JP2023546665A - 淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ Ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）に対するワクチン接種のための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、リポタンパク質であるか、又はリポタンパク質であるように修飾される淋菌タンパク質を含有する細菌に由来する天然外膜小胞（ＮＯＭＶ）を含む、淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症の治療のためのワクチンのための組成物及びその使用方法を提供する。リポタンパク質であるか、又はリポタンパク質であるように修飾される淋菌タンパク質をコードする遺伝子を含有する髄膜炎菌株も提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／１０４，８１９号明細書の利益を主張するものであり、この仮特許出願の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。

連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記載
本発明は、米国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、米国立アレルギー感染症研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）によって与えられた助成金番号Ｒ０１ＡＩ０４６４６４の下で連邦政府の資金提供を受けて行われた。連邦政府は、本発明における一定の権利を有する。

配列表の援用
Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓオペレーティングシステムで測定した際に２４８キロバイトであり、２０２１年１０月２２日に作成された「ＯＭＶ０００２－４０１－ＰＣ＿ＳＴ２５」という名称のファイルに含まれる配列表は、本明細書と共に電子的に提出され、参照により本明細書に援用される。

本開示は、組み換え細菌及び細菌外膜小胞に由来するワクチンに関する。

淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（Ｎｇ）は、女性の子宮頸部、子宮及び卵管並びに男性及び女性の両方の尿道を含む生殖器官の粘膜表面に最も一般的にコロニー形成する偏性ヒト細菌性病原体である。しかしながら、直腸、鼻咽頭及び眼を含む他の組織も淋菌を保有し得る。この細菌は、粘膜分泌物中及び場合により好中球内において、個体間の直接の身体的接触によって最も一般的に伝播される。２５年を超える研究にもかかわらず、Ｎｇに対する認可されたワクチンはなく、Ｎｇは、世界中で毎年約８０００万の感染及び米国で５００，０００を超える症例を引き起こしている。米国におけるＮｇ疾患の症例数は、２０１３～２０１８年に６７％増加した。女性では、Ｎｇ感染は、子宮頸管炎又は骨盤内炎症性疾患として最も多く発生し、これは、不妊症につながり得る。感染した女性の約半分のみが、感染を自らに認識させる臨床症状を有し、これは、疾患のさらなる蔓延につながる。感染した母親から生まれた乳幼児は、新生児眼炎を発生し得、これは、治療されないと失明に至ることがある。男性では、ほとんどのＮｇ感染は、尿道炎として現れる。Ｎｇは、咽頭及び肛門直腸感染（特に男性間性交渉者で）も引き起こす。ある場合には、Ｎｇ感染は、菌血症を伴う播種性感染に発展して、関節炎、心内膜炎又は髄膜炎をもたらす。複数の抗生物質耐性は、Ｎｇ疾患の抗生物質治療により少ない選択肢、普遍的に耐性の病原体の脅威を残す。これらの側面の全ては、重大な世界規模の公衆衛生問題及び有効なＮｇワクチンの必要性を際立たせている。

Ｎｇ感染は、防御免疫を誘発せず、それにより複数回の再感染をもたらし得る。したがって、Ｎｇに対する成功するワクチン接種手法の開発は、自然感染より高い防御免疫を誘発する必要がある。これは、自然感染において免疫抗原性が低い防御抗原の免疫原性を増大すること及び／又は免疫シールドを提供するＮｇ抗原を除去することに依存するであろう。例えば、Ｎｇ還元修飾可能タンパク質（Ｒｍｐ）に対する抗体を生じた商業的セックスワーカーは、抗体を欠いたセックスワーカーより３．４倍Ｎｇ感染しやすかった。Ｒｍｐに対する抗体及びリポオリゴ糖（ＬＯＳ）変異体は、抗ＰｏｒＢによって媒介される機能活性を遮断することが示されている。しかしながら、Ｎｍ Ｒｍｐは、同様の遮断抗体を誘発しないようである。したがって、遮断Ｒｍｐ抗体を除去し、遮断抗体を誘発しないＬＯＳ変異体をもたらす遺伝子をノックアウトするために、ＮｍでＮｇ抗原を発現することが有利である。

Ｎｇによって用いられる様々な免疫抑制機構のため、死菌、外膜小胞（ＯＭＶ）又は線毛に基づくワクチン手法は、成功していない。アドヘシン複合体タンパク質（ＡＣＰ）、メチオニン結合タンパク質ＭｅｔＱ及びプロテオーム手法によって発見された他の抗原並びに切断ＬＯＳを含めて、いくつかのＮｇ組み換えタンパク質抗原の進歩があったが、これらの手法のいずれも広い保護効果を有さず、この重要な病原体の疾病負担を抑えるために新規なワクチン手法が必要とされる可能性がある。

細菌付着及び粘膜組織のコロニー形成を防止し得るワクチン誘発性抗体は、Ｎｍ及びＮｇの両方によって引き起こされる疾患の予防のために極めて重要である。Ｎｍ及びＮｇは、ヒトの系と特異的に相互作用する結合（ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ４６）、浸潤及び免疫シールドのための機構を使用する偏性ヒト病原体である。ワクチンによって誘発される抗体（例えば、ＩｇＡ及びＩｇＧ）は、感染の最初期段階にＮｍ及びＮｇと直接接触する上皮細胞を包む分泌物中に存在し、コロニー形成及び浸潤を防止し得る。

付着及び免疫シールドの機構に対する抗体を誘発するワクチンは、感染の初期段階の個体をより進行した段階から保護し、個体間の伝播を抑えることによってワクチン未接種者を保護し得る。最もコスト効果が高く、広く使用されているワクチンは、個体及び社会の保護の両方を提供する。

ＯＭＶａｘは、天然立体配座で免疫系にタンパク質抗原を提示するための、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（Ｎｍ）天然外膜小胞（ＮＯＭＶ）に基づく、用途の広いワクチンプラットフォームを開発した。天然外膜小胞（ＮＯＭＶ）は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（Ｎｍ）細菌から天然にブレブ形成される。以前には、ワクチン株は、（ａ）通常、低い存在度で存在するＨ因子結合タンパク質（ＦＨｂｐ）を過剰発現し、（ｂ）ＦＨ結合を引き起こす相互作用を遮断する抗体応答を増大するために、宿主Ｈ因子への低い結合を有する突然変異体ＦＨｂｐを発現し、（ｃ）反応源性を低下させるために通常使用され、また潜在的防御抗原の除去又は改変をもたらす洗剤処理なしにＮＯＭＶの使用を可能にする弱毒化したエンドトキシンを有するように遺伝子組み換えされていた。ＬｐｘＬ１（ＬｐｘＬ１ ＫＯ）をノックアウトすることから得られるペンタアシル化リポオリゴ糖（ＬＯＳ）を有するＮＯＭＶ－ＦＨｂｐは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）内のサイトカイン応答を低下させ、これは、何万ものヒト対象に安全に投与されている洗剤抽出ＯＭＶワクチンによって誘発されたものと同様であるか又はそれより低かった。ＮＯＭＶ－ＦＨｂｐワクチンの安全性をさらに高めるために、ワクチンを調製するために使用される菌株は、グループＢ莢膜多糖及びＬＯＳの誘導体（これらは、類似の構造を有するヒトグリカンと交差反応することが知られている）を含む他の望ましくない抗原の発現をなくすさらなる遺伝子欠失を組み込む。

ＮＯＭＶで提示される抗原の免疫原性は、同等の量の組み換えタンパク質単独と比べて著しく増加される。しかしながら、最も有効な抗体応答の生成は、高い転写率を生じるように操作されたプロモーターを使用すること、細菌ゲノムに多重コピーを挿入すること及びマルチコピープラスミドによる形質転換によって達成された閾値レベルの発現を必要とする。

最も重要なエピトープが宿主タンパク質結合によってマスクされ、したがって免疫認識に利用できないことがあるため、宿主タンパク質、脂質又はグリカンに特異的に結合する抗原は、結合が起こる抗原の表面に対する抗体応答を刺激することができない場合がある。宿主分子に結合する抗原は、典型的には、発症機序で重要な役割を果たすため、ワクチンのために特に興味深い。

ヘキサアシル化リポオリゴ糖を含有する髄膜炎菌ＯＭＶは、炎症反応を生じる。反応源性は、洗剤抽出によって低下され得る。しかしながら、洗剤処理は、リポタンパク質抗原の損失及びタンパク質構造の改変をもたらし得る。ＮＯＭＶを生成するために使用されるＮｍ株は、ｌｐｘＬ１遺伝子座が破壊されており、ヘキサアシル化ＬＯＳと比べてペンタアシル化ＬＯＳの生成をもたらし、これは、弱毒化されたエンドトキシン活性をもたらす。

ＮＯＭＶプラットフォームは、抗体応答を高めるアジュバント特性も有する。概して、ＮＯＭＶベースのワクチンは、対応する組み換えタンパク質より広い反応性で抗体のより高い力価を誘発し、より少ないタンパク質が、有効な防御抗体応答を提供するために必要とされ得るため、忍容性がより良好であり得る。

Ｎｇでも高度に保存されたＮｍタンパク質のいくつかがＮｇワクチンのための抗原として提案されている。例えば、ＧＮＡ１２２０（９９％同一；ＮＭＢ１２２０及びＮＧＯ０７８８としても知られている）は、タンパク質のストマチン様ファミリーに関連している。このファミリーの個々のメンバーは、サブファミリー内の配列類似性に応じていくつかの名称で知られている。名称は、パラスリピン又はスリピン－２、ストマチン、プロヒビチン、フロチリン及びＨｆｌＫ／Ｃを含む。ストマチン様タンパク質は、３つ全ての生命ドメインで同定されている古い起源の一回膜貫通型オリゴマー膜タンパク質である。それらの機能的役割は、いずれの場合も完全には理解されていないが、それらは、主に膜ドメインに限局し；多くの場合、それらは、イオンチャネル活性を調節することが示されている。これらのファミリーに共通している保存ドメインは、バンド７ドメインとも呼ばれている。このファミリーの個々のタンパク質は、集合して膜マイクロドメインを形成し得、これは、次に、多タンパク質複合体を動員し得る。ストマチン様タンパク質のこのサブグループは、大部分が特性決定されていないままである。それは、ヒトストマチン様タンパク質－２を含み、これが上方制御され、食道扁平上皮細胞癌、子宮内膜腺癌、乳癌及び神経膠腫を含むいくつかのタイプの癌の進行及び発生に関与する。ＧＮＡ１２２０は、ヒト血清におけるＮｇ生存を増加させる際に役割を果たすようであり、非付着性から付着性への移行を開始するためのセンサーとして表面コロニー形成で重要な役割を果たすものと考えられる。ＧＮＡ１２２０は、有望な髄膜炎菌ワクチン候補として同定された。Ｎｍに対する組み換えＧＮＡ１２２０によって誘発される血清殺菌活性力価は、ゲノムシークエンシングによって同定される他のタンパク質と比較して比較的低く、ワクチン抗原としてのＧＮＡ１２２０の調査は、それが組み換えタンパク質として生成するのが難しかったため、その後、放棄された。

ＮｍとＮｇとの間で９７％同一であるＭｅｔＱ（ＮｍでＧＮＡ１９４６又はＮＭＢ１９４６及びＮｇでＮＧＯ２１３９としても知られている）も潜在的なＮｇワクチン候補として同定されている。ＭｅｔＱは、子宮頸部上皮細胞及び単球へのメチオニン輸送及びＮｇ付着に関与する細菌表面における多機能リポタンパク質である。ＭｅｔＱは、ヒト血清中のＮｇ生存のためにも重要である。ＭｅｔＱは、感染を模倣する増殖条件において構成的に発現される。最近、ＣｐＧヌクレオチドと共に配合された組み換えＭｅｔＱは、マウスにおける高い血清抗体力価及び分泌型ＩｇＡを誘発し、淋菌感染のエストロゲン処置雌マウスモデルでＮｇ膣コロニー形成の時間を減少させたことが報告された。それらの過去の研究は、リポタンパク質としてＭｅｔＱに言及する一方、結合された脂質なしに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生される組み換えタンパク質を実際に使用した。他方で、本開示は、組み換えＭｅｔＱ構築物を使用し、これは、本明細書に記載されるＮｍで産生されるリポタンパク質である。ある実施形態では、ＭｅｔＱの突然変異体も本開示に従って使用され得る。例えば、本明細書に記載されるように、本開示のために有用なＭｅｔＱの新規な突然変異体は、本明細書でＭｅｔＱＳＭと呼ばれるＭｅｔＱの天然突然変異体であり得る。ＭｅｔＱ及びＭｅｔＱＳＭは、淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症の治療のためのワクチンとして有用であり得、なぜなら、ＭｅｔＱは、本明細書に記載されるように、淋菌と髄膜炎菌との間で高度に保存されるためである。

ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌ）ヘパリン結合抗原（ＮＨＢＡ、ＮＧＯ１２２０及びＧＮＡ２１３２としても知られている）は、ヘパリン及びコンドロイチン硫酸に結合するリポタンパク質である。ＮＨＢＡは、淋菌株（＞９３％）間で高度に保存されるが、髄膜炎菌ＮＨＢＡとの相同性が低い（約６７％～８０％）。ＮＨＢＡの機能は、不明であるが、淋菌ＮＨＢＡは、Ｎｇコロニー形成において役割を果たすようである。

ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ及び／又はＮＨＢＡのワクチン免疫原性試験は、ＮＯＭＶで発現されない精製された組み換えタンパク質を使用した。本明細書に記載されるように、防御抗体応答は、ＮＯＭＶにおける、ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ及び／又はＮＨＢＡ並びにそれらの誘導体の提示によって著しく改善されるか、又は両方のタンパク質を含有するＮＯＭＶの混合物は、マウスで等しい又はより高い抗体力価を生じるためにより少ないタンパク質を必要とし、Ｎｇコロニー形成を防止する抗体を誘発するのに有利であり得る両方のタンパク質の誘導体を同定し、それにより淋菌の取得及び伝播を防止する。

したがって、一態様では、本開示は、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）からの少なくとも１つの組み換えタンパク質を含む複数の細菌天然外膜小胞（ＮＯＭＶ）を含む医薬ワクチン組成物であって、淋菌組み換えタンパク質は、リポタンパク質であるか、又はリポタンパク質であるように修飾される、医薬ワクチン組成物を提供する。一実施形態では、淋菌組み換えタンパク質は、表面が露出されていないタンパク質の部分を除去し、且つリポタンパク質シグナル配列を残りのＣ末端部分に付加することによって修飾され、淋菌組み換えタンパク質は、細菌の表面に提示され、及びＮＯＭＶは、リポタンパク質として細菌によって産生される。別の実施形態では、少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質は、ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ若しくはＮＨＢＡ又はそれらの誘導体若しくは断片或いはそれらの組合せである。別の態様では、ＮＯＭＶは、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する。別の実施形態では、髄膜炎菌株は、Ｈ４４／７６である。

別の態様では、本開示は、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）からの少なくとも１つの組み換えタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の菌株であって、少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質は、リポタンパク質であるか、又はリポタンパク質であるように修飾される、菌株を提供する。一実施形態では、少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質は、ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ若しくはＮＨＢＡ又はそれらの誘導体若しくは断片或いはそれらの組合せである。別の実施形態では、少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質は、プラスミド中の導入遺伝子から発現される。別の態様では、少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質は、細菌ゲノム中に挿入された導入遺伝子から発現される。別の態様では、髄膜炎菌株は、Ｈ４４／７６である。別の実施形態では、髄膜炎菌株Ｈ４４／７６は、ポーリンＰｏｒＡを発現しない。別の実施形態では、少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質をコードする導入遺伝子の発現は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）中の高い遺伝子転写率を生じる強力なプロモーター配列によって駆動される。別の実施形態では、強力なプロモーターは、ＰｏｒＡプロモーター又はその誘導体を含む。別の実施形態では、プロモーターは、図２～４に示される配列を含む。別の実施形態では、少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質をコードする導入遺伝子は、細菌ゲノムのｌｐｘＬ１遺伝子座中に挿入され、挿入は、アシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を撹乱し、撹乱は、ペンタアシル化されており、且つヘキサアシル化されていないリポオリゴ糖を細菌に生成させる。別の実施形態では、少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質をコードする導入遺伝子は、細菌ゲノムのｓｉａＤ－ｇａｌＥ遺伝子座中に挿入され、挿入は、莢膜多糖の発現及びリポオリゴ糖宿主抗原のシアリル化を撹乱する。別の実施形態では、少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質をコードする導入遺伝子は、ｓｉａＡ遺伝子座中に挿入される。別の実施形態では、少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質をコードする導入遺伝子は、ｆｈｂｐ遺伝子座（Ｈ因子結合タンパク質）中に挿入される。別の実施形態では、少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質をコードする導入遺伝子は、ｐｏｒＡ遺伝子座中に挿入される。

ある実施形態では、本開示は、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）からの少なくとも１つの組み換えタンパク質を含む複数の細菌天然外膜小胞（ＮＯＭＶ）を含む医薬ワクチン組成物であって、淋菌組み換えタンパク質は、リポタンパク質であるか、又はリポタンパク質であるように修飾される、医薬ワクチン組成物を提供する。

ある実施形態では、淋菌組み換えタンパク質は、表面が露出されていないタンパク質の部分を除去し、且つリポタンパク質シグナル配列を残りのＣ末端部分に付加することによって修飾され、淋菌組み換えタンパク質は、細菌の表面に提示され、及びＮＯＭＶは、リポタンパク質として細菌によって産生される。

