JP6867866B2 - 細菌のポリシストロン性発現系 - Google Patents
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Description
物によるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質などの産物の組換え工学技術および発
現に関する。より具体的には、本発明は、微生物によるそのような産物の発現のためのポ
リシストロン性発現構築物またはカセットに関し、さらに、関連ベクター、形質転換宿主
、対象へのそのように発現した産物の送達、特に治療的送達などの使用および応用に関す
る。
開発されている。異種または同種遺伝子発現のための系が原核生物、酵母および真菌なら
びに哺乳類細胞において確立された。
Saccharomyces cerevisiae)を宿主系として用いて発現された。これにもかかわらず、い
くつかの制限がS.セレビシエ(S. cerevisiae)系に検出された。例は、通常低い産物
の収量および非効率的な分泌(多くのS.セレビシエ(S. cerevisiae)タンパク質は、
培地中に遊離の状態で見いだされずに、細胞周辺腔に保持または細胞壁と結合している)
(Dominguezら、Int. Microbiol.、1998年、1巻(2号)、131〜142頁)である。酵母にお
ける産生の制限があるため、安価なブロス中で増殖させるのが容易であり、組換えタンパ
ク質を製造するために頻繁に用いられている、細菌におけるタンパク質の発現が大きな関
心を呼んだ。原核生物系のうちで、最高のタンパク質レベルは、通常、大腸菌(Escheric
hia coli)(E. coli)における組換え発現を用いて得られる(Jana & Deb. Appl. Micro
biol. Biotechnol.、2005年、67巻(3号)、289〜298頁)。しかし、大腸菌(E. coli)に
おいて、最も一般的に用いられている産生戦略は、細胞内(周辺質または細胞質中)であ
り、したがって、費用がかかり、しばしば問題のある下流精製工程を含む。
米国特許第5,559,007号)ならびに抗原および/または治療上関連するポリペプ
チドのin vivoまたはin situでの発現および送達(例えば、国際公開第9
7/14806号)のための宿主としてますます重要になりつつある。これらのグラム陽
性菌宿主において産生される異種タンパク質は、培地中に容易に分泌させることができ、
それにより、それらの精製ならびに対象へのそれらの直接的送達が促進される。
て)を非常に首尾よく取り扱うことができる。しかし、場合によって、複数のタンパク質
もしくは多重遺伝子性タンパク質複合体を発現することができる、例えば、抗体もしくは
タンパク質複合体のin vitro発現だけでなく、特定の疾患において相乗効果を有
する2つ以上のタンパク質のin vivoもしくはin situ発現および送達また
は抗体もしくはその機能性(多重遺伝子性)断片のin vivoもしくはin sit
u発現および送達も可能である発現系を有することが望ましい。これらの場合、多重遺伝
子の緊密な共調節が必要であるため、1つのプロモーターの制御下で所望のタンパク質ま
たは抗体をコードしている多重遺伝子を有することが望ましい。
現させ、精製したサブユニットのin vitroでの再構成を実施すること、または適
切な宿主においてサブユニットを共発現させることによりin vivoでの再構成を実
施することである(Selleck & Tan、「Recombinant protein complex expression in E.
coli」、Curr. Protoc. Protein Sci.、2008年、chapter 5:unit 5、21頁)。in vi
troでの再構成は成功裏に使用されたが、方法が冗長であり(各サブユニットを発現さ
せ、精製しなければならず、再構成の後に複合体をさらに精製しなければならない)、再
構成の収率がしばしば低い。これに反して、共発現によるin vivoでの再構成は、
効率の良さ(1ラウンドの発現および精製のみ)ならびに所望の複合体の潜在的により高
い収率および質(複合体の再折りたたみおよび集合が細胞環境におけるタンパク質折りた
たみ酵素の存在下で起こる)という利点がある(Selleck & Tan、2008年、前出)。in
vivoでの再構成は、個々のタンパク質サブユニットを発現するバキュロウイルスを
昆虫細胞に共感染させることにより(Tirodeら、Mol. Cell、1999年、3巻(1号)、87〜9
5頁)、また複数のプラスミドにより(Johnstonら、Protein Expr. Purif.、2000年、20
巻(3号)、435〜443頁、McNallyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1988年、85巻(19号) 7
270〜7273頁)または特殊化したポリシストロン性プラスミドにより(Henricksenら、J.
