用或治疗。这种施用将由临床医生或其他合格的医护人员做出。
在其他实施例中，淋球菌和/或脑膜炎球菌感染的症状可以减少一周或更长时间，如包括但不限于一周、2周、3周、4周、5周、6周、7周或8周或更长时间。在其他实施例中，施用如本文所述的NOMV疫苗可以将淋球菌和/或脑膜炎球菌感染的严重性或持续时间减少10％、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％、或90％、或100％。
除非本文另有说明，否则本文所述的方法可以根据本文示例的程序或本领域熟知的常规实践方法进行。参见例如，Methods in Enzymology[酶学方法],第289卷:Solid-Phase Peptide Synthesis[固相肽合成],J.N.Abelson,M.I.Simon,G.B.Fields(编辑),Academic Press[学术出版社]；第1版(1997)(ISBN-13:978-0121821906)；美国专利号4,965,343和5,849,954；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆实验室手册],冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press),纽约,(第3版,2000)；Brent等人,Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学当前方案],约翰威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc)(2003)；Davis等人,Basic Methods in Molecular Biology[分子生物学的基本方法],爱思唯尔科学出版公司(Elsevier Science Publishing,Inc.),美国纽约(1986)；或Methods in Enzymology:Guide to Molecular CloningTechniques[酶学方法：分子克隆技术指南]第152卷,S.L.Berger和A.R.Kimmel编辑,学术出版公司(Academic Press Inc.),美国圣地亚哥(1987)；Current Protocols in ProteinScience[最新蛋白质科学实验指南](CPPS)(John E.Coligan等人编辑,约翰威利父子公司(John Wiley and Sons,Inc.))，Current Protocols in Cell Biology[细胞生物学实验室指南](CPCB)(Juan S.Bonifacino等人编辑,约翰威利父子公司)，以及R.Ian Freshney的Culture of Animal Cells:AManual of Basic Technique[动物细胞培养：基本技术手册],出版商：威利-利斯(Wiley-Liss)；第5版(2005)，Animal Cell Culture Methods[动物细胞培养方法](Methods in Cell Biology[细胞生物学方法],第57卷,Jennie P.Mather和David Barnes编辑,学术出版社,第1版,1998)。以下部分为实践本披露的方法提供了另外的指导。
编码重组多肽的表达系统和载体
如本文详述的，本披露提供了可以施用于需要针对淋球菌和/或脑膜炎球菌感染进行长期体内保护或治疗的哺乳动物受试者的药物组合物和治疗性组合物。此类组合物典型地包含表达系统，例如，编码或表达如本文所述的重组多核苷酸或多肽的细菌菌株、多核苷酸或多肽序列、表达载体或病毒载体。在一些实施例中，表达的重组多核苷酸或多肽编码为脂蛋白或被修饰为脂蛋白的淋球菌蛋白。本披露的组合物允许如本文所述的重组多肽(其提供针对如本文所述的淋球菌和/或脑膜炎球菌感染的有效和长期保护)在受试者或患者(例如，人或非人灵长类动物)中的最佳体内活性或共表达。
如本文所述的含有重组多肽(如淋球菌蛋白)的NOMV最佳表达可以经由各种机制来完成。这种最佳表达可以使用编码重组多肽的表达载体的所期望结构设计，或通过在表达载体中使用适当调节元件来完成。另外，本披露的重组多肽在体内的最佳表达可以通过测量本文所述的重组多肽的细胞水平来进一步优化。可酌情使用用于确定多肽的适当水平的任何测定法。此类测试都可以经由本领域熟知的标准测定或方案容易地进行。
在一些实施例中，编码如本文所述的重组多肽(如淋球菌蛋白)的多核苷酸序列与本文所述的基于细菌或基于病毒的表达载体或表达系统中的表达控制序列(例如，启动子序列)可操作地连接。细菌表达系统的一些实例包括但不限于脑膜炎球菌菌株，如包括但不限于脑膜炎奈瑟球菌(脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)或Nm)、淋病奈瑟球菌(Ng)或其他合适的菌株。在一些实施例中，可用于表达淋球菌蛋白的Nm或Ng细菌菌株可以是缺乏孔蛋白PorA表达的菌株，如Nm菌株H44/76。
如本文所述，Nm可以用于表达淋球菌蛋白，如GNA1220、MetQ、MetQSM或NHBA，或点突变体或其部分。在一些实施例中，淋球菌蛋白是脂蛋白或被修饰为脂蛋白。本领域已知或可获得的任何有用的质粒均可以用于编码和/或表达Nm中的淋球菌蛋白。例如，可用于本披露的载体可以是质粒。有用的质粒可以包括但不限于本文所述的并且能够携带和编码如本文所述淋球菌蛋白的任何质粒，如pFP12-GNA1220WT质粒(参见图2)、pFP12-GNA1220_螺旋-αβα(参见图3)、pFP12-MetQWT质粒(参见图4)、Bluescript质粒(FHbp KO+MetQ，SEQ ID NO:14)、pGEM质粒(荚膜KO+MetQ，SEQ ID NO:19)、pUC18质粒(lpxL1 KO+MetQ，SEQ ID NO:24)、Bluescript质粒(FHbp KO+GNA1220，SEQ ID NO:28)、pGEM质粒(荚膜KO+GNA1220，SEQ IDNO:30)、pUC18质粒(lpxL1 KO+GNA1220，SEQ ID NO:32)、pFP12-MetQ质粒(SEQ ID NO:33)、pFP12-MetQSM质粒(SEQ ID NO:34)、pFP12-GNA1220质粒(SEQ ID NO:35)、pFP12-GNA1220_螺旋-αβα质粒(SEQ ID NO:36)、pFP12-NHBA质粒(SEQ ID NO:38)、pFP12-NHBA质粒(SEQ IDNO:39)、pBS-FHbpKO-MetQ质粒(SEQ ID NO:40)、pBS-FHbpKO-MetQSM质粒(SEQ ID NO:41)、pBS-FHbpKO-GNA1220质粒(SEQ ID NO:42)、pBS-FHbpKO-NHba质粒(SEQ ID NO:43)、pUC18-LpxL1KO-MetQ质粒(SEQ ID NO:44)、pUC18-LpxL1KO-MetQSM质粒(SEQ ID NO:45)、pUC18-LpxL1KO-GNA1220质粒(SEQ ID NO:46)、pUC18-LpxL1KO-NHba质粒(SEQ ID NO:47)、pGEM-SiaD-GalEKO-MetQ质粒(SEQ ID NO:48)、pGEM-SiaD-GalEKO-MetQSM质粒(SEQ ID NO:49)、pGEM-SiaD-GalEKO-GNA1220质粒(SEQ ID NO:50)、pGEM-SiaD-GalEKO-NHba质粒(SEQIDNO:51)、pFP12-MetQ质粒(SEQ ID NO:52)、pFP12-MetQSM质粒(SEQ ID NO:53)、pFP12-GNA1220质粒(SEQ ID NO:54)、pFP12-GNA1220αβα质粒(SEQ ID NO:55)或pFP12-NHba质粒(SEQ ID NO:56)。
适用于本披露的病毒载体的一些实例包括基于逆转录病毒的载体，例如慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)和牛痘载体。在一些实施例中，可以根据需要修饰载体的结构以优化重组多肽的表达或实现所期望的细胞水平，如包括表达控制元件(例如，启动子或增强子序列)。在一些实施例中，如本文所述的淋球菌蛋白的表达可以通过使用在Nm中产生高基因转录率的强启动子(如孔蛋白PorA启动子)来完成。在一些实施例中，一个启动子相对于另一个启动子的强度之间的差异是它与“共有序列”的一致性有多强，也就是说，最强地允许转录复合物以高概率与其结合的碱基序列。在其他实施例中，启动子可以被修饰以包括例如，改变-10和-35序列以匹配来自Nm的特定序列。例如，为了匹配例如，Nm的Sigma70共有序列，可以进行将如本文所述的启动子序列从TATTTG或TACAAA和TAAAGG或TGCCCG分别修饰为TATAAT和TTGACA。
在一些实施例中，根据本披露有用的这种启动子可以包括本文所示的任何启动子序列，或本领域已知和/或可获得的其他启动子序列。
在一些实施例中，待在脑膜炎球菌菌株(如Nm)中表达的淋球菌蛋白和合适的启动子，如本文所述，可以插入细菌基因组的基因座中。此类技术是本领域已知和可获得的。如本文所述的含有淋球菌蛋白和合适启动子以实现高转录率的构建体或质粒可以被插入细菌基因组中的任何所期望基因座中。某些基因座对此可能是优选的，如赋予细菌细胞特定性状或基因产物的基因。例如，如本文所述，可以将淋球菌蛋白基因和确保高转录率的启动子插入lpxL1基因座中，这破坏了酰基转移酶基因的表达，使得产生的脂寡糖是五酰化的而不是六酰化的。在其他实施例中，可以将淋球菌蛋白基因和确保高转录率的启动子插入siaD-galE基因座(也称为siaA)中，以破坏荚膜多糖的表达以及脂寡糖(LOS)宿主抗原的唾液酸化。在其他实施例中，可以将淋球菌蛋白基因和确保高转录率的启动子插入fhbp基因座(因子H结合蛋白)中。在其他实施例中，可以将淋球菌蛋白基因和确保高转录率的启动子插入porA基因座中。
可以根据本披露使用本领域熟知的其他启动子序列。这些包括但不限于例如，CMV启动子、延伸因子-I短(EFS)启动子、鸡肌动蛋白(CBA)启动子、EF-la启动子、人结蛋白(DES)启动子、Mini TK启动子和人甲状腺素结合球蛋白(TBG)启动子。此外，本披露的表达载体可以包括许多调节元件以实现淋球菌蛋白的最佳表达。例如，可以包括5'-增强子元件和/或5'-WPRE元件以提高重组多肽的表达。WPRE是一种转录后应答元件，与土拨鼠乙型肝炎病毒(WHYS)基因组的碱基对1093至1684具有100％的同源性。当用于哺乳动物表达盒的3'UTR中时，它可以显著提高mRNA稳定性和蛋白质产量。如本文所用，“表达盒”是指多核苷酸序列，该多核苷酸序列包含至少第一多核苷酸序列，该第一多核苷酸序列能够启动可操作地连接的第二多核苷酸序列的转录，并且任选地包含可操作地连接到第二多核苷酸序列的转录终止序列。如本文所用，表达盒可以包含编码如本文所述的淋球菌蛋白的外源核酸，其可操作地连接至如本文所述的启动子。
通过在受试者或患者中表达如本文所述的重组多肽，有效和长期的体内保护以对抗和/或治疗受试者如人中的淋球菌和/或脑膜炎球菌感染。对于这种方法，可以向受试者施用药物组合物，该药物组合物含有治疗或药学有效量的本披露的重组多肽或治疗性组合物或表达系统，即编码本文所述的淋球菌蛋白，如GNA1220、MetQ、MetQSM和/或NHBA。在一些相关实施例中，本披露提供了治疗性组合物，其包含用于在受试者中最佳表达如本文所述的淋球菌蛋白的表达系统。表达系统可以是多核苷酸序列或表达载体，以及NOMV、脂质体或其他含脂质的复合物，以及能够介导多核苷酸序列递送至宿主细胞或受试者的其他大分子复合物。多种表达载体或系统可用于在施用于受试者后表达本披露的重组多肽。在一些实施例中，表达载体或表达系统可以基于细菌载体。在一些实施例中，表达载体或表达系统可以基于病毒载体。在一些其他实施例中，表达系统由含有如本文所述的重组多肽的编码序列的多核苷酸序列构成，包括脱氧核糖核酸和核糖核酸序列。在一些实施例中，表达载体或系统以表达如本文所述淋球菌蛋白或其NOMV疫苗的重组细菌菌株的形式施用于受试者。根据本领域已知的方法，在施用于患者或受试者之前，可以分离和纯化NOMV。在一些实施例中，表达载体或系统以重组病毒的形式施用于受试者。例如，重组病毒可以是重组腺相关病毒(AAV)，例如自互补腺相关病毒(scAAV)载体。此类病毒递送方法允许安全、无干扰性和持续表达高水平的如本文所述的治疗剂。
如上所述，当使用本披露的治疗性组合物预防或治疗受试者的淋球菌感染时，可以在治疗过程中检查重组多肽的表达水平。在一些实施例中，施用的重组多肽或组合物导致重组多肽在受试者中的表达量足以将受试者中可检测到的细菌数量减少至少2-、3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、15-、20-、25-、30-、35-、40-、45-、50-、55-、60-、65-、70-、75-、80-、85-、90-、95-、100-、150-、200-、250-、300-、350-、400-、450-、500-、750-、1000-倍或更多。在一些优选的实施例中，用如本文所述的NOMV疫苗治疗受试者或患者以表达用于治疗或预防淋球菌和/或脑膜炎球菌感染的本披露的淋球菌蛋白或治疗性或药物组合物，导致细菌或细菌核酸或蛋白质减少至经治疗受试者血液或血浆中检测不到的水平。
如本文所述的表达载体可以包含进一步调节基因递送和/或基因表达或以其他方式提供有益特性的编码序列和其他组分或功能。此类其他组分包括，例如，影响与细胞结合或靶向的组分(包括介导细胞类型或组织特异性结合的组分)；影响细胞摄取载体的组分；摄取后影响转移的基因在细胞内定位的组分(例如介导核定位的试剂)；以及影响基因表达的组分。此类组分还可以包括标志物，例如可用于检测或选择已经摄取并正在表达由载体递送的核酸的细胞的可检测和/或可选择标志物。此类组分可作为载体的天然特征提供(例如使用具有介导结合和摄取的组分或功能的某些病毒载体)，或可修饰载体以提供此类功能。可选择标志物可以是阳性的、阴性的或双功能的。阳性可选择标志物允许选择携带该标志物的细胞，而阴性可选择标志物允许携带该标志物的细胞被选择性消除。已经描述了多种此类标志物基因，包括双功能(即阳性/阴性)标志物(参见例如，WO 92/08796；和WO 94/28143)。此类标志物基因可以提供另外的控制措施，这在基因治疗环境中可能是有利的。大量此类载体是本领域已知的并且通常是可获得的。在一些实施例中，将淋球菌蛋白单独或与提供高水平转录的合适启动子一起插入特定的细菌或病毒宿主基因中可以提供可筛选或可选择的特征，例如，以下中的一个或多个：lpxL1基因座，其破坏酰基转移酶基因的表达，使得产生的脂寡糖是五酰化的而不是六酰化的，或siaD-galE基因座(也称为siaA)，以破坏荚膜多糖的表达和脂寡糖宿主抗原的唾液酸化，或fhbp基因座(因子H结合蛋白)，或porA基因座。
适用于本披露的表达载体或系统包括但不限于分离的多核苷酸序列，例如可以在染色体外维持的基于质粒的载体，以及病毒载体，例如重组腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、痘病毒、乳头瘤病毒或腺相关病毒，包括病毒和非病毒载体，它们存在于脂质体(例如中性或阳离子脂质体，如DOSPA/DOPE、DOGS/DOPE或DMRIE/DOPE脂质体)中，和/或与其他分子缔合，如DNA-抗DNA抗体-阳离子脂质(DOTMA/DOPE)复合物。示例性基因病毒或细菌载体是本领域已知的并在下文描述。载体可以经由任何途径施用，这些途径包括但不限于肌肉内、口腔、直肠、冠状动脉内、静脉内、鼻内、经阴道、皮下、动脉内、关节内、腹膜内、肠胃外，并且可以使用电穿孔和/或离子透入增强向细胞的转移。
在一些实施例中，可用于构建如本文所述质粒的引物可以包括本文所述的任何引物。本领域技术人员将理解，在不脱离本披露范围的情况下，可以使用其他引物或载体。如本文所述有用的引物的一些实例如下：
可用于构建pUC18 Lpxl1和pBS FHbp质粒的引物：
MetQ WT和N238A突变体：
MetQ_奈瑟球菌正向引物，5'-atacaattgCCTCAGCGCATGCATC-3'(SEQ ID NO:9)
MetQ_SbfI反向引物，5'-tatCCTGCAGGTTATACGACTGCCTTATTTG-3'(SEQ ID NO:10)。
GNA1220：
MetQ_奈瑟球菌正向引物，5'-atacaattgCCTCAGCGCATGCATC-3'(SEQ ID NO:9)
GNA1220_SbfI反向引物，5'-tatCCTGCAGGTTATACGACTGCCTTATTTG-3'(SEQ ID NO:10)。
可用于构建pGEM SiaD/GalE质粒的引物：
MetQWT、N238A突变体和GNA1220：
MetQ_奈瑟球菌正向引物，5'-atacaattgCCTCAGCGCATGCATC-3'(SEQ ID NO:9)
MetQ_奈瑟球菌反向引物，5'-tattctagaTTATACGACTGCCTTATTTGGC-3'(SEQ IDNO:11)。
可用于构建pFP12质粒的引物：
MetQ WT和N238A突变体：
MetQ_奈瑟球菌正向引物，5'-atacaattgCCTCAGCGCATGCATC-3'(SEQ ID NO:9)
MetQ_SpeI反向引物，5'-tatACTAGTTTATACGACTGCCTTATTTGGCTG-3'(SEQ ID NO:12)。
GNA1220：
MetQ_奈瑟球菌正向引物，5'-atacaattgCCTCAGCGCATGCATC-3'(SEQ ID NO:9)
GNA1220_StuI反向引物，5'-tatAGGCCTTATACGACTGCCTTATTTGGC-3'(SEQ ID NO:13)。
在一些实施例中，特异性引物可用于确认奈瑟球菌中基因的存在或不存在，例如，MetQ pBS下游正向引物(SEQ ID NO:15)和RBD pBS下游反向引物(SEQ ID NO:16)，它们产生800bp的片段。
在其他实施例中，可以使用FHbp上游正向引物(SEQ ID NO:17)和上游反向引物(SEQ ID NO:18)，它们产生800bp的片段。在一些实施例中，这些引物也可以用于RBD。
在一些实施例中，可以用荚膜KO GalE正向引物(SEQ ID NO:20)和荚膜KO上游metQ反向引物(SEQ ID NO:21)产生上游900-bp片段。
在一些实施例中，可以用荚膜KO Spc下游正向引物(SEQ ID NO:22)和荚膜KOSiaD反向引物(SEQ ID NO:23)产生下游850-bp片段。
在一些实施例中，可以用Lpxl1上游正向引物(SEQ ID NO:25)和Lpxl1上游反向引物(SEQ ID NO:26)产生大约770-bp片段。
在一些实施例中，metQ pBS下游正向引物(SEQ ID NO:15)可以与Lpxl1下游反向引物(SEQ ID NO:27)一起用于检测FHbp基因座中的MetQ。
在一些实施例中，可以用GNA1220 pBS下游正向引物(SEQ ID NO:29)和RBD pBS下游反向引物(SEQ ID NO:16)产生800-bp片段。
在一些实施例中，可以用FHbp上游正向(SEQ ID NO:17)和FHbp上游反向(SEQ IDNO:18)产生800-bp片段。在一些实施例中，这些引物也可以用于RBD。
在一些实施例中，可以一起使用荚膜KO GalE正向引物(SEQ ID NO:20)和荚膜KO上游GNA1220反向引物(SEQ ID NO:31)。
在一些实施例中，可以用荚膜KO Spc下游正向引物(SEQ ID NO:22)和荚膜KOSiaD反向引物(SEQ ID NO:23)产生下游850-bp片段。
在一些实施例中，可以用Lpxl1上游正向引物(SEQ ID NO:25)和Lpxl1上游反向引物(SEQ ID NO:26)产生大约770-bp片段。
在一些实施例中，可以用GNA1220 pBS下游正向引物(SEQ ID NO:29)和Lpxl1下游反向引物(SEQ ID NO:27)产生650-bp片段。在一些实施例中，GNA1220下游正向引物可以用于检测FHbp基因座中的GNA1220。
在一些实施例中，可用于本披露的蛋白质序列可以包括但不限于MetQ(SEQ IDNO:1)、MetQSM(SEQ ID NO:3)、GNA1220(SEQ ID NO:5和7)和NHBA(SEQ ID NO:37)。
在一些实施例中，根据本披露，某些质粒序列可能是有用的，如Bluescript质粒(FHbp KO+MetQ，SEQ ID NO:14)、或pGEM质粒(荚膜KO+MetQ，SEQ ID NO:19)、或pUC18质粒(lpxL1 KO+MetQ，SEQ ID NO:24)、或Bluescript质粒(FHbp KO+GNA1220，SEQ ID NO:28)、或pGEM质粒(荚膜KO+GNA1220，SEQ ID NO:30)、或pUC18质粒(lpxL1KO+GNA1220，SEQ IDNO:32)、或pFP12-MetQ质粒(SEQ ID NO:33)、或pFP12-MetQSM质粒(SEQ ID NO:34)、或pFP12-GNA1220质粒(SEQ ID NO:35)、或pFP12-GNA1220_螺旋-αβα质粒(SEQ ID NO:36)、或pFP12-NHBA质粒(SEQ ID NO:38)、或pFP12-NHBA质粒(SEQ ID NO:39)、或pBS-FHbpKO-MetQ质粒(SEQ ID NO:40)、或pBS-FHbpKO-MetQSM质粒(SEQ ID NO:41)、或pBS-FHbpKO-GNA1220质粒(SEQ ID NO:42)、或pBS-FHbpKO-NHba质粒(SEQ ID NO:43)、或pUC18-LpxL1KO-MetQ质粒(SEQ ID NO:44)、或pUC18-LpxL1KO-MetQSM质粒(SEQ ID NO:45)、或pUC18-LpxL1KO-GNA1220质粒(SEQ ID NO:46)、或pUC18-LpxL1KO-NHba质粒(SEQ ID NO:47)、或pGEM-SiaD-GalEKO-MetQ质粒(SEQ ID NO:48)、或pGEM-SiaD-GalEKO-MetQSM质粒(SEQ ID NO:49)、或pGEM-SiaD-GalEKO-GNA1220质粒(SEQ ID NO:50)、或pGEM-SiaD-GalEKO-NHba质粒(SEQ IDNO:51)、或pFP12-MetQ质粒(SEQ ID NO:52)、或pFP12-MetQSM质粒(SEQ ID NO:53)、或pFP12-GNA1220质粒(SEQ ID NO:54)、或pFP12-GNA1220αβα质粒(SEQ ID NO:55)、或pFP12-NHba质粒(SEQ ID NO:56)。
用于预防细菌感染的药物组合物或治疗性组合物
在一些实施例中，本披露提供了一种治疗性或药物组合物，其包含表达淋球菌蛋白的NOMV疫苗，如GNA1220、MetQ和/或NHBA，或其突变体，如MetQSM，如本文所述。载体在上面详细描述并且将是本领域技术人员已知的。
在一些实施例中，表达如本文所述淋球菌蛋白的NOMV可以作为药物组合物或治疗性组合物提供，以施用于受试者或患者用于治疗淋球菌或脑膜炎球菌感染。本披露的组合物可以包含在单个单位中表达如本文所述淋球菌蛋白的NOMV，或者可替代地，在一些实施例中，表达如本文所述淋球菌蛋白的NOMV可以包含多个NOMV。在一些实施例中，NOMV可以表达完整的淋球菌蛋白，或者可以表达足以提供所期望免疫效果的淋球菌蛋白的一部分。
在一些实施例中，如本文所述的淋球菌蛋白可以作为表达淋球菌蛋白的NOMV提供或施用于受试者或患者。本披露提供了NOMV疫苗、药物组合物以及使用这些疫苗、组合物、或表达系统来抑制、预防或治疗淋球菌和/或脑膜炎球菌感染的相关方法。还提供了本文所述的多核苷酸、多肽和表达载体或系统用于制造预防或治疗淋球菌和/或脑膜炎球菌感染的药物的用途。药物组合物可以是治疗性配制品或预防性配制。通常，药物组合物可包含一种或多种活性成分和任选的一些非活性成分。在一些实施例中，活性成分可以是本文所述的NOMV疫苗、重组多肽、表达载体或表达系统。在一些其他实施例中，活性成分可以除了本披露的表达系统之外还包括其他抗菌剂。组合物可以另外包含一种或多种药学上可接受的媒剂和任选的其他治疗性成分(例如抗生素)。各种药学上可接受的添加剂也可用于此类组合物中。