ある実施形態では、少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質は、ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ若しくはＮＨＢＡ又はそれらの誘導体若しくは断片或いはそれらの組合せである。

ある実施形態では、ＮＯＭＶは、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する。

ある実施形態では、髄膜炎菌株は、Ｈ４４／７６である。

ある実施形態では、本開示は、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）からの少なくとも１つの組み換えタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の菌株であって、少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質は、リポタンパク質であるか、又はリポタンパク質であるように修飾される、菌株を提供する。

ある実施形態では、少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質は、ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ若しくはＮＨＢＡ又はそれらの誘導体若しくは断片或いはそれらの組合せである。

ある実施形態では、少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質は、プラスミド中の導入遺伝子から発現される。

ある実施形態では、少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質は、細菌ゲノム中に挿入された導入遺伝子から発現される。

ある実施形態では、髄膜炎菌株は、Ｈ４４／７６である。

ある実施形態では、髄膜炎菌株Ｈ４４／７６は、ポーリンＰｏｒＡを発現しない。

ある実施形態では、少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質をコードする導入遺伝子の発現は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）中の高い遺伝子転写率を生じる強力なプロモーター配列によって駆動される。

ある実施形態では、強力なプロモーターは、ＰｏｒＡプロモーター又はその誘導体を含む。

ある実施形態では、プロモーターは、図２～４に示される配列を含む。

ある実施形態では、少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質をコードする導入遺伝子は、細菌ゲノムのｌｐｘＬ１遺伝子座中に挿入され、挿入は、アシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を撹乱し、撹乱は、ペンタアシル化されており、且つヘキサアシル化されていないリポオリゴ糖を細菌に生成させる。

ある実施形態では、少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質をコードする導入遺伝子は、細菌ゲノムのｓｉａＤ－ｇａｌＥ遺伝子座中に挿入され、挿入は、莢膜多糖の発現及びリポオリゴ糖宿主抗原のシアリル化を撹乱する。

ある実施形態では、少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質をコードする導入遺伝子は、ｓｉａＡ遺伝子座中に挿入される。

ある実施形態では、少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質をコードする導入遺伝子は、ｆｈｂｐ遺伝子座中に挿入される。

ある実施形態では、少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質をコードする導入遺伝子は、ｐｏｒＡ遺伝子座中に挿入される。

本開示のこれらの及び他の実施形態が以下に詳細に説明される。

配列の簡単な説明
配列番号１－ＭｅｔＱタンパク質の配列。
配列番号２－ＭｅｔＱのＤＮＡ配列。
配列番号３－ＭｅｔＱＳＭタンパク質の配列。
配列番号４－ＭｅｔＱＳＭのＤＮＡ配列。
配列番号５－ＧＮＡ１２２０タンパク質の配列。
配列番号６－ＧＮＡ１２２０のＤＮＡ配列。
配列番号７－ＧＮＡ１２２０αβαタンパク質の配列。
配列番号８－ＧＮＡ１２２０＿ｈｅｌｉｘ－αβαのＤＮＡ配列。
配列番号９－ＭｅｔＱ＿ｎｅｉｓｓｅｒｉａフォワードプライマーの配列。
配列番号１０－ＭｅｔＱ＿ＳｂｆＩリバースプライマーの配列。
配列番号１１－ＭｅｔＱ＿ｎｅｉｓｓｅｒｉａリバースプライマーの配列。
配列番号１２－ＭｅｔＱ＿ＳｐｅＩリバースプライマーの配列。
配列番号１３－ＧＮＡ１２２０＿ＳｔｕＩリバースプライマーの配列。
配列番号１４－Ｂｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔプラスミド（ＦＨｂｐ ＫＯ＋ＭｅｔＱ）の配列。
配列番号１５－ＭｅｔＱ ｐＢＳ下流フォワードプライマーの配列。
配列番号１６－ＲＢＤ ｐＢＳ下流リバースプライマーの配列。
配列番号１７－ＦＨｂｐ上流フォワードプライマーの配列。
配列番号１８－ＦＨｂｐ上流リバースプライマーの配列。
配列番号１９－ｐＧＥＭプラスミド（Ｃａｐｓｕｌｅ ＫＯ＋ＭｅｔＱ）の配列。
配列番号２０－Ｃａｐｓｕｌｅ ＫＯ ＧａｌＥフォワードプライマーの配列。
配列番号２１－Ｃａｐｓｕｌｅ ＫＯ上流ＭｅｔＱリバースプライマーの配列。
配列番号２２－Ｃａｐｓｕｌｅ ＫＯ Ｓｐｃ下流フォワードプライマーの配列。
配列番号２３－Ｃａｐｓｕｌｅ ＫＯ ＳｉａＤリバースプライマーの配列。
配列番号２４－ｐＵＣ１８プラスミド（ｌｐｘＬ１ ＫＯ＋ＭｅｔＱ）の配列。
配列番号２５－Ｌｐｘｌ１上流フォワードプライマーの配列。
配列番号２６－Ｌｐｘｌ１上流リバースプライマーの配列。
配列番号２７－Ｌｐｘｌ１下流リバースプライマーの配列。
配列番号２８－Ｂｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔプラスミド（ＦＨｂｐ ＫＯ＋ＧＮＡ１２２０）の配列。
配列番号２９－ＧＮＡ１２２０ ｐＢＳ下流フォワードプライマーの配列。
配列番号３０－ｐＧＥＭプラスミド（Ｃａｐｓｕｌｅ ＫＯ＋ＧＮＡ１２２０）の配列。
配列番号３１－Ｃａｐｓｕｌｅ ＫＯ上流ＧＮＡ１２２０リバースプライマーの配列。
配列番号３２－ｐＵＣ１８プラスミド（ｌｐｘＬ１ ＫＯ＋ＧＮＡ１２２０）の配列。
配列番号３３－ｐＦＰ１２－ＭｅｔＱプラスミドの配列。
配列番号３４－ｐＦＰ１２－ＭｅｔＱＳＭプラスミドの配列。
配列番号３５－ｐＦＰ１２－ＧＮＡ１２２０プラスミドの配列（図２に示される）。
配列番号３６－ｐＦＰ１２－ＧＮＡ１２２０＿ｈｅｌｉｘ－αβαプラスミドの配列。
配列番号３７－ＮＨＢＡタンパク質の配列。
配列番号３８－ｐＦＰ１２－ＮＨＢＡプラスミドの配列。
配列番号３９－ｐＦＰ１２－ＮＨＢＡプラスミドの配列。
配列番号４０－ｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＭｅｔＱプラスミドの配列（図１２に対応する）。
配列番号４１－ｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＭｅｔＱＳＭプラスミドの配列（図１３に対応する）。
配列番号４２－ｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＧＮＡ１２２０プラスミドの配列（図１４に対応する）。
配列番号４３－ｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＮＨｂａプラスミドの配列（図１５に対応する）。
配列番号４４－ｐＵＣ１８－ＬｐｘＬ１ＫＯ－ＭｅｔＱプラスミドの配列（図１６に対応する）。
配列番号４５－ｐＵＣ１８－ＬｐｘＬ１ＫＯ－ＭｅｔＱＳＭプラスミドの配列（図１７に対応する）。
配列番号４６－ｐＵＣ１８－ＬｐｘＬ１ＫＯ－ＧＮＡ１２２０プラスミドの配列（図１８に対応する）。
配列番号４７－ｐＵＣ１８－ＬｐｘＬ１ＫＯ－ＮＨｂａプラスミドの配列（図１９に対応する）。
配列番号４８－ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥＫＯ－ＭｅｔＱプラスミドの配列（図２０に対応する）。
配列番号４９－ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥＫＯ－ＭｅｔＱＳＭプラスミドの配列（図２１に対応する）。
配列番号５０－ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥＫＯ－ＧＮＡ１２２０プラスミドの配列（図２２に対応する）。
配列番号５１－ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥＫＯ－ＮＨｂａプラスミドの配列（図２３に対応する）。
配列番号５２－ｐＦＰ１２－ＭｅｔＱプラスミドの配列（図２４に対応する）。
配列番号５３－ｐＦＰ１２－ＭｅｔＱＳＭプラスミドの配列（図２５に対応する）。
配列番号５４－ｐＦＰ１２－ＧＮＡ１２２０プラスミドの配列（図２６に対応する）。
配列番号５５－ｐＦＰ１２－ＧＮＡ１２２０αβαプラスミドの配列（図２７に対応する）。
配列番号５６－ｐＦＰ１２－ＮＨｂａプラスミドの配列（図２８に対応する）。

それぞれ抗ｒＭｅｔＱ又は抗ＮＨＢＡポリクローナル抗体によるフローサイトメトリーによって測定される、野生型株（灰色の陰影付きのヒストグラム）と比較した、実施例１に記載されるｓｉａＤ－ｇａｌＥ、ｌｐｘＬ１及びｆｈｂｐ遺伝子座中に挿入されたＭｅｔＱ又はＭｅｔＱＳＭの３つの染色体コピー（破線ヒストグラム）及び３つのコピー及びマルチコピープラスミド（黒色実線ヒストグラム）；並びに野生型ＮＨＢＡ発現（実線ヒストグラム）と比較した、不活性化されたｓｉａＤ－ｇａｌＥ、ｌｐｘＬ１及びｆｈｂｐ遺伝子座を有する菌株で過剰発現されたＮＨＢＡ及びＮｇ ＮＨＢＡを有するマルチコピープラスミド（破線ヒストグラム）によるＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ及びＮＨＢＡの過剰発現を示す。 ｐＦＰ１２－ＧＮＡ１２２０ＷＴプラスミドを示す。 ｐＦＰ１２－ＧＮＡ１２２０＿ｈｅｌｉｘ－αβαプラスミドを示す。 ｐＦＰ１２－ＭｅｔＱＷＴプラスミドを示す。 １つの染色体コピー（両方の下側の線）又は３つのコピー＋プラスミド当たり１つのコピーを有するｐＦＰ１２プラスミド（両方の上側の線）と共に、組み換えＭｅｔＱを含有するＮＯＭＶに結合するマウス（左）及びウサギ（右）からの抗ＭｅｔＱポリクローナル抗血清のＥＬＩＳＡからの結果を示す。この実験では、プレートに被覆されるＮＯＭＶは、１０μｇ／ｍｌで一定であり、ポリクローナル抗体は、図に示されるように連続希釈された。 １０μｇの組み換えＭｅｔＱ又はアルミニウムアジュバント（ミョウバン）単独で免疫化されたマウスと比較した、過剰発現されたＭｅｔＱ又はＭｅｔＱＳＭと共に３つの用量の１０μｇ、５μｇ又は２．５μｇのＮＯＭＶで免疫化されたマウスからの個々の血清中のＩｇＧ力価を示す。 フローサイトメトリーによる、淋菌株ＦＡ１０９０及びＭＳ１１に対する、過剰発現されたＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ、ＧＮＡ１２２０又はＮＨＢＡを含有する組み換えＭｅｔＱ（ｒＭｅｔＱ）、ｒＮＨＢＡ（最も右側のパネル中の実線）又はＮＯＭＶによる免役化によって生成されたポリクローナル抗体の１：２００希釈の結合を示す。 １０μｇの組み換えＭｅｔＱ（ｒＭｅｔＱ）又は組み換えＮＨＢＡ（ｒＮＨＢＡ）と比較した、トリプルノックアウト親株からの又は過剰発現されたＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ、ＧＮＡ１２２０若しくはＮＨＢＡを含有する５μｇのＮＯＭＶでマウスを免役化することによって生成されたポリクローナル抗体の血清殺菌活性（ＳＢＡ）力価を示す。 ＭＥ１８０ヒト子宮頸部細胞の２つの栄養条件で増殖された淋菌株ＦＡ１０９０及びＭＳ１１によるコロニー形成に対する、ｒＭｅｔＱ、ｒＮＨＢＡ、ＮＯＭＶ－ＭｅｔＱ、ＮＯＭＶ－ＭｅｔＱＳＭ、ＮＯＭＶ－ＧＮＡ１２２０又はＮＯＭＶ－ＮＨＢＡでマウスを免役化することによって生成されたポリクローナル抗体の阻害効果を示す。 ｆｈｂｐ、ｓｉａＤ－ｇａｌＥ及びｌｐｘＬ１遺伝子がノックアウトされた同じ株から作製された、２つの用量の１０μｇの組み換えＭｅｔＱ又は５μｇのＮＯＭＶ－ＭｅｔＱ、ＮＯＭＶ－ＭｅｔＱＳＭ、ＮＯＭＶ－ＧＮＡ１２２０又はＮＯＭＶで免疫化されたマウスからの抗血清（１：２００希釈）を有する髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）血清型群Ｂ株ＭＤ１２４４に対する抗体結合をフローサイトメトリーによって示す。 ｆｈｂｐ、ｓｉａＤ－ｇａｌＥ及びｌｐｘＬ１遺伝子がノックアウトされた同じ株から作製された、２つの用量の１０μｇの組み換えＭｅｔＱ又は５μｇのＮＯＭＶ－ＭｅｔＱ、ＮＯＭＶ－ＭｅｔＱＳＭ、ＮＯＭＶ－ＧＮＡ１２２０又はＮＯＭＶで免疫化されたマウスからの抗血清の血清殺菌活性（ＳＢＡ）を示す。 ｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＭｅｔＱプラスミド（配列番号４０に対応する）を示す。 ｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＭｅｔＱＳＭプラスミド（配列番号４１に対応する）を示す。 ｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＧＮＡ１２２０プラスミド（配列番号４２に対応する）を示す。 ｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＮＨｂａプラスミド（配列番号４３に対応する）を示す。 ｐＵＣ１８－ＬｐｘＬ１ＫＯ－ＭｅｔＱプラスミド（配列番号４４に対応する）を示す。 ｐＵＣ１８－ＬｐｘＬ１ＫＯ－ＭｅｔＱＳＭプラスミド（配列番号４５に対応する）を示す。 ｐＵＣ１８－ＬｐｘＬ１ＫＯ－ＧＮＡ１２２０プラスミド（配列番号４６に対応する）を示す。 ｐＵＣ１８－ＬｐｘＬ１ＫＯ－ＮＨｂａプラスミド（配列番号４７に対応する）を示す。 ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥＫＯ－ＭｅｔＱプラスミド（配列番号４８に対応する）を示す。 ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥＫＯ－ＭｅｔＱＳＭプラスミド（配列番号４９に対応する）を示す。 ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥＫＯ－ＧＮＡ１２２０プラスミド（配列番号５０に対応する）を示す。 ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥＫＯ－ＮＨｂａプラスミド（配列番号５１に対応する）を示す。 ｐＦＰ１２－ＭｅｔＱプラスミド（配列番号５２に対応する）を示す。 ｐＦＰ１２－ＭｅｔＱＳＭプラスミド（配列番号５３に対応する）を示す。 ｐＦＰ１２－ＧＮＡ１２２０プラスミド（配列番号５４に対応する）を示す。 ｐＦＰ１２－ＧＮＡ１２２０αβαプラスミド（配列番号５５に対応する）を示す。 ｐＦＰ１２－ＮＨｂａプラスミド（配列番号５６に対応する）。

概説
本開示は、（ａ）マルチコピープラスミドにおける新規なプロモーターを有する遺伝子の過剰発現並びにＦＨｂｐ、莢膜多糖及びＬＯＳシアリル化をノックアウトするための、染色体におけるさらなる遺伝子の挿入、（ｂ）髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（Ｎｍ）ＮＯＭＶの表面にタンパク質の部分を提示すること、（ｃ）莢膜多糖と共に、免疫系への淋菌タンパク質のアクセス性を低下させ得る免疫優勢抗原であるポーリンＰｏｒＡを欠く細菌株中でＮＯＭＶを生成すること、及び（ｄ）髄膜炎菌ＮＯＭＶ中の淋菌における通常少ない抗原である保存された淋菌タンパク質を高度に発現することによる、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（Ｎｇ）又は髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（Ｎｍ）に対する抗体の強化された保護効果を記載する。十分に解明されているわけではないが、上述されるＲｍｐ及びＬＯＳ誘導体の免疫シールド機構にある程度依存する可能性が高いという理由のため、淋菌ＮＯＭＶで発現される同じ抗原は、免疫原性が低く、Ｎｇによって引き起こされる疾患から保護する抗体を誘発しない。しかしながら、Ｎｇ ＮＯＭＶによって誘発されるＲｍｐ及びＬＯＳ遮断抗体は、上述されるｇａｌＥ遺伝子座をノックアウトすることによって修飾されたＮｍ ＮＯＭＶによって誘発されない。

髄膜炎菌ポーリンタンパク質ＰｏｒＡは、Ｎｍ中で最も高度に発現されるタンパク質の１つであり、抗ＰｏｒＡ抗体の高い力価を誘発する。しかしながら、遺伝子の発現を駆動するＰｏｒＡプロモーターは、複製中のポリＧトラクトにおける塩基の挿入又は欠失が、増加又は低下した発現をもたらし得るように位相可変である。本明細書における本発明者らは、Ｎｍ中のＰｏｒＡ遺伝子の上流の領域が６つの潜在的なプロモーターを含有し、その１つのみがポリＧトラクトを含有することを発見した。この分析に基づいて、ポリＧトラクトを含有する配列を除去し、それにより高いレベルの転写を駆動する能力を保持しながら位相変化の可能性をなくすことにより、ＰｏｒＡプロモーターを操作した。操作されたプロモーター構築物を用いて、染色体及びマルチコピープラスミドに挿入された淋菌遺伝子の発現を駆動した。プロモーター遺伝子構築物を、莢膜多糖の生成及びＬＯＳ、ｆｈｂｐ及びｌｐｘＬ１のシアリル化をなくすためにｓｉａＤ及びｇａｌＥ遺伝子を含む領域並びに染色体外プラスミドに挿入した。ＰｏｒＡ発現を欠くＮｍ株Ｈ４４／７６の変異体を、淋菌抗原のアクセス性を高め、Ｎｇからの保護で有用でない免疫優勢抗原との可能な免疫学的競合をなくすように選択した。