Biol. Chem.、1994年、269巻(15号)、11121〜11132頁、Ishiaiら、J. Biol. Chem.、1996
年、271巻(34号)、20868〜20878頁、Liら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1997年、94巻(
6号)、2278〜2283頁)細菌において成功裏に行われた。
ン性発現系が記載された(Selleck & Tan、2008年、前出、Tan、Protein. Expr. Purif.
、2001年、21巻(1号)、224〜234頁、Tanら、Protein Expr. Purif.、2005年、40巻(2号)
、385〜395頁)。これらの系は、必要な開始および停止コドンを有するコーディング領域
を含み、Shine−Dalgarno(SD)配列などの翻訳開始シグナルおよび翻訳
エンハンサーが先行する翻訳カセットの概念を利用する(Tan、2001年、Tanら、2005年、
前出)。mRNAに転写されたとき、翻訳カセットは、大腸菌(E. coli)翻訳機構がm
RNAの所望のポリペプチドへの翻訳を開始し、持続するために必要かつ十分な情報を含
む(Selleck & Tan、2008年、前出)。
て記載されたが、2つの遺伝子の間の遺伝子間領域が合成リンカーからなり、カスパーゼ
4の発現がICEの発現よりはるかに高かったことから、明らかに遺伝子特異的である。
Smolkeらは、合成遺伝子間領域配列を用いてオペロンにおける2つ以上の遺伝子に
よりコードされるタンパク質レベルを差別的に制御することが可能であることを以前に示
した(Smolkeら、Appl. Environ. Microbiol.、2000年、66巻(12号)、5399〜5405頁、Smo
lke & Keasling、Biotechnol. Bioeng.、2002年、80巻(7号)、762〜776頁)。しかし、こ
のアプローチは、ランダムな組合せに依拠し、発現ホストへの合成配列の導入を必要とす
る。
酵母および真菌ならびに哺乳類細胞において確立された。単鎖および単ドメイン抗体は、
細菌から作製することがより容易であるが、フルサイズ抗体は、注射したとき、一般的に
より高い結合親和力と中和抗体の形成のより低いリスクを有する。
7年、25巻(5号)、563〜565頁、Simmonsら、J. Immunol. Methods、2002年、263巻(1〜2号
)、133〜147頁)。組換え原核生物発現に関する大部分の報告に、ほぼもっぱら大腸菌(E
. coli)からであるが、抗体断片の作製が記載されている。多くの操作されたLABは、
ジスルフィド結合を修正することができるが、文献にはLABから産生された抗体様分子
の限られた数の例のみが含まれている(Krugerら、Nature Biotechnology、2002年、20巻
(7号)、702〜706頁、Beninatiら、Nature Biotechnology、2000年、18巻(10号)、1060〜1
064頁、Chanceyら、J. Immunol.、2006年、176巻(9号)、5627〜5636頁、Hultbergら、BMC
Biotechnol.、2007年、7巻、58頁、Yuvarajら、Mol. Nutr. Food. Res.、2008年、52巻(
8号)、913〜920頁)。これらの報告にはラクトバシラス属(Lactobacillus)種、ラクト
コッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)およびストレプトコッカス・ゴルドニ(St
reptococcus gordonii)において発現した単鎖抗体断片のみが記載され、多重遺伝子性、
二本鎖抗体断片またはフルサイズ抗体は記載されていない。ポリシストロン性発現系は、
抗体のような複合タンパク質の効率的な原核生物における合成および発現を得るうえで不
可欠であり得る。依然として移植拒絶反応の管理に利用できる最も強力な免疫抑制薬の1