在一些实施例中，如本文所述的用于治疗淋球菌和/或脑膜炎球菌感染的NOMV疫苗，以及如本文所述的包含编码淋球菌蛋白的构建体或质粒的重组细菌及其药物组合物，可以以任何适当的剂量施用以获得治疗结果。如本领域技术人员将理解的，适合于治疗或预防淋球菌和/或脑膜炎球菌感染或实现特定结果的NOMV剂量将取决于各种因素而变化，这些因素包括但不限于所选择的基因和启动子、病症、患者特异性参数(例如身高、体重和年龄)，以及是否要实现预防或治疗。本披露的NOMV疫苗可以方便地以适于施用到例如血流中(例如，冠状动脉内)的配制品形式提供。合适的施用形式最好可以由执业医师或临床医生根据标准程序为每个患者单独确定，并且可以包括但不限于肌肉内、口腔、直肠、冠状动脉内、静脉内、鼻内、经阴道、皮下、动脉内、关节内、腹膜内、肠胃外或本领域已知的任何其他合适的施用方式。
本披露的疫苗或药物组合物可以根据本领域熟知的标准程序制备。参见例如，Remingtons Pharmaceutical Sciences[雷明顿制药科学],第19版,麦克出版公司(MackPublishing Company),宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,Pa.),1995；Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems[缓控释药物递送系统],J.R.Robinson编辑,马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker,Inc.),纽约,1978；美国专利号4,652,441；4,917,893；4,677,191；4,728,721；和4,675,189。本披露的药物组合物可以容易地用于预防或治疗淋球菌和/或脑膜炎球菌感染的多种治疗性应用或预防性应用中。对于处于发生淋球菌和/或脑膜炎球菌感染风险中的受试者，可以施用本披露的疫苗组合物以提供针对淋球菌和/或脑膜炎球菌感染的预防性保护。取决于具体的受试者和条件，本披露的组合物可以通过本领域普通技术人员已知的多种施用方式(例如，肌肉内、皮下、静脉内、动脉内、关节内、腹膜内或胃肠外途径)施用于受试者或患者。在一些实施例中，如本文所述的组合物可施用给需要这样的治疗的受试者，施用时间和条件足以预防、抑制和/或改善所选疾病或病症或其一种或多种症状。对于治疗性应用，组合物可以包含治疗有效量的本文所述的表达系统。对于预防性应用，如本文所述的组合物可包含预防有效量的如本文所述的表达系统。表达系统(例如，表达载体)的适当量可以基于待治疗或预防的特定疾病或病症，受试者的严重性、年龄，以及特定受试者的其他个人属性(例如，受试者健康的一般状况和受试者免疫系统的健壮性)来确定。有效剂量的确定还可以通过动物模型研究(即灵长类动物、犬科动物等)、随后的人体临床试验以及显著降低受试者中靶向的疾病症状或病症的发生或严重性的施用方案来指导。
对于预防性应用，如本文所述的NOMV疫苗可以在任何症状出现之前提供，例如在感染之前提供。免疫原性组合物的预防性施用可用于预防或改善任何随后的感染。因此，在一些实施例中，待治疗的受试者是患有淋球菌和/或脑膜炎球菌感染或有发生淋球菌和/或脑膜炎球菌感染风险(例如由于暴露于细菌或可能暴露于细菌)的人。在施用治疗有效量的所披露的治疗性组合物后，可以监测受试者或患者的淋球菌和/或脑膜炎球菌感染、与淋球菌和/或脑膜炎球菌感染相关的症状或两者。
对于治疗性应用，如本文所述的组合物可以在疾病或感染的症状发作时或之后提供，例如在淋球菌和/或脑膜炎球菌感染的症状发展之后，或在诊断感染之后。因此，如本文所述的组合物可以在预期暴露于淋球菌菌株或脑膜炎球菌菌株之前提供，以减轻暴露或疑似暴露于细菌之后，或在感染实际开始之后感染和/或相关疾病症状的预期严重性、持续时间或程度。
在一些实施例中，本披露的NOMV疫苗可以以含有一定量的表达或包含淋球菌蛋白(其在一个或多个剂量中是有效的)的NOMV的剂型提供。有效剂量可以是临床医生或从业者认为适当的任何范围。NOMV疫苗与淋球菌蛋白、表达淋球菌蛋白的重组细菌菌株或包含任何这些的组合物的施用可以在缓冲液中，如磷酸盐缓冲盐水，或其他适当的缓冲液或稀释剂中。缓冲液或稀释剂的量可能会有所不同，并由临床医生或从业者确定。对于将单独的质粒DNA或与其他大分子复合的质粒DNA递送至细胞，待施用的DNA量将是对接受者产生有益效果的量。例如，可以以单独剂量或分开的剂量施用0.0001至1mg或更多，例如，多达1g，例如，从0.001至0.5mg，或0.01至0.1mg DNA。如本文所述，对于重组多肽，如淋球菌蛋白(例如，GNA1220、MetQ、MetQSM和/或NHBA)或其衍生物的递送，施用的量将是对接受者产生有益效果的量。例如，可以以单独剂量或分开的剂量施用0.0001至100g或更多，例如多达1g，例如0.001至0.5g，或0.01至0.1g重组多肽。对于如本文所述的NOMV疫苗的递送，施用的量将是对接受者产生有益效果的量，无论是治疗性的还是预防性的。此类量或体积将由临床医生或从业者确定。
在一些实施例中，本披露的组合物可以与本领域已知的用于治疗或预防淋球菌和/或脑膜炎球菌感染的其他药剂组合。这些可以包括本领域已知或可获得的用于治疗细菌感染的任何药物，例如抗体或其他抗菌剂，如抗菌化合物或药物、蛋白酶抑制剂、融合蛋白抑制剂等。在一些实施例中，如本文所述的用于治疗或预防淋球菌和/或脑膜炎球菌感染的组合物在患者或受试者由于细菌中抗生素耐药性增加而对抗生素治疗无反应的情况下可能是有利的。组合物和一种或多种已知抗菌剂的施用可以同时或顺序进行。
如本文所述，基于NOMV的疫苗比相应的重组蛋白引发更高的抗体滴度和更广泛的反应性，并且可能更耐受，因为提供有效的保护性抗体应答可能需要更少的蛋白质。因此，在一些实施例中，为了增强抗体应答，NOMV可以与佐剂一起施用。合适的佐剂是本领域已知的，并且可以包括但不限于铝化合物[例如，无定形羟基磷酸硫酸铝(AAHS)、氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾(明矾)、氢氧化铝佐剂(2％铝胶)]、胞嘧啶磷酸鸟嘌呤(CpG)核苷酸(例如，CpG1018)、AS01、AS04、QS-21、RIBI、MF59等。
核酸的表达
可在表达构建体中提供可用于本披露的多核苷酸。本披露的表达构建体通常包括在要表达表达构建体的预期宿主细胞中起作用的调节元件。因此，本领域普通技术人员可以选择调节元件用于例如细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、哺乳动物宿主细胞和人宿主细胞。用于表达核基因的调节元件包括启动子、转录终止序列、翻译终止序列、增强子和多腺苷酸化元件。如本文所用，术语“表达构建体”是指提供可操作地连接的核酸序列的转录的核酸序列的组合。如本文所用，术语“可操作地连接”是指所描述的组分的并列，其中组分处于允许它们以它们的预期方式起作用的关系中。通常，可操作地连接的组分处于连续的关系。
本披露的表达构建体可以包含与编码本披露的多肽的多核苷酸序列可操作地连接的启动子序列。可以使用本领域已知的标准技术将启动子掺入多核苷酸中。启动子的多个拷贝或多个启动子可以用于本披露的表达构建体中。在优选的实施例中，启动子与表达构建体中的转录起始位点的距离可以与其跟其天然遗传环境中的转录起始位点的距离大致相同。在不显著降低启动子活性的情况下，允许该距离有一些变化。转录起始位点通常包含在表达构建体中。
本披露的核表达构建体可以任选地包含转录终止序列、翻译终止序列、编码信号肽的序列和/或增强子元件。转录终止区通常可以从真核或病毒基因序列的3'非翻译区获得。转录终止序列可以位于编码序列的下游以提供有效终止。信号肽序列是一种短氨基酸序列，通常存在于蛋白质的氨基末端，负责将可操作地连接的成熟多肽重新定位到广泛范围的翻译后细胞目的地，范围从特定的细胞器区室到蛋白质作用位点和细胞外环境。通过使用可操作地连接的信号肽序列将基因产物靶向到预期的细胞和/或细胞外目的地被考虑用于与本披露的多肽一起使用。经典增强子是增加基因转录的顺式作用元件，也可以包含在表达构建体中。经典增强子元件是本领域已知的，包括但不限于巨细胞病毒(CMV)早期启动子增强子元件和SV40增强子元件。增强基因表达的内含子介导的增强子元件也是本领域已知的。这些元件必须存在于转录区域内并且是取向依赖性的。
指导从表达构建体转录的mRNA的多腺苷酸化的DNA序列也可以包括在表达构建体中，例如SV40聚A信号，并且包括但不限于章鱼碱合酶或胭脂碱合酶信号。
本披露的多核苷酸可以由RNA或DNA或其杂合体构成。本披露还涵盖那些在序列上与本文披露的多核苷酸互补的多核苷酸。本披露的多核苷酸和多肽能够以纯化或分离的形式提供。
核酸
可以使用本领域技术人员熟知的许多方法来分离和操作DNA分子。例如，如前所述，PCR技术可以用于扩增特定的起始DNA分子和/或产生起始DNA分子的变体。也可以通过本领域已知的任何技术(包括通过化学手段直接合成片段)获得DNA分子或其片段。因此，可以合成如本文所述的全部或部分核酸。
如本文所用，术语“核酸”和“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或混合的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸聚合物，并且除非另有限制，否则将涵盖天然核苷酸的能够以与天然存在的核苷酸类似的方式起作用的已知类似物。多核苷酸序列包括转录成RNA的DNA链序列和与转录的DNA链互补的链序列。多核苷酸序列还包括全长序列以及衍生自全长序列的较短序列。多核苷酸序列包括作为单独链或在双链体中的有义链和反义链。
试剂盒
本披露进一步提供了一种试剂盒，其包含一个或多个一次性容器，该容器包含如本文所述的NOMV疫苗。在一些实施例中，本披露的试剂盒可以提供包含NOMV疫苗的组合物，用于治疗或预防如本文所述的淋球菌和/或脑膜炎球菌感染。在其他实施例中，如本文所述的试剂盒可以提供如本文所述的细菌菌株，例如，在培养物中或作为与例如甘油组合的冻存物。在一些实施例中，试剂盒可以提供用于向受试者或患者施用的药物组合物，该药物组合物包含NOMV疫苗或淋球菌蛋白(如GNA1220、MetQ、MetQSM和/或NHBA)的纯化制剂，作为如本文所述的多肽(例如，与佐剂混合)。在其他实施例中，可以酌情提供用于施用如本文所述的NOMV疫苗、纯化的淋球菌蛋白、RNA、载体和/或药物组合物的无菌试剂和/或供应品。试剂盒可以进一步包含用于细胞转化和/或转染、细菌或病毒培养等的试剂。
本披露的试剂盒中提供的组分可以包括例如可用于进行如本文所述方法的任何起始材料。这样的试剂盒可以包含一种或多种此类试剂或组分，用于多种测定，包括例如核酸测定，例如PCR或RT-PCR测定、萤光素酶(Luc)测定、细胞转化/转染、病毒/细胞培养、血液测定，即全血细胞计数(CBC)、病毒滴度/病毒载量测定、抗体测定、病毒抗原检测测定、DNA或RNA检测测定、细菌滴度测定、病毒中和测定、遗传互补测定或根据本披露有用的任何测定。组分可以视情况以冻干、脱水或干燥的形式提供，或者可以在水溶液或适合于根据本披露使用的其他液体介质中提供。
可用于本披露的试剂盒还可以包括另外的试剂，例如缓冲液、底物、抗体、配体、检测试剂、培养基组分，例如盐(包括MgCl2)、聚合酶、脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、表达载体等，用于DNA分离、DNA/RNA转染等的试剂，如本文所述。此类试剂或组分在本领域是熟知的。在一些实施例中，本文所述的一种或多种佐剂可以包含在本披露的试剂盒中。在适当的情况下，这样的试剂盒中包含的试剂可以作为引物对或多个引物对提供在相同的容器或培养基中。在一些实施例中，此类试剂可以放置在第二或另外的不同容器(在其中可以放置另外的组合物或试剂)中，并适当地等分。可替代地，能够以单个容器手段提供试剂。本披露的试剂盒还可以包括包装组分、使用说明，包括适当时对各个组分的储存要求。如本文所述的这样的试剂盒可以配制用于临床环境，例如医院、治疗中心或临床环境，或者可以适当地配制用于个人使用。
定义
在提供值的范围的情况下，应理解在该范围的上限与下限之间的每个居中值(到下限的十分之一单位，除非上下文中另外明确指明)以及在所陈述范围内的任何其他所陈述的值或居中值均被涵盖在本披露之内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在本披露内，遵守所述范围内任何明确排除性限制。在所陈述的范围包括一个或两个限值时，排除了那些被包括的限值的任一个或两个的范围也被包括在本披露之内。
除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语均具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然现在描述优选方法和材料，但类似或等效于本文所述的任何方法和材料也可以用于本披露的实践或测试。将所有本文提及的出版物通过引用并入本文以披露和描述与引用出版物相关的方法和/或材料。仅提供本文所讨论的出版物在本申请的提交日期之前的披露内容。本文中的任何内容均不应被解释为承认本披露无权凭借先前的披露提前公开这种出版物。此外，所提供的公开日期可能与实际公开日期不同，实际公开日期可能需要独立地确认。
除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的意义。以下定义了对本披露的描述具有特定意义的特定术语。
如在本说明书和所附权利要求中所使用的，在描述特定实施例的背景下(特别是在某些以下权利要求的背景下)使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”以及类似提及可以被解释为涵盖单数和复数两者，除非另有特别说明。因此，例如，“活性剂”不仅是指单个的活性剂，而且两个或更多个不同的活性剂的组合，“剂型”是指剂型的组合，以及单个剂型等。在一些实施例中，如本文(包括权利要求书)所用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指代替代物或替代物是相互排斥的。
在一些实施例中，用于描述和要求保护本披露的某些实施例的表示成分的量、性质如分子量、反应条件等的数字应理解为在一些情况下通过术语“约”修饰。在一些实施例中，术语“约”用于指示值包括用于确定该值的装置或方法的均值的标准差。在一些实施例中，书面描述和所附权利要求书中阐述的数值参数是近似值，其可以根据特定实施例寻求获得的所需性质而变化。在一些实施例中，数值参数应该根据报告的有效数字的数目并通过应用普通的舍入技术来解释。尽管阐述本披露的一些实施例的宽范围的数值范围和参数是近似值，但是具体实施例中阐述的数值尽可能精确地报告。在本披露的一些实施例中呈现的数值可能含有必然由在它们相应的测试测量中发现的标准差导致的某些误差。本文对值范围的描述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另有指示，否则每个单独值被并入说明书中，如同其在本文中单独描述一样。在一些实施例中，“约”是指特定值+/-10％、或9％、或8％、或7％、或6％、或5％、或4％、或3％、或2％、或1％。
术语“包含”、“具有”和“包括”是开放式连接动词。一个或多个这些动词的任何形式或时态(如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(includes)”和“包括(including)”)也是开放式的。例如，“包括(comprises)”、“具有”或“包括(includes)”一个或多个步骤的任何方法不限于仅具有那些一个或多个步骤，并且还可以覆盖其他未列出的步骤。类似地，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个特征的任何组合物或装置不限于仅具有那些一个或多个特征，并且可以覆盖其他未列出的特征。
如本文所用，“不良事件”是指与人使用如本文所述的药物或疫苗相关的任何不良医学事件，无论是否与药物有关。如果AE或疑似不良反应导致以下任何结果，则可以认为它是“严重不良事件”：死亡、或直接死亡风险、住院治疗或现有住院时间延长、持续或显著进行正常生活功能的能力的丧失或严重破坏、先天性异常/出生缺陷。不良事件也可能是重要的医疗事件，它可能不会导致死亡，危及生命，或需要住院治疗，但可能危害患者或受试者，并且可能需要医疗或外科手术干预以防止以上结果之一。在一些实施例中，不良事件是指施用如本文所述的药物或疫苗而引起的输注反应。
如本文所用，“过敏性反应”是指可能在几分钟到几小时内发生的严重急性发作的过敏反应。过敏性反应可以累及皮肤、粘膜组织、或两者，并且可以具有包括但不限于以下的一个或多个症状：泛发性荨麻疹，瘙痒(发痒)，潮红，嘴唇、舌头、咽喉或小舌的肿胀，呼吸急促，呕吐，头晕目眩，喘息、血流动力学不稳定性，和皮疹或荨麻疹。另外，过敏性反应可以伴随以下中的至少一个：呼吸受损(例如，呼吸困难、喘息-支气管痉挛、喘鸣、峰值流速降低、低氧血症)，以及血压降低(即，收缩压<90mm Hg或从该个人的基线降低大于30％)或终器衰竭(例如，张力减退[虛脫]、晕厥、失禁)。根据本披露的过敏性反应由国家过敏和传染病研究所/食物过敏和过敏性反应网络(NIAID/FAAN)诊断过敏性反应的临床标准定义。
如本文所用，术语“抗原”或“免疫原”可互换使用，指能够在受试者中诱导免疫应答的物质，通常是蛋白质。该术语还指具有免疫活性的蛋白质，即一旦施用给受试者(直接或通过向受试者施用编码该蛋白质的核苷酸序列或载体)能够引起针对该蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫应答。
如本文所用，“共同施用”是指一种或多种药物与另一种药物的同时施用。在其他实施例中，两种药物在相同的时间施用。如本文其他地方所述，共同施用也可以指一种或两种药物的任何特定时间段的施用。例如，如本文所述，一种药物可以在施用另一种药物前数小时、数天或数周施用，而且仍被认为是共同施用。在一些实施例中，共同施用可以是指任一种药物的任何时间的施用，使两种药物同时存在于患者体内。在一些实施例中，任一种药物可以在另一种药物之前或之后施用，只要它们两者都存在于患者体内足够的时间使得患者接受预期的临床或药理学益处。
如本文所用，术语“有效量”和“治疗有效量”是指药剂、疫苗、化合物、药物、组合物或组合的如下量，该量无毒且在向受试者或患者(例如，人受试者或患者)施用后有效产生某种所期望的治疗效果，如减少或消除病症或疾病的迹象或症状。例如，如本文所述，有效量可以是治疗或预防淋球菌感染，或可测量地改变淋球菌感染的外在症状所必需的量。通常，该量将足以显著抑制细菌复制或传染性，或减轻感染症状。在一些实例中，“有效量”是治疗(包括预防)任何障碍或疾病的一种或多种症状和/或潜在原因的量。在一个实例中，有效量是治疗有效量。在一个实例中，有效量是防止特定疾病或病症的一种或多种体征或症状发展的量。
如本文所用，“表位”是指抗原决定簇。表位是分子上的特定化学基团或肽序列，其具有抗原性，因此它们引发特定的免疫应答，例如，表位是B和/或T细胞对其作出应答的抗原区域。可以由连续氨基酸或由于蛋白质的三级折叠并列的非连续氨基酸两者形成表位。
如本文所用，“表达构建体”是指包含编码的外源核酸蛋白的核酸构建体，该外源核酸蛋白可以被转录和翻译以在其被施用的接受体中发挥功能。在一些实施例中，这样的表达构建体可以包含DNA序列、RNA序列或其组合。在一些实施例中，可以将这样的构建体遗传工程化到适合于在受试者或患者(如特定的细菌菌株或人患者)中施用的质粒或载体中。例如，如本文所述，本披露的构建体可以包含编码淋球菌蛋白的核酸序列。
如本文所用，“外源序列”是指源自宿主细胞外部的核酸序列。外源序列可以是DNA序列、RNA序列、或其组合。如本领域技术人员将理解的，可以根据本披露使用本领域可获得的任何类型的核酸。这样的核酸序列可以从与其被递送到的细胞不同的物种或相同的物种中获得。在一些实施例中，根据本披露的外源核酸序列可以编码如本文所述的淋球菌蛋白，其适于施用于受试者或患者。这样的重组多肽可以施用于受试者或患者以便治疗或预防淋球菌和/或脑膜炎球菌感染。
如本文所用，“基因递送”是指将外源多核苷酸引入细胞中用于基因转移，并且可以包括靶向、结合、摄取、转运、定位、复制子整合和表达。
如本文所用，“基因转移”是指将外源多核苷酸引入细胞，其可涵盖靶向、结合、摄取、转运、定位和复制子整合，但不同于且不暗示基因的后续表达。
如本文所用，“基因表达”或“表达”是指基因转录、翻译和翻译后修饰的过程。
如本文所用，“天然外膜囊泡”或“NOMV”是指脑膜炎奈瑟球菌的外膜，主要由脂寡糖(LOS)、外膜蛋白(OMP)和磷脂组成，并且通常非常松散地附着于细胞壁。在细菌的稳定生长期间，外膜的囊泡或气泡被释放到周围介质中。这些天然外膜囊泡(NOMV)由完整的外膜组成，包括所有相关蛋白和LOS，但缺乏周质和细胞质组分。如本文所用，NOMV是指未用清洁剂处理的OMV，即“天然的”。
如本文所用，“淋病奈瑟球菌”或“Ng”是指如本文所述使用的淋球菌菌株，其是淋球菌感染的原因。
如本文所用，“脑膜炎奈瑟球菌”或“Nm”是指如本文所述使用以表达如本文所述淋球菌蛋白的脑膜炎球菌菌株。Nm是脑膜炎球菌感染的原因。
通过“药学上可接受的”意指不是生物学上或其他方面不期望的材料，即该材料可以掺入到施用于患者的药物组合物中而不引起任何不期望的生物效应，或不以有害的方式与含有该材料的组合物的任何其他组分相互作用。当术语“药学上可接受的”用于指药物载剂或赋形剂时，暗示该载剂或赋形剂符合毒理学和制造测试的所需标准，或者该载剂或赋形剂包括在由美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug administration)制定的Inactive Ingredient Guide[非活性成分指南]中。如在“药理学活性”(或简称“活性”)衍生物或类似物中的“药理学活性”(或“活性”)是指具有与母体化合物相同类型的药理学活性且在程度上近似相等的衍生物或类似物。术语“药学上可接受的盐”包括酸加成盐，这些酸加成盐是与无机酸(例如，盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的。与游离羧基基团形成的盐也可以衍生自无机碱(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和有机碱(例如，异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)。
如本文所用，“降低”是指减少或减轻，如降低淋球菌感染的症状。在一些实施例中，与未施用这种疫苗的患者相比，施用如本文所述的疫苗(例如NOMV疫苗)可以导致患者症状的“降低”或减轻。“降低”也可以是指如本文所述的治疗单独或与另一种药物共同施用引起的疾病症状的降低。
如本文所用，“受试者”或“个体”或“患者”是指期望对其进行针对淋球菌和/或脑膜炎球菌感染的疗法或治疗的任何患者，并且通常是指疗法的接受者。“受试者”或“患者”是指分类为哺乳动物的任何动物，例如人和非人哺乳动物。非人动物的实例包括狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔等。除非另有说明，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。在一些实施例中，适合本披露的治疗性应用的受试者可以是灵长类动物，例如人和非人灵长类动物。
如本文所用，将多核苷酸或载体施用给宿主细胞或受试者是指经由任何常规实施的方法引入细胞或受试者。这包括本领域熟知的“转导”、“转染”、“转化”或“进行转导”。这些术语都是指将外源多核苷酸(例如，淋球菌蛋白)引入宿主细胞(例如，脑膜炎奈瑟球菌)导致多核苷酸(例如，转基因)在细胞中表达的标准过程，并且包括使用质粒和/或重组病毒将外源多核苷酸引入宿主细胞。细胞中多核苷酸的转导、转染或转化可以通过本领域熟知的方法来确定，包括但不限于蛋白质表达(包括稳态水平)，例如通过ELISA、流式细胞术和蛋白质印迹，通过测定法测量DNA和RNA，例如RNA印迹、DNA印迹、报道功能(Luc)测定法和/或凝胶迁移率测定法。用于引入外源多核苷酸的方法包括熟知的技术，如细菌和/或病毒感染或转染、脂转染、转化和电穿孔，以及其他非病毒基因递送技术。引入的多核苷酸可以稳定地或瞬时地维持在宿主细胞中。
在本披露中使用的“转录调节序列”或“TRS”通常包括至少一种转录启动子并且还可以包括一种或多种转录增强子和/或终止子。“可操作地连接”是指两个或更多个组分的布置，其中如此描述的组分处于允许它们以协调的方式起作用的关系。举例来说，如果TRS或启动子促进编码序列的转录，则转录调节序列或启动子与编码序列可操作地连接。可操作地连接的TRS通常与编码序列以顺式连接，但不一定直接与其相邻。
