CN117535333B - 促进淋球菌外膜囊泡分泌的方法、淋球菌敲除株及其制备方法和应用 - Google Patents

促进淋球菌外膜囊泡分泌的方法、淋球菌敲除株及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种促进淋球菌外膜囊泡分泌的方法、淋球菌敲除株及其制备方法和应用，涉及微生物技术领域。本发明通过降低和/或抑制淋球菌中MlaA基因；和/或，降低和/或抑制MlaA蛋白促进淋球菌外膜囊泡分泌；本发明通过敲除质粒介导的同源重组敲除淋球菌中的MlaA基因，获得了MlaA基因缺失的淋球菌敲除株，为淋球菌的基础研究和应用提供了物质和方法基础。

Description

促进淋球菌外膜囊泡分泌的方法、淋球菌敲除株及其制备方 法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种促进淋球菌外膜囊泡分泌的方法、淋球菌敲除株及其制备方法和应用。
背景技术
淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae），简称淋球菌，是革兰阴性双球菌。淋病是由淋球菌引起的一种常见泌尿生殖系统性传播感染性疾病。男性表现为尿道炎，女性为宫颈炎或尿道炎等。若未及时治疗，男性可上行感染引起附睾炎，女性可引起包括盆腔炎、不孕和异位妊娠等并发症，还可促进HIV的感染和传播。抗菌药是目前治疗推荐淋病的首选方法，但WHO监测数据显示淋球菌几乎对现有推荐抗生素包括磺胺类、青霉素类、四环素、环丙沙星以及阿奇霉素和头孢曲松都产生了耐药，特别是对一线药物头孢曲松高度耐药株（超级淋球菌）的出现，使得能有效治疗淋病的抗菌药物正在迅速减少，抗生素耐药严重影响了淋病治疗的有效性。
革兰阴性菌包膜由内膜（IM）和外膜（OM）组成，其不对称外膜是具有选择性的渗透屏障。维持脂质不对称（Mla）途径因其在细菌细胞包膜生理学中的作用而越来越受到重视。Mla系统由Mla A~F 6种蛋白组成。Mla A（Vac J）位于外膜内，充当从外小叶穿梭磷脂的通道，Mla A缺失会破坏外膜的完整性。进一步探究Mla A在淋球菌中的作用，对了解淋球菌的生理生化性质，以及对淋病治疗的药物的研发具有重要作用。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供促进淋球菌（Neisseria gonorrhoeae）外膜囊泡分泌的方法以及具有能够分泌更多外膜囊泡的基因敲除淋球菌突变株，本发明的另一目的是提供缺失了MlaA基因的淋球菌敲除株的制备方法，为淋球菌的基础研究和应用提供了物质和方法基础。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，提供了一种促进淋球菌（Neisseria gonorrhoeae）外膜囊泡分泌的方法，包括降低和/或抑制淋球菌中MlaA基因；和/或，降低和/或抑制MlaA蛋白。
优选地，降低和/或抑制淋球菌中MlaA基因包括沉默或敲除淋球菌的MlaA基因。
根据本发明的一个方面，还提供了一种敲除淋球菌MlaA基因的方法，包括使用敲除质粒介导同源重组片段替换淋球菌MlaA基因；所述同源重组片段包括MlaA基因上游同源臂、抗性基因和MlaA基因下游同源臂，所述敲除质粒中含有筛选标记基因。
优选地，包括将含有所述敲除质粒的供体菌和受体菌混合，然后在含有氯霉素的培养基上培养，筛选阳性克隆；然后将筛选的阳性克隆在含有蔗糖的培养基中培养，再次筛选阳性克隆；所述受体菌为待敲除MlaA基因的淋球菌；
根据本发明的一个方面，还提供了一种淋球菌敲除株，所述淋球菌敲除株缺失MlaA基因。
优选地，所述淋球菌敲除株中的MlaA基因替换为抗性基因。
优选地，所述淋球菌敲除株采用上述方法制备得到。
根据本发明的一个方面，还提供了上述促进淋球菌外膜囊泡分泌的方法，或上述敲除淋球菌MlaA基因的方法，或上述淋球菌敲除株在如下任意一项中的应用：
（a）制备淋球菌抑制剂、抗淋球菌的药物或用于预防、缓解或治疗淋球菌感染疾病的药物；
（b）生产淋球菌外膜囊泡，或制备用于生产淋球菌外膜囊泡的产品；