つである(Hooksら、Pharmacotherapy、1991年、11巻(1号)、26〜37頁)、ムロモナブC
D3(Muromonab-CD3)の1986年におけるFDA承認以来、フルサイズ抗体および抗
体断片は、医学におけるますます重要かつ多目的ツールになっている。
が、これらは、かなり限定されており、複数の遺伝子を導入し、発現するためのより効率
の高い系の必要性を際立たせている。したがって、タンパク質の発現、好ましくは異種タ
ンパク質の発現、より好ましくは複数の異種タンパク質の発現に有利に用いることができ
るさらなる配列を提供する必要がある。
ルクタンパク質の生産および下流精製のためにより多くの量の組換えタンパク質を製造す
る努力は、多大な技術的努力を意味する。異種タンパク質の産生を増加させるための既存
のアプローチは、選択される強プロモーターを使用することである(例えば、国際公開第
2008/084115号参照)。このアプローチにおいて、微生物により発現された最
も豊富な内因性タンパク質を同定するためにプロテオミック解析が行われる。ゲノム配列
を用いることにより、それぞれの遺伝子およびプロモーターを同定し、単離することがで
きる。これらの強プロモーター(例えば、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus la
ctis)hIIA遺伝子プロモーター、PhIIA)は、異種遺伝子の前に配置することが
でき、このようにして、高発現を達成することができる。しかし、宿主の生理を障害する
発現のレベルは、宿主に増殖負荷を負わせる可能性があり、対抗選択をもたらす。これは
、発現宿主における所定の異種タンパク質の最高の可能な発現を特定の固有のレベルに本
質的に制限する。これは、染色体局在性発現ユニットの開発における特にやっかいな障害
である。
ば、抗生物質耐性遺伝子を準備することによる正または負の選択は、導入された異種遺伝
子の損失を防ぐことができる。あるいは、または選択マーカーの使用に加えて、宿主の非
カップリング増殖および異種タンパク質の発現を可能にし、それにより、異種遺伝子が発
現しない場合に増殖段階における可能性のある対抗選択を予防する、誘導遺伝子発現系を
用いることができる。これに関連して、欧州特許第0569604号は、異種遺伝子がL
acZ遺伝子の5’側に強制的に配置されている、ストレプトコッカス・サーモフィルス
(Streptococcus thermophilus)における誘導発現系を記載している。このようにして、
異種遺伝子の発現は、誘導性であるだけでなく、さらに、LacZ遺伝子の発現を必要と
する、炭素源としてのラクトースを含むそれらの自然生息環境乳汁中で細菌を増殖させる
ことによって、異種遺伝子の維持も選択される。
例えば、抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーの使用は、食物生産または製薬応用分野
における応用に容易に耐えられない。さらに、自然生息環境中の増殖に、または増殖のた
めに自然生息環境からの炭素源を用いることに限定することは、異種遺伝子発現のための
系の汎用性を著しく低くする。また、誘導系の使用は、誘導物質を添加すべき定義された
培地が異種タンパク質の発現を保証するために必要であるような、宿主の増殖条件に本質
的に依存する。
々な異なる条件下で多目的に使用でき、広く適用できると同時に、産業および/または治
療環境において十分な量の発現異種タンパク質を得るために高い発現レベルを達成するこ
とができる配列、クローニングシステムおよび戦略が必要である。これらの環境において
、それぞれがそれ自体の生物学的活性および治療効果を有する複数のタンパク質の発現を
得ることも特に有用であると思われる。
、1つまたは複数に対応する。
または複数)も含むポリシストロン性発現ユニットからの外因性または異種遺伝子を効率
的に発現することができることを発見した。このように、グラム陽性細菌は、そのような
遺伝子がこれらの細菌の内因性遺伝子(単数または複数)に転写可能または翻訳可能に結
合される場合にポリシストロン性発現ユニットからの外因性または異種遺伝子を効率的に