如本文所用的术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”或“减轻”或“降低”是指降低或减轻症状的严重性和/或频率、消除症状和/或潜在病因，以及改善或补救例如淋球菌和/或脑膜炎球菌感染的损害。短语“向患者施用”是指经由本领域公认的引入手段将组合物、疫苗或剂型引入患者中的过程。“治疗”或“减轻”还包括向受试者施用化合物或药剂以预防或延迟疾病(例如，淋球菌和/或脑膜炎球菌感染)的症状、并发症或生化指标的发作，减轻症状或阻止或抑制疾病、病症或障碍的进一步发展。需要治疗的受试者包括那些已经患有疾病或障碍的受试者以及处于患上疾病或障碍的风险中的受试者。治疗可以是预防性的(以防止或延迟疾病的发作，或防止其临床或亚临床症状的表现)或在疾病表现后治疗性抑制或减轻症状。
“载体”是可以引入细胞的有或没有载剂的核酸。能够指导编码一种或多种多肽的基因表达的载体被称为“表达载体”。适用于本披露的载体的实例包括例如病毒载体、质粒载体、脂质体和其他基因递送媒剂。
在本文描述的所有方法能够以任何合适顺序进行，除非本文另外说明或另外与上下文明显矛盾。相对于本文的某些实施例提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明本披露并且不对本披露的范围构成限制，除非另有声明。本说明书中的任何语言都不应该被解释为指示任何未要求保护的要素为实践本披露所必需。
本文披露的本披露的替代要素或实施例的分组不应该被解释为限制。每个组成员可以单独地提及和要求保护，或者与该组的其他成员或本文中找到的其他元素以任何组合提及和要求保护。出于方便或可专利性的原因，组的一个或多个成员可以包括在组中或从其中删除。
已经详细描述了本披露，清楚的是在不背离所附权利要求书限定的本披露的范围的情况下，修改、变化和等效实施例是可能的。此外，应该了解，本披露中的所有实例都作为非限制性实例提供。
实例
在以下实例中提供了本披露内容的实施例的实例。以下实例仅以说明的方式呈现，并且帮助本领域普通技术人员使用本披露。这些实例并不旨在以任何方式另外限制本披露内容的范围。
实例1–通过插入编码淋病奈瑟球菌(Ng)抗原的基因来敲除fhbp、siaD-galE和lpxL1基因。
脑膜炎奈瑟球菌的转化。
通过用质粒pBS-FHbpKO-[GNA1220、MetQ或MetQSM]-ERM(使用红霉素选择(10μg/ml))、pGEM-SiaD/GalEKO-[GNA1220、MetQ或MetQSM]-SPC(使用壮观霉素选择(50μg/ml))、pUC18-lpxL1KO-[GNA1220、MetQ或MetQSM]-KAN(使用卡那霉素选择(50μg/ml))和pFP12-[GNA1220、MetQ或MetQSM]-CAT转化，通过同源重组制备了其中fhbp、siaD-galE和lpxL1基因被灭活(H44/76ΔFHbpΔ荚膜ΔlpxL1)并插入了GNA1220、MetQ和/或MetQSM拷贝的H44/76菌株。从野生型菌株开始的转化按以下顺序进行：
(1)敲除荚膜基因并添加第一个拷贝[GNA1220、MetQ或MetQSM](pGEM-SiaD/GalEKO-[GNA1220、MetQ或MetQSM]-SPC质粒)；
(2)敲除lpxL1基因并添加第二个拷贝[GNA1220、MetQ或MetQSM](pUC18-lpxL1KO-[GNA1220、MetQ或MetQSM]-KAN质粒)；
(3)敲除FHbp基因并添加第三个拷贝[GNA1220、MetQ或MetQSM](pBS-FHbpKO-[GNA1220、MetQ或MetQSM]-ERM质粒)；
(4)过表达[GNA1220、MetQ、MetQSM或NHBA](pFP12-[GNA1220、MetQ、MetQSM或NHBA]-CAT质粒)。
值得注意的是，NHBA在来自pFP12的亲本菌株中表达，该亲本菌株已经敲除了siaD-galE、LpxLa和FHbp，但没有被NHBA的拷贝替代。
H44/76菌株的十至15个菌落选自已经过夜生长的TSB(胰蛋白酶大豆培养液，非动物来源)琼脂板。将细菌的菌落与3μg的质粒混合，接种至TSB琼脂板，并且在37℃下孵育6小时。将连续稀释的细菌在含有抗生素的TSB琼脂板上再培养用于选择。将培养板在37℃下孵育过夜，并且通过使用特异性抗体的流式细胞术测定和使用热灭活细胞的PCR针对GNA1220、MetQ、MetQSM或NHBA表达以及FHbp、荚膜和lpxL1的表达缺乏筛选菌落。将阳性个体菌落在10％脱脂乳(wt/vol)和15％甘油中冷冻，并且在-80℃下储存。
引物：
进入pUC18 Lpxl1和pBS FHbp质粒的引物如下：
MetQ WT和N238A突变体：
MetQ_奈瑟球菌正向引物：5'atacaattgCCTCAGCGCATGCATC3'(SEQ ID NO:9)
MetQ_SbfI反向引物：5'tatCCTGCAGGTTATACGACTGCCTTATTTG 3'(SEQ ID NO:10)
GNA1220：
MetQ_奈瑟球菌正向引物：5'atacaattgCCTCAGCGCATGCATC3'(SEQ ID NO:9)
GNA1220_SbfI反向引物：
5'tatCCTGCAGGTTATACGACTGCCTTATTTG 3'(SEQ ID NO:10)
进入pGEM SiaD/GalE质粒的引物：
MetQ WT、N238A突变体和GNA1220：
MetQ_奈瑟球菌正向引物：5'atacaattgCCTCAGCGCATGCATC3'(SEQ ID NO:9)
MetQ_奈瑟球菌反向引物：5'tattctagaTTATACGACTGCCTTATTTGGC 3'(SEQ ID NO:11)
进入pFP12质粒的引物：
MetQ WT和N238A突变体：
MetQ_奈瑟球菌正向引物：5'atacaattgCCTCAGCGCATGCATC3'(SEQ ID NO:9)
MetQ_SpeI反向引物：5'tatACTAGTTTATACGACTGCCTTATTTGGCTG 3'(SEQ ID NO:12)
GNA1220：
MetQ_奈瑟球菌正向引物：5'atacaattgCCTCAGCGCATGCATC3'(SEQ ID NO:9)
GNA1220_StuI反向引物：5'tatAGGCCTTATACGACTGCCTTATTTGGC 3'(SEQ ID NO:13)
metQ pBS下游正向引物：5'CCCTGTTCCAAGAGCCGAGC 3'(SEQ ID NO:15)
RBD pBS下游反向引物：5'AGCTTCTTCCAGCGCGAACG 3'(SEQ ID NO:16)，产生800-bp片段。
FHbp上游正向引物(对RBD也使用这些引物组)：5'GGCGAAATCGGCGTATTGGG 3'(SEQID NO:17)
FHbp上游反向引物：5'CTACATTACGCATTTGGAATACC 3'(SEQ ID NO:18)，产生800-bp片段。
构建含有具有Nm脂蛋白信号序列的GNA1220、MetQ、MetQSM或NHBA的pFP12穿梭载 体，或构建具有大肠杆菌复制起点的载体。
Nm菌株H44/76突变体的特征，该菌株含有编码GNA1220、MetQ、MetQSM或NHBA的3个染色体拷贝和编码GNA1220、MetQ、MetQSM或NHBA的多拷贝质粒，每一个都具有Nm脂蛋白信号序列。
PCR
设计PCR引物以扩增插入脑膜炎奈瑟球菌菌株H44/76中的构建体上游和下游，这些构建体携带fhbp、siaD-galE或lpxL1基因、GNA1220、MetQ或MetQSM基因的侧翼区以及抗生素抗性盒。在加热灭活细胞上进行PCR。将来自野生型H44/76的热灭活细胞用作阴性对照。
流式细胞术
如先前所述(Giuntini等人,Clin Vaccine Immunol[临床及疫苗免疫学]23:698-706,2016)，通过流式细胞术测量针对GNA1220、MetQ、MetQSM或NHBA的纯化单克隆和多克隆抗体与活的脑膜炎奈瑟球菌或淋病奈瑟球菌细菌表面的结合。将H44/76(被工程化以表达靶抗原)用作测试菌株。简而言之，使细菌在含有20mM而不是4mM乳酸盐的Frantz+乳酸盐或化学成分确定的培养基(CDM)(Müller等人2015,Infect Immun[感染与免疫]83:1257-1264)中生长，直到OD620nm为0.6-0.7。为了测量抗MetQ或抗NHBA抗体结合，将固定浓度的抗MetQ或抗NHBA抗体或作为阴性对照的10μg/mL的不相关抗体与107个细菌/mL一起孵育。使用AlexaFluor 488缀合的山羊抗小鼠或兔IgG二抗(杰克逊免疫研究实验室(JacksonImmuno Research Laboratories))检测结合的抗体(图1)。图1描绘了通过流式细胞术抗MetQ多克隆抗体与缺乏PorA的H44/76的实验室传代菌株的增强结合，该菌株中siaD-galE、lpxL1和fhbp基因座已经被分别编码MetQ和MetQSM的基因的拷贝破坏，并且此外，携带具有每个相应基因的多拷贝质粒(图2-4中描绘的示例质粒图谱)。此外，图1中示出了抗NHBA多克隆抗体与相同亲本菌株的增强结合，该菌株中siaD-galE、lpxL1和fhbp基因座已被破坏，但与该菌株天然表达的野生型脑膜炎球菌NHBA的表达相比，重组NHBA基因仅由多拷贝pFP12-NHBA质粒提供。
含有GNA1220、MetQ、MetQSM或NHBA的NOMV疫苗的制备和表征。
NOMV制备
由脑膜炎奈瑟球菌物种的培养菌株制备外膜囊泡(OMV)，该菌株经遗传修饰以表达GNA1220、MetQ、MetQSM或NHBA全长蛋白质和衍生物。可以从生长在肉汤或固体培养基中的脑膜炎奈瑟球菌获得OMV，优选地通过从培养基中分离细菌细胞(例如，通过过滤或通过使细胞沉淀的低速离心等)、裂解细胞(例如，通过添加清洁剂、渗透休克、超声处理、空化、均质化等)以及从细胞质分子中分离外膜部分(例如，通过过滤；或通过外膜和/或外膜囊泡的差异沉淀或聚集，或通过使用特异性识别外膜分子的配体的亲和分离方法；或通过使外膜和/或外膜囊泡沉淀的高速离心等)；外膜部分可以用于产生OMV。
从生长在含有20mM而不是4mM乳酸盐的Frantz+乳酸盐或化学成分确定的培养基(CDM)(Müller等人2015,Infect Immun[感染与免疫]83:1257-1264)中的脑膜炎奈瑟球菌获得OMV，用来自TSB(胰酶大豆肉汤，非动物来源)琼脂板上过夜菌落的OD620nm为0.15-0.2的细菌接种。将培养物在37℃下于5％ CO2中孵育，并且使培养基的体积顺序增加，从在OD620nm＝约0.15时将单个菌落接种到24mL培养基中开始，至通过在OD620nm达到0.6-0.7时，将培养物转移到下一个更大体积的1L(即，24mL至90mL至300mL至1L)。当到达最终体积时，将培养物在带有通风口的摇瓶中再生长15小时。然后将细菌离心(10,000x g，20分钟)，通过玻璃纤维过滤器将上清液过滤以去除碎片，然后无菌过滤(0.22μm过滤器)，并且通过超滤(100k或30k截止过滤器，Amicon)浓缩且添加苯佐纳酶(benzonase)(1000U/L)。在环境温度下继续苯佐纳酶处理至少1小时。将浓缩的滤液离心(202,601x g，1.5小时，4℃)以收集NOMV。将NOMV在10mM Tris·HCl，pH 7.4，3％(w/v)蔗糖中悬浮，如先前步骤所述的再一次离心，并且最终在Tris/蔗糖溶液中悬浮至浓度为1至3mg/ml之间的蛋白质，如通过DC蛋白质测定(美国伯乐公司(Bio-Rad))所确定。将NOMV配制品在-70℃下冷冻储存直到使用。
ELISA测定
为了确定MetQ或MetQSM在NOMV疫苗(NOMV指定的蛋白质)中的表达，用滴定纯化的NOMV-MetQ或NOMV-MetQSM将96孔板(Nunc)在4℃下包被过夜。用PBS中的1％ BSA+0.05％吐温20封闭板。将固定浓度(1μg/ml)的MetQ多克隆抗体在PBS+0.1％吐温20中稀释并且添加至板中2小时。用碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠IgG(杰克逊免疫研究实验室)(1:2,000)或山羊抗兔IgG(杰克逊免疫研究实验室)(1:2,000)将板染色1小时，并且使用对硝基苯基磷酸酯(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))显影。MetQ和MetQSM的结果描绘于图5中。
实例2–免疫接种
将NOMV-GNA1220、NOMV-MetQ、NOMV-MetQSM或NOMV-NHBA制剂或重组蛋白稀释在10mM Tris·HCl，pH 7.4，3％(w/v)蔗糖中，并用等体积的氢氧化铝佐剂(2％铝胶，Invivogen公司)吸附。在免疫前的晚上制备疫苗，并在4℃下孵育过夜。对4-6周龄雌性CD1小鼠(查尔斯河育种实验室(Charles River Breeding Laboratories))的组(每组N＝10)进行腹膜内(IP)免疫。每只小鼠接受含有与600μg佐剂预混合的10-2.5μg NOMV总蛋白或10ug重组GNA1220、MetQ、MetQSM或NHBA的剂量。总共进行了三次注射，每次间隔3周。在第三次剂量后两周，通过心脏穿刺将小鼠放血并处死。分离血清并在-80℃下冷冻储存。
实例3-用NOMV-GNA1220或NOMV-MetQ进行鼻内免疫
为了确定是否可以通过鼻内疫苗接种产生保护性粘膜抗体应答，将对CD1小鼠鼻内接种50μg NOMV-GNA1220、NOMV-MetQ或NOMV-MetQSM疫苗。对于在异氟烷麻醉下的小鼠，将10μl疫苗制剂应用于每个鼻孔，使其吸入。小鼠将被免疫2至3次，间隔3至4周。5μg疫苗的一次腹膜内注射还将与1至2次鼻内治疗组合。
实例4–在CD1小鼠中对含有该蛋白的NOMV疫苗的抗体应答的特征
对于在用重组MetQ(rMetQ)、NOMV-MetQ、NOMV-MetQSM疫苗免疫的小鼠中产生的多克隆抗体的结合活性，用2μg/ml rMetQ蛋白将96孔板(Nunc)在4℃下包被过夜。用PBS中的1％ BSA+0.05％吐温20 封闭板。将来自免疫小鼠的血清在PBS+0.1％吐温20中稀释并且添加至板中2小时。用碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠IgG(杰克逊免疫研究实验室)(1:3,000)二抗将板染色1小时，并且使用对硝基苯基磷酸酯(赛默飞世尔科技公司)显影。在Emax精密度读板器(分子仪器公司(Molecular Devices))上测量在OD为405nm处的吸光度。
图6显示，除了给予10μg剂量的NOMV-MetQ的小鼠之外，用2.5-10μg NOMV疫苗免疫的小鼠的IgG滴度相似，其中当与所有其他组相比时，平均滴度明显较低。用rMetQ免疫的小鼠的平均IgG滴度显著高于所有其他组(p<0.01)。
使用流式细胞术来比较来自用rMetQ、rNHBA、NOMV-MetQ、NOMV-MetQSM、NOMV-GNA1220和NOMV-NHBA免疫的小鼠的多克隆抗体与活细菌的结合。如上所述进行对淋球菌菌株FA1090和MS11以及脑膜炎球菌血清组B菌株MD1224的结合测定。图7显示所有疫苗都引发了与两种测试的淋球菌菌株结合的抗体。图10显示仅通过用NOMV-MetQ、NOMV-MetQSM和NOMV-GNA1220免疫产生的抗体在1:200稀释的抗血清中与Nm菌株MD1224结合。
来自用rMetQ、rNHBA、NOMV-MetQ、NOMV-MetQSM、NOMV-GNA1220和NOMV-NHBA免疫的小鼠的多克隆抗体针对Ng菌株FA1090和MS11的血清杀菌活性(SBA)。将细菌在补充有IsoVitaleXTM(费歇尔科学公司(Fischer Scientific))的巧克力琼脂或等效板上于37℃下用5％CO2生长过夜，并且于第二天传代至预热的巧克力琼脂IsoVitaleXTM或等效板。将板在37℃下用5％ CO2孵育5小时。将细菌悬浮在含有0.15mM CaCl2和1mM MgCl2(HBSS++)以及0.1％ BSA的Hanks平衡盐溶液(HBSS)中至OD620nm为0.6。在杀菌性96孔板上，在含有0.1％BSA的HBSS++中实现了1:12500的最终稀释度(以获得约5x 104cfu/ml)。在使用山羊抗小鼠IgM(μ链特异性)-琼脂糖抗体(密理博公司(Millipore))进行测定之前，从免疫小鼠的血清中耗尽IgM，并在HBSS++中连续稀释。将百分之二十(体积/体积)的IgG和IgM耗尽的人血清用作补体来源，并添加到96孔板的每个孔中。将板在37℃下用5％ CO2孵育30min，并进行连续稀释以确定菌落形成单位(cfu)。尽管用重组蛋白免疫产生了与两种淋球菌菌株具有相似结合的相同或更高的抗体滴度，但NOMV-MetQ和NOMV-NHBA对淋球菌菌株FA1090和MS11具有比相应重组蛋白引发的抗体更高的SBA活性，如图8所描绘。
用淋球菌菌株FA1090和MS11测试来自用rMetQ、rNHBA、NOMV-MetQ、NOMV-MetQSM、NOMV-GNA1220和NOMV-NHBA免疫的小鼠的多克隆抗体对定植的影响。将ME180细胞(ATCCHTB33)(一种来源于人宫颈癌的上皮细胞样细胞系)维持在补充有10％(体积/体积)胎牛血清和青霉素(100U/ml)-链霉素(1mg/ml)的麦考伊5A培养基中。对于粘附测定，将细胞以2.5x105个细胞/孔接种到96孔板中，并在37℃下在5％ CO2中孵育24小时。用100μl细菌(107个细菌/ml)覆盖非汇合单层(70％-80％汇合)，在37℃下在5％ CO2中孵育1h，并在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中洗涤三次，每次5min。在37℃下添加蕲蛇酶(100μl/孔)15min，并进行连续稀释以确定菌落形成单位(cfu)。淋球菌定植于不同的生物环境中，这些环境对细菌造成不同的营养压力。可变的营养环境导致细菌表面上不同蛋白质的表达。测试多克隆抗体在两种不同条件下对FA1090和MS11定植的影响。如图10所描绘，当细菌在巧克力琼脂板上生长时，抗NOMV-GNA1220和抗NOMV-NHBA最强烈地抑制了定植，而抗NOMV-MetQSM和抗NOMV-NHBA对在含有10％(体积/体积)IgG/IgM耗尽的人血清的CDM中的液体培养物中生长的细菌具有最大作用。
如Beernink等人J Infect Disease[传染病杂志]219:1131,2019中所述，测定来自用2个剂量的2.5μg、5μg或10μg NOMV-MetQ、NOMV-MetQSM、NOMV-GNA1220、单独佐剂或10μg重组MetQ(rMetQ)免疫的小鼠的多克隆抗体的血清杀菌活性(SBA)。如图11所描绘，具有NOMV-MetQ但特别是NOMV-MetQSM的小鼠在用人补体介导SBA方面是有效的，这与人的保护作用相关。
总的来说，所描绘的数据提供了以下证据：通过用脑膜炎球菌NOMV中保守的淋球菌抗原免疫产生的抗体比通过用相应的重组蛋白免疫产生的抗体具有更强的对淋球菌和脑膜炎球菌菌株、SBA的结合和定植功能活性的抑制。
实例5–用于评价疫苗引发的抗体对Nm和ng感染早期的保护作用的条件性重编程人上皮细胞培养(CRC)模型。
通过重编程产生具有组织特征的人原代上皮细胞培养物的能力是相对新的，并且使用它们来评价疫苗引发的抗体对Nm定植、发病机理和针对两者的保护作用的效果是新的。特别感兴趣的是在感染的最早阶段通过疫苗引发的抗体进行保护，因为这在历史上较少被研究，但对于在大群体中控制疾病是至关重要的。永生化的人细胞系(例如，16HBE14o-和ME180)是可获得的，但不能复制CRC细胞的各种细胞类型和特征。人组织外植体也很重要，但几乎不可获得，这使得很难进行所需数量的实验来比较由相对大量的拟测试疫苗引发的抗体的效果。建立了脑膜炎球菌定植的原代鼻上皮(pNE)模型，并且将使用类似的方法(Suprynowicz等人,Proc Natl Acad Sci U S A[美国国家科学院学报]2012；109(49):20035-40)来建立Ng定植的原代宫颈模型。总之，原代人细胞培养模型为评价疫苗引发的抗体影响Nm和Ng定植和侵袭过程的潜力提供了重要和创新的方法。将ME180人宫颈细胞用于本文所述的粘附研究，并且还将研究与CRC细胞的粘附。
实例6–用于评价疫苗引发的抗体对Nm和Ng感染早期的保护作用的人CEACAM1/FH转基因(Tg)小鼠模型。
用表达促进定植(CEACAM1)和免疫保护(FH)的人基因的功能性互补系统产生了独特的人转基因(Tg)小鼠模型，其通过鼻内感染被Nm定植，并随着细菌从鼻咽迁移到包围大脑的脑膜而快速发展成脑膜炎样症状。另外，对Tg小鼠模型进行了技术改进，区分了从鼻咽分离的粘附和非粘附细菌。人CEACAM1/FH Tg小鼠也可用于在雌二醇处理的雌性小鼠模型中测量疫苗引发的抗体对Ng定植的保护作用(Jerse等人,Front Microbiol[微生物学前沿]2011；2:107)，因为CEACAM1在这些小鼠中在排列于子宫表面和子宫颈内膜的柱状上皮细胞中表达，其中Opa与CEACAM1的结合增强了Ng缔合并渗透到这些组织中(Islam等人,Infect Immun[感染与免疫]2018；86(8))。另外，NspA、PorB2和LOS衍生物与人FH的结合提供了免疫屏蔽，并且可能为上皮细胞粘附提供另外的机制。
实例7-增加NOMV中DNA量的电穿孔
评价了增加NOMV中质粒量的电穿孔。为了提高电穿孔效率，测试了不同比率的NOMV:质粒DNA、不同的电穿孔电压和脉冲数。作为电穿孔的结果，与没有电穿孔的细胞中存在的dsDNA含量相比，NOMV中的dsDNA含量增加了高达5倍。
将NOMV和质粒DNA在300mM蔗糖缓冲液中以2:1比率或1:1比率电穿孔。详情参见下表1和表2。在电穿孔后，将样品与苯佐纳酶一起孵育过夜，以消除任何残留/外部DNA。在苯佐纳酶处理后，用1％SDS溶液裂解NOMV，并使用QubitTM1X dsDNA HS测定试剂盒测量dsDNA。
表1.电穿孔的参数。
2:1比率的NOMV:pFP12 NOMV的dsDNA ng/ug 倍数增加
没有电穿孔 0.94
800V 2X脉冲 1.9 2
900V 2X脉冲 2.9 3
1000V 2X脉冲 3.12 3.3
表2. 900V 2X脉冲电穿孔的参数。
2X脉冲 NOMV的dsDNA ng/ug 倍数增加
没有电穿孔 0.76
2:1比率NOMV:0FP12 2.28 3
1:1比率NOMV:pFP12 3.8 5
序列表
<110> Omvax公司（Omvax, Inc.）
<120> 用于抗淋病奈瑟球菌的疫苗接种的组合物和方法
<130> OMV0002-401-PC
<150> 63/104,819
<151> 2020-10-23
<160> 56
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 淋病奈瑟球菌MetQ蛋白
<400> 1
Met Lys Thr Phe Phe Lys Thr Leu Ser Ala Ala Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Ala Ala Cys Gly Gly Gln Lys Asp Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ala
20 25 30
Ala Ala Pro Ser Ala Asp Asn Gly Ala Ala Lys Lys Glu Ile Val Phe
35 40 45
Gly Thr Thr Val Gly Asp Phe Gly Asp Met Val Lys Glu Gln Ile Gln
50 55 60
Ala Glu Leu Glu Lys Lys Gly Tyr Thr Val Lys Leu Val Glu Phe Thr
65 70 75 80
Asp Tyr Val Arg Pro Asn Leu Ala Leu Ala Glu Gly Glu Leu Asp Ile
85 90 95
Asn Val Phe Gln His Lys Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Lys Lys Glu His
100 105 110
Asn Leu Asp Ile Thr Glu Ala Phe Gln Val Pro Thr Ala Pro Leu Gly
115 120 125
Leu Tyr Pro Gly Lys Leu Lys Ser Leu Glu Glu Val Lys Asp Gly Ser
130 135 140
Thr Val Ser Ala Pro Asn Asp Pro Ser Asn Phe Ala Arg Ala Leu Val
145 150 155 160
Met Leu Asn Glu Leu Gly Trp Ile Lys Leu Lys Asp Gly Ile Asn Pro
165 170 175
Leu Thr Ala Ser Lys Ala Asp Ile Ala Glu Asn Leu Lys Asn Ile Lys