ＮＯＭＶの表面に提示されるタンパク質は、１つ以上の膜貫通セグメントを有する一体型の膜タンパク質であるか、又は結合された脂肪酸が膜へのアンカーとしての役割を果たすリポタンパク質を産生するタンパク質のアミノ末端への脂肪酸の結合によって修飾される。リポタンパク質は、プレプロリポタンパク質として最初に翻訳され、これは、分泌タンパク質のシグナルペプチドの典型的な特徴を有する約２０のアミノ酸のアミノ末端シグナルペプチドを有する。コンセンサスアミノ酸配列［ＬＶＩ］［ＡＳＴＶＩ］［ＧＡＳ］Ｃを有する、リポボックスと呼ばれる、シグナルペプチドの保存された配列は、不可欠なシステイン残基の側鎖におけるチオール基へのジアシルグリセロール部分の共有結合によって修飾される。この修飾は、酵素リポタンパク質ジアシルグリセリルトランスフェラーゼ（Ｌｇｔ）によって触媒され、タンパク質へのチオエステル結合によって連結されたジアシルグリセロール部分からなるプロリポタンパク質が得られる。脂質化後、リポタンパク質シグナルペプチダーゼ（Ｌｓｐ又はＳＰａｓｅ ＩＩ）は、脂質付加プロリポタンパク質のシグナル配列を切断することに関与し、リポボックスのシステインを新たなアミノ末端残基として残す。髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）などのグラム陰性菌では、切断されたプロリポタンパク質は、リポタンパク質Ｎ－アシルトランスフェラーゼ（Ｌｎｔ）によるＮ末端システイン残基へのアミド結合されたアシル基の結合によってさらなる修飾を受ける。ジアシルグリセリル基及びアミノ末端アシル基は、膜リン脂質に由来し、膜へのリポタンパク質の確実な固定を提供する。

宿主タンパク質、脂質又はグリカンに特異的に結合する抗原は、結合が起こる抗原の表面に対する抗体応答を刺激することができないことがあるが、これは、それらの抗原がそれぞれの宿主タンパク質への結合によってマスクされ、したがって抗原特異的Ｂ細胞における受容体に利用できないためである。宿主分子に結合する抗原は、典型的には、発症機序で重要な役割を果たし、したがって免疫選択圧にかかわらず、保存される可能性が高いため、ワクチンのために特に興味深い。

淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（Ｎｇ）タンパク質ＧＮＡ１２２０
ＧＮＡ１２２０の構造モデリングは、以下の図に示される４つの構造ドメインを同定した。それらは、Ｎ末端における膜アンカーセグメント、環構造を形成することが知られているストマチン様ドメイン、伸長されたらせんセグメント及びＣ末端におけるα－β－αドメイン（αβα）を含む。らせん及びαβαドメインは、細菌の外表面及び防御抗体の標的上にある可能性が高いため、特に重要である。本発明者らは、らせんに融合されたＦＨｂｐ ＩＤ９のリポタンパク質シグナル配列及びＧＮＡ１２２０のαβαドメインから構成されるＧＮＡ１２２０のリポタンパク質変異体を構築し、らせんドメインは、ストマチン様ドメインのＣ末端における可能なタンパク質分解切断部位（ＲＫ）の直後に開始する。

淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（Ｎｇ）タンパク質ＭｅｔＱ
本明細書でＭｅｔＱＳＭと呼ばれるＭｅｔＱの天然突然変異体は、タンパク質の開放構造を安定させることによってメチオニン結合を防止する。Ｎｇによって発現される野生型タンパク質の開放形態に結合する開放構造中にロックされたＭｅｔＱワクチン抗原によって誘発される抗体は、メチオニンに結合することができないか、又はメチオニン結合に関連する構造変化を起こすことができず、それにより、ＭｅｔＱは、血清及び細菌付着に対する耐性に関連する複数の機能を媒介することができなくなる。

淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（Ｎｇ）タンパク質ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌ）ヘパリン結合抗原（ＮＨＢＡ）
ＮＨＢＡは、ヘパリン及びコンドロイチン硫酸に結合し、Ｎｇ中で高度に保存される（９７％～１００％の同一性）リポタンパク質であり、宿主上皮細胞への淋菌の付着に関与し得る。

天然外膜小胞（ＮＯＭＶ）及びそのワクチン
ある実施形態では、ＮＯＭＶは、本明細書に記載される患者又は対象における淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症を治療又は予防するためのワクチンとして使用され得る。ＮＯＭＶは、淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症の症状を生じている患者又は対象に治療有効用量又は量で投与され得るか、又は淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症の検査で陽性となった無症状の患者に治療有効用量又は量で投与され得る。

髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜は、主にリポオリゴ糖（ＬＯＳ）、外膜タンパク質（ＯＭＰ）及びリン脂質から構成され、通常、細胞壁に非常に緩く結合される。細菌の静止増殖中、外膜の小胞又はブレブが周囲媒体中に放出される。これらの天然外膜小胞（ＮＯＭＶ）は、関連するタンパク質及びＬＯＳの全てを含むが、ペリプラスム及び細胞質成分を欠いた無傷の外膜からなる。本明細書に記載されるように、本開示の本発明者らは、ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、突然変異体タンパク質ＭｅｔＱＳＭ及び／又はＮＨＢＡなど、淋菌タンパク質を発現するように髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（Ｎｍ）の菌株を操作した。本明細書に記載されるように、ＮＯＭＶワクチンは、治療有効量又は予防的に有効な量で患者に投与される場合、淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症並びに感染症の症状の治療及び予防の両方を可能にする。ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ及び／又はＮＨＢＡなどの淋菌タンパク質を発現するＮＯＭＶワクチンの調製が実施例に記載され、本明細書で詳細に説明される。

淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症を治療又は予防するための方法
ある実施形態では、本開示は、淋菌細菌株又は髄膜炎菌細菌株に感染した患者への、治療有効量の、本明細書に記載されるＮＯＭＶワクチンの投与を含む、淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症の治療のための方法を提供する。ある実施形態では、ＮＯＭＶワクチンのこのような投与は、治療的であり得、患者における淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症に関連する症状の改善をもたらし得る。他の実施形態では、ＮＯＭＶワクチンのこのような投与は、予防的であり得、疾患の感染及び発生の予防をもたらし得る。

本開示の方法は、本明細書に記載される淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症による対象又は患者の感染を治療又は予防し得る。本明細書に記載されるＮＯＭＶを含む組成物の投与は、本明細書に記載される臨床環境で行われ得るか、又は臨床医若しくは開業医によって適切であると見なされる別の環境で行われ得る。このようなＮＯＭＶワクチンの投与のためのさらなる実施形態が本明細書の他の箇所に記載される。

ある実施形態では、本明細書に記載されるＮＯＭＶワクチンを含むこのような組成物は、患者における淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症の治療のための他の治療法又は治療薬と組み合わされ得る。任意の適切な薬物治療又は治療法は、臨床医によって適切であると見なされる際に使用され得る。

本明細書に記載されるＮＯＭＶワクチンの投与は、淋菌及び／又は髄膜炎菌症状の日数を１日以上だけ減少させ得、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５などだけ症状を減少させる。本明細書に記載されるＮＯＭＶワクチンの投与は、単回投与若しくは用量であり得るか、又は例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２若しくはそれを超える用量を含む２回以上の投与若しくは用量であり得る。当業者によって理解されるように、一部の患者又は対象は、本開示のＮＯＭＶワクチンによる２回以上の投与又は治療から利益を得られる。このような決定は、臨床医又は他の資格のある医療従事者によって行われるであろう。

他の実施形態では、淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症の症状は、限定されないが、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間若しくは８週間又はそれを超えるものなどを含めて、１週間以上だけ減少され得る。他の実施形態では、本明細書に記載されるＮＯＭＶワクチンの投与は、淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症の重症度又は持続時間を１０％、又は２０％、又は３０％、又は４０％、又は５０％、又は６０％、又は７０％、又は８０％、又は９０％、又は１００％だけ減少させ得る。

本明細書に特に規定されない限り、本明細書に記載される方法は、本明細書で例示される手順又は当技術分野で周知の日常的に実施される方法に従って実施され得る。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２８９：Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊ．Ｎ．Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｍ．Ｉ．Ｓｉｍｏｎ，Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ（Ｅｄｉｔｏｒｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９７）（ＩＳＢＮ－１３：９７８－０１２１８２１９０６）；米国特許第４，９６５，３４３号明細書及び同第５，８４９，９５４号明細書；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，（３ｒｄ ｅｄ．，２０００）；Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３）；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（１９８６）；又はＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｖｏｌ．１５２，Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ａ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｌ Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ（１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ）（Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ．ａｌ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＣＢ）（Ｊｕａｎ Ｓ．Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ ｅｔ．ａｌ．ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）及びＣｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｂｙ Ｒ．Ｉａｎ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ；５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００５），Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．５７，Ｊｅｎｎｉｅ Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｂａｒｎｅｓ ｅｄｉｔｏｒｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９８）を参照されたい。以下の節は、本開示の方法を実施するためのさらなる指針を提供する。

組み換えポリペプチドをコードする発現系及びベクター
本明細書に詳述されるように、本開示は、淋菌及び／若しくは髄膜炎菌感染症からの長期のインビボ保護又はその治療を必要とする哺乳動物対象に投与され得る医薬及び治療用組成物を提供する。このような組成物は、典型的には、本明細書に記載される組み換えポリヌクレオチド又はポリペプチドをコード又は発現する、発現系、例えば菌株、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列、発現ベクター又はウイルスベクターを含有する。ある実施形態では、発現される組み換えポリヌクレオチド又はポリペプチドは、リポタンパク質であるか、又はリポタンパク質であるように修飾される淋菌タンパク質をコードする。本開示の組成物は、本明細書に記載される淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症からの強力な及び長期の保護を提供する、本明細書に記載される組み換えポリペプチドの、対象又は患者（例えば、ヒト又は非ヒト霊長類）における最適なインビボ活性又は共発現を可能にする。

本明細書に記載される淋菌タンパク質など、組み換えポリペプチドを含有するＮＯＭＶの最適な発現は、様々な機構を介して達成され得る。このような最適な発現は、組み換えポリペプチドをコードする発現ベクターの所望の構造設計を用いて又は発現ベクターにおける適切な調節要素の使用によって達成され得る。さらに、インビボでの本開示の組み換えポリペプチドの最適な発現は、本明細書に記載される組み換えポリペプチドの細胞レベルの測定によってさらに最適化され得る。ポリペプチドの適切なレベルの決定のための任意のアッセイが必要に応じて使用され得る。このような試験は、全て当技術分野で周知の標準的なアッセイ又はプロトコルによって容易に行われ得る。

ある実施形態では、本明細書に記載されるような、淋菌タンパク質などの組み換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書に記載される細菌ベース若しくはウイルスベースの発現ベクター又は発現系における発現制御配列（例えば、プロモーター配列）に動作可能に連結される。細菌発現系のいくつかの例としては、限定されないが、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）又はＮｍ）などを含むがこれに限定されない髄膜炎菌細菌株、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（Ｎｇ）又は他の好適な細菌株が挙げられる。ある実施形態では、淋菌タンパク質を発現するために有用なＮｍ又はＮｇ細菌の菌株は、Ｎｍ株Ｈ４４／７６など、ポーリンＰｏｒＡの発現を欠く菌株であり得る。

本明細書に記載されるように、Ｎｍは、ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ若しくはＮＨＢＡ又はその点突然変異体若しくは部分などの淋菌タンパク質を発現するために使用され得る。ある実施形態では、淋菌タンパク質は、リポタンパク質であるか、又はリポタンパク質であるように修飾される。当技術分野で公知の又は入手可能な任意の有用なプラスミドは、Ｎｍ中の淋菌タンパク質をコード及び／又は発現するために使用され得る。例えば、本開示のために有用なベクターは、プラスミドであり得る。有用なプラスミドは、限定されないが、本明細書に記載される任意のプラスミドを含み得、本明細書に記載される淋菌タンパク質、例えばｐＦＰ１２－ＧＮＡ１２２０ＷＴプラスミド（図２を参照されたい）、ｐＦＰ１２－ＧＮＡ１２２０＿ｈｅｌｉｘ－αβα（図３を参照されたい）、ｐＦＰ１２－ＭｅｔＱＷＴプラスミド（図４を参照されたい）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（ＦＨｂｐ ＫＯ＋ＭｅｔＱ、配列番号１４）、ｐＧＥＭプラスミド（Ｃａｐｓｕｌｅ ＫＯ＋ＭｅｔＱ）、配列番号１９）、ｐＵＣ１８プラスミド（ｌｐｘＬ１ ＫＯ＋ＭｅｔＱ、配列番号２４）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（ＦＨｂｐ ＫＯ＋ＧＮＡ１２２０、配列番号２８）、ｐＧＥＭプラスミド（Ｃａｐｓｕｌｅ ＫＯ＋ＧＮＡ１２２０、配列番号３０）、ｐＵＣ１８プラスミド（ｌｐｘＬ１ ＫＯ＋ＧＮＡ１２２０、配列番号３２）、ｐＦＰ１２－ＭｅｔＱプラスミド（配列番号３３）、ｐＦＰ１２－ＭｅｔＱＳＭプラスミド、配列番号３４）、ｐＦＰ１２－ＧＮＡ１２２０プラスミド（配列番号３５）、ｐＦＰ１２－ＧＮＡ１２２０＿ｈｅｌｉｘ－αβαプラスミド（配列番号３６）、ｐＦＰ１２－ＮＨＢＡプラスミド（配列番号３８）、ｐＦＰ１２－ＮＨＢＡプラスミド（配列番号３９）、ｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＭｅｔＱプラスミド（配列番号４０）、ｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＭｅｔＱＳＭプラスミド（配列番号４１）、ｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＧＮＡ１２２０プラスミド（配列番号４２）、ｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＮＨｂａプラスミド（配列番号４３）、ｐＵＣ１８－ＬｐｘＬ１ＫＯ－ＭｅｔＱプラスミド（配列番号４４）、ｐＵＣ１８－ＬｐｘＬ１ＫＯ－ＭｅｔＱＳＭプラスミド（配列番号４５）、ｐＵＣ１８－ＬｐｘＬ１ＫＯ－ＧＮＡ１２２０プラスミド（配列番号４６）、ｐＵＣ１８－ＬｐｘＬ１ＫＯ－ＮＨｂａプラスミド（配列番号４７）、ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥＫＯ－ＭｅｔＱプラスミド（配列番号４８）、ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥＫＯ－ＭｅｔＱＳＭプラスミド（配列番号４９）、ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥＫＯ－ＧＮＡ１２２０プラスミド（配列番号５０）、ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥＫＯ－ＮＨｂａプラスミド（配列番号５１）、ｐＦＰ１２－ＭｅｔＱプラスミド（配列番号５２）、ｐＦＰ１２－ＭｅｔＱＳＭプラスミド（配列番号５３）、ｐＦＰ１２－ＧＮＡ１２２０プラスミド（配列番号５４）、ｐＦＰ１２－ＧＮＡ１２２０αβαプラスミド（配列番号５５）又はｐＦＰ１２－ＮＨｂａプラスミド（配列番号５６）を保有及びコードすることが可能であり得る。

本開示に好適なウイルスベクターのいくつかの例としては、レトロウイルスベースのベクター、例えばレンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及びワクシニアベクターが挙げられる。ある実施形態では、ベクターの構造は、発現制御要素（例えば、プロモーター又はエンハンサー配列）などを含む組み換えポリペプチドの、発現の最適化のため又は所望の細胞レベルを達成するために必要である場合修飾され得る。ある実施形態では、本明細書に記載される淋菌タンパク質の発現は、ポーリンＰｏｒＡプロモーターなど、Ｎｍ中の高い遺伝子転写率を生じる強力なプロモーターの使用により達成され得る。ある実施形態では、１つのプロモーターの、別のプロモーターと比べた強度の差は、それが「コンセンサス配列」、すなわちそれへの転写複合体の結合を高い確率で最も強力に可能にする塩基の配列とどの程度一致するかにある。他の実施形態では、プロモーターは、例えば、Ｎｍからの特定の配列と一致するように－１０及び－３５配列を変更することを含むように修飾され得る。例えば、ＴＡＴＴＴＧ又はＴＡＣＡＡＡ及びＴＡＡＡＧＧ又はＴＧＣＣＣＧからＴＡＴＡＡＴ及びＴＴＧＡＣＡのそれぞれへの本明細書に記載されるプロモーター配列の修飾は、例えば、ＮｍのためのＳｉｇｍａ７０コンセンサス配列と一致させるために行われ得る。

ある実施形態では、本開示に従って有用なこのようなプロモーターは、本明細書に記載される任意のプロモーター配列又は当技術分野で公知の及び／若しくは入手可能な他のプロモーター配列を含み得る。