発現することができる。意外なことに、本発明者らは、内因性遺伝子およびポリシストロ
ン性発現ユニットにおける外因性遺伝子の転写可能および/または翻訳可能な結合がグラ
ム陽性細菌における外因性遺伝子の高い発現レベルをもたらすことを発見した。特に、グ
ラム陽性細菌の内因性遺伝子に転写可能および/または翻訳可能に結合された外因性遺伝
子の発現レベルは、グラム陽性細菌の内因性遺伝子に転写可能または翻訳可能に結合され
ない外因性遺伝子の発現レベルと少なくとも同等、有利なことにより高いことが見いださ
れた。
陽性細菌に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、1つまたは複数の内因性遺伝子
および1つまたは複数の外因性遺伝子を含む。ポリシストロン性発現ユニットは、内因性
遺伝子(例えば、制限なしに1つの内因性遺伝子)および1つまたは複数の外因性遺伝子
を含むと示すこともできる。好ましくは、ポリシストロン性発現ユニットは、1つまたは
複数の内因性遺伝子および1つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含む。したがって、
そのようなポリシストロン性発現ユニットは、内因性遺伝子(例えば、制限なしに1つの
内因性遺伝子)および1つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含むと示すこともできる
。ポリシストロン性発現ユニットは、ポリシストロン性mRNAにおける1つまたは複数
の内因性遺伝子および1つまたは複数の外因性遺伝子の転写をもたらすように構成されて
いる。したがって、本グラム陽性細菌は、1つまたは複数の外因性遺伝子が転写可能また
は翻訳可能に結合された1つまたは複数の内因性遺伝子を含むと別途示すことができる。
したがって、1つまたは複数の外因性遺伝子が転写可能および/または翻訳可能に結合さ
れた1つまたは複数の内因性遺伝子を含むグラム陽性細菌も提供する。
トロン性発現ユニットは、グラム陽性細菌に内因性の遺伝子およびグラム陽性細菌に外因
性の1つまたは複数の遺伝子を含む。好ましくは、ポリシストロン性発現ユニットは、1
つまたは複数の内因性遺伝子および1つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含む。した
がって、グラム陽性細菌に外因性の1つまたは複数の遺伝子が転写可能および/または翻
訳可能に結合されたグラム陽性細菌に内因性の1つまたは複数の遺伝子を含むポリシスト
ロン性発現ユニットを含む組換え核酸も提供する。
、前記1つまたは複数の内因性遺伝子の3’末端に転写可能または翻訳可能に結合させる
ことができる。本発明者らは、そのような構成が異種タンパク質発現レベル、ポリシスト
ロン性発現ユニットの維持および/またはゲノム安定性の点で有益であることを驚くべき
ことに発見した。さらなる下流のゲノム配列が重要性がより低いか、または重要でないこ
とがさらに発見された。
複数の外因性遺伝子の転写は、グラム陽性細菌における転写を達成することができるプロ
モーターにより適切に調節または制御することができ、好ましくは前記グラム陽性細菌の
内因性プロモーターにより調節または制御することができる。したがって、1つまたは複
数の外因性遺伝子が転写可能または翻訳可能に結合された、その天然の染色体遺伝子座に
局在する1つまたは複数の内因性遺伝子を含むグラム陽性細菌も提供する。好ましくは、
これらの転写可能または翻訳可能に結合された1つまたは複数の内因性遺伝子および1つ
または複数の外因性遺伝子の転写は、前記1つまたは複数の内因性遺伝子の天然のプロモ
ーターにより調節または制御される。適切には、転写または翻訳共役は、例えば、1つま
たは複数の外因性遺伝子を前記遺伝子座における前記1つまたは複数の内因性遺伝子の3
’に染色体上で組み込むことなどにより、1つまたは複数の外因性遺伝子を前記遺伝子座
に染色体上で組み込むことによって達成することができる。