（c）制备淋球菌外膜囊泡疫苗。
根据本发明的一个方面，还提供了用于降低和/或抑制淋球菌中MlaA基因；和/或，降低和/或抑制MlaA蛋白的物质在如下任意一项中的应用：
（a）制备淋球菌抑制剂、抗淋球菌的药物或用于预防、缓解或治疗淋球菌感染疾病的药物；
（b）生产淋球菌外膜囊泡，或制备用于生产淋球菌外膜囊泡的产品；
（c）制备调节淋球菌外膜的产品。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过实验发现，敲除MlaA基因的淋球菌能够促进淋球菌外膜囊泡分泌，其外膜囊泡的分泌量大约是未敲除MlaA基因淋球菌的1.9倍，并且敲除MlaA基因的淋球菌能够分泌更多的粒径更小的外膜囊泡（30~100nm）。基于该发现，本发明提供了一种促进淋球菌外膜囊泡分泌的方法，该方法通过降低和/或抑制淋球菌中MlaA基因和/或蛋白实现促进淋球菌外膜囊泡分泌。并且本发明还提供了敲除MlaA基因的方法以及敲除了MlaA基因的淋球菌，本发明提供的敲除MlaA基因的方法操作简单，可以准确的筛选出敲除MlaA基因的阳性克隆菌株，本发明提供的敲除MlaA基因的淋球菌外膜囊泡分泌的量显著的高于野生型菌株，丰富了淋球菌的基础研究和应用的物质和方法基础。并且，由于OMV与细菌耐药密切相关，因此MlaA基因可能作为潜在的协助治疗靶点，上述敲除MlaA基因的方法以及敲除MlaA基因的淋球菌为抗淋球菌制剂、疫苗和药物的研发，以及制备用于预防、缓解或治疗淋球菌感染疾病的药物的研发提供了更多的研究方法和实验模型。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为pCVD442载体的质粒图谱；
图2为本发明实施例1构建的WHO L ΔMlaA株MlaA-in引物的PCR鉴定结果图，图中M：DNA Marker（DL 2000）；1：阴性对照；2：野生型WT；3：WHO L ΔMlaA突变株；
图3为本发明实施例1构建的WHO L ΔMlaA株MlaA-out引物的PCR鉴定结果图，图中M：DNA Marker（DL 2000）；1：野生株WT；2-3：WHO L ΔMlaA株；
图4为本发明实施例1构建的WHO L ΔMlaA株蛋白水平的Western blot鉴定，图中M：DNA Marker（DL 2000）；1：野生株WT；2-3：WHO L ΔMlaA株；
图5为WHO L ΔMlaA株与野生菌株的生长特性曲线，其中横坐标代表时间，纵坐标代表利用比浊法测定的OD600值；
图6为膜应激环境下WHO L ΔMlaA株与野生菌株的生长变化，其中横坐标代表时间，纵坐标代表利用比浊法测定的OD600值；
图7为WHO L ΔMlaA株与WT株的透射电镜观察，从左至右比例尺分别为2μm，500nm和200 nm；
图8为WHO L ΔMlaA株与WT株的扫描电镜观察，从左至右比例尺分别为1 μm，500nm 和400 nm；
图9为WHO L ΔMlaA株与WT株的分泌的OMV的浓度比较结果，x±s，n=3，t检验，与WT型比较：p＜0.05；
图10为纳米粒径检测仪NTA检测WHO L ΔMlaA株与WT株分泌的OMV浓度和粒径分析的检测呈像图；
图11为WHO L ΔMlaA株与WT株分泌的粒径为30~100nm的浓度比较结果x±s，n=3，t检验，与WT型比较：p＜0.001。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
定义：
本文中，淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae）也简称为淋球菌，淋病奈瑟氏菌和淋球菌可以互相任意替换使用。
本文中“MlaA”无特指时表示MlaA基因和/或MlaA蛋白，MlaA基因表示编码MlaA蛋白的核苷酸片段，其可以是编码完整MlaA蛋白，也可以是编码MlaA蛋白的部分核苷酸片段。因此，本文中无特地指明的前提下，沉默或缺失MlaA基因可以为缺失完整的MlaA基因，也可以是MlaA基因其中的部分片段，当沉默或缺失MlaA基因其中的部分片段时，将导致缺失后的不完整的MlaA基因无法转录和表达MlaA蛋白。本文中MlaA不区分大小写。