180 185 190
Ile Val Glu Leu Glu Ala Ala Gln Leu Pro Arg Ser Arg Ala Asp Val
195 200 205
Asp Phe Ala Val Val Asn Gly Asn Tyr Ala Ile Ser Ser Gly Met Lys
210 215 220
Leu Thr Glu Ala Leu Phe Gln Glu Pro Ser Phe Ala Tyr Val Asn Trp
225 230 235 240
Ser Ala Val Lys Thr Ala Asp Lys Asp Ser Gln Trp Leu Lys Asp Val
245 250 255
Thr Glu Ala Tyr Asn Ser Asp Ala Phe Lys Ala Tyr Ala His Lys Arg
260 265 270
Phe Glu Gly Tyr Lys Tyr Pro Ala Ala Trp Asn Glu Gly Ala Ala Lys
275 280 285
<210> 2
<211> 880
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 淋病奈瑟球菌MetQ DNA序列
<400> 2
atgaaaacct tcttcaaaac cctttccgcc gccgcactcg cgctcatcct cgcagcctgc 60
ggcggtcaaa aagacagcgc gcccgcagcc tctgccgccg ccccttctgc cgataacggc 120
gcggcgaaaa aagaaatcgt cttcggcacg accgtcggcg acttcggcga tatggtcaaa 180
gaacaaatcc aagccgagct ggagaaaaaa ggctacaccg tcaaattggt cgaatttacc 240
gactatgtgc gcccgaatct ggcattggcg gagggcgagt tggacatcaa cgtcttccaa 300
cacaaaccct atcttgacga tttcaaaaaa gaacacaacc tggacatcac cgaagccttc 360
caagtgccga ccgcgccttt gggactgtat ccgggcaaac tgaaatcgct ggaagaagtc 420
aaagacggca gcaccgtatc cgcgcccaac gacccgtcca acttcgcacg cgccttggtg 480
atgctgaacg aactgggttg gatcaaactc aaagacggca tcaatccgct gaccgcatcc 540
aaagccgaca tcgcggaaaa cctgaaaaac atcaaaatcg tcgagcttga agccgcacaa 600
ctgccgcgca gccgcgccga cgtggatttt gccgtcgtca acggcaacta cgccataagc 660
agcggcatga agctgaccga agccctgttc caagagccga gctttgccta tgtcgcctgg 720
tctgccgtca aaaccgccga caaagacagc caatggctta aagacgtaac cgaggcctat 780
aactccgacg cgttcaaagc ctacgcgcac aaacgcttcg agggctacaa ataccctgcc 840
gcatggaatg aaggcgcagc caaataaggc agtcgtataa 880
<210> 3
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 淋病奈瑟球菌MetQSM蛋白
<400> 3
Met Lys Thr Phe Phe Lys Thr Leu Ser Ala Ala Ala Leu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Ala Ala Cys Gly Gly Gln Lys Asp Ser Ala Pro Ala Ala Ser Ala
20 25 30
Ala Ala Pro Ser Ala Asp Asn Gly Ala Ala Lys Lys Glu Ile Val Phe
35 40 45
Gly Thr Thr Val Gly Asp Phe Gly Asp Met Val Lys Glu Gln Ile Gln
50 55 60
Ala Glu Leu Glu Lys Lys Gly Tyr Thr Val Lys Leu Val Glu Phe Thr
65 70 75 80
Asp Tyr Val Arg Pro Asn Leu Ala Leu Ala Glu Gly Glu Leu Asp Ile
85 90 95
Asn Val Phe Gln His Lys Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Lys Lys Glu His
100 105 110
Asn Leu Asp Ile Thr Glu Ala Phe Gln Val Pro Thr Ala Pro Leu Gly
115 120 125
Leu Tyr Pro Gly Lys Leu Lys Ser Leu Glu Glu Val Lys Asp Gly Ser
130 135 140
Thr Val Ser Ala Pro Asn Asp Pro Ser Asn Phe Ala Arg Ala Leu Val
145 150 155 160
Met Leu Asn Glu Leu Gly Trp Ile Lys Leu Lys Asp Gly Ile Asn Pro
165 170 175
Leu Thr Ala Ser Lys Ala Asp Ile Ala Glu Asn Leu Lys Asn Ile Lys
180 185 190
Ile Val Glu Leu Glu Ala Ala Gln Leu Pro Arg Ser Arg Ala Asp Val
195 200 205
Asp Phe Ala Val Val Asn Gly Asn Tyr Ala Ile Ser Ser Gly Met Lys
210 215 220
Leu Thr Glu Ala Leu Phe Gln Glu Pro Ser Phe Ala Tyr Val Ala Trp
225 230 235 240
Ser Ala Val Lys Thr Ala Asp Lys Asp Ser Gln Trp Leu Lys Asp Val
245 250 255
Thr Glu Ala Tyr Asn Ser Asp Ala Phe Lys Ala Tyr Ala His Lys Arg
260 265 270
Phe Glu Gly Tyr Lys Tyr Pro Ala Ala Trp Asn Glu Gly Ala Ala Lys
275 280 285
<210> 4
<211> 1091
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 淋病奈瑟球菌MetQSM DNA序列
<400> 4
atgcatccgg gcagcagcgc atcggctcgc acgaggtctg cgcttgaatt gtgttgtaga 60
aacacaacgt ttttgaaaaa ataagctatt gttttatatc aaaatataat catttttaaa 120
ataaaggttg cggcatttat cagatatttg ttctgaaatg aagacgtatc gggtgtttgc 180
ccgatgtttt taggttttta tcaaatttac aaaaggaagc ccatatgaaa accttcttca 240
aaaccctttc cgccgccgca ctcgcgctca tcctcgcagc ctgcggcggt caaaaagaca 300
gcgcgcccgc agcctctgcc gccgcccctt ctgccgataa cggcgcggcg aaaaaagaaa 360
tcgtcttcgg cacgaccgtc ggcgacttcg gcgatatggt caaagaacaa atccaagccg 420
agctggagaa aaaaggctac accgtcaaat tggtcgaatt taccgactat gtgcgcccga 480
atctggcatt ggcggagggc gagttggaca tcaacgtctt ccaacacaaa ccctatcttg 540
acgatttcaa aaaagaacac aacctggaca tcaccgaagc cttccaagtg ccgaccgcgc 600
ctttgggact gtatccgggc aaactgaaat cgctggaaga agtcaaagac ggcagcaccg 660
tatccgcgcc caacgacccg tccaacttcg cacgcgcctt ggtgatgctg aacgaactgg 720
gttggatcaa actcaaagac ggcatcaatc cgctgaccgc atccaaagcc gacatcgcgg 780
aaaacctgaa aaacatcaaa atcgtcgagc ttgaagccgc acaactgccg cgcagccgcg 840
ccgacgtgga ttttgccgtc gtcaacggca actacgccat aagcagcggc atgaagctga 900
ccgaagccct gttccaagag ccgagctttg cctatgtcgc ctggtctgcc gtcaaaaccg 960
ccgacaaaga cagccaatgg cttaaagacg taaccgaggc ctataactcc gacgcgttca 1020
aagcctacgc gcacaaacgc ttcgagggct acaaataccc tgccgcatgg aatgaaggcg 1080
cagccaaata a 1091
<210> 5
<211> 315
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 淋病奈瑟球菌GNA1220蛋白。
<400> 5
Met Glu Phe Phe Ile Ile Leu Leu Ala Ala Val Ala Val Phe Gly Phe
1 5 10 15
Lys Ser Phe Val Val Ile Pro Gln Gln Glu Val His Val Val Glu Arg
20 25 30
Leu Gly Arg Phe His Arg Ala Leu Thr Ala Gly Leu Asn Ile Leu Ile
35 40 45
Pro Phe Ile Asp Arg Val Ala Tyr Arg His Ser Leu Lys Glu Ile Pro
50 55 60
Leu Asp Val Pro Ser Gln Val Cys Ile Thr Arg Asp Asn Thr Gln Leu
65 70 75 80
Thr Val Asp Gly Ile Ile Tyr Phe Gln Val Thr Asp Pro Lys Leu Ala
85 90 95
Ser Tyr Gly Ser Ser Asn Tyr Ile Met Ala Ile Thr Gln Leu Ala Gln
100 105 110
Thr Thr Leu Arg Ser Val Ile Gly Arg Met Glu Leu Asp Lys Thr Phe
115 120 125
Glu Glu Arg Asp Glu Ile Asn Ser Thr Val Val Ser Ala Leu Asp Glu
130 135 140
Ala Ala Gly Ala Trp Gly Val Lys Val Leu Arg Tyr Glu Ile Lys Asp
145 150 155 160
Leu Val Pro Pro Gln Glu Ile Leu Arg Ala Met Gln Ala Gln Ile Thr
165 170 175
Ala Glu Arg Glu Lys Arg Ala Arg Ile Ala Glu Ser Glu Gly Arg Lys
180 185 190
Ile Glu Gln Ile Asn Leu Ala Ser Gly Gln Arg Glu Ala Glu Ile Gln
195 200 205
Gln Ser Glu Gly Glu Ala Gln Ala Ala Val Asn Ala Ser Asn Ala Glu
210 215 220
Lys Ile Ala Arg Ile Asn Arg Ala Lys Gly Glu Ala Glu Ser Leu Arg
225 230 235 240
Leu Val Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ala Ile Arg Gln Ile Ala Ala Ala
245 250 255
Leu Gln Thr Gln Gly Gly Ala Asp Ala Val Asn Leu Lys Ile Ala Glu
260 265 270
Gln Tyr Val Ala Ala Phe Asn Asn Leu Ala Lys Glu Ser Asn Thr Leu
275 280 285
Ile Met Pro Ala Asn Val Ala Asp Ile Gly Ser Leu Ile Ser Ala Gly
290 295 300
Met Lys Ile Ile Asp Ser Ser Lys Thr Ala Lys
305 310 315
<210> 6
<211> 948
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 淋病奈瑟球菌GNA1220 DNA序列。
<400> 6
atggaatttt tcattatctt gttggcagcc gtcgccgttt tcggcttcaa atcctttgtc 60
gtcatccccc agcaggaagt ccacgttgtc gaaaggctcg ggcgtttcca tcgcgccctg 120
acggccggtt tgaatatttt gattcccttt atcgaccgcg tcgcctaccg ccattcgctg 180
aaagaaatcc ctttagacgt acccagccag gtctgcatca cgcgcgataa tacgcaattg 240
actgttgacg gcatcatcta tttccaagta accgatccca aactcgcctc atacggttcg 300
agcaactaca ttatggcaat tacccagctt gcccaaacga cgctgcgttc cgttatcggg 360
cgtatggagt tggacaaaac gtttgaagaa cgcgacgaaa tcaacagtac cgtcgtctcc 420
gccctcgatg aagccgccgg ggcttggggt gtgaaagtcc tccgttacga aatcaaggat 480
ttggttccgc cgcaagaaat ccttcgcgca atgcaggcac aaattaccgc cgaacgcgaa 540
aaacgcgccc gtattgccga atccgaaggc cgtaaaatcg aacaaatcaa ccttgccagt 600
ggtcagcgtg aagccgaaat ccaacaatcc gaaggcgagg ctcaggctgc ggtcaatgcg 660
tccaatgccg agaaaatcgc ccgcatcaac cgcgccaaag gcgaagcgga atccctgcgc 720
cttgttgccg aagccaatgc cgaagccatc cgtcaaattg ccgccgccct tcaaacccaa 780
ggcggggcgg atgcggtcaa tctgaagatt gcggaacaat acgtagccgc gttcaacaat 840
cttgccaaag aaagcaatac gctgattatg cccgccaatg ttgccgacat cggcagcctg 900
atttctgccg gcatgaaaat tatcgacagc agcaaaaccg ccaaataa 948
<210> 7
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 淋病奈瑟球菌GNA1220aba蛋白序列。
<400> 7
Met Val Asn Arg Thr Ala Phe Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Glu Gln Ile Asn Leu Ala
20 25 30
Ser Gly Gln Arg Glu Ala Glu Ile Gln Gln Ser Glu Gly Glu Ala Gln
35 40 45
Ala Ala Val Asn Ala Ser Asn Ala Glu Lys Ile Ala Arg Ile Asn Arg
50 55 60
Ala Lys Gly Glu Ala Glu Ser Leu Arg Leu Val Ala Glu Ala Asn Ala
65 70 75 80
Glu Ala Ile Arg Gln Ile Ala Ala Ala Leu Gln Thr Gln Gly Gly Ala
85 90 95
Asp Ala Val Asn Leu Lys Ile Ala Glu Gln Tyr Val Ala Ala Phe Asn
100 105 110
Asn Leu Ala Lys Glu Ser Asn Thr Leu Ile Met Pro Ala Asn Val Ala
115 120 125
Asp Ile Gly Ser Leu Ile Ser Ala Gly Met Lys Ile Ile Asp Ser Ser
130 135 140
Lys Thr Ala Lys
145
<210> 8
<211> 447
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 淋病奈瑟球菌GNA1220_螺旋-aba DNA序列。
<400> 8
atggtgaacc gaactgcctt ctgcctttct ctgaccgccg ccctgattct gaccgcctgc 60
agcagcggag ggggtggtga acaaatcaac cttgccagtg gtcagcgtga agccgaaatc 120
caacaatccg aaggcgaggc tcaggctgcg gtcaatgcgt ccaatgccga gaaaatcgcc 180
cgcatcaacc gcgccaaagg cgaagcggaa tccctgcgcc ttgttgccga agccaatgcc 240
gaagccatcc gtcaaattgc cgccgccctt caaacccaag gcggggcgga tgcggtcaat 300
ctgaagattg cggaacaata cgtagccgcg ttcaacaatc ttgccaaaga aagcaatacg 360
ctgattatgc ccgccaatgt tgccgacatc ggcagcctga tttctgccgg catgaaaatt 420
atcgacagca gcaaaaccgc caaataa 447
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MetQ_奈瑟球菌正向引物
<400> 9
atacaattgc ctcagcgcat gcatc 25
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MetQ_SbfI反向引物
<400> 10
tatcctgcag gttatacgac tgccttattt g 31
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MetQ_奈瑟球菌反向引物
<400> 11
tattctagat tatacgactg ccttatttgg c 31
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MetQ_SpeI反向引物
<400> 12
tatactagtt tatacgactg ccttatttgg ctg 33
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GNA1220_StuI反向引物
<400> 13
tataggcctt atacgactgc cttatttggc 30
<210> 14
<211> 2260
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Blue script质粒（FHbp KO+MetQ）
<400> 14
atggcactcg tatccatgcg ccaactgctt gatcatgctg ccgaaaacag ctacggcctg 60
ccggcgttca acgtcaacaa cctcgaacag atgcgcgcca tcatggaggc tgcagaccaa 120
gtcgacgccc ccgtcatcgt acaggcgagt gccggtgcgc gcaaatatgc gggtgcgccg 180
tttttacgcc acctgatttt ggcggctgtc gaagaatttc cacacatccc gtcgtcatgc 240
accaagacca cggcgcatca cccgacgtgt gccaacgctc catccaactg ggcttctcct 300
ctgtaatgat ggacggctcg ctgatggaag acggcaaaac cccttcttct tacgaataca 360
acgtcaacgc cacacgtacc gtggttaact tctcccacgc ttgcggcgta tccgttgaag 420
gcgaaatcgg cgtattgggc aacctcgaaa ccggcgaagc aggcgaagaa gacggtgtag 480
gcgcagtggg caaactttcc cacgaccaaa tgctgaccag cgtcgaagat gccgtatgtt 540
tcgttaaaga taccggcgtt gacgcattgg ctattgccgt cggcaccagc cacggcgcat 600
acaaattcac ccgtccgccc acaggcgatg tattacgtat cgaccgcatc aaagaaatcc 660
accaagccct gcccaataca cacatcgtga tgcacggctc cagctccgtt ccgcaagaat 720
ggctgaaagt catcaacgaa tacggcggca atatcggcga aacctacggc gtgccggttg 780
aagaaatcgt cgaaggcatc aaacacggcg tgcgcaaagt caacatcgat accgacttgc 840
gccttgcttc taccggcgcg gtacgccgct accttgccga aaatccgtcc gactttgacc 900
cgcgcaaata cctgagcaaa accattgagg ccatgaagca aatctgcctc gaccgttatc 960
ttgcgtttgg ctgcgaaggt caggcaggca aaatcaaacc tgtttcgttg gaaaaaatgg 1020
caagccgtta tgccaagggc gaattgaacc aaatcgtcaa ataacaggtt gcctgtaaac 1080
aaaatgccgt cccatgggca aacttaagag tgtgttgata gtgcagtatc ttaaaatttt 1140
gtgtataata ggaattgaag ttaaattaga tgctaaaaat ttgtaattaa gaaggaggga 1200