ある実施形態では、本明細書に記載されるように、Ｎｍなどの髄膜炎菌株中で発現される淋菌タンパク質及び好適なプロモーターは、細菌ゲノムの遺伝子座中に挿入され得る。このような技術は、当技術分野で公知であり、入手可能である。高い転写率を達成するために淋菌タンパク質及び好適なプロモーターを含有することが本明細書に記載される構築物又はプラスミドは、細菌ゲノム中の任意の所望の遺伝子座中に挿入され得る。特定の遺伝子座がこのために好ましいことがあり、例えば特定の特質又は遺伝子産物を細菌細胞に与える遺伝子である。例えば、本明細書に記載されるように、高い転写率を確実にするための淋菌タンパク質遺伝子及びプロモーターがｌｐｘＬ１遺伝子座中に挿入され得、これは、生成されるリポオリゴ糖がヘキサアシル化される代わりにペンタアシル化されるように、アシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を撹乱する。他の実施形態では、高い転写率を確実にするための淋菌タンパク質遺伝子及びプロモーターは、莢膜多糖の発現及びリポオリゴ糖（ＬＯＳ）宿主抗原のシアリル化を撹乱するためにｓｉａＤ－ｇａｌＥ遺伝子座（ｓｉａＡも）中に挿入され得る。他の実施形態では、高い転写率を確実にするための淋菌タンパク質遺伝子及びプロモーターは、ｆｈｂｐ遺伝子座（Ｈ因子結合タンパク質）中に挿入され得る。他の実施形態では、高い転写率を確実にするための淋菌タンパク質遺伝子及びプロモーターは、ｐｏｒＡ遺伝子座中に挿入され得る。

当技術分野で周知の他のプロモーター配列は、本開示に従って使用され得る。これらとしては、限定されないが、例えばＣＭＶプロモーター、伸長因子－Ｉ短鎖（ＥＦＳ）プロモーター、ニワトリ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＥＦ－ｌａプロモーター、ヒトデスミン（ＤＥＳ）プロモーター、Ｍｉｎｉ ＴＫプロモーター及びヒトチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーターが挙げられる。さらに、本開示の発現ベクターは、淋菌タンパク質の最適な発現を達成するためにいくつかの調節要素を含み得る。例えば、５’－エンハンサー要素及び／又は５’－ＷＰＲＥ要素は、組み換えポリペプチドの発現を増大するために含まれ得る。ＷＰＲＥは、ウッドチャックＢ型肝炎ウイルス（ＷＨＹＳ）ゲノムの塩基対１０９３～１６８４との１００％の相同性を有する転写後応答要素である。哺乳動物発現カセットの３’ＵＴＲで使用される場合、それは、ｍＲＮＡ安定性及びタンパク質収量を有意に増加させ得る。本明細書で使用される際、「発現カセット」は、動作可能に連結された第２のポリヌクレオチド配列の転写を開始させることが可能な少なくとも第１のポリヌクレオチド配列及び任意に第２のポリヌクレオチド配列に動作可能に連結された転写終結配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。本明細書で使用される際、発現カセットは、本明細書に記載されるプロモーターに動作可能に連結された本明細書に記載される淋菌タンパク質をコードする外因性核酸を含み得る。

対象又は患者において、本明細書に記載される組み換えポリペプチドを発現することによる、ヒトなどの対象における淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症からの有効な及び長期のインビボ保護及び／又はその治療である。このような方法では、対象には、本開示の、すなわちＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ及び／又はＮＨＢＡなどの本明細書に記載される淋菌タンパク質をコードする治療有効量又は薬学的に有効な量の組み換えポリペプチド又は治療用組成物又は発現系を含有する医薬組成物が投与され得る。ある関連する実施形態では、本開示は、対象において、本明細書に記載される淋菌タンパク質を最適に発現するための発現系を含有する治療用組成物を提供する。発現系は、ポリヌクレオチド配列又は発現ベクター並びにＮＯＭＶ、リポソーム又は他の脂質含有複合体及び宿主細胞又は対象へのポリヌクレオチド配列の送達を媒介することが可能な他の高分子複合体であり得る。様々な発現ベクター又は系は、対象への投与後に本開示の組み換えポリペプチドを発現するために用いられ得る。ある実施形態では、発現ベクター又は発現系は、細菌ベクターに基づき得る。ある実施形態では、発現ベクター又は発現系は、ウイルスベクターに基づき得る。ある他の実施形態では、デオキシリボ核酸及びリボ核酸配列を含む本明細書に記載される組み換えポリペプチドのためのコード配列を有する発現系から構成される。ある実施形態では、発現ベクター又は系は、本明細書に記載される淋菌タンパク質又はそのＮＯＭＶワクチンを発現する組み換え細菌株の形態で対象に投与される。ＮＯＭＶは、当技術分野で公知の方法に従い、患者又は対象への投与前に単離され、精製され得る。ある実施形態では、発現ベクター又は系は、組み換えウイルスの形態で対象に投与される。例えば、組み換えウイルスは、組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、例えば自己相補的なアデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ベクターであり得る。このようなウイルス送達方法は、高いレベルの本明細書に記載される治療薬の安全であり、控えめであり且つ持続的な発現を可能にする。

上述されるように、対象における淋菌感染を予防又は治療するための本開示の治療用組成物を使用する場合、組み換えポリペプチドの発現レベルが治療過程中に調べられ得る。ある実施形態では、投与された組み換えポリペプチド又は組成物は、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、７５０倍、１０００倍又はそれを超えて、検出可能な細菌の数を減少させるために十分な量において、対象における組み換えポリペプチドの発現をもたらす。ある好ましい実施形態では、淋菌タンパク質を発現するための本明細書に記載されるＮＯＭＶワクチン又は淋菌及び／若しくは髄膜炎菌感染症の治療又は予防のための本開示の治療用又は医薬組成物による対象又は患者の治療は、治療される対象の血液又は血漿中で検出不可能なレベルへの、細菌又は細菌核酸又はタンパク質の減少をもたらす。

本明細書に記載される発現ベクターは、遺伝子送達及び／若しくは遺伝子発現をさらに調節するか、又は他の形で有益な特性を提供する、コード配列及び他の成分又は機能性を含有し得る。このような他の成分としては、例えば、細胞への結合又は標的化に影響を与える成分（細胞型又は組織特異的結合を媒介する成分を含む）；細胞によるベクターの取り込みに影響を与える成分；取り込み後に細胞内で伝達された遺伝子の局在化に影響を与える成分（核局在化を媒介する因子など）；及び遺伝子の発現に影響を与える成分が挙げられる。このような成分は、取り込まれた及びベクターによって送達される核酸を発現している細胞を検出又は選択するために使用され得る検出可能な及び／又は選択可能マーカーなどのマーカーも含むであろう。このような成分は、ベクターの天然の特徴（結合及び取り込みを媒介する成分又は機能性を有する特定のウイルスベクターの使用など）として提供され得るか、又はベクターは、このような機能性を提供するように修飾され得る。選択可能マーカーは、陽性、陰性又は二機能性であり得る。陽性選択可能マーカーは、マーカーを保有する細胞の選択を可能にするが、陰性選択可能マーカーは、マーカーを保有する細胞が選択的に除外されることを可能にする。様々なこのようなマーカー遺伝子が二機能性（すなわち陽性／陰性）マーカーを含めて記載されている（例えば、国際公開第９２／０８７９６号パンフレット；及び国際公開第９４／２８１４３号パンフレットを参照されたい）。このようなマーカー遺伝子は、遺伝子治療の状況で有利であり得る追加の制御手段を提供し得る。多様なこのようなベクターが当技術分野で公知であり、一般に入手可能である。ある実施形態では、高い転写レベルを提供するために、特定の細菌又はウイルス宿主遺伝子中への単独での又は好適なプロモーターを伴う淋菌タンパク質の挿入は、スクリーニング可能な又は選択可能な特徴、例えば生成されたリポオリゴ糖がヘキサアシル化の代わりにペンタアシル化されるように、アシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を撹乱するｌｐｘＬ１遺伝子座又は莢膜多糖の発現及びリポオリゴ糖宿主抗原のシアリル化を撹乱するためのｓｉａＤ－ｇａｌＥ遺伝子座（ｓｉａＡも）、又はｆｈｂｐ遺伝子座（Ｈ因子結合タンパク質）、又はｐｏｒＡ遺伝子座の１つ以上を提供し得る。

本開示に好適な発現ベクター又はシステムとしては、限定されないが、単離されたポリヌクレオチド配列、例えば染色体外に維持され得るプラスミドベースのベクター及びウイルスベクター、例えば組み換えアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、パピローマウイルス又はアデノ随伴ウイルスが挙げられ、これは、リポソーム、例えば中性又はカチオン性リポソーム、例えばＤＯＳＰＡ／ＤＯＰＥ、ＤＯＧＳ／ＤＯＰＥ若しくはＤＭＲＩＥ／ＤＯＰＥリポソーム中に存在し、且つ／又は他の分子、例えばＤＮＡ－抗ＤＮＡ抗体－カチオン性脂質（ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ）複合体に関連するウイルス及び非ウイルスベクターを含む。例示的な遺伝子ウイルス又は細菌ベクターは、当技術分野で公知であり、後述される。ベクターは、限定されないが、筋肉内、口腔、直腸、冠動脈内、静脈内、鼻腔内、経膣、皮下、動脈内、関節内、腹腔内、非経口を含む任意の経路を介して投与され得、細胞への移動は、エレクトロポレーション及び／又はイオントフォレシスを用いて向上され得る。

ある実施形態では、本明細書に記載されるプラスミドの構築のために有用なプライマーは、本明細書に記載される任意のプライマーを含み得る。当業者は、他のプライマー又はベクターが本開示の範囲から逸脱せずに使用され得ることを理解するであろう。本明細書に記載されるように有用なプライマーのいくつかの例は、以下のとおりである。

ｐＵＣ１８ Ｌｐｘｌ１及びｐＢＳ ＦＨｂｐプラスミドの構築のために有用なプライマー：
ＭｅｔＱ ＷＴ及びＮ２３８Ａ突然変異体：
ＭｅｔＱ＿ｎｅｉｓｓｅｒｉａフォワードプライマー、５’－ａｔａｃａａｔｔｇＣＣＴＣＡＧＣＧＣＡＴＧＣＡＴＣ－３’（配列番号９）
ＭｅｔＱ＿ＳｂｆＩリバースプライマー、５’－ｔａｔＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＡＴＡＣＧＡＣＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧ－３’（配列番号１０）。

ＧＮＡ１２２０：
ＭｅｔＱ＿ｎｅｉｓｓｅｒｉａフォワードプライマー、５’－ａｔａｃａａｔｔｇＣＣＴＣＡＧＣＧＣＡＴＧＣＡＴＣ－３’（配列番号９）
ＧＮＡ１２２０＿ＳｂｆＩリバースプライマー、５’－ｔａｔＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＡＴＡＣＧＡＣＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧ－３’（配列番号１０）。

ｐＧＥＭ ＳｉａＤ／ＧａｌＥプラスミドの構築のために有用なプライマー：
ＭｅｔＱ ＷＴ、Ｎ２３８Ａ突然変異体及びＧＮＡ１２２０：
ＭｅｔＱ＿ｎｅｉｓｓｅｒｉａフォワードプライマー、５’－ａｔａｃａａｔｔｇＣＣＴＣＡＧＣＧＣＡＴＧＣＡＴＣ－３’（配列番号９）
ＭｅｔＱ＿ｎｅｉｓｓｅｒｉａリバースプライマー、５’－ｔａｔｔｃｔａｇａＴＴＡＴＡＣＧＡＣＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧＧＣ－３’（配列番号１１）。

ｐＦＰ１２プラスミドの構築のために有用なプライマー：
ＭｅｔＱ ＷＴ及びＮ２３８Ａ突然変異体：
ＭｅｔＱ＿ｎｅｉｓｓｅｒｉａフォワードプライマー、５’－ａｔａｃａａｔｔｇＣＣＴＣＡＧＣＧＣＡＴＧＣＡＴＣ－３’（配列番号９）
ＭｅｔＱ＿ＳｐｅＩリバースプライマー、５’－ｔａｔＡＣＴＡＧＴＴＴＡＴＡＣＧＡＣＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧＧＣＴＧ－３’（配列番号１２）。

ＧＮＡ１２２０：
ＭｅｔＱ＿ｎｅｉｓｓｅｒｉａフォワードプライマー、５’－ａｔａｃａａｔｔｇＣＣＴＣＡＧＣＧＣＡＴＧＣＡＴＣ－３’（配列番号９）
ＧＮＡ１２２０＿ＳｔｕＩリバースプライマー、５’－ｔａｔＡＧＧＣＣＴＴＡＴＡＣＧＡＣＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧＧＣ－３’（配列番号１３）。

ある実施形態では、特定のプライマーは、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）における遺伝子の存在又は非存在を確認するために有用であり得、例えば８００ｂｐの断片を生成するＭｅｔＱ ｐＢＳ下流フォワードプライマー（配列番号１５）及びＲＢＤ ｐＢＳ下流リバースプライマー（配列番号１６）である。

他の実施形態では、８００ｂｐの断片を生成する、ＦＨｂｐ上流フォワードプライマー（配列番号１７）及び上流リバースプライマー（配列番号１８）が使用され得る。ある実施形態では、これらのプライマーは、同様にＲＢＤに使用され得る。

ある実施形態では、上流９００－ｂｐ断片は、Ｃａｐｓｕｌｅ ＫＯ ＧａｌＥフォワードプライマー（配列番号２０）及びＣａｐｓｕｌｅ ＫＯ上流ｍｅｔＱリバースプライマー（配列番号２１）と共に生成され得る。

ある実施形態では、下流８５０－ｂｐ断片は、Ｃａｐｓｕｌｅ ＫＯ Ｓｐｃ下流フォワードプライマー（配列番号２２）及びＣａｐｓｕｌｅ ＫＯ ＳｉａＤリバースプライマー（配列番号２３）と共に生成され得る。

ある実施形態では、約７７０－ｂｐ断片は、Ｌｐｘｌ１上流フォワードプライマー（配列番号２５）及びＬｐｘｌ１上流リバースプライマー（配列番号２６）と共に生成され得る。

ある実施形態では、ｍｅｔＱ ｐＢＳ下流フォワードプライマー（配列番号１５）は、Ｌｐｘｌ１下流リバースプライマー（配列番号２７）と共に、ＦＨｂｐ遺伝子座中のＭｅｔＱを検出するために使用され得る。

ある実施形態では、８００－ｂｐ断片は、ＧＮＡ１２２０ ｐＢＳ下流フォワードプライマー（配列番号２９）及びＲＢＤ ｐＢＳ下流リバースプライマー（配列番号１６）と共に生成され得る。

ある実施形態では、８００－ｂｐ断片は、ＦＨｂｐ上流フォワード（配列番号１７）及びＦＨｂｐ上流リバース（配列番号１８）と共に生成され得る。ある実施形態では、これらのプライマーは、ＲＢＤにも使用され得る。

ある実施形態では、Ｃａｐｓｕｌｅ ＫＯ ＧａｌＥフォワードプライマー（配列番号２０）及びＣａｐｓｕｌｅ ＫＯ上流ＧＮＡ１２２０リバースプライマー（配列番号３１）は、一緒に使用され得る。

ある実施形態では、下流８５０－ｂｐ断片は、Ｃａｐｓｕｌｅ ＫＯ Ｓｐｃ下流フォワードプライマー（配列番号２２）及びＣａｐｓｕｌｅ ＫＯ ＳｉａＤリバースプライマー（配列番号２３）と共に生成され得る。

ある実施形態では、約７７０－ｂｐ断片は、Ｌｐｘｌ１上流フォワードプライマー（配列番号２５）及びＬｐｘｌ１上流リバースプライマー（配列番号２６）と共に生成され得る。

ある実施形態では、６５０－ｂｐ断片は、ＧＮＡ１２２０ ｐＢＳ下流フォワードプライマー（配列番号２９）及びＬｐｘｌ１下流リバースプライマー（配列番号２７）と共に生成され得る。ある実施形態では、ＧＮＡ１２２０下流フォワードプライマーは、ＦＨｂｐ遺伝子座中のＧＮＡ１２２０を検出するために使用され得る。

ある実施形態では、本開示のために有用なタンパク質配列としては、限定されないが、ＭｅｔＱ（配列番号１）、ＭｅｔＱＳＭ（配列番号３）、ＧＮＡ１２２０（配列番号５及び７）及びＮＨＢＡ（配列番号３７）が挙げられ得る。