本发明通过实验发现，敲除淋球菌的MlaA基因能够促进淋球菌外膜囊泡分泌，敲除MlaA基因的淋球菌外膜囊泡的分泌量大约是野生淋球菌的1.9倍，并且敲除MlaA基因的淋球菌能够分泌更多的粒径更小的外膜囊泡（30~100nm）。上述发现说明淋球菌中MlaA基因/蛋白与外膜囊泡的分泌量相关，根据上述发现，本发明提供了一种促进淋球菌（Neisseria gonorrhoeae）外膜囊泡分泌的方法，该方法包括降低和/或抑制淋球菌中MlaA基因；和/或，降低和/或抑制MlaA蛋白。
本发明中降低和/或抑制淋球菌中MlaA基因指的是相比于未经介入手段干预的淋球菌，MlaA基因的转录水平降低或MlaA基因从淋球菌中敲除，可选的实施方式中，降低和/或抑制淋球菌中MlaA基因包括沉默或敲除淋球菌的MlaA基因。
本发明中降低和/或抑制淋球菌中MlaA蛋白指的是相比于未经介入手段干预的淋球菌，MlaA蛋白的含量降低或活性降低，例如通过抑制MlaA基因转录水平来降低MlaA蛋白含量，或通过施用抑制剂降低MlaA蛋白活性。
根据本发明的另一个方面，还提供了一种敲除淋球菌MlaA基因的方法，该方法包括使用敲除质粒介导同源重组片段替换淋球菌MlaA基因；所述同源重组片段包括MlaA基因上游同源臂、抗性基因和MlaA基因下游同源臂，所述敲除质粒中含有筛选标记基因。
敲除质粒一般是R质粒的衍生物粒，往往具备广泛的宿主范围和基因接合转移等特征。在敲除质粒的复制过程中需要一种大部分细菌无法形成的蛋白。所以当敲除质粒进入寄生细菌后，不是无法复制导致被消灭；就是整合到细菌基因组中，和染色体一同复制。根据敲除质粒这一特性，利用缺失基因两端的同源片段，对敲除质粒进行整合位点定位，从而将基因工程技术构建的基因缺失DNA片段克隆成敲除质粒。而精确基因缺失菌株则是通过同源性DNA片段可发生重组的原理构建的。选择合适的敲除质粒，是构建基因敲除工程菌的关键所在，主要是需满足以下条件：①受体菌中不能复制敲除质粒；②敲除质粒需包含可供选择的抗性标记，且在整合到染色体内以后才能选用；③敲除质粒具有多克隆位点，较易克隆。
可选的实施方式中，筛选标记基因位于非同源重组区域。同源重组时，敲除质粒中的同源重组片段与淋球菌发生同源重组，同源重组片段以外区域被切除。而随机整合是在载体的两端将整个载体连入染色体内，发生同源重组的淋球菌染色体内只含有同源重组片段中的抗性基因，发生随机整合的淋球菌内同时含有上述抗性基因和筛选标记基因。将发生随机整合的淋球菌置于筛选标记基因对应的培养环境中将导致发生随机整合的淋球菌死亡，实现过滤掉未同源重组的淋球菌的目的。
可选的实施方式中，敲除质粒为pCVD442，含有sacB筛选基因。这种敲除载体是通过等位基因交换在宿主菌株中产生突变的。该载体包括来自质粒R6K的pir依赖性复制起源，允许通过含有tra位点的菌株的接合进行有效转移的mob区域，以及革兰氏阴性菌中对蔗糖敏感的sacB基因。质粒pCVD442通过接合转移进入受体菌并进行同源片段交换。
可选的实施方式中，所述抗性基因为氯霉素抗性基因，所述筛选标记基因为sacB基因。在含有氯霉素的培养基中，氯霉素抗性基因替换了MlaA基因的淋球菌可以生存，实现正向筛选；sacB基因是蔗糖敏感基因，含有该基因的淋球菌在含有蔗糖的培养基中无法生存，因此可以过滤掉发生随机整合的淋球菌，实现反向筛选。
可选的实施方式中，MlaA基因上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，MlaA基因下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
可选的实施方式中，包括将含有所述敲除质粒的供体菌和受体菌混合，然后在含有氯霉素的培养基中培养，筛选阳性克隆；然后将筛选的阳性克隆在含有蔗糖的培养基中培养后在还含有氯霉素的培养基中培养，再次筛选阳性克隆；所述受体菌为待敲除MlaA基因的淋球菌。
可选的实施方式中，供体菌为大肠杆菌β2155菌。