ttcgtcatgt tggtattcca aatgcgtaat gtagataaaa catctactgt tttgaaacag 1260
actaaaaaca gtgattacgc agataaataa atacgttaga ttaattccta ccagtgacta 1320
atcttatgac tttttaaaca gataactaaa attacaaaca aatcgtttaa cttctgtatt 1380
tatttacaga tgtaatcact tcaggagtaa ttacatgaac aaaaatataa aatattctca 1440
aaacttttta acgagtgaaa aagtactcaa ccaaataata aaacaattga atttaaaaga 1500
aaccgatacc gtttacgaaa ttggaacagg taaagggcat ttaacgacga aactggctaa 1560
aataagtaaa caggtaacgt ctattgaatt agacagtcat ctattcaact tatcgtcaga 1620
aaaattaaaa ctgaacattc gtgtcacttt aattcaccaa gatattctac agtttcaatt 1680
ccctaacaaa cagaggtata aaattgttgg gagtattcct taccatttaa gcacacaaat 1740
tattaaaaaa gtggtttttg aaagccatgc gtctgacatc tatctgattg ttgaagaagg 1800
attctacaag cgtaccttgg atattcaccg aacactaggg ttgctcttgc acactcaagt 1860
ctcgattcag caattgctta agctgccagc ggaatgcttt catcctaaac caaaagtaaa 1920
cagtgtctta ataaaactta cccgccatac cacagatgtt ccagataaat attggaagct 1980
atatacgtac tttgtttcaa aatgggtcaa tcgagaatat cgtcaactgt ttactaaaaa 2040
tcagtttcat caagcaatga aacacgccaa agtaaacaat ttaagtacca ttacttatga 2100
gcaagtattg tctattttta atagttatct attatttaac gggaggaaat aattctatga 2160
gtcgcttttt taaatttgga aagttacacg ttactaaagg gaatggagat aaattattag 2220
atatactact gacagcttcc aagaagctaa agaggtccct 2260
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> metQ pBS下游正向引物
<400> 15
ccctgttcca agagccgagc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RBD pBS下游反向引物
<400> 16
agcttcttcc agcgcgaacg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FHbp上游正向引物
<400> 17
ggcgaaatcg gcgtattggg 20
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FHbp上游反向引物
<400> 18
ctacattacg catttggaat acc 23
<210> 19
<211> 5330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGEM质粒（荚膜KO+MetQ）
<400> 19
ctattttcca gtacctaaac gttccaaacg atagctgccg ttcaatacat tttgccacca 60
ggttttgttg tccagatacc attgcacggt tttgcggagg ccggactcga aggtttccaa 120
aggcagccag cccaaatccc gcctgatttt ggctgcgtcg acggcgtagc gtacgtcatg 180
gccggggcgg tcttgtacga aagtaatcaa atcttcataa cgcgccacac cggccggttt 240
ttcgggagcg agttcttcca gcagggcgca gatggttttg acgacttcaa tattggcttt 300
ttcattgtgg ccgccgatat tgtaggtttc gccgacaaca ccttcggtaa caacctgata 360
cagtgcgcgc gcgtggtctt cgacaaacag ccagtcgcgg atttgcatac cgtcgccgta 420
cacaggcagc ggtttgccgt caagcgcgtt cagaatcatc aaaggaatga gtttttccgg 480
aaaatggtaa ggaccgtagt tgttggagca gttggttaca atggtcggca agccgtaagt 540
acgcaaccac gcgcggacga ggtggtcgct ggacacttta gaggcagagt aggggctgga 600
cggcgcgtag ggcgcggttt cggtaaacaa atcgtccgtg ccgcctaaat cgccatagac 660
ttcatcggtg gaaatatggt ggaaacggaa ggcttcgtgc tgttcagacg gcatttgttg 720
ccagtaggcg cgggctgctt caagcagatt gaatgtgccg acgatattgg tttggataaa 780
ctcgcctgcc gaaccgatag agcggtcgac atggctttcc gccgccaagt gcatcacggc 840
atcgggccgg tgttgtgcga atacgcggtc gagttcggcg cggtcgcaaa tgtccacttg 900
ctcgaaagca tagcggggat tatcggcaat gtcggtcagc gattcgagat tgcccgcgta 960
ggtcagtttg tcgaggttga cgacggaatc ttgggtgttt cggataatat gacggacaac 1020
ggcagaaccg ataaagcccg caccgccggt aacgaggatg gtttttttgt ttgcggtttg 1080
catttaatcc ccatatccgt tggggttgcg gctgacccaa cgccacgaat cttccatcat 1140
ttgctgcaag ccgcgtttgg tttcccagcc ggtttgttgt ttggtatggg acgggtcggc 1200
aaaggaacac gccaaatcac cggcgcggcg cggtttgatt tcaaatggaa tggttaaacc 1260
cgaagccgct tcaaatgcgc ggatgatttc caataccgaa gaagcgcggc cggagcctaa 1320
gttcagcaaa tgcgtgcctg ctacattact ttttgcctgc atagccgcga catggccttc 1380
tgccaaatcc atcacatgaa tatagtcacg catccccgtg ccgtcggggg tagggtagtc 1440
atcgccaaat accgccaatt gcctcagcgc atgcatccgg gcagcagcgc atcggctcgc 1500
acgaggtctg cgcttgaatt gtgttgtaga aacacaacgt ttttgaaaaa ataagctatt 1560
gttttatatc aaaatataat catttttaaa ataaaggttg cggcatttat cagatatttg 1620
ttctgaaatg aagacgtatc gggtgtttgc ccgatgtttt taggttttta tcaaatttac 1680
aaaaggaagc ccatatgaaa accttcttca aaaccctttc cgccgccgca ctcgcgctca 1740
tcctcgcagc ctgcggcggt caaaaagaca gcgcgcccgc agcctctgcc gccgcccctt 1800
ctgccgataa cggcgcggcg aaaaaagaaa tcgtcttcgg cacgaccgtc ggcgacttcg 1860
gcgatatggt caaagaacaa atccaagccg agctggagaa aaaaggctac accgtcaaat 1920
tggtcgaatt taccgactat gtgcgcccga atctggcatt ggcggagggc gagttggaca 1980
tcaacgtctt ccaacacaaa ccctatcttg acgatttcaa aaaagaacac aacctggaca 2040
tcaccgaagc cttccaagtg ccgaccgcgc ctttgggact gtatccgggc aaactgaaat 2100
cgctggaaga agtcaaagac ggcagcaccg tatccgcgcc caacgacccg tccaacttcg 2160
cacgcgcctt ggtgatgctg aacgaactgg gttggatcaa actcaaagac ggcatcaatc 2220
cgctgaccgc atccaaagcc gacatcgcgg aaaacctgaa aaacatcaaa atcgtcgagc 2280
ttgaagccgc acaactgccg cgcagccgcg ccgacgtgga ttttgccgtc gtcaacggca 2340
actacgccat aagcagcggc atgaagctga ccgaagccct gttccaagag ccgagctttg 2400
cctatgtcaa ctggtctgcc gtcaaaaccg ccgacaaaga cagccaatgg cttaaagacg 2460
taaccgaggc ctataactcc gacgcgttca aagcctacgc gcacaaacgc ttcgagggct 2520
acaaataccc tgccgcatgg aatgaaggcg cagccaaata aggcagtcgt ataatctaga 2580
gacgatgccg tctgaagaaa ccttgcgctc gttcgccagc caggacagaa atgcctcgac 2640
ttcgctgctg cccaaggttg ccgggtgacg cacaccgtgg aaacggatga aggcacgaac 2700
ccagtggaca taagcctgtt cggttcgtaa gctgtaatgc aagtagcgta tgcgctcacg 2760
caactggtcc agaaccttga ccgaacgcag cggtggtaac ggcgcagtgg cggttttcat 2820
ggcttgttat gactgttttt ttggggtaca gtctatgcct cgggcatcca agcagcaagc 2880
gcgttacgcc gtgggtcgat gtttgatgtt atggagcagc aacgatgtta cgcagcaggg 2940
cagtcgccct aaaacaaagt taaacatcat gagggaagcg gtgatcgccg aagtatcgac 3000
tcaactatca gaggtagttg gcgtcatcga gcgccatctc gaaccgacgt tgctggccgt 3060
acatttgtac ggctccgcag tggatggcgg cctgaagcca cacagtgata ttgatttgct 3120
ggttacggtg accgtaaggc ttgatgaaac aacgcggcga gctttgatca acgacctttt 3180
ggaaacttcg gcttcccctg gagagagcga gattctccgc gctgtagaag tcaccattgt 3240
tgtgcacgac gacatcattc cgtggcgtta tccagctaag cgcgaactgc aatttggaga 3300
atggcagcgc aatgacattc ttgcaggtat cttcgagcca gccacgatcg acattgatct 3360
ggctatcttg ctgacaaaag caagagaaca tagcgttgcc ttggtaggtc cagcggcgga 3420
ggaactcttt gatccggttc ctgaacagga tctatttgag gcgctaaatg aaaccttaac 3480
gctatggaac tcgccgcccg actgggctgg cgatgagcga aatgtagtgc ttacgttgtc 3540
ccgcatttgg tacagcgcag taaccggcaa aatcgcgccg aaggatgtcg ctgccgactg 3600
ggcaatggag cgcctgccgg cccagtatca gcccgtcata cttgaagcta gacaggctta 3660
tcttggacaa gaagaagatc gcttggcctc gcgcgcagat cagttggaag aatttgtcca 3720
ctacgtgaaa ggcgagatca ccaaggtagt cggcaaataa tgtctatgcc gtctgaatac 3780
tcgagcggaa cccgggtagt ggcctgtaaa agacagcata tagagatgag caggctgtat 3840
aatattaagg atttttttgt aacttctata aatataaagt aattttttag gagttatatt 3900
attagggctt ctaggaagct caaatagata aatagattca aatagattct tgttagctga 3960
ttgatgaact aacttaggca tttttaagtt tttagaagta tataaaatta ctagtaaatt 4020
attggttaat ttttgtattt taattaggct ttggacttgg ttaagctgac ctaaattaga 4080
tatgacaaat aaattgttac gtgggggggt aagataaaat ggagatgttg tcaaccacat 4140
tgaatcttga aaaaactttt taggctgaaa aagagctttt tttattttct ttagcattat 4200
tgtatctctt aaaaattaat gagaattagc tatatgtaat agccaatcct ctgttaataa 4260
agtaactaag ttaataagca ttattcaata tcagtttttt tgatttgagc acctttgcga 4320
atattgcaag cagcgacctt accaaataat gtttcatatt cgttgacgct gaagtctcca 4380
ttgcctgggc gtttaaccca taggttatct ccggacaaca gttctccttt tttaatgtct 4440
ttatctgcta cgacagatgc aaaggcgaaa tctttagttg gcttttctcc cgcgataatc 4500
gtgtcttttt tgccgccgcg tgccaatttt aaagcatgag cgccttgctt gagctcttta 4560
aaagtatccg gattcataga gcatacaata tccggacctg ggcgatccat gcggtcagta 4620
aagtgacgct ctaaaatcga accgcctaaa gctactgctc ctaagcaagc atagttatct 4680
aaggtatggt cagacaggcc aatgattgcg tctggaaagg cttcagataa atcgttcata 4740
ccacccaatc gaacatcttc gtaaggggtt gggtagatgt tggtacagtg aagcaaagca 4800
taaggtaccc ctgcttctcg aataatttct accgactttt tgatgctttc aatagaattc 4860
atgccggtag agagaataat aggcttacca aaagaggcca ccagtttaat taatgggtag 4920
ttattacatt cgccagagcc gattttatat gctggaatat ccatacgttg taatcgtaaa 4980
gcagctgcac gagagaaagg agtactgata aaaatcatac ccttactctc tacgtattct 5040
tttaatttaa tctcatcttc ttcattcagg gcgcaacgtt ccataatttc ataaatagag 5100
acatctgcat tgcctggaat gacttgtttg gcctcatcag acatttcgtc ttcaacgatg 5160
tgtgtttgat gtttaacaac ttcagcgcct gcattatagg cagcatcaac catttcaaaa 5220
gctgttttta aagagccttc atgattgatg ccgatttcac agataatcaa tggttcgtgg 5280
ttgtaaccta ctgaacgatt accaatttta aattcgttgt tgttttgcat 5330
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 荚膜KO GalE正向引物
<400> 20
atacgcggtc gagttcggcg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 荚膜KO上游metQ反向引物
<400> 21
gcgcgctgtc tttttgaccg 20
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 荚膜KO Spc下游正向引物
<400> 22
gatgagcgaa atgtagtgct tacg 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 荚膜KO SiaD反向引物
<400> 23
gcatctgtcg tagcagataa agac 24
<210> 24
<211> 3392
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pUC18质粒（lpxL1 KO+MetQ）
<400> 24
atgtcggcaa ccgtccgtat cttgggcatt gacccgggca gccgcgtaac gggtttcggc 60
atcatcgatg tcagggggcg cgatcatttt tacgttgcct caggctgcat caaaacgcct 120
gccgatgcgc ctctggcaga caggattgcc gtcatcgtcc ggcacatcgg cgaagtcgtt 180
accgtttaca agcctcaaca ggcggcggtg gaacaggtgt tcgtcaacgt caatcctgca 240
tcgacgctga tgctcggtca ggcgcggggc gcggcattgg cggcattggt cagccataag 300
ctgcccgttt cggaatacac ggccttgcag gtcaaacagg cggtggtcgg caagggtaag 360
gcagcgaaag aacaggtgca gcatatggtg gtgcagatgc tggggctttc gggaacaccg 420
caggcggatg cggcggacgg tcttgccgtc gcgctgaccc acgccttacg caaccacggg 480
cttgccgcca aactcaatcc ttcagggatg caggtcaagc gcggaaggtt tcaatagttt 540
cagacggcat ttgtattttg ccgtctgaaa agaaaatgtg tatcgagatg aaatttatat 600
ttttgtactg tatgttttgc agtttctgcc gtttgcgctg ctgcacaaga ttgccgacct 660
gacgggtttg cttgcctacc ttctggtcaa accgcgccgc cgtatcggcg aaatcaattt 720
ggcaaaatgt ttttccgaat ggagtgagga aaagcgtaaa accgtgttga aacagcattt 780
caaacacatg gcgaaactga tgttggaata cggtttatat tggtacgcgc ctgccggacg 840
tttgaaatcg ctggtgcgct accgcaataa gcattatttg gacgacgcgc tggcggcggg 900
ggaaaaagtc atcatcctgt atccgcactt caccgctgca gttgcagtga ctaactagga 960
ggaataaatg gctaaaatga gaatatcacc ggaattgaaa aaactgatcg aaaaataccg 1020
ctgcgtaaaa gatacggaag gaatgtctcc tgctaaggta tataagctgg tgggagaaaa 1080
tgaaaaccta tatttaaaaa tgacggacag ccggtataaa gggaccacct atgatgtgga 1140
acgggaaaag gacatgatgc tatggctgga aggaaagctg cctgttccaa aggtcctgca 1200
ctttgaacgg catgatggct ggagcaatct gctcatgagt gaggccgatg gcgtcctttg 1260
ctcggaagag tatgaagatg aacaaagccc tgaaaagatt atcgagctgt atgcggagtg 1320
catcaggctc tttcactcca tcgacatatc ggattgtccc tatacgaata gcttagacag 1380
ccgcttagcc gaattggatt acttactgaa taacgatctg gccgatgtgg attgcgaaaa 1440
ctgggaagaa gacactccat ttaaagatcc gcgcgagctg tatgattttt taaagacgga 1500
aaagcccgaa gaggaacttg tcttttccca cggcgacctg ggagacagca acatctttgt 1560
gaaagatggc aaagtaagtg gctttattga tcttgggaga agcggcaggg cggacaagtg 1620
gtatgacatt gccttctgcg tccggtcgat cagggaggat atcggggaag aacagtatgt 1680
cgagctattt tttgacttac tggggatcaa gcctgattgg gagaaaataa aatattatat 1740
tttactggat gaattgtttt agtacccctc agcgcatgca tccgggctct gcgcttgaat 1800
tgtgttgtag aaacacaacg tttttgaaaa aataagctat tgttttatat caaaatataa 1860