ある実施形態では、特定のプラスミド配列は、本開示に従って有用であり得、例えばＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（ＦＨｂｐ ＫＯ＋ＭｅｔＱ、配列番号１４）、又はｐＧＥＭプラスミド（Ｃａｐｓｕｌｅ ＫＯ＋ＭｅｔＱ）、配列番号１９）、又はｐＵＣ１８プラスミド（ｌｐｘＬ１ ＫＯ＋ＭｅｔＱ、配列番号２４）、又はＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（ＦＨｂｐ ＫＯ＋ＧＮＡ１２２０、配列番号２８）、又はｐＧＥＭプラスミド（Ｃａｐｓｕｌｅ ＫＯ＋ＧＮＡ１２２０、配列番号３０）、又はｐＵＣ１８プラスミド（ｌｐｘＬ１ ＫＯ＋ＧＮＡ１２２０、配列番号３２）、又はｐＦＰ１２－ＭｅｔＱプラスミド（配列番号３３）、又はｐＦＰ１２－ＭｅｔＱＳＭプラスミド、配列番号３４）、又はｐＦＰ１２－ＧＮＡ１２２０プラスミド（配列番号３５）、又はｐＦＰ１２－ＧＮＡ１２２０＿ｈｅｌｉｘ－αβαプラスミド（配列番号３６）、又はｐＦＰ１２－ＮＨＢＡプラスミド（配列番号３８）、又はｐＦＰ１２－ＮＨＢＡプラスミド（配列番号３９）、又はｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＭｅｔＱプラスミド（配列番号４０）、又はｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＭｅｔＱＳＭプラスミド（配列番号４１）、又はｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＧＮＡ１２２０プラスミド（配列番号４２）、又はｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－ＮＨｂａプラスミド（配列番号４３）、又はｐＵＣ１８－ＬｐｘＬ１ＫＯ－ＭｅｔＱプラスミド（配列番号４４）、又はｐＵＣ１８－ＬｐｘＬ１ＫＯ－ＭｅｔＱＳＭプラスミド（配列番号４５）、又はｐＵＣ１８－ＬｐｘＬ１ＫＯ－ＧＮＡ１２２０プラスミド（配列番号４６）、又はｐＵＣ１８－ＬｐｘＬ１ＫＯ－ＮＨｂａプラスミド（配列番号４７）、又はｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥＫＯ－ＭｅｔＱプラスミド（配列番号４８）、又はｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥＫＯ－ＭｅｔＱＳＭプラスミド（配列番号４９）、又はｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥＫＯ－ＧＮＡ１２２０プラスミド（配列番号５０）、又はｐＧＥＭ－ＳｉａＤ－ＧａｌＥＫＯ－ＮＨｂａプラスミド（配列番号５１）、又はｐＦＰ１２－ＭｅｔＱプラスミド（配列番号５２）、又はｐＦＰ１２－ＭｅｔＱＳＭプラスミド（配列番号５３）、又はｐＦＰ１２－ＧＮＡ１２２０プラスミド（配列番号５４）、又はｐＦＰ１２－ＧＮＡ１２２０αβαプラスミド（配列番号５５）、又はｐＦＰ１２－ＮＨｂａプラスミド（配列番号５６）である。

細菌感染を予防するための医薬又は治療用組成物
ある実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるような、淋菌タンパク質、例えばＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ及び／若しくはＮＨＢＡ又はＭｅｔＱＳＭなどのその突然変異体を発現するＮＯＭＶワクチンを含む治療用又は医薬組成物を提供する。ベクターは、上に詳細に記載され、当業者に公知であろう。

ある実施形態では、本明細書に記載される淋菌タンパク質を発現するＮＯＭＶは、淋菌又は髄膜炎菌感染症の治療のために対象又は患者に投与される医薬又は治療用組成物として提供され得る。本開示の組成物は、単一単位で本明細書に記載される淋菌タンパク質を発現するＮＯＭＶを含み得るか、又は代わりに、ある実施形態では、本明細書に記載される淋菌タンパク質を発現するＮＯＭＶは、複数のＮＯＭＶを含み得る。ある実施形態では、ＮＯＭＶは、全淋菌タンパク質を発現し得るか、又は所望の免疫学的効果を得るために十分な淋菌タンパク質の一部を発現し得る。

ある実施形態では、本明細書に記載される淋菌タンパク質は、淋菌タンパク質を発現するＮＯＭＶとして対象又は患者に提供又は投与され得る。本開示は、ＮＯＭＶワクチン、医薬組成物並びに淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症を阻害、予防又は治療するためにこれらのワクチン、組成物又は発現系を使用する関連方法を提供する。淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症を予防又は治療するための薬剤の製造のための、本明細書に記載されるポリヌクレオチド、ポリペプチド及び発現ベクター又は系の使用も提供される。医薬組成物は、治療用製剤又は予防用製剤のいずれかであり得る。典型的には、医薬組成物は、１つ以上の有効成分と、任意に、いくつかの不活性成分とを含有し得る。ある実施形態では、有効成分は、本明細書に記載されるＮＯＭＶワクチン、組み換えポリペプチド、発現ベクター又は発現系であり得る。ある他の実施形態では、有効成分は、本開示の発現系に加えて、他の抗菌剤を含み得る。組成物は、１つ以上の薬学的に許容されるビヒクルと、任意に、他の治療成分（例えば、抗生物質）とをさらに含み得る。様々な薬学的に許容される添加剤もこのような組成物に使用され得る。

ある実施形態では、淋菌タンパク質をコードする構築物又はプラスミドを含む組み換え細菌と共に、本明細書に記載される淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症の治療のためのＮＯＭＶワクチン及び本明細書に記載される医薬組成物は、治療結果を得るために任意の適切な投与量で投与され得る。当業者によって理解されるように、淋菌及び／若しくは髄膜炎菌感染症の治療又は予防のため又は特定の結果を達成するために適切なＮＯＭＶの投与量は、限定されないが、選択される遺伝子及びプロモーター、病態、患者特異的パラメータ、例えば身長、体重及び年齢並びに予防又は治療のいずれが達成されるべきかを含む様々な要因に応じて変化するであろう。本開示のＮＯＭＶワクチンは、例えば、血流中（例えば、冠動脈内）への投与に好適な製剤の形態で好都合に提供され得る。好適な投与形式は、標準的な手順に従い、患者ごとに個別に医師又は臨床医によって最良に決定され得、限定されないが、筋肉内、口腔、直腸、冠動脈内、静脈内、鼻腔内、経膣、皮下、動脈内、関節内、腹腔内、非経口又は当技術分野で公知の任意の他の好適な投与方法を含み得る。

本開示のワクチン又は医薬組成物は、当技術分野で周知の標準的な手順に従って調製され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９５；Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８；米国特許第４，６５２，４４１号明細書；同第４，９１７，８９３号明細書；同第４，６７７，１９１号明細書；同第４，７２８，７２１号明細書；及び同第４，６７５，１８９号明細書を参照されたい。本開示の医薬組成物は、淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症を予防又は治療するための様々な治療又は予防用途で容易に用いられ得る。淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症を発症するリスクのある対象のために、本開示のワクチン組成物は、淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症からの予防的保護を提供するために投与され得る。具体的な対象及び病態に応じて、本開示の組成物は、当業者に公知の様々な投与方法、例えば筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、関節内、腹腔内又は非経口経路により、対象又は患者に投与され得る。ある実施形態では、本明細書に記載される組成物は、選択された疾患又は病態又はその１つ以上の症状を予防、阻害及び／又は改善するために十分な時間にわたって及びそのような条件下において、このような治療を必要とする対象に投与され得る。治療用途では、組成物は、治療有効量の、本明細書に記載される発現系を含有し得る。予防用途では、本明細書に記載される組成物は、予防的に有効な量の、本明細書に記載される発現系を含有し得る。発現系（例えば、発現ベクター）の適切な量は、治療又は予防される具体的な疾患又は病態、重症度、対象の年齢及び具体的な対象の他の個人的特質（例えば、対象の健康の全般的状態及び対象の免疫系の堅牢性）に基づいて決定され得る。有効な投与量の決定は、動物モデル試験（すなわち霊長類、イヌ科動物など）、続いてヒト臨床試験及び対象における標的とされる疾患症状又は病態の発生又は重症度を著しく低下させる投与プロトコルにより、さらに導かれ得る。

予防用途では、本明細書に記載されるＮＯＭＶワクチンは、何らかの症状前、例えば感染前に提供され得る。免疫原性組成物の予防的投与は、何らかのその後の感染を予防又は改善するのに役立ち得る。したがって、ある実施形態では、治療される対象は、例えば、細菌への曝露又は曝露の可能性のため、淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症に罹患しているか又は発症するリスクのある対象である。治療有効量の、開示される治療用組成物の投与後、対象又は患者は、淋菌及び／若しくは髄膜炎菌感染症、淋菌及び／若しくは髄膜炎菌感染症に関連する症状又は両方について監視され得る。

治療用途では、本明細書に記載される組成物は、疾患又は感染の症状の発現時又は発現後、例えば淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症の症状の発現後又は感染の診断後に提供され得る。したがって、本明細書に記載される組成物は、予想される重症度、感染の期間又は程度及び／又は関連する疾患症状を軽減するように、淋菌細菌株又は髄膜炎菌細菌株への予想される曝露前、細菌への曝露若しくは疑わしい曝露後又は感染の実際の開始後に提供され得る。

ある実施形態では、本開示のＮＯＭＶワクチンは、１回又は複数回用量で有効な量の、淋菌タンパク質を発現する又は含むＮＯＭＶを含有する剤形で提供され得る。有効な用量は、臨床医又は開業医によって適切であると見なされる任意の範囲であり得る。淋菌タンパク質、淋菌タンパク質を発現する組み換え細菌株又はこれらのいずれかを含む組成物を含むＮＯＭＶワクチンの投与は、緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水又は他の適切な緩衝液又は希釈剤中で行われ得る。緩衝液又は希釈剤の量は、変化し得、臨床医又は開業医によって決定されるであろう。プラスミドＤＮＡ単独又は他の高分子との複合体中のプラスミドＤＮＡの、細胞への送達では、投与されるＤＮＡの量は、レシピエントに有益な効果をもたらす量であろう。例えば、個々の用量又は分割用量において、０．０００１～１ｍｇ又はそれを超えて、例えば最大で１ｇ、例えば０．００１～０．５ｍｇ又は０．０１～０．１ｍｇのＤＮＡが投与され得る。本明細書に記載される、淋菌タンパク質（例えば、ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ及び／又はＮＨＢＡ）又はその誘導体などの組み換えポリペプチドの送達では、投与される量は、レシピエントに有益な効果をもたらす量であろう。例えば、個々の用量又は分割用量において、０．０００１～１００ｇ又はそれを超えて、例えば最大で１ｇ、例えば０．００１～０．５ｇ又は０．０１～０．１ｇの組み換えポリペプチドが投与され得る。本明細書に記載されるＮＯＭＶワクチンの送達では、投与される量は、治療であるか又は予防であるかにかかわらず、レシピエントに有益な効果をもたらす量であろう。このような量又は体積は、臨床医又は開業医によって決定されるであろう。

ある実施形態では、本開示の組成物は、淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症を治療又は予防するための、当技術分野で公知の他の薬剤と組み合わされ得る。これらは、細菌感染症を治療するための、当技術分野で公知であるか又は入手可能な任意の薬物、例えば抗体又は他の抗菌剤、例えば抗菌化合物又は抗菌薬、プロテアーゼ阻害剤、融合タンパク質阻害剤などを含み得る。ある実施形態では、淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症の治療又は予防のための本明細書に記載される組成物は、患者又は対象が、細菌における抗生物質耐性の増加のため、抗生物質治療に反応しない状況で有利であり得る。組成物及び１つ以上の公知の抗菌剤の投与は、同時に又は連続して行われ得る。

本明細書に記載されるように、ＮＯＭＶベースのワクチンは、対応する組み換えタンパク質より広い反応性で抗体のより高い力価を誘発し、より少ないタンパク質が、有効な防御抗体応答を提供するために必要とされ得るため、忍容性がより良好であり得る。したがって、ある実施形態では、ＮＯＭＶは、抗体応答を増強するために、アジュバントと共に投与され得る。好適なアジュバントは、当技術分野で公知であり、限定されないが、アルミニウム化合物［例えば、非晶質アルミニウムヒドロキシホスフェート硫酸塩（ＡＡＨＳ）、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム（ミョウバン）、水酸化アルミニウムアジュバント（２％のＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ）］、シトシンホスホグアニン（ＣｐＧ）ヌクレオチド（例えば、ＣｐＧ １０１８）、ＡＳ０１、ＡＳ０４、ＱＳ－２１、ＲＩＢＩ、ＭＦ５９などを含み得る。

核酸の発現
本開示で有用なポリヌクレオチドは、発現構築物中で提供され得る。本開示の発現構築物は、一般に、発現構築物が発現される意図される宿主細胞において機能的である調節要素を含む。したがって、当業者は、例えば、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、哺乳動物宿主細胞及びヒト宿主細胞に使用するための調節要素を選択することができる。核遺伝子の発現のために使用される調節要素は、プロモーター、転写終結配列、翻訳終結配列、エンハンサー及びポリアデニル化要素を含む。本明細書で使用される際、「発現構築物」という用語は、動作可能に連結された核酸配列の転写を提供する核酸配列の組合せを指す。本明細書で使用される際、「動作可能に連結された」という用語は、複数の成分が、それらが意図される方法で機能することを可能にする関係にある、記載される成分の並置を指す。一般に、動作可能に連結された成分は、近接関係にある。

本開示の発現構築物は、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーター配列を含み得る。プロモーターは、当技術分野で公知の標準的な技術を用いてポリヌクレオチドに組み込まれ得る。プロモーターの複数のコピー又は複数のプロモーターが本開示の発現構築物で使用され得る。好ましい実施形態では、プロモーターは、それがその天然の遺伝的環境における転写開始部位に由来する際、発現構築物における転写開始部位からおよそ同じ距離に位置し得る。この距離のいくらかの変化は、プロモーター活性の大きい低下なしに許容される。転写開始部位は、典型的には、発現構築物に含まれる。

本開示の核発現構築物は、任意に、転写終結配列、翻訳終結配列、シグナルペプチドをコードする配列及び／又はエンハンサー要素を含有し得る。転写終結領域は、典型的には、真核生物又はウイルス遺伝子配列の３’非翻訳領域から得られる。転写終結配列は、効率的な終結を提供するために、コード配列の下流に位置し得る。シグナルペプチド配列は、特定の細胞小器官区画からタンパク質作用の部位及び細胞外環境までの範囲の、広範な翻訳後細胞目的地への動作可能に連結された成熟ポリペプチドの再配置に関与するタンパク質のアミノ末端に典型的に存在する短鎖アミノ酸配列である。動作可能に連結されたシグナルペプチド配列の使用により、遺伝子産物を、意図される細胞及び／又は細胞外目的地に標的化することは、本開示のポリペプチドでの使用について想定される。古典的なエンハンサーは、遺伝子転写を増大するシス作用性要素であり、また発現構築物に含まれ得る。古典的なエンハンサー要素は、当技術分野で公知であり、限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターエンハンサー要素及びＳＶ４０エンハンサー要素を含む。遺伝子発現を増強するイントロン媒介性エンハンサー要素も当技術分野で公知である。これらの要素は、転写領域内に存在しなければならず、配向依存性である。

ＳＶ４０ポリＡシグナルなど、発現構築物から転写されたｍＲＮＡのポリアデニル化を指向するＤＮＡ配列も発現構築物に含まれ得、限定されないが、オクトピンシンターゼ又はノパリンシンターゼシグナルが挙げられる。

本開示のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか又はそれらのハイブリッドから構成され得る。本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドに配列が相補的なポリヌクレオチドも包含する。本開示のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、精製又は単離された形態で提供され得る。

核酸
当業者の周知の様々な方法は、ＤＮＡ分子を単離し、操作するために使用され得る。例えば、既に記載されるように、ＰＣＲ技術は、特定の出発ＤＮＡ分子を増幅し、且つ／又は出発ＤＮＡ分子の変異体を生成するために使用され得る。ＤＮＡ分子又はその断片は、化学的な手段によって断片を直接合成することを含む、当技術分野で公知の任意の技術によっても得られる。したがって、本明細書に記載される核酸の全て又は一部が合成され得る。

本明細書で使用される際、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又は一本鎖又は二本鎖形態のいずれかの混合デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドポリマーを指し、特に限定されない限り、天然ヌクレオチドと同様に機能し得る、天然ヌクレオチドの公知の類似体を包含するであろう。ポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配列及び転写されるＤＮＡ鎖に相補的な鎖配列を含む。ポリヌクレオチド配列は、完全長配列並びに完全長配列に由来するより短い配列の両方も含む。ポリヌクレオチド配列は、個々の鎖として又は二重鎖中でセンス及びアンチセンス鎖の両方を含む。

キット
本開示は、本明細書に記載されるＮＯＭＶワクチンを含む１つ以上の使い捨て容器を含むキットをさらに提供する。ある実施形態では、本開示のキットは、本明細書に記載される淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症の治療又は予防のためのＮＯＭＶワクチンを含む組成物を提供し得る。他の実施形態では、本明細書に記載されるキットは、例えば、培養物中において又は例えばグリセロールと組み合わされた凍結ストックとして、本明細書に記載される細菌株を提供し得る。ある実施形態では、キットは、対象又は患者への投与のための、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、アジュバントと混合された）としての、ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ及び／又はＮＨＢＡなど、ＮＯＭＶワクチン又は淋菌タンパク質の精製された調製物を含む医薬組成物を提供し得る。他の実施形態では、本明細書に記載されるＮＯＭＶワクチン、精製された淋菌タンパク質、ＲＮＡ、ベクター及び／又は医薬組成物の投与のための滅菌試薬及び／又は追加の物質が必要に応じて提供され得る。キットは、細胞形質転換及び／又はトランスフェクション、細菌又はウイルス培養などのための試薬をさらに含み得る。

本開示のキット中で提供される成分は、例えば、本明細書に記載される方法を実施するために有用な任意の出発材料を含み得る。このようなキットは、例えば、核酸アッセイ、例えばＰＣＲ又はＲＴ－ＰＣＲアッセイ、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）アッセイ、細胞形質転換／トランスフェクション、ウイルス／細胞培養、血液アッセイ、すなわち完全血球算定（ＣＢＣ）、ウイルス力価／ウイルス負荷アッセイ、抗体アッセイ、ウイルス抗原検出アッセイ、ＤＮＡ又はＲＮＡ検出アッセイ、細菌力価アッセイ、ウイルス中和アッセイ、遺伝的相補性アッセイ又は本開示に従って有用な任意のアッセイを含む様々なアッセイに使用するための１つ以上のこのような試薬又は成分を含み得る。成分は、必要に応じて、凍結乾燥、乾燥保存若しくは乾燥された形態で提供され得るか、又は水溶液若しくは本開示に従って使用するのに適切な他の液体媒体中で提供され得る。