可选的实施方式中，受体菌为淋球菌WHO L株。
可选的实施方式中，在含有氯霉素的培养基中培养，筛选阳性克隆的步骤中，使用核苷酸序列分别为SEQ ID NO. 3和4所示的引物和SEQ ID NO. 5和6所示的引物筛选，阳性克隆的扩增产物分别为1305bp和1307bp。
可选的实施方式中，在含有蔗糖的培养基中培养后在还含有氯霉素的培养基中培养，再次筛选阳性克隆的步骤中，使用核苷酸序列分别为SEQ ID NO.7和8所示的引物和SEQID NO. 9和10所示的引物筛选。SEQ ID NO.7和8所示的引物扩增后阳性克隆产物2587bp，野生株产物2510bp；和SEQ ID NO. 9和10所示的引物扩增后，阳性克隆无扩增产物，野生株扩增产物为337bp。
根据本发明的另一方面，还提供了一种淋球菌敲除株，该淋球菌敲除株缺失MlaA基因。
可选的实施方式中，所述淋球菌敲除株中的MlaA基因替换为抗性基因，抗性基因可选择本领域常规的、成熟的抗性基因，如选自氯霉素抗性基因。
可选的实施方式中，所述淋球菌敲除株的出发菌株为淋球菌WHO L株。
可选的实施方式中，缺失MlaA基因的淋球菌敲除株是采用上述敲除淋球菌MlaA基因的方法制备得到的菌株。
根据本发明的另一方面，还提供了上述促进淋球菌外膜囊泡分泌的方法，或上述敲除淋球菌MlaA基因的方法，或上述淋球菌敲除株在如下任意一项中的应用：
（a）制备淋球菌抑制剂、抗淋球菌的药物或用于预防、缓解或治疗淋球菌感染疾病的药物，本发明提供的缺失MlaA基因的淋球菌为淋球菌相关实验提供了新的实验工具和方法，丰富了淋球菌抑制剂、抗淋球菌的药物或用于预防、缓解或治疗淋球菌感染疾病的药物的研发和制备的物质和方法基础。
（b）生产淋球菌外膜囊泡，或制备用于生产淋球菌外膜囊泡的产品。
（c）制备淋球菌外膜囊泡疫苗。
根据本发明的另一方面，还提供了用于降低和/或抑制淋球菌中MlaA基因；和/或，降低和/或抑制MlaA蛋白的物质在如下任意一项中的应用：
（a）制备淋球菌抑制剂、抗淋球菌的药物或用于预防、缓解或治疗淋球菌感染疾病的药物；
（b）生产淋球菌外膜囊泡，或制备用于生产淋球菌外膜囊泡的产品；
（c）制备调节淋球菌外膜的产品。
可选的实施方式中，所述用于降低和/或抑制淋球菌中MlaA基因的物质包括前述实施方式中使用的敲除质粒，以实施对淋球菌中MlaA基因的敲除。
可以理解的是，上述涉及制备产品的应用中，所述产品还任选地包括本领域可接受的、常规的组分，例如至少一种淋球菌培养基或至少一种用于组成淋球菌培养基的组分，包括但不限于盐、氨基酸、糖类和血清等。用于分离和纯化淋球菌或淋球菌外膜囊泡的试剂、设备或耗材等。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
下述实施例中主要使用的材料有：
（1）淋病奈瑟氏菌WHO L株，以下也简称WHO L菌株。本文实施例中使用的淋病奈瑟氏菌WHO L株由南方医科大学皮肤病医院存有。
（2）MlaA同源臂基因由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并装入pCVD442载体，甘油保存至-40℃冰箱中。pCVD442载体的质粒图谱如图1所示。
（3）主要试剂：LB肉汤培养基、HRP标记的山羊抗鼠二抗和蔗糖购于生工生物工程（上海）股份有限公司；羊血、TM固体培养基购自江门市凯林贸易有限公司；蛋白Maker购于Thermo Fisher公司；高保真酶购于宝生物工程（大连）有限公司；SDS-PAGE LoadingBuffer购于康为世纪生物科技有限公司；MlaA兔多克隆抗体由本课题组前期制备并保存（参见文献李晓晓, 刘明靓, 江银波, et al. 淋球菌MlaA重组蛋白表达及多克隆抗体的制备与应用 [J]. 中国病原生物学杂志, 2023,18(01):19-22+29.）；所有引物合成和测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
（4）引物设计及合成：
根据MlaA基因序列设计引物，用于扩增MlaA基因的上、下游同源臂及验证缺失株的特异性引物，引物信息表见表1。