tcatttttaa aataaaggtt gcggcattta tcagatattt gttctgaaat gaagacgtat 1920
cgggtgtttg cccgatgttt ttaggttttt atcaaattta caaaaggaag cccatatgaa 1980
aaccttcttc aaaacccttt ccgccgccgc actcgcgctc atcctcgcag cctgcggcgg 2040
tcaaaaagac agcgcgcccg cagcctctgc cgccgcccct tctgccgata acggcgcggc 2100
gaaaaaagaa atcgtcttcg gcacgaccgt cggcgacttc ggcgatatgg tcaaagaaca 2160
aatccaagcc gagctggaga aaaaaggcta caccgtcaaa ttggtcgaat ttaccgacta 2220
tgtgcgcccg aatctggcat tggcggaggg cgagttggac atcaacgtct tccaacacaa 2280
accctatctt gacgatttca aaaaagaaca caacctggac atcaccgaag ccttccaagt 2340
gccgaccgcg cctttgggac tgtatccggg caaactgaaa tcgctggaag aagtcaaaga 2400
cggcagcacc gtatccgcgc ccaacgaccc gtccaacttc gcacgcgcct tggtgatgct 2460
gaacgaactg ggttggatca aactcaaaga cggcatcaat ccgctgaccg catccaaagc 2520
cgacatcgcg gaaaacctga aaaacatcaa aatcgtcgag cttgaagccg cacaactgcc 2580
gcgcagccgc gccgacgtgg attttgccgt cgtcaacggc aactacgcca taagcagcgg 2640
catgaagctg accgaagccc tgttccaaga gccgagcttt gcctatgtca actggtctgc 2700
cgtcaaaacc gccgacaaag acagccaatg gcttaaagac gtaaccgagg cctataactc 2760
cgacgcgttc aaagcctacg cgcacaaacg cttcgagggc tacaaatacc ctgccgcatg 2820
gaatgaaggc gcagccaaat aaggcagtcg tataacctgc agggaataat gagtcgacag 2880
gatttcggac gcaacgattc ggtttttgtg gattttttcg gtattcagac ggcaacgatt 2940
accggattga gccgcattgc cgcgcttgca aatgcaaaag tgatacccgc cattcccgtc 3000
cgcgaggcag acaatacggt tacattgcat ttctaccctg cttggaaatc ctttccgggt 3060
gaagacgcga aagccgacgc gcagcgcatg aaccgtttta tcgaagacag ggtgcgcgaa 3120
catccggaac aatatttttg gctgcacaag cgttttaaaa cccgtccgga aggcagcccc 3180
gatttttact gactacgtaa aattacaaaa catatcaggc gtttcgagtc gaaactcctg 3240
attgtttttt taaatgcaaa atggcagatt atatgaacag atttcatttg ataatcgctg 3300
ctatttaagt atctcaaaaa acaatatttt taagacttgg tcgggaaatt cgaagcaggt 3360
tttggaagaa ataccgcaaa cctatgaata ta 3392
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lpxl1上游正向引物
<400> 25
gtcggcaagg gtaaggcagc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lpxl1上游反向引物
<400> 26
ccctttatac cggctgtccg 20
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lpxl1下游反向引物
<400> 27
atattcatag gtttgcggta tttc 24
<210> 28
<211> 2261
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Blue script质粒（FHbp KO+GNA1220）
<400> 28
atggcactcg tatccatgcg ccaactgctt gatcatgctg ccgaaaacag ctacggcctg 60
ccggcgttca acgtcaacaa cctcgaacag atgcgcgcca tcatggaggc tgcagaccaa 120
gtcgacgccc ccgtcatcgt acaggcgagt gccggtgcgc gcaaatatgc gggtgcgccg 180
tttttacgcc acctgatttt ggcggctgtc gaagaatttc cacacatccc cgtcgtcatg 240
caccaagacc acggcgcatc acccgacgtg tgccaacgct ccatccaact gggcttctcc 300
tctgtaatga tggacggctc gctgatggaa gacggcaaaa ccccttcttc ttacgaatac 360
aacgtcaacg ccacacgtac cgtggttaac ttctcccacg cttgcggcgt atccgttgaa 420
ggcgaaatcg gcgtattggg caacctcgaa accggcgaag caggcgaaga agacggtgta 480
ggcgcagtgg gcaaactttc ccacgaccaa atgctgacca gcgtcgaaga tgccgtatgt 540
ttcgttaaag ataccggcgt tgacgcattg gctattgccg tcggcaccag ccacggcgca 600
tacaaattca cccgtccgcc cacaggcgat gtattacgta tcgaccgcat caaagaaatc 660
caccaagccc tgcccaatac acacatcgtg atgcacggct ccagctccgt tccgcaagaa 720
tggctgaaag tcatcaacga atacggcggc aatatcggcg aaacctacgg cgtgccggtt 780
gaagaaatcg tcgaaggcat caaacacggc gtgcgcaaag tcaacatcga taccgacttg 840
cgccttgctt ctaccggcgc ggtacgccgc taccttgccg aaaatccgtc cgactttgac 900
ccgcgcaaat acctgagcaa aaccattgag gccatgaagc aaatctgcct cgaccgttat 960
cttgcgtttg gctgcgaagg tcaggcaggc aaaatcaaac ctgtttcgtt ggaaaaaatg 1020
gcaagccgtt atgccaaggg cgaattgaac caaatcgtca aataacaggt tgcctgtaaa 1080
caaaatgccg tcccatgggc aaacttaaga gtgtgttgat agtgcagtat cttaaaattt 1140
tgtgtataat aggaattgaa gttaaattag atgctaaaaa tttgtaatta agaaggaggg 1200
attcgtcatg ttggtattcc aaatgcgtaa tgtagataaa acatctactg ttttgaaaca 1260
gactaaaaac agtgattacg cagataaata aatacgttag attaattcct accagtgact 1320
aatcttatga ctttttaaac agataactaa aattacaaac aaatcgttta acttctgtat 1380
ttatttacag atgtaatcac ttcaggagta attacatgaa caaaaatata aaatattctc 1440
aaaacttttt aacgagtgaa aaagtactca accaaataat aaaacaattg aatttaaaag 1500
aaaccgatac cgtttacgaa attggaacag gtaaagggca tttaacgacg aaactggcta 1560
aaataagtaa acaggtaacg tctattgaat tagacagtca tctattcaac ttatcgtcag 1620
aaaaattaaa actgaacatt cgtgtcactt taattcacca agatattcta cagtttcaat 1680
tccctaacaa acagaggtat aaaattgttg ggagtattcc ttaccattta agcacacaaa 1740
ttattaaaaa agtggttttt gaaagccatg cgtctgacat ctatctgatt gttgaagaag 1800
gattctacaa gcgtaccttg gatattcacc gaacactagg gttgctcttg cacactcaag 1860
tctcgattca gcaattgctt aagctgccag cggaatgctt tcatcctaaa ccaaaagtaa 1920
acagtgtctt aataaaactt acccgccata ccacagatgt tccagataaa tattggaagc 1980
tatatacgta ctttgtttca aaatgggtca atcgagaata tcgtcaactg tttactaaaa 2040
atcagtttca tcaagcaatg aaacacgcca aagtaaacaa tttaagtacc attacttatg 2100
agcaagtatt gtctattttt aatagttatc tattatttaa cgggaggaaa taattctatg 2160
agtcgctttt ttaaatttgg aaagttacac gttactaaag ggaatggaga taaattatta 2220
gatatactac tgacagcttc caagaagcta aagaggtccc t 2261
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GNA1220 pBS下游正向引物
<400> 29
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<210> 30
<211> 5411
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGEM质粒（荚膜KO+GNA1220）
<400> 30
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ttcattgtgg ccgccgatat tgtaggtttc gccgacaaca ccttcggtaa caacctgata 360
cagtgcgcgc gcgtggtctt cgacaaacag ccagtcgcgg atttgcatac cgtcgccgta 420
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acgcaaccac gcgcggacga ggtggtcgct ggacacttta gaggcagagt aggggctgga 600
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gttttatatc aaaatataat catttttaaa ataaaggttg cggcatttat cagatatttg 1620
ttctgaaatg aagacgtatc gggtgtttgc ccgatgtttt taggttttta tcaaatttac 1680
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cttggtaggt ccagcggcgg aggaactctt tgatccggtt cctgaacagg atctatttga 3540
ggcgctaaat gaaaccttaa cgctatggaa ctcgccgccc gactgggctg gcgatgagcg 3600
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atataaaatt actagtaaat tattggttaa tttttgtatt ttaattaggc tttggacttg 4140
gttaagctga cctaaattag atatgacaaa taaattgtta cgtggggggg taagataaaa 4200
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ttttattttc tttagcatta ttgtatctct taaaaattaa tgagaattag ctatatgtaa 4320
tagccaatcc tctgttaata aagtaactaa gttaataagc attattcaat atcagttttt 4380
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ggcttttctc ccgcgataat cgtgtctttt ttgccgccgc gtgccaattt taaagcatga 4620
gcgccttgct tgagctcttt aaaagtatcc ggattcatag agcatacaat atccggacct 4680
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<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 荚膜KO上游GNA1220 R
<400> 31
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<210> 32
<211> 3498
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pUC18质粒（lpxL1 KO+GNA1220）
<400> 32
atgtcggcaa ccgtccgtat cttgggcatt gacccgggca gccgcgtaac gggtttcggc 60
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gccgatgcgc ctctggcaga caggattgcc gtcatcgtcc ggcacatcgg cgaagtcgtt 180
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caggcggatg cggcggacgg tcttgccgtc gcgctgaccc acgccttacg caaccacggg 480
cttgccgcca aactcaatcc ttcagggatg caggtcaagc gcggaaggtt tcaatagttt 540
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<210> 33
<211> 6740
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pFP12-MetQ质粒
<400> 33
ctgcaggccg tctgaaccgc tctaaccgct ttttctcggc ttaatttttc tgtctctgtt 60
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aaaataatca taatccccat tgtcatttga tattttcaga acgccaactt gacggcatag 2640
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atgaatggct acctcaaata gaaaaatacg ttaaagccca agaaaagcgg gacggaatgg 3240
aagtagagat cacgcaatac gacaaggatt tacagcgtat tcagggagac tataacaagc 3300
tcacagataa aaatcagggt tttctcggtt tatgggaaac taaagagcaa aaagcaaaga 3360
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aattagccga gtatagccaa aaaataaaag catacgaaca gaaaacgcta gagccaatca 3480
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gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagcttcct 4140
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aagtcctccg ttacgaaatc aaggatttgg ttccgccgca agaaatcctt cgcgcaatgc 4860
aggcacaaat taccgccgaa cgcgaaaaac gcgcccgtat tgccgaatcc gaaggccgta 4920
aaatcgaaca aatcaacctt gccagtggtc agcgtgaagc cgaaatccaa caatccgaag 4980
gcgaggctca ggctgcggtc aatgcgtcca atgccgagaa aatcgcccgc atcaaccgcg 5040
ccaaaggcga agcggaatcc ctgcgccttg ttgccgaagc caatgccgaa gccatccgtc 5100
aaattgccgc cgcccttcaa acccaaggcg gggcggatgc ggtcaatctg aagattgcgg 5160
aacaatacgt agccgcgttc aacaatcttg ccaaagaaag caatacgctg attatgcccg 5220
ccaatgttgc cgacatcggc agcctgattt ctgccggcat gaaaattatc gacagcagca 5280
aaaccgccaa ataagtgcgg tcatcttcgg tttccgtgtt tcgtaaagtc tggaaacgcg 5340
gaagtcccct acgtgctgct gaagttgccc caacagagag tggaaccaac cggtgatacc 5400
acgatactat gactgagagt caacgccatg agcggcctca tttcttattc tgagttacaa 5460
cagtccgcac cgctgtccgg tagctccttc cggtgggcgc ggggcatgac tatcgtcgcc 5520
gcacttatga ctgtcttctt tatcatgcaa ctcgtaggac aggtgccggc agcgcccaac 5580
agtcccccgg ccacggggcc tgccaccata cccacgccga aacaagcgcc ctgcaccatt 5640
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ttaacgaagc gctaaccgtt tttatcaggc tctgggaggc agaataaatg atcatatcgt 5760
caattattac ctccacgggg agagcctgag caaactggcc tcaggcattt gagaagcaca 5820
cggtcacact gcttccggta gtcaataaac cggtaaacca gcaatagaca taagcggcta 5880
tttaacgacc ctgccctgaa ccgacgaccg ggtcgaattt gctttcgaat ttctgccatt 5940
catccgctta ttatcactta ttcaggcgta gcaccaggcg tttaagggca ccaataactg 6000
ccttaaaaaa attacgcccc gccctgccac tcatcgcagt actgttgtaa ttcattaagc 6060
attctgccga catggaagcc atcacagacg gcatgatgaa cctgaatcgc cagcggcatc 6120
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tccatattgg ccacgtttaa atcaaaactg gtgaaactca cccagggatt ggctgagacg 6240
aaaaacatat tctcaataaa ccctttaggg aaataggcca ggttttcacc gtaacacgcc 6300
acatcttgcg aatatatgtg tagaaactgc cggaaatcgt cgtggtattc actccagagc 6360
gatgaaacgt ttcagtttgc tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata 6420
tcaccagctc accgtctttc attgccatac ggaattccgg atgagcattc atcaggcggg 6480
caagaatgtg aataaaggcc ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg gtctttaaaa 6540
aggccgtaat atccagctga acggtctggt tataggtaca ttgagcaact gactgaaatg 6600
cctcaaaatg ttctttacga tgccattggg atatatcaac ggtggtatat ccagtgattt 6660
ttttctccat tttagcttcc ttagctcctg aaaatctcga taactcaaaa aatacgcccg 6720
gtagtgatct tatttcatta tggtgaaagt tggaacctct tacgtgccga tcaacgtctc 6780
attttcgcca aaagttggcc cagggcttcc cggtatcaac a 6821
<210> 36
<211> 6374
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pFP12-GNA1220_螺旋-bab质粒
<400> 36
ctgcaggccg tctgaaccgc tctaaccgct ttttctcggc ttaatttttc tgtctctgtt 60
ataaaattgc tattcatctt gttcttcttc aaaaaaaagt taagtaaaat acctacctaa 120
atttttacta gttcgcaatc tacgagctta taacctcgtt ttttcaattc atttaaaaaa 180
tcagattttg agcctaattt tgatctattg ctatcgttac ccgctagaaa tacccagtaa 240