本開示のために有用なキットは、本明細書に記載されるような、さらなる試薬、例えば緩衝液、基質、抗体、リガンド、検出試薬、培地成分、例えばＭｇＣｌ_２を含む塩、ポリメラーゼ酵素、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、発現ベクターなど、ＤＮＡ単離、ＤＮＡ／ＲＮＡトランスフェクションのための試薬なども含み得る。このような試薬又は成分は、当技術分野で周知である。ある実施形態では、本明細書に記載される１つ以上のアジュバントが本開示のキットに含まれ得る。必要に応じて、このようなキットに含まれる試薬は、プライマー対又は複数のプライマー対として、同じ容器又は培地中のいずれかで提供され得る。ある実施形態では、このような試薬は、第２の又はさらなる異なる容器に入れられ得、その中にさらなる組成物又は試薬が入れられ、好適には等分され得る。代わりに、試薬は、単一の容器手段中で提供され得る。本開示のキットは、包装構成要素、必要に応じて個々の構成要素のための貯蔵要件を含む使用説明書も含む。本明細書に記載されるこのようなキットは、病院、治療施設若しくは臨床環境などの臨床環境で使用するために製剤化され得るか、又は必要に応じて個人使用のために製剤化され得る。

定義
ある範囲の値が提供される場合、その範囲の上限及び下限間の、文脈上特に明記されない限り下限の単位の１０分の１までの各介在値及び任意の他の記載される値又はその記載される範囲内の介在値が本開示の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、より小さい範囲内に独立して含まれ得、記載される範囲内の任意の具体的に除外された限度を条件として本開示の範囲内にさらに包含される。記載される範囲が限度の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限度のいずれか又は両方を除外した範囲も本開示に含まれる。

特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等のいずれの方法及び材料も本開示の実施又は試験に使用され得るが、好ましい方法及び材料がここで記載される。本明細書に言及される全ての刊行物は、関連して刊行物が引用される方法及び／又は材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に援用される。本明細書に記載される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示について提供されるに過ぎない。本明細書におけるいずれの刊行物も、本開示が、先行する開示によってこのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の公開日と異なる場合があり、独立して確認される必要があり得る。

特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語及び科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本開示の説明にとって特に重要な特定の用語が以下に定義される。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される際、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、特定の実施形態の説明に関連して（特に以下の特許請求の範囲の特定のものに関連して）使用される類似の言及と共に、特に示されない限り、単数及び複数の両方を包含するものと解釈され得る。したがって、例えば、「活性薬剤」は、単一の薬剤を指すだけでなく、２つ以上の異なる薬剤の組合せも指し、「剤形」は、剤形の組合せ及び単一の剤形を指すなどである。ある実施形態では、特許請求の範囲を含めて、本明細書で使用される際の「又は」という用語は、代替物のみを指すか又は代替物が互いに矛盾することが明確に示されない限り、「及び／又は」を意味するために使用される。

ある実施形態では、本開示の特定の実施形態を説明し、特許請求するために使用される、成分、特性、例えば分子量、反応条件などの量を表す数値は、ある場合には、「約」という用語によって修飾されるものと理解されるべきである。ある実施形態では、「約」という用語は、値が、値を決定するために用いられるデバイス又は方法についての平均値の標準偏差を含むことを示すために使用される。ある実施形態では、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、特定の実施形態によって得ようとされる所望の特性に依存して変化し得る近似値である。ある実施形態では、数値パラメータは、報告される有効桁の数を考慮して且つ通常の四捨五入法を適用することによって解釈されるべきである。本開示のある実施形態の広い範囲を記載する数値範囲及びパラメータが近似値であるにもかかわらず、特定の例に記載される数値は、可能な限り正確に報告される。本開示のある実施形態に示される数値は、それらのそれぞれの試験測定で見られる標準偏差から必然的に生じるいくらかの誤差を含み得る。本明細書における値の範囲の記載は、その範囲内に含まれる各別個の値に個々に言及する簡単な方法として用いられるに過ぎないことが意図される。本明細書に特に示されない限り、各個々の値は、それが本明細書に個々に記載されたかのように、本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、「約」は、記載される値＋／－１０％、又は９％、又は８％、又は７％、又は６％、又は５％、又は４％、又は３％、又は２％、又は１％を指す。

「含む」、「有する」及び「包含する」という用語は、オープンエンドの連結動詞である。これらの動詞の１つ以上の任意の形態又は時制、例えば「含む」、「含んでいる」、「有する」、「有している」、「包含する」及び「包含している」もオープンエンドである。例えば、１つ以上の工程を「含む」、「有する」又は「包含する」任意の方法は、それらの１つ以上の工程のみを有することに限定されず、他の列挙されていない工程も包含し得る。同様に、１つ以上の特徴を「含む」、「有する」又は「包含する」任意の組成物又はデバイスは、それらの１つ以上の特徴のみを有することに限定されず、他の列挙されていない特徴を包含し得る。

本明細書で使用される際、「有害事象」は、薬物関連であるか否かにかかわらず、ヒトにおける本明細書に記載される薬物又はワクチンの使用に関連するあらゆる好ましくない医学上の事象を指す。ＡＥ又は疑わしい有害反応は、それが以下の転帰のいずれかを生じる場合、「重篤な有害事象」と見なされ得る：死亡又は差し迫った死亡リスク、入院又は現在の入院期間の延長、持続的な若しくは著しい身体障害又は正常な生活機能を行う能力の実質的な破壊、先天性異常／出生時欠損。有害事象は、死亡につながらないか、生命に関わらないか又は入院を必要としないことがあるが、患者又は対象を危険に曝すことがあり、上記の転帰の１つを防止するために医療又は外科的介入を必要とすることがある重要な医療事象でもあり得る。ある実施形態では、有害事象は、本明細書に記載される薬物又はワクチンの投与の結果としての注入反応を指す。

本明細書で使用される際、「アナフィラキシー」は、数分間から数時間にわたって起こり得る重篤な急性発症アレルギー反応を指す。アナフィラキシーは、皮膚、粘膜組織又は両方を侵すことがあり、限定されないが、全身性じんましん、掻痒症（痒み）、紅潮、唇、舌、喉若しくは口蓋垂の腫脹、息切れ、嘔吐、目まい、喘鳴、血行動態不安定及び発疹又はじんましんを含む１つ以上の症状を有し得る。さらに、アナフィラキシーは、以下の少なくとも１つを伴い得る：呼吸機能障害（例えば、呼吸困難、喘鳴－気管支痙攣、喘鳴音、最大呼気流速度の低下、低酸素症）及び血圧の低下（すなわち収縮期血圧＜９０ｍｍ Ｈｇ又はその人のベースラインからの３０％超の低下）又は末端器官障害の関連症状（例えば、低血圧［虚脱］、失神、失禁）。本開示に係るアナフィラキシーは、アナフィラキシーを診断するための米国立アレルギー感染症研究所／食物アレルギーアナフィラキシーネットワーク（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ／Ｆｏｏｄ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ）（ＮＩＡＩＤ／ＦＡＡＮ）臨床基準によって定義される。

本明細書で使用される際、「抗原」又は「免疫原」という用語は、対象における免疫応答を誘導することが可能な物質、典型的にタンパク質を指すために同義的に使用される。この用語は、対象に投与されると（直接又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列又はベクターを対象に投与することにより）、タンパク質に対して体液性及び／又は細胞型の免疫応答を引き起こすことができるという意味で免疫学的に活性であるタンパク質も指す。

本明細書で使用される際、「共投与」は、１つ以上の薬物の互いに同時の投与を指す。他の実施形態では、両方の薬物が同時に投与される。本明細書における他の箇所に記載されるように、共投与は、いずれかの薬物又は両方の薬物の投与の任意の特定の期間も指し得る。例えば、本明細書に記載されるように、薬物は、別の薬物の投与の数時間、数日又は数週間前に投与され得、依然として共投与されたと見なされ得る。ある実施形態では、共投与は、両方の薬物が患者の身体内に同時に存在するような、いずれかの薬物の任意の投与時点を指し得る。ある実施形態では、いずれかの薬物は、薬物が両方とも、患者が意図される臨床的又は薬理学的利益を受ける十分な時間にわたって患者内に存在する限り、互いの前又は後に投与され得る。

本明細書で使用される際、「有効量」及び「治療有効量」という用語は、非毒性であり、対象又は患者（例えば、ヒト対象又は患者）への投与時にいくらかの所望の治療効果を生じるために有効である、例えば病態又は疾患の兆候又は症状を軽減するか又はなくす、薬剤、ワクチン、化合物、薬物、組成物又は組合せの量を指す。例えば、本明細書に記載されるように、有効量は、淋菌感染を治療若しくは予防するか、又は淋菌感染の外見的な症状を明らかに変化させるために必要な量であり得る。一般に、この量は、細菌複製又は感染性を明らかに阻害するか、又は感染の症状を緩和するために十分であろう。ある例では、「有効量」は、障害又は疾患のいずれかの１つ以上の症状及び／又は根底にある原因を治療する（予防を含む）量である。一例では、有効量は、治療有効量である。一例では、有効量は、特定の疾患又は障害の１つ以上の兆候又は症状が発生することを予防する量である。

本明細書で使用される際、「エピトープ」は、抗原決定基を指す。エピトープは、それらが特定の免疫応答を誘発するように抗原性である分子上の特定の化学基又はペプチド配列であり、例えば、エピトープは、Ｂ及び／又はＴ細胞が応答する抗原の領域である。エピトープは、タンパク質の三次折り畳みによって並置される隣接アミノ酸又は非隣接アミノ酸の両方から形成され得る。

本明細書で使用される際、「発現構築物」は、それが投与されたレシピエントで機能するように転写及び翻訳され得るコードされた外因性核酸タンパク質を含む核酸構築物を指す。ある実施形態では、このような発現構築物は、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列又はそれらの組合せを含み得る。ある実施形態では、このような構築物は、対象又は患者、例えば特定の細菌株又はヒト患者における投与に適切なプラスミド又はベクターに遺伝子組み換えされ得る。例えば、本明細書に記載されるように、本開示の構築物は、淋菌タンパク質をコードする核酸配列を含み得る。

本明細書で使用される際、「外因性配列」は、宿主細胞の外に由来する核酸配列を指す。外因性配列は、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列又はそれらの組合せであり得る。当技術分野で入手可能な任意のタイプの核酸は、当業者によって理解されるように本開示に従って使用され得る。このような核酸配列は、それが送達される細胞の種と異なる種又は同じ種から得ることができる。ある実施形態では、本開示に係る外因性核酸配列は、対象又は患者への投与に好適な、本明細書に記載される淋菌タンパク質をコードし得る。このような組み換えポリペプチドは、淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症を治療又は予防するために、対象又は患者に投与され得る。

本明細書で使用される際、「遺伝子送達」は、遺伝子導入のための細胞内への外因性ポリヌクレオチドの導入を指し、標的化、結合、取り込み、輸送、局在化、レプリコン統合及び発現を包含し得る。

本明細書で使用される際、「遺伝子導入」は、標的化、結合、取り込み、輸送、局在化及びレプリコン統合を包含し得る細胞内への外因性ポリヌクレオチドの導入を指すが、遺伝子のその後の発現と異なり、それを示唆しない。

本明細書で使用される際、「遺伝子発現」又は「発現」は、遺伝子転写、翻訳及び翻訳後修飾の過程を指す。

本明細書で使用される際、「天然外膜小胞」又は「ＮＯＭＶ」は、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜を指し、これは、主にリポオリゴ糖（ＬＯＳ）、外膜タンパク質（ＯＭＰ）及びリン脂質から構成され、通常、細胞壁に非常に緩く結合される。細菌の静止増殖中、外膜の小胞又はブレブは、周囲媒体中に放出される。これらの天然外膜小胞（ＮＯＭＶ）は、関連するタンパク質及びＬＯＳの全てを含むが、ペリプラスム及び細胞質成分を欠いた無傷の外膜からなる。本明細書で使用される際、ＮＯＭＶは、洗剤で処理されていない、すなわち「天然の」ＯＭＶを指す。

本明細書で使用される際、「淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）」又は「Ｎｇ」は、淋菌感染の原因となる、本明細書に記載されるように使用される淋菌細菌株を指す。

本明細書で使用される際、「髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）」又は「Ｎｍ」は、本明細書に記載される淋菌タンパク質を発現するために本明細書に記載されるように使用される髄膜炎菌細菌株を指す。Ｎｍは、髄膜炎菌感染症の原因となる。

「薬学的に許容される」とは、生物学的に又は他の形で有害でない材料を意味し、すなわち、この材料は、何らの望ましくない生物学的影響を引き起こさないか、又は材料が含まれる組成物の他の成分のいずれとも有害に相互作用することなく、患者に投与される医薬組成物に組み込まれ得る。「薬学的に許容される」という用語が医薬担体又は賦形剤を指すために使用される場合、担体又は賦形剤は、毒物学的及び製造試験の必要な基準を満たすこと又はそれが米国食品医薬品局によって作製されたＩｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｇｕｉｄｅに含まれることが示唆される。「薬理的に活性な」（又は「活性な」）誘導体又は類似体にあるような「薬理的に活性な」（又は単に「活性な」）は、親化合物と同じタイプの薬理学的活性及びほぼ同等の程度を有する誘導体又は類似体を指す。「薬学的に許容される塩」という用語は、例えば、塩酸又はリン酸などの無機酸又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸と共に形成される酸付加塩を含む。遊離カルボキシル基と共に形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化第二鉄などの無機塩基及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基からも誘導され得る。

本明細書で使用される際、「軽減すること」は、淋菌感染の症状を低下又は減少させる、例えば軽減することを指す。ある実施形態では、ＮＯＭＶワクチンなどの本明細書に記載されるワクチンの投与は、このようなワクチンを投与されなかった患者と比較して、患者における「軽減された」又は減少された症状をもたらし得る。「軽減すること」は、単独で又は別の薬物と共投与される、本明細書に記載される治療の結果としての疾患症状の軽減も指し得る。

本明細書で使用される際、「対象」又は「個体」又は「患者」は、淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症のための治療法又は治療が必要とされる任意の患者を指し、一般に、治療のレシピエントを指す。「対象」又は「患者」は、哺乳動物として分類される任意の動物、例えばヒト及び非ヒト哺乳動物を指す。非ヒト動物の例としては、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどが挙げられる。特に断りのない限り、「患者」又は「対象」という用語は、本明細書で同義的に使用される。ある実施形態では、本開示の治療用途に適した対象は、霊長類、例えばヒト及び非ヒト霊長類であり得る。

本明細書で使用される際、宿主細胞又は対象へのポリヌクレオチド又はベクターの投与は、任意の日常的に実施される方法による細胞又は対象への導入を指す。これは、当技術分野で周知であるように、「形質導入」、「トランスフェクション」、「形質転換」又は「形質導入すること」を含む。これらの用語は、全てポリヌクレオチドの発現をもたらす宿主細胞（例えば、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））への外因性ポリヌクレオチド、例えば淋菌タンパク質の導入、例えば細胞への導入遺伝子の導入のための標準的なプロセスを指し、宿主細胞に外因性ポリヌクレオチドを導入するためのプラスミド及び／又は組み換えウイルスの使用を含む。細胞内のポリヌクレオチドの形質導入、トランスフェクション又は形質転換は、限定されないが、例えばＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー及びウエスタンブロットによるタンパク質発現（定常状態レベルを含む）、アッセイ、例えばノーザンブロット、サザンブロット、レポーター機能（Ｌｕｃ）アッセイ及び／又はゲルシフト移動度アッセイによるＤＮＡ及びＲＮＡの測定を含む、当技術分野で周知の方法によって決定され得る。外因性ポリヌクレオチドの導入に使用される方法は、細菌及び／又はウイルス感染又はトランスフェクション、リポフェクション、形質転換及びエレクトロポレーション並びに他の非ウイルス遺伝子送達技術などの周知の技術を含む。導入されたポリヌクレオチドは、安定的に又は一時的に宿主細胞内に維持され得る。

本開示に使用するための「転写調節配列」又は「ＴＲＳ」は、一般に、少なくとも１つの転写プロモーターを含み、転写の１つ以上のエンハンサー及び／又はターミネーターも含み得る。「動作可能に連結された」は、２つ以上の成分の配置を指し、そのように記載される成分は、それらが協働して機能することを可能にする関係にある。例として、転写調節配列又はプロモーターは、ＴＲＳ又はプロモーターがコード配列の転写を促進する場合、コード配列に動作可能に連結される。動作可能に連結されたＴＲＳは、一般に、コード配列とｃｉｓに結合されるが、それは、必ずしもそれに直接隣接しているわけではない。