核酸またはグラム陽性細菌に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、内因性遺伝子
および前記1つまたは複数の内因性遺伝子の3’末端に転写可能に結合された1つまたは
複数の外因性遺伝子を連続して含み、好ましくは前記1つまたは複数の外因性遺伝子がポ
リシストロン性発現ユニットの最も3’側の遺伝子(単数または複数)(the most 3' ge
ne(s))である。
天然の遺伝子の3’側に転写可能に結合された外因性または異種遺伝子(または複数の異
種遺伝子)の染色体組込みが、(1つまたは複数の)外因性遺伝子に対する対抗選択が予
想に反して存在しないか、または最小限である、安定な発現ユニットをもたらすことを驚
くべきことに発見した。
により特定の条件下で達成されるときに、本明細書で述べる利点がますます明らかになる
ことを思いがけなく発見した。本発明者らは、異種タンパク質(単数または複数)に対す
る対抗選択が、選択マーカーの使用などの従来の手段により、または誘導系の使用により
対処されない、本明細書で述べるポリシストロン性発現系は、それにもかかわらず高レベ
ルで安定に維持し、発現させることができ、それにより、様々な異なる条件下で広く適用
でき、選択剤または誘導物質の必要がないことを驚くべきことに発見した。したがって、
本明細書で述べるポリシストロン性発現モジュールは、非選択可能(non-selectable)内
因性および/または外因性遺伝子の使用を可能にする。
ラム陽性細菌に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、内因性遺伝子および前記内
因性遺伝子の3’末端に転写可能に結合された1つまたは複数の外因性遺伝子を連続して
含み、前記ポリシストロン性発現ユニットの発現が構成的プロモーターにより達成される
。
グラム陽性細菌に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、内因性遺伝子および前記
内因性遺伝子の3’末端に転写可能に結合された1つまたは複数の外因性遺伝子を連続し
て含み、前記ポリシストロン性発現ユニットの発現が中心代謝遺伝子プロモーターにより
達成される。
グラム陽性細菌に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、内因性遺伝子および前記
内因性遺伝子の3’末端に転写可能に結合された1つまたは複数の外因性遺伝子を連続し
て含み、前記ポリシストロン性発現ユニットの発現がハウスキーピング遺伝子プロモータ
ーにより達成される。
グラム陽性細菌に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、内因性遺伝子および前記
内因性遺伝子の3’末端に転写可能に結合された1つまたは複数の外因性遺伝子を連続し
て含み、前記ポリシストロン性発現ユニットの発現が必須遺伝子プロモーターにより達成
される。
グラム陽性細菌に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、内因性遺伝子および前記
内因性遺伝子の3’末端に転写可能に結合された1つまたは複数の外因性遺伝子を連続し
て含み、前記ポリシストロン性発現ユニットの発現が誘導遺伝子プロモーターにより達成
されない。
グラム陽性細菌に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、内因性遺伝子および前記
内因性遺伝子の3’末端に転写可能に結合された1つまたは複数の外因性遺伝子を連続し
て含み、前記ポリシストロン性発現ユニットの発現がリボソーム遺伝子プロモーターによ
り達成される。
グラム陽性細菌に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、内因性遺伝子および前記
内因性遺伝子の3’末端に転写可能に結合された1つまたは複数の外因性遺伝子を連続し
て含み、前記ポリシストロン性発現ユニットの発現が解糖遺伝子プロモーターにより達成
される。