ttacgcaaat cttcattggt aactttcgta atatcggtgt aatgatcttc gagtattttt 300
aagcaatctc tagcccataa accgtactcg tgattgctca tcttagggtt ttgcttatcg 360
agtttgacga acttcccata cttgttttta tgtggaaata ctggccgttt tgcaacttct 420
tcaatttttt gagctgttcg ttttttacta ccaatcacaa aatttaaaga gtgaatagta 480
cgcccacgct tgatttgttc aacctcaacg actaaatcag atttctcgtt aatctcagtt 540
attgcaggtt ccaaaacacg ttgatttaat gaattaaatc tagggtattt attttcaacc 600
tgaagccatt cttttagttt ttctactgta atttcacgac taccaacaga gcgatattgt 660
gtaattagct cataaattcg aattgaatgt acactgttga aataagcgat atgtttgagt 720
tgatattgcg tgaattgccc tttaagttgc gttaggtatg gcataacttc atcagtcatt 780
gcaattctaa aacgcccctc tttcttgaaa tatgttctag aggaaaccca acgaaattca 840
gttacacggt ctttatcttc agttttaaca cttcggtcat aaatccgttt tatagccgcc 900
tgaatttgct tataggcgtt atcttggctt atttctggaa actcacggac aaaatcagcc 960
accgtaaaat caaaaatctt ttgattagat ttcggatcca tagtcccaat agttaaagct 1020
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acaacaacta aatcatttgg cataagacaa caaatttcct gtttaaaaca acaagcaaaa 1140
tatacctgtt gtttatatat aaaacaacaa gtattttctt aaaagttgtc tataacagga 1200
aatttgttgt cttataacag gaaatttgtt gtcgtataac aggaaatttg ttgtcgtata 1260
acaggaaatt tgttgtcgta taagtttgta acttattgat tttactggtt ttaaaaacgc 1320
cgaaaacaag taaaaaacaa aaatataaaa atatagggac tttcgtccct tttttgggct 1380
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tcttttatcg tactcatcaa tccttttttg cattctttcg tttgctttgt gatcggcaaa 1620
ttttgaataa gatttttcca tctcatctaa cattctatca atccgttttt tatgttgcca 1680
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gattgttaca atttcgctca cagttatttt ttaccttttt caatttcttc attgataaat 1800
gcactcaatt catcaaattt cttgtcatca ttgataaatt tacgcaactt agggaagttt 1860
ctatctacat ctaaaagagg gttatttatt atttcattta gccaaaaagc ccctaataaa 1920
accttgtaat gcgtagcttt cttacgcttt tctgcttgtt cttttgactt aatcgcacga 1980
attttcgctt tgatttcgtc ctgcttgcgt tgtaaatctg cttgttgctg ttccaatctt 2040
gtaagttttt cgcttgccat actagcccct ttatatagtt agaaattatc gttattttat 2100
tcagtaggtg ctaggcttgc aagtgttctg ttcattacgt taaaataacg taatgcccac 2160
ttatcagttt ctcttcgaga aactggtggg caagcgtacc gcttgaccgt ttcgcaatac 2220
tcaacactat ggcaatctat catttaaacg ttcgctattg cagtaaaagc aaagggcaat 2280
cagctcaagc caaaaacgac tacatcaacc gcaatgataa atattcaaag cggttagatg 2340
atttacagtt ttcaggctat ggtaatatgc caaaatttgc cgaagataat ccgcaagaat 2400
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aaaataatca taatccccat tgtcatttga tattttcaga acgccaactt gacggcatag 2640
accgtacagc cgagcagttt tttaaacgtg ctaatactaa atccccagaa aagggcggag 2700
cgatgaaaac ggcagatttt cgagatcgtg agtttatcca atctgtccga aaaacgtgga 2760
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gacaagaaat taacaaagaa aaatcctact tgcagaaaat cgaagaaaaa caggctcaag 3000
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taaaacacga tttaagcaac gaaaaagaaa aagacagtaa aatacacact caagaagaaa 3120
aagtgcctca aaatcgcatt caggggcttt ctcaagcaga ttttgatcag tttttaattg 3180
atgaatggct acctcaaata gaaaaatacg ttaaagccca agaaaagcgg gacggaatgg 3240
aagtagagat cacgcaatac gacaaggatt tacagcgtat tcagggagac tataacaagc 3300
tcacagataa aaatcagggt tttctcggtt tatgggaaac taaagagcaa aaagcaaaga 3360
aaaaagagct tgaagatgaa tacaaacata cagcagagca acggaacgct aaaagccaag 3420
aattagccga gtatagccaa aaaataaaag catacgaaca gaaaacgcta gagccaatca 3480
acgagaagat tgccaaatat caagctgaca accctgaaat aaaaatgcgg agcttaggat 3540
ttgtgaaaaa aattaaggct caaggggcat ataaagcggc tcaagagcga atggagcgag 3600
aaaaacagca ccaacaggaa aaacaacaga gacatttaga gcgagagagt ggtttgagct 3660
tgtagctaac gccctacgcc tacggcttcg gttgttcaac ccttaaagaa ctcgcaacaa 3720
gttgcaaatt ctttaagggt tcgcaataaa aacaaccgct aaacatttct gcccagcggt 3780
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actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt 4080
gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagcttcct 4140
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aaataagcta ttgttttata tcaaaatata atcattttta aaataaaggt tgcggcattt 4260
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tatcaaattt acaaaaggaa gcccatatgg tgaaccgaac tgccttctgc ctttctctga 4380
ccgccgccct gattctgacc gcctgcagca gcggaggggg tggtgaacaa atcaaccttg 4440
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cccaaggcgg ggcggatgcg gtcaatctga agattgcgga acaatacgta gccgcgttca 4680
acaatcttgc caaagaaagc aatacgctga ttatgcccgc caatgttgcc gacatcggca 4740
gcctgatttc tgccggcatg aaaattatcg acagcagcaa aaccgccaaa taaaggccta 4800
ctagtcggcc gtacgggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgattaagtg cggtcatctt 4860
cggtttccgt gtttcgtaaa gtctggaaac gcggaagtcc cctacgtgct gctgaagttg 4920
ccccaacaga gagtggaacc aaccggtgat accacgatac tatgactgag agtcaacgcc 4980
atgagcggcc tcatttctta ttctgagtta caacagtccg caccgctgtc cggtagctcc 5040
ttccggtggg cgcggggcat gactatcgtc gccgcactta tgactgtctt ctttatcatg 5100
caactcgtag gacaggtgcc ggcagcgccc aacagtcccc cggccacggg gcctgccacc 5160
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gagcaaactg gcctcaggca tttgagaagc acacggtcac actgcttccg gtagtcaata 5400
aaccggtaaa ccagcaatag acataagcgg ctatttaacg accctgccct gaaccgacga 5460
ccgggtcgaa tttgctttcg aatttctgcc attcatccgc ttattatcac ttattcaggc 5520
gtagcaccag gcgtttaagg gcaccaataa ctgccttaaa aaaattacgc cccgccctgc 5580
cactcatcgc agtactgttg taattcatta agcattctgc cgacatggaa gccatcacag 5640
acggcatgat gaacctgaat cgccagcggc atcagcacct tgtcgccttg cgtataatat 5700
ttgcccatgg tgaaaacggg ggcgaagaag ttgtccatat tggccacgtt taaatcaaaa 5760
ctggtgaaac tcacccaggg attggctgag acgaaaaaca tattctcaat aaacccttta 5820
gggaaatagg ccaggttttc accgtaacac gccacatctt gcgaatatat gtgtagaaac 5880
tgccggaaat cgtcgtggta ttcactccag agcgatgaaa cgtttcagtt tgctcatgga 5940
aaacggtgta acaagggtga acactatccc atatcaccag ctcaccgtct ttcattgcca 6000
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gggatatatc aacggtggta tatccagtga tttttttctc cattttagct tccttagctc 6240
ctgaaaatct cgataactca aaaaatacgc ccggtagtga tcttatttca ttatggtgaa 6300
agttggaacc tcttacgtgc cgatcaacgt ctcattttcg ccaaaagttg gcccagggct 6360
tcccggtatc aaca 6374
<210> 37
<211> 426
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 淋病奈瑟球菌NHBA蛋白
<400> 37
Met Phe Lys Arg Ser Val Ile Ala Met Ala Cys Ile Phe Pro Leu Ser
1 5 10 15
Ala Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Pro Asp Val Lys Ser Ala Asp
20 25 30
Thr Pro Ser Lys Pro Ala Ala Pro Val Val Ala Glu Asn Ala Gly Glu
35 40 45
Gly Val Leu Pro Lys Glu Lys Lys Asp Glu Glu Ala Ala Gly Gly Ala
50 55 60
Pro Gln Ala Asp Thr Gln Asp Ala Thr Ala Gly Glu Gly Ser Gln Asp
65 70 75 80
Met Ala Ala Val Ser Ala Glu Asn Thr Gly Asn Gly Gly Ala Ala Thr
85 90 95
Thr Asp Asn Pro Lys Asn Glu Asp Ala Gly Ala Gln Asn Asp Met Pro
100 105 110
Gln Asn Ala Ala Glu Ser Ala Asn Gln Thr Gly Asn Asn Gln Pro Ala
115 120 125
Gly Ser Ser Asp Ser Ala Pro Ala Ser Asn Pro Ala Pro Ala Asn Gly
130 135 140
Gly Ser Asp Phe Gly Arg Thr Asn Val Gly Asn Ser Val Val Ile Asp
145 150 155 160
Gly Pro Ser Gln Asn Ile Thr Leu Thr His Cys Lys Gly Asp Pro Cys
165 170 175
Asn Gly Asp Asn Leu Leu Asp Glu Glu Ala Pro Pro Lys Ser Glu Phe
180 185 190
Glu Ser Leu Ser Asp Glu Glu Lys Ile Lys Lys Tyr Lys Lys Asp Gly
195 200 205
Glu Lys Phe Thr Gly Leu Val Ala Ile Lys Val Glu Asn Asn Gly Leu
210 215 220
Asn Lys Tyr Thr Ile Ile Tyr Gln Ala Gln Pro Thr Arg Ser Ala Arg
225 230 235 240
Ser Arg Arg Ser Leu Pro Ala Glu Ile Pro Leu Ile Pro Val Asn Gln
245 250 255
Ala Asp Thr Leu Ile Val Asp Gly Glu Ala Val Ser Leu Thr Gly His
260 265 270
Ser Gly Asn Ile Phe Ala Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Tyr Leu Thr Tyr
275 280 285
Gly Ala Glu Lys Leu Pro Gly Gly Ser Tyr Ala Leu Arg Val Gln Gly
290 295 300
Glu Pro Ala Lys Gly Glu Met Leu Ala Gly Thr Ala Val Tyr Asn Gly
305 310 315 320
Glu Val Leu His Phe His Met Glu Asn Gly Arg Pro Tyr Pro Ser Gly
325 330 335
Gly Arg Phe Ala Ala Lys Val Asp Phe Gly Ser Lys Ser Val Asp Gly
340 345 350
Ile Ile Asp Ser Ser Asp Asp Leu His Met Gly Thr Gln Lys Phe Lys
355 360 365
Ala Ala Ile Asp Gly Asn Gly Phe Lys Gly Thr Trp Thr Glu Asn Gly
370 375 380
Gly Gly Asp Val Ser Gly Arg Phe Tyr Gly Pro Ala Gly Glu Glu Val
385 390 395 400
Ala Gly Lys Tyr Ser Tyr Arg Pro Thr Asp Ala Glu Lys Gly Gly Phe
405 410 415
Gly Val Phe Ala Gly Lys Lys Asp Arg Asp
420 425
<210> 38
<211> 1281
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pFP12-NHBA质粒
<400> 38
atgtttaaac gcagtgtgat tgcaatggct tgtatttttc ccctttcagc ctgtgggggc 60
ggcggtggcg gatcgcccga tgtcaagtcg gcggacacgc cgtcaaaacc ggccgccccc 120
gttgttgctg aaaatgccgg ggaaggggtg ctgccgaaag aaaagaaaga tgaggaggca 180
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atggcggcag tttcggcaga aaatacaggc aatggcggtg cggcaacaac ggacaacccc 300
aaaaatgaag acgcgggggc gcaaaatgat atgccgcaaa atgccgccga atccgcaaat 360
caaacaggga acaaccaacc cgccggttct tcagattccg cccccgcgtc aaaccctgcc 420
cctgcgaatg gcggtagcga ttttggaagg acgaacgtgg gcaattctgt tgtgattgac 480
ggaccgtcgc aaaatataac gttgacccac tgtaaaggcg atccttgtaa tggtgataat 540
ttattggatg aagaagcacc gccaaaatca gaatttgaat cgttaagtga tgaagagaaa 600
attaagaaat ataaaaaaga tggagaaaag tttactggtt tggttgctat aaaagttgaa 660
aataatgggt tgaataaata taccattatt tatcaagctc agcctactcg ttctgcacgg 720
tcgaggaggt cgcttccggc cgagattccg ctgattcccg tcaatcaggc cgatacgctg 780
attgtggatg gggaagcggt cagcctgacg gggcattccg gcaatatctt cgcgcccgaa 840
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cgtgtgcaag gcgaaccggc aaaaggcgaa atgcttgcgg gcacggccgt gtacaacggc 960
gaagtgctgc atttccacat ggaaaacggc cgtccgtacc cgtccggagg caggtttgcc 1020
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gcgggaaaat acagctatcg cccgacagat gctgaaaagg gcggattcgg cgtgtttgcc 1260
ggcaaaaaag atcgggattg a 1281
<210> 39
<211> 8066
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pFP12-NHBA质粒
<400> 39
ctgcaggccg tctgaaccgc tctaaccgct ttttctcggc ttaatttttc tgtctctgtt 60
ataaaattgc tattcatctt gttcttcttc aaaaaaaagt taagtaaaat acctacctaa 120
atttttacta gttcgcaatc tacgagctta taacctcgtt ttttcaattc atttaaaaaa 180
tcagattttg agcctaattt tgatctattg ctatcgttac ccgctagaaa tacccagtaa 240
ttacgcaaat cttcattggt aactttcgta atatcggtgt aatgatcttc gagtattttt 300
aagcaatctc tagcccataa accgtactcg tgattgctca tcttagggtt ttgcttatcg 360
agtttgacga acttcccata cttgttttta tgtggaaata ctggccgttt tgcaacttct 420
tcaatttttt gagctgttcg ttttttacta ccaatcacaa aatttaaaga gtgaatagta 480
cgcccacgct tgatttgttc aacctcaacg actaaatcag atttctcgtt aatctcagtt 540
attgcaggtt ccaaaacacg ttgatttaat gaattaaatc tagggtattt attttcaacc 600
tgaagccatt cttttagttt ttctactgta atttcacgac taccaacaga gcgatattgt 660
gtaattagct cataaattcg aattgaatgt acactgttga aataagcgat atgtttgagt 720
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accgtaaaat caaaaatctt ttgattagat ttcggatcca tagtcccgat agttaaagct 1020
aaaattctga tttcatcaat actcaatcgg taattggctt caataaggct attagccttt 1080
acaacaacta aatcatttgg cataagacaa caaatttcct gtttaaaaca acaagcaaaa 1140