表1引物序列
实施例1
构建MlaA基因缺失的淋病奈瑟氏菌WHO L株。
（1）菌株准备：
复苏WHO L菌株，于37℃、5%CO2培养箱培养过夜，次日挑单克隆至2ml淋球菌肉汤培养基中，37℃过夜培养，作为受体菌。
将构建好的敲除质粒pCVD442-MlaA-cm转化大肠杆菌β2155菌，pCVD442-MlaA-cm含有同源重组片段，同源重组片段包括MlaA基因上游同源臂（SEQ ID NO.1）、氯霉素抗性基因和MlaA基因下游同源臂（SEQ ID NO.2）。次日挑单克隆至2ml含DAP和氨苄青霉素的LB培养基，37℃，220rpm培养过夜至对数生长中期，作为供体菌。
（2）接合反应：
分别吸取0.5ml供体菌和受体菌至2支1.5ml无菌Ep管，8000rpm，离心5min，弃上清，菌体用1ml肉汤培养基轻轻悬浮洗涤，8000rpm，离心5min，弃上清。按供体菌/受体菌1:1的体积比混合后，铺至接合平板滤膜上，30℃静置吸干后倒置培养过夜。次日，用肉汤将滤膜上的菌体洗涤下来。
取100μl上述菌液涂至含氯霉素的淋球菌培养板，30℃、5%CO2培养箱培养过夜。挑取单克隆分别采用5’和3’端引物进行PCR鉴定（筛选引物1和筛选引物2）。阳性克隆两侧分别有1305bp和1307bp的片段扩增。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，120v，30min。
（3）蔗糖二次筛选：
选取PCR结果两侧均有扩增的单克隆，继续进行培养。次日用等体积含10%蔗糖LB溶液悬浮洗涤，并重悬等体积蔗糖溶液，30℃培养过夜。次日，吸取适量上述细菌培养物涂布至含氯霉素的淋球菌培养板上，37℃培养至单克隆形成。挑取多个单克隆到LB培养基，以原始菌株和空白作为对照。
取2μl用MlaA基因内部引物（MlaA-in）进行PCR鉴定，野生株预计扩增片段为337bp，MlaA缺失突变株无扩增条带。扩增结果如图2所示，结果显示，野生株在337bp处可见预期大小的PCR条带，而在MlaA缺失突变株和空白对照处，未见PCR条带，提示MlaA缺失突变株构建成功。
同时取2μl用MlaA基因同源臂两侧引物（MlaA-out）进行PCR鉴定，野生菌的扩增产物长度为2510bp，MlaA缺失突变株的长度为2587bp，扩增产物送测序，测序引物分别为mla-outF和mla-outR双向测通。结果显示野生菌扩增产物长度为2510bp，MlaA缺失突变株的长度为2587bp（图3）。测序结果显示野生株扩增片段与WHO L株MlaA基因及两侧同源臂可完全配对，而MlaA缺失突变株扩增序列则可与氯霉素抗性基因相匹配，提示MlaA缺失突变成功，且原MlaA基因已被氯霉素抗性基因取代。将该缺失菌株命名为WHO L ΔMlaA株。
敲除株蛋白水平的鉴定：使用MlaA抗体对WHO L ΔMlaA株和野生株MlaA蛋白进行Western blot鉴定，结果如图所示，野生株在35KDa左右可见MlaA蛋白条带，而WHO L ΔMlaA株为阴性无条带显示（图4），进一步提示MlaA基因敲除成功。
实施例2
MlaA基因对淋球菌膜应激环境下的生长影响：
同时添加去垢剂SDS和金属离子螯合剂EDTA模拟膜应激条件下，将淋球菌野生株与MlaA基因敲除株采用淋球菌肉汤培养基在5%、37℃、CO2培养箱进行培养，分别在不同时间点测定OD600，并绘制生长曲线。以野生型菌株和WHO L ΔMlaA株正常生长作为对照，探讨MlaA对淋球菌生长的影响。
结果如图5和图6所示，统计分析24小时处的OD600，敲除株和野生株两者的细菌活性差异具有统计学意义（P<0.05）。淋球菌野生株与WHO L ΔMlaA株在正常淋球菌肉汤培养条件下，两者的生长曲线无显著差异（图5）。而在添加去垢剂SDS和金属离子螯合剂EDTA模拟膜应激条件下，发现WHO L ΔMlaA株相对野生株存在严重的生长缺陷（图6）。结果表明淋球菌MlaA基因的缺失，使其失去对SDS/EDTA膜应激的抗性，表明MlaA基因缺失可能使淋球菌外膜稳态受损。
实施例3
（一）MlaA基因对淋球菌外膜囊泡（OMV）生成的影响