本明細書で使用される際の「治療すること」及び「治療」又は「緩和すること」又は「軽減すること」という用語は、症状の重症度及び／又は頻度の軽減又は減少、症状及び／又は根底にある原因の除去並びに例えば淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症の改善又はその損傷の修復を指す。「患者に投与すること」という語句は、当技術分野で認識されている導入手段により、組成物、ワクチン又は剤形を患者中に導入するプロセスを指す。「治療すること」又は「緩和すること」は、疾患（例えば、淋菌及び／又は髄膜炎菌感染症）の症状、合併症若しくは生化学的指標の発現を予防するか若しくは遅らせるため、症状を緩和するため又は疾患、病態若しくは障害のさらなる発現を抑止若しくは阻害するための、対象への化合物又は薬剤の投与も含む。治療を必要とする対象は、疾患又は障害に既に罹患している対象並びに疾患又は障害を発生するリスクがある対象を含む。治療は、予防的（疾患の発現を予防するか若しくは遅らせるため、又はその臨床症状若しくは亜臨床症状の発現を予防するため）若しくは治療的抑制、又は疾患の発現後の症状の緩和であり得る。

「ベクター」は、細胞内に導入され得る担体を伴うか又は伴わない核酸である。１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を指向することが可能なベクターは、「発現ベクター」と呼ばれる。本開示に好適なベクターの例としては、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、リポソーム及び他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。

本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に特に示されない限り又は文脈上明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書で特定の実施形態に関連して提供されたあらゆる例又は例示的な文言（例えば、「など」）の使用は、本開示をよりよく例示することが意図されるに過ぎず、特許請求される本開示の範囲に対して限定を課すものではない。本明細書におけるいかなる文言も、本開示の実施に不可欠である、特許請求されない要素を示すものと解釈されるべきではない。

本明細書に開示される本開示の代替的な要素又は実施形態の群は、限定として解釈されるべきではない。各群のメンバーは、個々に又は群の他のメンバー若しくは本明細書に見られる他の要素と任意に組み合わせて言及され、特許請求され得る。群の１つ以上のメンバーは、便宜上又は特許性の理由のため、群に含まれ得るか又は群から除外され得る。

本開示を詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲で規定される本開示の範囲を逸脱することなく、変更形態、変形形態及び均等な実施形態が可能であることが明らかであろう。さらに、本開示における全ての例が非限定的な例として提供されることが理解されるべきである。

本開示の実施形態の例が以下の実施例に提供される。以下の実施例は、例として且つ本開示を使用する際に当業者を補助するために示されるに過ぎない。実施例は、本開示の範囲を限定することを決して意図されていない。

実施例１ － 淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（Ｎｇ）抗原をコードする遺伝子の挿入によるｆｈｂｐ、ｓｉａＤ－ｇａｌＥ及びｌｐｘＬ１遺伝子のノックアウト。
髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の形質転換。
ｆｈｂｐ、ｓｉａＤ－ｇａｌＥ及びｌｐｘＬ１遺伝子が不活性化され、ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ及び／又はＭｅｔＱＳＭのコピーが挿入されたＨ４４／７６株（Ｈ４４／７６ΔＦＨｂｐ ΔＣａｐｓｕｌｅ ΔｌｐｘＬ１）を、エリスロマイシン選択（１０μｇ／ｍｌ）を用いてプラスミドｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－［ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ又はＭｅｔＱＳＭ］－ＥＲＭ、スペクチノマイシン選択（５０μｇ／ｍｌ）を用いてｐＧＥＭ－ＳｉａＤ／ＧａｌＥＫＯ－［ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ又はＭｅｔＱＳＭ］－ＳＰＣ、カナマイシン選択（５０μｇ／ｍｌ）を用いてｐＵＣ１８－ｌｐｘＬ１ＫＯ－［ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ又はＭｅｔＱＳＭ］－ＫＡＮ及びｐＦＰ１２－［ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ又はＭｅｔＱＳＭ］－ＣＡＴによる形質転換による相同的組み換えによって作製した。野生型株から開始する形質転換を以下の順序で行った：
（１）莢膜遺伝子をノックアウトし、［ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ又はＭｅｔＱＳＭ］の第１のコピーを付加した（ｐＧＥＭ－ＳｉａＤ／ＧａｌＥＫＯ－［ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ又はＭｅｔＱＳＭ］－ＳＰＣプラスミド）；
（２）ｌｐｘＬ１遺伝子をノックアウトし、［ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ又はＭｅｔＱＳＭ］の第２のコピーを付加した（ｐＵＣ１８－ｌｐｘＬ１ＫＯ－［ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ又はＭｅｔＱＳＭ］－ＫＡＮプラスミド）；
（３）ＦＨｂｐ遺伝子をノックアウトし、［ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ又はＭｅｔＱＳＭ］の第３のコピーを付加した（ｐＢＳ－ＦＨｂｐＫＯ－［ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ又はＭｅｔＱＳＭ］－ＥＲＭプラスミド）。
（４）［ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ又はＮＨＢＡ］（ｐＦＰ１２－［ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ又はＮＨＢＡ］－ＣＡＴプラスミド）の過剰発現。

注目すべきことに、ＮＨＢＡを、ｓｉａＤ－ｇａｌＥ、ＬｐｘＬａ及びＦＨｂｐノックアウトを有していたが、ＮＨＢＡのコピーと置き換えなかったｐＦＰ１２からの親株で発現させた。

Ｈ４４／７６株の１０～１５のコロニーを、一晩増殖させたＴＳＢ（トリプシンソイブロス、非動物由来）寒天プレートから選択した。細菌のコロニーを３μｇのプラスミドと混合し、ＴＳＢ寒天プレート上で平板培養し、３７℃で６時間インキュベートした。細菌の連続希釈物を、選択のために抗生物質を含有するＴＳＢ寒天プレート上で再度培養した。培養プレートを３７℃で一晩インキュベートし、コロニーを、ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ又はＮＨＢＡ発現について且つＦＨｂｐ、Ｃａｐｓｕｌｅ及びｌｐｘＬ１の発現の欠如について、特定の抗体を用いたフローサイトメトリーアッセイ及び熱殺菌細胞を用いたＰＣＲによってスクリーニングした。陽性の個々のコロニーを１０％の脱脂粉乳（ｗｔ／ｖｏｌ）及び１５％のグリセロール中で凍結させ、－８０℃で貯蔵した。

プライマー：
ｐＵＣ１８ Ｌｐｘｌ１及びｐＢＳ ＦＨｂｐプラスミドに入るプライマーは、以下のとおりであった。

ＭｅｔＱ ＷＴ及びＮ２３８Ａ突然変異体：
ＭｅｔＱ＿ｎｅｉｓｓｅｒｉａフォワードプライマー：５’ａｔａｃａａｔｔｇＣＣＴＣＡＧＣＧＣＡＴＧＣＡＴＣ ３’（配列番号９）
ＭｅｔＱ＿ＳｂｆＩリバースプライマー：５’ｔａｔＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＡＴＡＣＧＡＣＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧ ３’（配列番号１０）

ＧＮＡ１２２０：
ＭｅｔＱ＿ｎｅｉｓｓｅｒｉａフォワードプライマー：５’ａｔａｃａａｔｔｇＣＣＴＣＡＧＣＧＣＡＴＧＣＡＴＣ ３’（配列番号９）

ＧＮＡ１２２０＿ＳｂｆＩリバースプライマー：
５’ｔａｔＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＡＴＡＣＧＡＣＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧ ３’（配列番号１０）

ｐＧＥＭ ＳｉａＤ／ＧａｌＥプラスミドに入るプライマー：
ＭｅｔＱ ＷＴ、Ｎ２３８Ａ突然変異体及びＧＮＡ１２２０：
ＭｅｔＱ＿ｎｅｉｓｓｅｒｉａフォワードプライマー：５’ａｔａｃａａｔｔｇＣＣＴＣＡＧＣＧＣＡＴＧＣＡＴＣ ３’（配列番号９）
ＭｅｔＱ＿ｎｅｉｓｓｅｒｉａリバースプライマー：５’ｔａｔｔｃｔａｇａＴＴＡＴＡＣＧＡＣＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧＧＣ ３’（配列番号１１）

ｐＦＰ１２プラスミドに入るプライマー：
ＭｅｔＱ ＷＴ及びＮ２３８Ａ突然変異体：
ＭｅｔＱ＿ｎｅｉｓｓｅｒｉａフォワードプライマー：５’ａｔａｃａａｔｔｇＣＣＴＣＡＧＣＧＣＡＴＧＣＡＴＣ ３’（配列番号９）
ＭｅｔＱ＿ＳｐｅＩリバースプライマー：５’ｔａｔＡＣＴＡＧＴＴＴＡＴＡＣＧＡＣＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧＧＣＴＧ ３’（配列番号１２）

ＧＮＡ１２２０：
ＭｅｔＱ＿ｎｅｉｓｓｅｒｉａフォワードプライマー：５’ａｔａｃａａｔｔｇＣＣＴＣＡＧＣＧＣＡＴＧＣＡＴＣ ３’（配列番号９）
ＧＮＡ１２２０＿ＳｔｕＩリバースプライマー：５’ｔａｔＡＧＧＣＣＴＴＡＴＡＣＧＡＣＴＧＣＣＴＴＡＴＴＴＧＧＣ ３’（配列番号１３）
ｍｅｔＱ ｐＢＳ下流フォワードプライマー：５’ＣＣＣＴＧＴＴＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＡＧＣ ３’（配列番号１５）
ＲＢＤ ｐＢＳ下流リバースプライマー：５’ＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＣＧＣＧＡＡＣＧ ３’（配列番号１６）、８００－ｂｐ断片を生成する。
ＦＨｂｐ上流フォワードプライマー（ＲＢＤのためのプライマーのこれらの組を同様に使用する）：５’ＧＧＣＧＡＡＡＴＣＧＧＣＧＴＡＴＴＧＧＧ ３’（配列番号１７）
ＦＨｂｐ上流リバースプライマー：５’ＣＴＡＣＡＴＴＡＣＧＣＡＴＴＴＧＧＡＡＴＡＣＣ ３’（配列番号１８）、８００－ｂｐ断片を生成する。

Ｎｍリポタンパク質シグナル配列を有するＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ又はＮＨＢＡを含有するｐＦＰ１２シャトルベクターの構築又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製起点を有するその構築。
それぞれＮｍリポタンパク質シグナル配列を有する、ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ又はＮＨＢＡをコードする３つの染色体コピー及びＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ又はＮＨＢＡをコードするマルチコピープラスミドを含有するＮｍ株Ｈ４４／７６の突然変異体の特性決定。

ＰＣＲ
ＰＣＲプライマーを、ｆｈｂｐ、ｓｉａＤ－ｇａｌＥ又はｌｐｘＬ１遺伝子、ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ又はＭｅｔＱＳＭ遺伝子のための隣接領域及び抗生物質耐性カセットを保有する髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株Ｈ４４／７６に挿入された構築物の上流及び下流を増幅するために設計した。ＰＣＲを熱殺菌細胞で行った。野生型Ｈ４４／７６からの熱殺菌細胞を陰性対照として使用した。

フローサイトメトリー
生髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）又は淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）細菌の表面への、ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ又はＮＨＢＡに対する精製されたモノクローナル及びポリクローナル抗体の結合を、既に記載されるようにフローサイトメトリーによって測定した（Ｇｉｕｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３：６９８－７０６，２０１６）。標的抗原を発現するように操作されたＨ４４／７６を試験株として使用した。簡潔に述べると、細菌を、Ｆｒａｎｔｚ＋ラクテート又は４ｍＭのラクテートの代わりに２０ｍＭを含有する既知組成培地（ＣＤＭ）（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１５，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ８３：１２５７－１２６４）中で０．６～０．７のＯＤ_{６２０ｎｍ}まで増殖させた。抗ＭｅｔＱ又は抗ＮＨＢＡ抗体結合を測定するために、一定の濃度の抗ＭｅｔＱ又は抗ＮＨＢＡ抗体又は陰性対照として１０μｇ／ｍＬの無関係な抗体を１０^７個の細菌／ｍＬと共にインキュベートした。結合抗体を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８コンジュゲートヤギ抗マウス又はウサギＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて検出した（図１）。図１は、ｓｉａＤ－ｇａｌＥ、ｌｐｘＬ１及びｆｈｂｐ遺伝子座がＭｅｔＱ及びＭｅｔＱＳＭのそれぞれをコードする遺伝子のコピーで撹乱され、さらに、各それぞれの遺伝子と共にマルチコピープラスミド（例のプラスミドマップが図２～４に示される）を保有する、ＰｏｒＡを欠くＨ４４／７６の実験室で継代された株への、抗ＭｅｔＱポリクローナル抗体の強化された結合をフローサイトメトリーによって示す。図１に示されるのは、株によって天然に発現される野生型髄膜炎菌ＮＨＢＡの発現と比較した、ｓｉａＤ－ｇａｌＥ、ｌｐｘＬ１及びｆｈｂｐ遺伝子座が撹乱されたが、組み換えＮＨＢＡ遺伝子がマルチコピーｐＦＰ１２－ＮＨＢＡプラスミドによって提供された同じ親株への抗ＮＨＢＡポリクローナル抗体の強化された結合でもある。

ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ又はＮＨＢＡを含有するＮＯＭＶワクチンの調製及び特性決定。

ＮＯＭＶ調製
外膜小胞（ＯＭＶ）は、ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ又はＮＨＢＡ完全長タンパク質及び誘導体を発現するように遺伝子組み換えされた髄膜炎菌種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ｓｐｐ．）の培養された株から調製される。ＯＭＶは、好ましくは、培養培地から細菌細胞を分離し（例えば、ろ過又は細胞をペレット化する低速遠心分離などにより）、細胞を溶解させ（例えば、洗剤の添加、浸透圧衝撃、超音波処理、キャビテーション、均質化などにより）、且つ細胞質分子から外膜画分を分離すること（例えば、ろ過；又は外膜及び／若しくは外膜小胞の示差的沈殿若しくは凝集又は外膜分子を特異的に認識するリガンドを用いたアフィニティー分離方法；又は外膜及び／若しくは外膜小胞をペレット化する高速遠心分離などにより）により、ブロス又は固体培地中で増殖された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）から得られ；外膜画分は、ＯＭＶを生成するために使用され得る。

ＯＭＶを、Ｆｒａｎｔｚ＋ラクテート又は４ｍＭのラクテートの代わりに２０ｍＭを含有する既知組成培地（ＣＤＭ）（Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１５，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ８３：１２５７－１２６４）中で増殖された髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）から得て、ＴＳＢ（トリプシンソイブロス、非動物由来）寒天プレートにおける細菌の一晩コロニーから０．１５～０．２のＯＤ_{６２０ｎｍ}まで細菌を接種した。培養物を５％のＣＯ_２中で３７℃においてインキュベートし、培地の体積を、ＯＤ_{６２０ｎｍ}＝約０．１５で２４ｍＬの培地に接種された個々のコロニーから開始して、培養物を、ＯＤ_{６２０ｎｍ}が０．６～０．７に達するように次のより大きい体積になるまで移すことによって１Ｌまで連続して増加させた（すなわち２４ｍＬ～９０ｍＬ～３００ｍＬ～１Ｌ）。最終的な体積に達したとき、培養物を、通気式の囲いを有する振とうフラスコ中でさらに１５時間にわたって増殖させておいた。次に、細菌を遠心分離し（１０，０００×ｇ、２０分間）、上清をガラス繊維フィルタに通してろ過して、残屑を除去し、次に滅菌ろ過し（０．２２μｍフィルタ）、限外ろ過（１００ｋ又は３０ｋカットオフフィルタ、Ａｍｉｃｏｎ）によって濃縮し、ベンゾナーゼを加えた（１０００Ｕ／Ｌ）。ベンゾナーゼ処理を周囲温度で少なくとも１時間続けた。濃縮したろ液を遠心分離して（２０２，６０１×ｇ、１．５時間、４℃）、ＮＯＭＶを収集した。ＮＯＭＶを１０ｍＭのトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．４、３％（ｗ／ｖ）のスクロース中で懸濁させ、前の工程に記載されるように再度遠心分離し、最後に、ＤＣタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって決定した際に１～３ｍｇ／ｍｌのタンパク質の濃度になるまで、トリス／スクロース溶液中で懸濁させた。ＮＯＭＶ製剤を使用するまで－７０℃で冷凍貯蔵した。

ＥＬＩＳＡアッセイ
ＮＯＭＶワクチン（ＮＯＭＶで表示されるタンパク質）中でＭｅｔＱ又はＭｅｔＱＳＭの発現を決定するために、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、精製されたＮＯＭＶ－ＭｅｔＱ又はＮＯＭＶ－ＭｅｔＱＳＭの滴定と共に４℃で一晩被覆した。プレートをＰＢＳ中において１％のＢＳＡ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０でブロックした。一定の濃度（１μｇ／ｍｌ）のＭｅｔＱポリクローナル抗体をＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ ２０中で希釈し、２時間にわたってプレートに加えた。プレートをアルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１：２，０００）又はヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１：２，０００）で１時間にわたって染色し、ｐ－ニトロフェニルリン酸（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて発色させた。ＭｅｔＱ及びＭｅｔＱＳＭについての結果が図５に示される。

実施例２ － 免役化
ＮＯＭＶ－ＧＮＡ１２２０、ＮＯＭＶ－ＭｅｔＱ、ＮＯＭＶ－ＭｅｔＱＳＭ若しくはＮＯＭＶ－ＮＨＢＡ製剤又は組み換えタンパク質を１０ｍＭのトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．４、３％（ｗ／ｖ）のスクロース中で希釈し、等しい体積の水酸化アルミニウムアジュバント（２％のＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）で吸着させた。ワクチンを免役化前の夕方に調製し、４℃で一晩インキュベートした。４～６週齢の雌ＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の群（群当たりＮ＝１０）を腹腔内で（ＩＰ）免疫化した。各マウスに、６００μｇのアジュバントと予め混合された、１０～２．５μｇのＮＯＭＶの総タンパク質又は１０ｕｇの組み換えＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ又はＮＨＢＡを含有する用量を投与した。それぞれ３週間の間隔を空けて、合計で３回の注入を与えた。第３の用量の２週間後、マウスを心穿刺によって出血させ、殺処分した。血清を分離し、－８０℃で冷凍貯蔵した。