tatacctgtt gtttatatat aaaacaacaa gtattttctt aaaagttgtc tataacagga 1200
aatttgttgt cgtataacag gaaatttgtt gtcttataac aggaaatttg ttgtcgtata 1260
acaggaaatt tgttgtcgta taagtttgta acttattgat tttactggtt ttaaaaacgc 1320
cgaaaacaag taaaaaacaa aaatataaaa atatagggac tttcgtccct tttttgggct 1380
ttcagcccta attttttctt ttttcaggat taaaaattac aaaaccctta cagagcaagt 1440
aaacttgttt gcttgttctg caagggttca gcaaccgtag ccgtcaggcg tagggcggta 1500
gcctataaaa gccatttaat tttatcttta aacttccttt taaatgcttt gagtgggtgt 1560
cttttatcgt actcatcaat ccttttttgc attctttcgt ttgctttgtg atcggcaaat 1620
tttgaataag atttttccat ctcatctaac attctatcaa tccgtttttt atgttgccat 1680
ttcaggtaaa cataaacact tatagcaatt aaagacaata tcaatacatt gtaaaaaatg 1740
attgttacaa tttcgctcac agttattttt tacctttttc aatttcttca ttgataaatg 1800
cactcaattc atcaaatttc ttgtcatcat tgataaattt acgcaactta gggaagtttc 1860
tatctacatc taaaagaggg ctatttatta cttcatttag ccaaaaagcc cctaataaaa 1920
ccttgtaatg cgtagctttc ttacgctttt ctgcttgttc ttttgactta atcgcacgaa 1980
ttttcgcttt gatttcgtcc tgcttgcgtt gtaaatctgc ttgttgctgt tccaatcttg 2040
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tatcagtttc tcttcgagaa actggtgggc aagcgtaccg cttgaccgtt tcgcaatact 2220
caacactatg gcaatctatc atttaaacgt tcgctattgc agtaaaagca aagggcaatc 2280
agctcaagcc aaaaacgact acatcaaccg caatgataaa tattcaaagc ggttagatga 2340
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aatttgttgt cgtataacag gaaatttgtt gtcttataac aggaaatttg ttgtcgtata 1260
acaggaaatt tgttgtcgta taagtttgta acttattgat tttactggtt ttaaaaacgc 1320
cgaaaacaag taaaaaacaa aaatataaaa atatagggac tttcgtccct tttttgggct 1380
ttcagcccta attttttctt ttttcaggat taaaaattac aaaaccctta cagagcaagt 1440
aaacttgttt gcttgttctg caagggttca gcaaccgtag ccgtcaggcg tagggcggta 1500
gcctataaaa gccatttaat tttatcttta aacttccttt taaatgcttt gagtgggtgt 1560
cttttatcgt actcatcaat ccttttttgc attctttcgt ttgctttgtg atcggcaaat 1620
tttgaataag atttttccat ctcatctaac attctatcaa tccgtttttt atgttgccat 1680
ttcaggtaaa cataaacact tatagcaatt aaagacaata tcaatacatt gtaaaaaatg 1740
attgttacaa tttcgctcac agttattttt tacctttttc aatttcttca ttgataaatg 1800
cactcaattc atcaaatttc ttgtcatcat tgataaattt acgcaactta gggaagtttc 1860
tatctacatc taaaagaggg ctatttatta cttcatttag ccaaaaagcc cctaataaaa 1920
ccttgtaatg cgtagctttc ttacgctttt ctgcttgttc ttttgactta atcgcacgaa 1980
ttttcgcttt gatttcgtcc tgcttgcgtt gtaaatctgc ttgttgctgt tccaatcttg 2040
taagtttttc gcttgccata ctagcccctt tatatagtta gaaattatcg ttattttatt 2100
cagtaggtgc taggcttgca agtgttctgt tcattacgtt aaaataacgt aatgcccact 2160
tatcagtttc tcttcgagaa actggtgggc aagcgtaccg cttgaccgtt tcgcaatact 2220
caacactatg gcaatctatc atttaaacgt tcgctattgc agtaaaagca aagggcaatc 2280
agctcaagcc aaaaacgact acatcaaccg caatgataaa tattcaaagc ggttagatga 2340
tttacagttt tcaggctatg gtaatatgcc aaaatttgcc gaagataatc cgcaagaatt 2400
ttggcgattg tcagatattt acgagcgagc taatgcccga gtttgtactg aaattgaatt 2460
tgctttacct agagaattaa ccctagaaca acagcaaaaa ttagtaagtt cgtttataga 2520
aaatacggtt gatagcggta gcaataaact accctactct ttcgctatcc ataccgataa 2580
aaataatcat aatccccatt gtcatttgat attttcagaa cgccaacttg acggcataga 2640
ccgtacagcc gagcagtttt ttaaacgtgc taatactaaa tccccagaaa agggcggagc 2700
gatgaaaacg gcagattttc gagatcgtga gtttatccaa tctgtccgaa aaacgtggag 2760
agagcaagct aatcaagcct tagagcaata cggatatgcc gcacgaattg acgaacgtag 2820
ctacaaggaa caaggcatag agcaagcccc aagagcaaga attgacaggg taacgtggca 2880
agaattgaac cgattagagc aagaagaacg ccaaatcgtg caagagcttg cacttaaagg 2940
acaagaaatt aacaaagaaa aatcctactt gcagaaaatc gaagaaaaac aggctcaagg 3000
aatgggcaaa tatgaatcca aattcgcagc tgcgttttct aaattatcgg aaagtgccct 3060
aaaacacgat ttaagcaacg aaaaagaaaa agacagtaaa atacacactc aagaagaaaa 3120
agtgcctcaa aatcgcattc aggggctttc tcaagcagat tttgatcagt ttttaattga 3180
tgaatggcta cctcaaatag aaaaatacgt taaagcccaa gaaaagcggg acggaatgga 3240
agtagagatc acgcaatacg acaaggattt acagcgtatt cagggagact ataacaagct 3300
cacagataaa aatcagggtt ttctcggttt atgggaaact aaagagcaaa aagcaaagaa 3360
aaaagagctt gaagatgaat acaaacatac agcagagcaa cggaacgcta aaagccaaga 3420
attagccgag tatagccaaa aaataaaagc atacgaacag aaaacgctag agccaatcaa 3480
cgagaagatt gccaaatatc aagctgacaa ccctgaaata aaaatgcgga gcttaggatt 3540
tgtgaaaaaa attaaggctc gaggggcata taaagcggct caagagcgaa tggagcgaga 3600
aaaacagcac caacaggaaa aacaacagag acatttagag cgagagagtg gtttgagctt 3660
gtagctaacg ccctacgcct acggcttcgg ttgttcaacc cttaaagaac tcgcaacaag 3720
ttgcaaattc tttaagggtt cgcaataaaa acaaccgcta aacatttctg cccagcggtt 3780
gaaaatttac ctattcacca ttacaatgat caagcaggaa atttttttga ttgccgtaaa 3840
tgtccgtata tctagttgag gcacaacccg ccaaagtcat tgccccaacc agaacggcga 3900
aagctaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccga ttcattaatg cagctggcac 3960
gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc 4020
actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt 4080
gtgagcggat aacaatttca cacgggaaac agctatgacc atgattacgc caagcttcct 4140
cagcgcatgc atccgggcag cagcgcatcg gctcgcacga ggtctgcgct tgaattgtgt 4200
tgtagaaaca caacgttttt gaaaaaataa gctattgttt tatatcaaaa tataatcatt 4260
tttaaaataa aggttgcggc atttatcaga tatttgttct gaaatgaaga cgtatcgggt 4320
gtttgcccga tgtttttagg tttttatcaa atttacaaaa ggaagcccat atgtttaaac 4380
gcagtgtgat tgcaatggct tgtatttttc ccctttcagc ctgtgggggc ggcggtggcg 4440
gatcgcccga tgtcaagtcg gcggacacgc cgtcaaaacc ggccgccccc gttgttgctg 4500
aaaatgccgg ggaaggggtg ctgccgaaag aaaagaaaga tgaggaggca gcgggcggtg 4560
cgccgcaagc cgatacgcag gacgcaaccg ccggagaagg cagccaagat atggcggcag 4620
tttcggcaga aaatacaggc aatggcggtg cggcaacaac ggacaacccc aaaaatgaag 4680
acgcgggggc gcaaaatgat atgccgcaaa atgccgccga atccgcaaat caaacaggga 4740
acaaccaacc cgccggttct tcagattccg cccccgcgtc aaaccctgcc cctgcgaatg 4800
gcggtagcga ttttggaagg acgaacgtgg gcaattctgt tgtgattgac ggaccgtcgc 4860
aaaatataac gttgacccac tgtaaaggcg atccttgtaa tggtgataat ttattggatg 4920
aagaagcacc gccaaaatca gaatttgaat cgttaagtga tgaagagaaa attaagaaat 4980
ataaaaaaga tggagaaaag tttactggtt tggttgctat aaaagttgaa aataatgggt 5040
tgaataaata taccattatt tatcaagctc agcctactcg ttctgcacgg tcgaggaggt 5100
cgcttccggc cgagattccg ctgattcccg tcaatcaggc cgatacgctg attgtggatg 5160
gggaagcggt cagcctgacg gggcattccg gcaatatctt cgcgcccgaa gggaattacc 5220
ggtatctgac ttacggggcg gaaaaattgc ccggcggatc gtatgccctc cgtgtgcaag 5280
gcgaaccggc aaaaggcgaa atgcttgcgg gcacggccgt gtacaacggc gaagtgctgc 5340
atttccacat ggaaaacggc cgtccgtacc cgtccggagg caggtttgcc gcaaaagtcg 5400
atttcggcag caaatctgtg gacggcatta tcgacagcag cgatgatttg cacatgggta 5460
cgcaaaaatt caaagccgcc atcgatggaa acggctttaa ggggacttgg acggaaaatg 5520
gcggcgggga tgtttccgga aggttttacg gcccggccgg cgaggaagtg gcgggaaaat 5580
acagctatcg cccgacagat gctgaaaagg gcggattcgg cgtgtttgcc ggcaaaaaag 5640
atcgggattg aaggcctcct gcaggactag tcggccgtac ctgtcagacc aagtttactc 5700
atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat 5760
cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc 5820
agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg 5880
ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct 5940
accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct 6000
tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct 6060
cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg 6120
gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc 6180
gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga 6240
gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg 6300
cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta 6360
tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 6420
ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 6480
ctggcctttt gctcacatgt gggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat agcttaagtg 6540
cggtcatctt cggtttccgt gtttcgtaaa gtctggaaac gcggaagtcc cctacgtgct 6600
gctgaagttg cccgcaacag agagtggaac caaccggtga taccacgata ctatgactga 6660
gagtcaacgc catgagcggc ctcatttctt attctgagtt acaacagtcc gcaccgctgc 6720
cggtagctcc ttccggtggg cgcggggcat gactatcgtc gccgcactta tgactgtctt 6780
ctttatcatg caactcgtag gacaggtgcc ggcagcgccc aacagtcccc cggccacggg 6840
gcctgccacc atacccacgc cgaaacaagc gccctgcacc attatgttcc ggatctgcat 6900
cgcaggatgc tgctggctac cctgtggaac acctacatct gtattaacga agcgctaacc 6960
gtttttatca ggctctggga ggcagaataa atgatcatat cgtcaattat tacctccacg 7020
gggagagcct gagcaaactg gcctcaggca tttgagaagc acacggtcac actgcttccg 7080
gtagtcaata aaccggtaaa ccagcaatag acataagcgg ctatttaacg accctgccct 7140
gaaccgacga ccgggtcgaa tttgctttcg aatttctgcc attcatccgc ttattatcac 7200
ttattcaggc gtagcaacca ggcgtttaag ggcaccaata actgccttaa aaaaattacg 7260
ccccgccctg ccactcatcg cagtactgtt gtaattcatt aagcattctg ccgacatgga 7320
agccatcaca aacggcatga tgaacctgaa tcgccagcgg catcagcacc ttgtcgcctt 7380
gcgtataata tttgcccatg gtgaaaacgg gggcgaagaa gttgtccata ttggccacgt 7440
ttaaatcaaa actggtgaaa ctcacccagg gattggctga gacgaaaaac atattctcaa 7500
taaacccttt agggaaatag gccaggtttt caccgtaaca cgccacatct tgcgaatata 7560
tgtgtagaaa ctgccggaaa tcgtcgtggt attcactcca gagcgatgaa aacgtttcag 7620
tttgctcatg gaaaacggtg taacaagggt gaacactatc ccatatcacc agctcaccgt 7680
ctttcattgc catacggaat tccggatgag cattcatcag gcgggcaaga atgtgaataa 7740
aggccggata aaacttgtgc ttatttttct ttacggtctt taaaaaggcc gtaatatcca 7800
gctgaacggt ctggttatag gtacattgag caactgactg aaatgcctca aaatgttctt 7860
tacgatgcca ttgggatata tcaacggtgg tatatccagt gatttttttc tccattttag 7920
cttccttagc tcctgaaaat ctcgataact caaaaaatac gcccggtagt gatcttattt 7980
cattatggtg aaagttggaa cctcttacgt gccgatcaac gtctcatttt cgccaaaagt 8040
tggcccaggg cttcccggta tcaaca 8066

Claims (19)

1.一种药物疫苗组合物，其包含多个细菌天然外膜囊泡(NOMV)，这些细菌天然外膜囊泡包含至少一种来自淋病奈瑟球菌的重组蛋白，其中该淋球菌重组蛋白是脂蛋白或被修饰为脂蛋白。
2.如权利要求1所述的药物疫苗组合物，其中通过消除该蛋白质中未暴露于表面的部分并向剩余的C-末端部分添加脂蛋白信号序列来修饰该淋球菌重组蛋白，其中该淋球菌重组蛋白展示在该细菌表面上，并且NOMV作为脂蛋白由该细菌产生。
3.如权利要求1或2所述的药物疫苗组合物，其中该至少一种淋球菌重组蛋白是GNA1220、MetQ、MetQSM或NHBA，或其衍生物或片段，或其组合。
4.如权利要求1所述的药物疫苗组合物，其中这些NOMV来源于脑膜炎奈瑟球菌。
5.如权利要求4所述的药物疫苗组合物，其中该脑膜炎球菌菌株是H44/76。
6.一种脑膜炎奈瑟球菌菌株，其包含编码至少一种来自淋病奈瑟球菌的重组蛋白的至少一种基因，其中该至少一种淋球菌重组蛋白是脂蛋白或被修饰为脂蛋白。
7.如权利要求6所述的脑膜炎球菌菌株，其中该至少一种淋球菌重组蛋白是GNA1220、MetQ、MetQSM或NHBA，或其衍生物或片段，或其组合。
8.如权利要求7所述的脑膜炎球菌菌株，其中该至少一种淋球菌重组蛋白由质粒中的转基因表达。
9.如权利要求7所述的脑膜炎球菌菌株，其中该至少一种淋球菌重组蛋白由插入该细菌基因组的转基因表达。
10.如权利要求6-9中任一项所述的脑膜炎球菌菌株，其中该脑膜炎球菌菌株是H44/76。
11.如权利要求10所述的脑膜炎球菌菌株，其中该脑膜炎球菌菌株H44/76不表达孔蛋白PorA。
12.如权利要求6-11中任一项所述的脑膜炎球菌菌株，其中编码该至少一种淋球菌重组蛋白的转基因的表达由强启动子序列驱动，该强启动子序列在脑膜炎奈瑟球菌中产生高速率的基因转录。
13.如权利要求12所述的脑膜炎球菌菌株，其中该强启动子包括PorA启动子或其衍生物。
14.如权利要求13所述的脑膜炎球菌菌株，其中该启动子包含图2-4所示的序列。
15.如权利要求6-14所述的脑膜炎球菌菌株，其中将编码该至少一种淋球菌重组蛋白的转基因插入该细菌基因组的lpxL1基因座中，其中该插入破坏酰基转移酶基因的表达，并且其中该破坏导致该细菌产生五酰化而非六酰化的脂寡糖。
16.如权利要求6-14中任一项所述的脑膜炎球菌菌株，其中将编码该至少一种淋球菌重组蛋白的转基因插入该细菌基因组的siaD-galE基因座中，并且其中该插入破坏荚膜多糖的表达和这些脂寡糖宿主抗原的唾液酸化。
17.如权利要求6-14中任一项所述的脑膜炎球菌菌株，其中将编码该至少一种淋球菌重组蛋白的转基因插入siaA基因座中。
18.如权利要求6-17中任一项所述的脑膜炎球菌菌株，其中将编码该至少一种淋球菌重组蛋白的转基因插入fhbp基因座(因子H结合蛋白)中。
19.如权利要求6-17中任一项所述的脑膜炎球菌菌株，其中将编码该至少一种淋球菌重组蛋白的转基因插入porA基因座中。
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