子プロモーターである。さらに下でも詳述するように、好ましくは、本明細書で用いるプ
ロモーターは、強プロモーターである。好ましくは、ただし制限なしに、前記内因性プロ
モーターは、eno、usp45、gapB、pyk、rpmBおよびrplSのプロモ
ーターからなる群から選択することができる。極めて好ましくは、翻訳可能に結合された
内因性遺伝子および1つまたは複数の外因性遺伝子の転写は、前記内因性遺伝子(の1つ
)の天然のプロモーターにより調節または制御され得る。
理解すべきである。したがって、実施形態において、本発明は、ポリシストロン性発現ユ
ニットを含む組換え核酸またはグラム陽性細菌に関し、前記ポリシストロン性発現ユニッ
トは、内因性遺伝子および前記内因性遺伝子の3’末端に転写可能に結合された1つまた
は複数の外因性遺伝子を連続して含み、前記ポリシストロン性発現ユニットの発現が、例
えば、(内因性)構成的ハウスキーピング遺伝子プロモーター、(内因性)構成的中心代
謝遺伝子プロモーター、(内因性)構成的必須遺伝子プロモーター、(内因性)構成的リ
ボソーム遺伝子プロモーター、(内因性)構成的解糖遺伝子プロモーター、(内因性)中
心代謝ハウスキーピング遺伝子プロモーター、(内因性)必須中心代謝遺伝子プロモータ
ー、(内因性)必須中心代謝ハウスキーピング遺伝子プロモーター、(内因性)必須ハウ
スキーピング遺伝子プロモーター、(内因性)構成的中心代謝ハウスキーピング遺伝子プ
ロモーター、(内因性)構成的必須中心代謝ハウスキーピング遺伝子プロモーター、(内
因性)必須リボソーム遺伝子プロモーター、(内因性)必須解糖遺伝子プロモーター、(
内因性)構成的必須リボソーム遺伝子プロモーター、(内因性)構成的必須解糖遺伝子プ
ロモーターにより達成される。
、前記1つまたは複数の内因性遺伝子の3’末端に転写可能または翻訳可能に結合させる
ことができ、それにより、1つまたは複数の内因性遺伝子は、細菌の染色体上のそれら自
然位置に存在する。この構成において、1つまたは複数の内因性遺伝子(内因性遺伝子プ
ロモーターを最小限含む)の5’末端における配列は、野生菌株のそれと同じであり、1
つまたは複数の外因性遺伝子の3’末端の後の領域は、野生菌株におけるように1つまた
は複数の内因性遺伝子の領域3’の配列と同じである。
現の多くの応用は、特定の選択される宿主微生物における前記治療用タンパク質の発現か
ら恩恵を受け得る。これらの微生物は、例えば、ヒトまたは動物微生物群に由来する選択
される菌株のような、それらのコロニー形成能に基づいて選択することができると思われ
る。微生物はまた、例えば、それらの細胞壁、細胞表面または細胞内内容物と宿主免疫系
との相互作用の結果として、例えば、toll様受容体、Igファミリーメンバー、補体
、サイトカインおよびその他との相互作用により、特定の送達された治療用タンパク質の
活性を増強するそれらの能力に基づいて選択することができると思われる。特定の微生物
は、腫瘍内、皮膚、高胆汁含量を有する部位、低いpHを有する部位およびその他などの
特定な苛酷な送達部位内または上で存続するそれらの堅牢性に関して選択することができ
ると思われる。本明細書を通して列挙するグラム陽性細菌は、好ましくは乳酸菌(LAB
)、より好ましくはラクトコッカス属種(Lactococcus sp.)、より好ましくはラクトコ
ッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)またはその亜種またはその菌株であり得る。
あるいは、前記LABは、好ましくはエンテロコッカス属種(Enterococcus sp.)、より
好ましくはエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus fecium)またはエンテロコッ
カス・フェカリス(Enterococcus faecalis)またはその亜種またはその菌株であり得る
。
現は、医学における治療用タンパク質の送達ツールとしての組換え細菌叢の使用に極めて
有利である。また、染色体に局在する発現ユニットは、染色体に局在する発現ユニットが