実施例３ － ＮＯＭＶ－ＧＮＡ１２２０又はＮＯＭＶ－ＭｅｔＱによる鼻腔内免役化
防御粘膜抗体応答が鼻腔内ワクチン接種によって生成され得るかどうかを決定するために、ＣＤ１マウスに５０μｇのＮＯＭＶ－ＧＮＡ１２２０、ＮＯＭＶ－ＭｅｔＱ又はＮＯＭＶ－ＭｅｔＱＳＭワクチンを鼻腔内接種する。マウスにイソフルラン麻酔をかけて、１０μｌのワクチン製剤を各鼻孔に適用し、それを吸入させる。マウスを、３～４週間の間隔を空けて２～３回免疫化する。５μｇのワクチンの１回の腹腔内注入も１～２回の鼻腔内処置と組み合わせる。

実施例４ － ＣＤ１マウスにおけるタンパク質を含有するＮＯＭＶワクチンに対する抗体応答の特性決定
組み換えＭｅｔＱ（ｒＭｅｔＱ）、ＮＯＭＶ－ＭｅｔＱ、ＮＯＭＶ－ＭｅｔＱＳＭワクチンで免疫化されたマウスで発生したポリクローナル抗体の結合活性について、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を２μｇ／ｍｌのｒＭｅｔＱタンパク質で４℃において一晩被覆した。プレートをＰＢＳ中の１％のＢＳＡ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０でブロックした。免疫化されたマウスからの血清をＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ ２０中で希釈し、２時間にわたってプレートに加えた。プレートをアルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（１：３，０００）二次抗体で１時間にわたって染色し、ｐ－ニトロフェニルリン酸（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて発色させた。４０５ｎｍのＯＤにおける吸光度をＥｍａｘ高精度プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定した。

図６は、ＩｇＧ力価が、１０μｇの用量のＮＯＭＶ－ＭｅｔＱを投与されたマウスを除いて、２．５～１０μｇのＮＯＭＶワクチンで免疫化されたマウスについて同様であったことを示し、平均力価は、全ての他の群と比較した際に有意に低かった。ｒＭｅｔＱで免疫化されたマウスについての平均ＩｇＧ力価は、全ての他の群より有意に高かった（ｐ＜０．０１）。

フローサイトメトリーを用いて、ｒＭｅｔＱ、ｒＮＨＢＡ、ＮＯＭＶ－ＭｅｔＱ、ＮＯＭＶ－ＭｅｔＱＳＭ、ＮＯＭＶ－ＧＮＡ１２２０及びＮＯＭＶ－ＮＨＢＡで免疫化されたマウスからのポリクローナル抗体の、生細菌への結合を比較した。淋菌株ＦＡ１０９０及びＭＳ１１及び髄膜炎菌血清型群Ｂ株ＭＤ１２２４への結合アッセイを、上述されるように行った。図７は、ワクチンの全てが、試験される両方の淋菌株に結合する抗体を誘発したことを示す。図１０は、ＮＯＭＶ－ＭｅｔＱ、ＮＯＭＶ－ＭｅｔＱＳＭ及びＮＯＭＶ－ＧＮＡ１２２０による免役化によって生じた抗体のみが抗血清の１：２００希釈でＮｍ株ＭＤ１２２４に結合することを示す。

Ｎｇ株ＦＡ１０９０及びＭＳ１１に対する、ｒＭｅｔＱ、ｒＮＨＢＡ、ＮＯＭＶ－ＭｅｔＱ、ＮＯＭＶ－ＭｅｔＱＳＭ、ＮＯＭＶ－ＧＮＡ１２２０及びＮＯＭＶ－ＮＨＢＡで免疫化されたマウスからのポリクローナル抗体の血清殺菌活性（ＳＢＡ）。細菌を、ＩｓｏＶｉｔａｌｅＸ（商標）（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充されたチョコレート寒天又は同等のプレートを５％のＣＯ_２で３７℃において一晩増殖させ、翌日、予め温めたチョコレート寒天ＩｓｏＶｉｔａｌｅＸ（商標）又は同等のプレートに継代した。プレートを５％のＣＯ_２で３７℃において５時間インキュベートした。細菌を、０．６のＯＤ_{６２０ｎｍ}まで０．１％のＢＳＡと共に０．１５ｍＭのＣａＣｌ_２及び１ｍＭのＭｇＣｌ_２（ＨＢＳＳ＋＋）を含有するハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中で懸濁させた。０．１％のＢＳＡによるＨＢＳＳ＋＋中の１：１２５００最終希釈（約５×１０^４ｃｆｕ／ｍｌを得るため）を殺菌９６ウェルプレートで達成した。免疫化されたマウスからの血清を、ヤギ抗マウスＩｇＭ（μ－鎖特異的）－アガロース抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてアッセイ前にＩｇＭから枯渇させ、ＨＢＳＳ＋＋中で連続希釈した。２０パーセント（体積／体積）のＩｇＧ及びＩｇＭが枯渇されたヒト血清を補体源として使用し、９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。プレートを５％のＣＯ_２で３７℃において３０分間インキュベートし、連続希釈物を平板培養して、コロニー形成単位（ｃｆｕ）を決定した。組み換えタンパク質による免役化が両方の淋菌株への同様の結合と共に等しい又はより高い抗体力価を生じたが、ＮＯＭＶ－ＭｅｔＱ及びＮＯＭＶ－ＮＨＢＡは、図８に示されるように、対応する組み換えタンパク質によって誘発される抗体より、淋菌株ＦＡ１０９０及びＭＳ１１に対してより高いＳＢＡ活性を有していた。

コロニー形成に対する、ｒＭｅｔＱ、ｒＮＨＢＡ、ＮＯＭＶ－ＭｅｔＱ、ＮＯＭＶ－ＭｅｔＱＳＭ、ＮＯＭＶ－ＧＮＡ１２２０及びＮＯＭＶ－ＮＨＢＡで免疫化されたマウスからのポリクローナル抗体の効果を、淋菌株ＦＡ１０９０及びＭＳ１１を用いて試験した。ＭＥ１８０細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３３）、ヒト子宮頸癌に由来する上皮細胞様細胞株を、１０％（体積／体積）のウシ胎仔血清及びペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）－ストレプトマイシン（１ｍｇ／ｍｌ）を補充されたマッコイ５Ａ培地中で維持した。付着アッセイのために、細胞を２．５×１０^５個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、２４時間にわたって３７℃において５％のＣＯ_２中でインキュベートした。コンフルエントでない単層（７０～８０％のコンフルエンス）を１００μｌの細菌（１０^７個の細菌／ｍｌ）で覆い、３７℃において５％のＣＯ_２中で１時間インキュベートし、毎回５分間にわたって３回、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中で洗浄した。アキュターゼ（１００μｌ／ウェル）を３７℃で１５分間にわたって加え、連続希釈物を平板培養して、コロニー形成単位（ｃｆｕ）を決定した。淋菌は、細菌に様々な栄養的ストレスを課す様々な生物学的ニッチにコロニー形成する。可変の栄養環境が細菌の表面に様々なタンパク質の発現をもたらす。ポリクローナル抗体を、２つの異なる条件においてＦＡ１０９０及びＭＳ１１コロニー形成に対する効果について試験した。図１０に示されるように、細菌をチョコレート寒天プレート上で増殖させた場合、コロニー形成は、抗ＮＯＭＶ－ＧＮＡ１２２０及び抗ＮＯＭＶ－ＮＨＢＡによって最も強く阻害された一方、抗ＮＯＭＶ－ＭｅｔＱＳＭ及び抗ＮＯＭＶ－ＮＨＢＡは、１０％（体積／体積）のＩｇＧ／ＩｇＭが枯渇されたヒト血清を含有するＣＤＭ中の液体培養物中で増殖された細菌に対して最も高い効果を有していた。

２つの用量の２．５μｇ、５μｇ又は１０μｇのＮＯＭＶ－ＭｅｔＱ、ＮＯＭＶ－ＭｅｔＱＳＭ、ＮＯＭＶ－ＧＮＡ１２２０、アジュバント単独又は１０μｇの組み換えＭｅｔＱ（ｒＭｅｔＱ）で免疫化されたマウスからのポリクローナル抗体の血清殺菌活性（ＳＢＡ）を、Ｂｅｅｒｎｉｎｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓｅａｓｅ ２１９：１１３１，２０１９に記載されるように決定した。図１１に示されるように、ＮＯＭＶ－ＭｅｔＱ、特にＮＯＭＶ－ＭｅｔＱＳＭを有するマウスは、ヒト補体でＳＢＡを媒介するために有効であり、これは、ヒトにおける保護と相関する。

概して、示されるデータは、髄膜炎菌ＮＯＭＶ中の保存された淋菌抗原による免役化によって生成された抗体が、淋菌及び髄膜炎菌株、ＳＢＡへのより高い結合及び対応する組み換えタンパク質による免役化によって生成された抗体よりコロニー形成機能活性の阻害を有するというエビデンスを提供する。

実施例５ － Ｎｍ及びＮｇ感染の初期段階におけるワクチン誘発性抗体による保護を評価するための条件付きで再プログラム化されたヒト上皮細胞培養（ＣＲＣ）モデル。
組織の特徴を再プログラム化することによってヒト初代上皮細胞培養を生成する能力は、比較的新しく、Ｎｍコロニー形成、発病及び両方からの保護に対するワクチン誘発性抗体の効果を評価するためのそれらの使用は新規である。感染の再初期段階におけるワクチン誘発性抗体による保護は、特に興味深く、なぜなら、これは、大規模な集団における疾患のコントロールのために重要であるものの歴史的にあまり研究されてこなかったためである。不死化ヒト細胞株（例えば、１６ＨＢＥ１４ｏ－及びＭＥ１８０）は、利用可能であるが、様々な細胞型及びＣＲＣ細胞の特徴を複製しない。ヒト組織外植片も重要であるが、入手しにくいため、試験されるために提供される比較的多数のワクチンによって誘発される抗体の効果を比較するために必要とされる数の実験を実施するのが難しい。髄膜炎菌コロニー形成の初代鼻上皮（ｐＮＥ）モデルが確立され、同様の方法がＮｇコロニー形成の初代子宮頸部モデルを確立するために使用されるであろう（Ｓｕｐｒｙｎｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２０１２；１０９（４９）：２００３５－４０）。総合すると、初代ヒト細胞培養モデルは、Ｎｍ及びＮｇコロニー形成及び浸潤の過程に作用するワクチン誘発性抗体の可能性を評価するための重要な及び革新的な手法を提供する。ＭＥ１８０ヒト子宮頸部細胞を、本明細書に記載される付着試験に使用し、ＣＲＣ細胞への付着も調べる。

実施例６ － Ｎｍ及びＮｇ感染の初期段階におけるワクチン誘発性抗体による保護を評価するためのヒトＣＥＡＣＡＭ１／ＦＨトランスジェニック（Ｔｇ）マウスモデル。
独自のヒトトランスジェニック（Ｔｇ）マウスモデルを、鼻腔内感染によってＮｍによってコロニー形成され、鼻咽頭から脳を囲む髄膜までの細菌の移動により髄膜炎様症状を急速に発生するコロニー形成（ＣＥＡＣＡＭ１）及び免疫防御（ＦＨ）を促進するヒト遺伝子を発現する機能的補体系により生成した。さらに、鼻咽頭から単離された非付着性細菌と付着性細菌を区別する、Ｔｇマウスモデルに対する技術的改善が加えられた。ヒトＣＥＡＣＡＭ１／ＦＨ Ｔｇマウスは、エストラジオール処置雌マウスモデルにおけるＮｇコロニー形成からのワクチン誘発性抗体による保護を測定するためにも有用であり得（Ｊｅｒｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０１１；２：１０７）、これは、ＣＥＡＣＡＭ１が、これらのマウスにおいて、子宮の表面及び子宮頸部を覆う円柱状上皮細胞で発現され、ＣＥＡＣＡＭ１へのＯｐａ結合がＮｇ結合及びこれらの組織への浸透を促進するためである（Ｉｓｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ２０１８；８６（８））。さらに、ＮｓｐＡ、ＰｏｒＢ２及びＬＯＳ誘導体によるヒトＦＨ結合は、免疫シールド及び場合により上皮細胞付着のためのさらなる機構を提供する。

実施例７ － ＮＯＭＶ中のＤＮＡの量を増加させるためのエレクトロポレーション
ＮＯＭＶ中のプラスミドの量を増加させるためのエレクトロポレーションを評価した。エレクトロポレーション効率を高めるために、ＮＯＭＶ：プラスミドＤＮＡの異なる比率、異なるエレクトロポレーション電圧及びパルス数を試験した。エレクトロポレーションの結果として、ｄｓＤＮＡの含量は、エレクトロポレーションなしの細胞内に存在するものと比較して、ＮＯＭＶで５倍まで増加した。

ＮＯＭＶ及びプラスミドＤＮＡを３００ｍＭのスクロース緩衝液中２：１の比率又は１：１の比率でエレクトロポレートした。詳細については以下の表１及び２を参照されたい。エレクトロポレーション後、残留／外部ＤＮＡを除去するために、試料をベンゾナーゼと共に一晩インキュベートした。ベンゾナーゼ処理後、ＮＯＭＶを１％のＳＤＳ溶液で溶解させ、ｄｓＤＮＡを、Ｑｕｂｉｔ（商標）１Ｘ ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて測定した。

Claims (19)

1. 淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）からの少なくとも１つの組み換えタンパク質を含む複数の細菌天然外膜小胞（ＮＯＭＶ）を含む医薬ワクチン組成物であって、前記淋菌組み換えタンパク質は、リポタンパク質であるか、又はリポタンパク質であるように修飾される、医薬ワクチン組成物。
2. 前記淋菌組み換えタンパク質は、表面が露出されていない前記タンパク質の部分を除去し、且つリポタンパク質シグナル配列を残りのＣ末端部分に付加することによって修飾され、前記淋菌組み換えタンパク質は、前記細菌の表面に提示され、及びＮＯＭＶは、リポタンパク質として前記細菌によって産生される、請求項１に記載の医薬ワクチン組成物。
3. 前記少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質は、ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ若しくはＮＨＢＡ又はそれらの誘導体若しくは断片或いはそれらの組合せである、請求項１又は２に記載の医薬ワクチン組成物。
4. 前記ＮＯＭＶは、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する、請求項１に記載の医薬ワクチン組成物。
5. 髄膜炎菌株は、Ｈ４４／７６である、請求項４に記載の医薬ワクチン組成物。
6. 淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）からの少なくとも１つの組み換えタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の菌株であって、前記少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質は、リポタンパク質であるか、又はリポタンパク質であるように修飾される、菌株。
7. 前記少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質は、ＧＮＡ１２２０、ＭｅｔＱ、ＭｅｔＱＳＭ若しくはＮＨＢＡ又はそれらの誘導体若しくは断片或いはそれらの組合せである、請求項６に記載の髄膜炎菌株。
8. 前記少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質は、プラスミド中の導入遺伝子から発現される、請求項７に記載の髄膜炎菌株。
9. 前記少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質は、細菌ゲノム中に挿入された導入遺伝子から発現される、請求項７に記載の髄膜炎菌株。
10. Ｈ４４／７６である、請求項６～９のいずれか一項に記載の髄膜炎菌株。
11. 前記髄膜炎菌株Ｈ４４／７６は、ポーリンＰｏｒＡを発現しない、請求項１０に記載の髄膜炎菌株。
12. 前記少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質をコードする前記導入遺伝子の発現は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）中の高い遺伝子転写率を生じる強力なプロモーター配列によって駆動される、請求項６～１１のいずれか一項に記載の髄膜炎菌株。
13. 前記強力なプロモーターは、ＰｏｒＡプロモーター又はその誘導体を含む、請求項１２に記載の髄膜炎菌株。
14. 前記プロモーターは、図２～４に示される配列を含む、請求項１３に記載の髄膜炎菌株。
15. 前記少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質をコードする前記導入遺伝子は、前記細菌ゲノムのｌｐｘＬ１遺伝子座中に挿入され、前記挿入は、アシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を撹乱し、前記撹乱は、ペンタアシル化されており、且つヘキサアシル化されていないリポオリゴ糖を前記細菌に生成させる、請求項６～１４のいずれか一項に記載の髄膜炎菌株。
16. 前記少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質をコードする前記導入遺伝子は、前記細菌ゲノムのｓｉａＤ－ｇａｌＥ遺伝子座中に挿入され、前記挿入は、莢膜多糖の発現及びリポオリゴ糖宿主抗原のシアリル化を撹乱する、請求項６～１４のいずれか一項に記載の髄膜炎菌株。
17. 前記少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質をコードする前記導入遺伝子は、ｓｉａＡ遺伝子座中に挿入される、請求項６～１４のいずれか一項に記載の髄膜炎菌株。
18. 前記少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質をコードする前記導入遺伝子は、ｆｈｂｐ遺伝子座（Ｈ因子結合タンパク質）中に挿入される、請求項６～１７のいずれか一項に記載の髄膜炎菌株。
19. 前記少なくとも１つの淋菌組み換えタンパク質をコードする前記導入遺伝子は、ｐｏｒＡ遺伝子座中に挿入される、請求項６～１７のいずれか一項に記載の髄膜炎菌株。

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