将淋球菌野生株与WHO L ΔMlaA株采用0.22 μm滤器过滤后的淋球菌肉汤培养基在5%、37℃、CO2培养箱进行培养，次日至对数生长期，收集菌液。取0.5麦氏点等量的菌液50ml进行离心，300×g离心10 min，弃去细菌沉淀。2000 ×g离心10 min，弃去死细菌沉淀物，将上清用0.45 μm的滤膜过滤。10,000 ×g离心30 min，弃去细胞碎片沉淀物，其上清用0.22 μm的滤膜过滤。置入超速离心管中，140,000 ×g离心90 min。并用0.1 μm过滤后的PBS洗涤2次，140,000 ×g 离心90 min。小心弃上清，用300 μLPBS，轻柔吹打混匀。采用NTA进行定量和粒径分析，并通过负染透射电镜和扫描电镜分析其形态改变。
透射电镜成像中，淋球菌外膜凸起的小泡，即为分泌的外膜囊泡（OMV）（图7）。扫描电镜成像中（图8），显示WHO L ΔMlaA株与野生株的形态存在差异，具体表现为WHO L ΔMlaA株以较散在的形式排列；继续放大倍数观察，发现在500nm和400 nm的比例尺下，WHO LΔMlaA株较野生株相比，双球菌菌体呈现出明显的小泡状凸起现象，可能为囊泡状结构的凸起形成OMV。
（二）MlaA基因对淋球菌OMV分泌的影响
将（一）中通过超速离心法提取的OMV利用纳米粒径检测仪NTA对WHO L野生株和WHO L ΔMlaA株分泌的OMV进行浓度和粒径分析，WHO L ΔMlaA株的OMV分泌量明显升高（P<0.05），WHO L ΔMlaA株OMV的分泌量大约是野生株的1.9倍（如图9所示），并且从检测呈像图更直观地看出同体积下敲除株OMV的密度更高（如图10所示）。从峰图可以看出，野生株与敲除株两者相比较，OMV粒径分布较均一化，进一步统计分析发现（参见图11）两者分泌的OMV中大多集中在30~200 nm，并且在30~100 nm的范围内两者差异更为显著（P<0.001），提示WHO L ΔMlaA株可能分泌更多的小囊泡。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (3)

1.敲除淋球菌MlaA基因的方法，其特征在于，包括使用敲除质粒介导同源重组片段替换淋球菌MlaA基因；所述同源重组片段包括MlaA基因上游同源臂、氯霉素抗性基因和MlaA基因下游同源臂，所述敲除质粒中含有筛选标记基因，筛选标记基因位于非同源重组区域；所述敲除质粒为pCVD442，筛选标记基因为sacB基因；
所述方法包括将含有所述敲除质粒的供体菌和受体菌混合，然后在含有氯霉素的培养基上培养，筛选阳性克隆；然后将筛选的阳性克隆在含有蔗糖的培养基中培养，再次筛选阳性克隆；所述受体菌为待敲除MlaA基因的淋球菌；
所述供体菌为大肠杆菌β2155菌；所述受体菌为淋球菌WHO L株；
所述上游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种促进淋球菌外膜囊泡分泌的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的敲除淋球菌MlaA基因的方法对淋球菌的MlaA基因进行敲除，所述淋球菌得到的外膜囊泡的粒径为30~100nm。
3.权利要求1所述的敲除淋球菌MlaA基因的方法，或权利要求2所述的促进淋球菌外膜囊泡分泌的方法在生产淋球菌外膜囊泡，或制备用于生产淋球菌外膜囊泡的产品中的应用，所述淋球菌外膜囊泡的粒径为30~100nm。
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Title
Neisseria gonorrhoeae MlaA influences gonococcal virulence and membrane vesicle production;Baarda 等;《PLoSPathog》;20190307;第15卷(第3期);摘要、第4页第3段、第26页第3段、图7 *

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