バルクタンパク質の産生に用いられる産生菌株の望ましい構造であり得るように、世代に
わたってはるかにより安定に受け継がれることが証明され得る。現況技術において、染色
体挿入は、条件付きで非複製型であり、相同的組換えを可能にする異種遺伝子中間フラン
キング領域(in-between flanking regions)を含むノックイン(KI)タイプベクター
を用いて実施される。従来のアプローチ(例えば、国際公開第2008/084115号
参照)では、KIプラスミドは、同族宿主において構築される(L.ラクティス(L. lac
tis)のKIプラスミドはL.ラクティス(L. lactis)において構築される)。多くの分
泌シグナルが他の宿主に使用するのに適合しないので、これは、特にタンパク質分泌を必
要とする異種発現に当てはまる。細菌染色体上に配置することが意図される発現構築物に
おける強プロモーターの使用は、KIプラスミド中間体からの異種遺伝子の発現により妨
げられる。異種遺伝子には強プロモーターが直接先行し、これによって、KIプラスミド
からの発現が、意図されず、また要求されないが、最強のプロモーターの使用を本質的に
制限することとなる。多くの場合、KIプラスミドは、宿主における染色体数の多重度で
あるコピー数を有し、組込みにより、発現が数倍低くなる。したがって、染色体発現ユニ
ットは、達成可能な最高であるものより本質的に弱い。この問題は、ここに述べる本発明
により回避される。このアプローチにおいて、異種遺伝子は、下流に配置され、細菌染色
体上の(強く発現した)内因性遺伝子に転写可能および/または翻訳可能に結合される。
この戦略は、内因性(強い)プロモーターがKIプラスミド上に存在することを必要とし
ない。むしろ、異種遺伝子の上流に、(強く発現した)内因性遺伝子のプロモーターレス
3’末端が配置されている。この種のKIプラスミドは、サイレントであり、強いプロモ
ーターの使用を制限しない。
写または翻訳共役は、グラム陽性細菌において活性な(すなわち、機能性の、有効な)遺
伝子間領域により、好ましくはグラム陽性細菌の内因性遺伝子間領域により達成すること
ができる。したがって、さらなる態様は、グラム陽性細菌において活性な遺伝子間領域、
好ましくは前記グラム陽性細菌に対して外因性の遺伝子に作動可能に連結した、グラム陽
性細菌の内因性遺伝子間領域を含む組換え核酸を提供する。作動可能な連結は、mRNA
上に存在する遺伝子間領域の転写物ならびに外因性遺伝子の転写物が、グラム陽性細菌に
おける、外因性遺伝子の翻訳の開始のための部位を与えることができることを保証する。
好ましくは、遺伝子間領域は、外因性遺伝子の5’に配置することができる。核酸は、各
外因性遺伝子に遺伝子間領域が先行する、ポリシストロン性配置の2つ以上の外因性遺伝
子を含み得る。遺伝子間領域は、同じまたは異なっていてもよい。例えば、遺伝子間領域
が異なる場合、これらは、同じもしくは異なる種の異なる遺伝子に、または異なる種の同
じ遺伝子に由来する遺伝子間領域に相当し得る。これらの核酸は、1つまたは複数の他の
遺伝子が遺伝子間領域を介して1つまたは複数の外因性遺伝子に転写可能または翻訳可能
に結合された、1つまたは複数の外因性遺伝子を含むポリシストロン性発現ユニットを構
築するのに有用であり得る。例えば、これらの核酸は、1つまたは複数の内因性遺伝子が
遺伝子間領域を介して1つまたは複数の外因性遺伝子に転写可能または翻訳可能に結合さ
れた、本明細書で教示したようなポリシストロン性発現ユニットを構築するのに有用であ
り得る。好ましくはポリシストロン性発現ユニットの第1のシストロンは、強く発現する
内因性遺伝子である。
を含むレプリコンまたはベクターに関する。例えば、ベクターは、原核生物発現ベクター
、好ましくは原核生物ポリシストロン性発現ベクターであり得る。しかし、そのようなプ
ラスミド発現系の開発は、特定のレプリコンと強プロモーターの組合せが不安定であり得
るため、面倒であり得る。また、特に、治療用タンパク質の送達のための応用の場合のよ
うに、抗生物質選択マーカーを発現プラスミドに含めることができない場合でないとすれ
ば、天然のプラスミドの存在のため、選択される微生物を組換えプラスミドにより形質転
換し、微生物において組換えプラスミドを安定に維持することは、不可能であり得る。異
種遺伝子を下流に配置し、細菌染色体上で(強く発現した)内因性遺伝子に転写可能また
は翻訳可能に結合させることによって、この問題を回避することができる。この戦略は、
プラスミド媒介性発現系を必要としないので、あらゆるタイプの選択される細菌叢の遺伝
子工学に適用され得る一般的なアプローチとして用いることができる。要求される唯一の
菌株固有の情報は、最先端技術により速やかに確定することができる。十分に発現したタ
ンパク質のプロテオミック解析と組み合わせた高処理配列決定により、十分に存在するタ
ンパク質をコードする領域のヌクレオチド配列が速やかに得られる。したがって、最も好
ましくは、本明細書で述べるベクターは、外因性遺伝子(単数または複数)の染色体組込
みを発生させるような、グラム陽性細菌における相同的組換えを達成するように構成する
ことができる。
めの、または1つもしくは複数の内因性遺伝子および1つもしくは複数の外因性遺伝子の
ポリシストロン性発現のための本明細書で述べる組換え核酸またはベクターの使用をさら
に提供する。その上、グラム陽性細菌が1つもしくは複数の外因性遺伝子のポリシストロ
ン性発現または1つもしくは複数の内因性遺伝子および1つもしくは複数の外因性遺伝子
のポリシストロン性発現の能力がある、本明細書で教示した組換え核酸またはベクターを
含む(例えば、それにより形質転換した)グラム陽性細菌を開示する。さらに、本明細書
で教示した組換え核酸またはベクターを前記グラム陽性細菌に導入するステップを含む、
グラム陽性細菌における1つもしくは複数の外因性遺伝子のポリシストロン性発現を達成
するためのまたは1つもしくは複数の内因性遺伝子および1つもしくは複数の外因性遺伝
子のポリシストロン性発現を達成するための方法を提供する。その上、本明細書で教示し
た組換え核酸またはベクターを前記グラム陽性細菌に導入するステップを含む、1つもし
くは複数の外因性遺伝子のポリシストロン性発現の能力のあるまたは1つもしくは複数の
内因性遺伝子および1つもしくは複数の外因性遺伝子のポリシストロン性発現の能力のあ
るグラム陽性細菌を発生させる方法を提供する。
つもしくはそれ以上の)異なる外因性遺伝子を発現させる、好ましくは強力に(高度に)
発現させる。前記外因性遺伝子または複数の外因性遺伝子は、有利にタンパク質(単数ま
たは複数)、ポリペプチド(単数または複数)および/またはペプチド(単数または複数
)などの発現産物または複数の発現産物をコードし得る。例として、また制限なしに、そ
のようなタンパク質(単数または複数)、ポリペプチド(単数または複数)および/また
はペプチド(単数または複数)は、抗原(例えば、免疫または免疫寛容を誘導するため)
、アレルゲン、非ワクチン原性治療用ポリペプチド(サイトカイン、成長因子、創傷治癒
因子、・・・)、抗体またはその機能性断片(例えば、Fab断片)、融合タンパク質、
多量体タンパク質などおよびそれらの組合せを含み得る。
チド鎖を含むタンパク質(例えば、多量体タンパク質、タンパク質複合体)の発現に特に
適するものにすることができる。したがって、本明細書で意図する2種以上の外因性遺伝
子は、好ましくは多量体タンパク質の異なるモノマーまたはサブユニットをコードするこ
とができ、それによって、遺伝子がポリシストロン性mRNAに共転写され、個々のモノ
マーまたはサブユニットがこのmRNAから翻訳される。これにより、例えば、個々のモ
ノマーまたはサブユニットの多量体タンパク質へのバランスのとれた最適な集合を達成す
ることなどの、外因性遺伝子の厳密に調節された共発現が可能になり得る。
、本明細書で教示した2種以上の外因性遺伝子は、好ましくは抗体またはその機能性断片
の別個の鎖をコードし得る。例えば、1つの外因性遺伝子が抗体またはその機能性断片の
軽鎖(VL)をコードし、他の外因性遺伝子が抗体またはその機能性断片の重鎖(VH)
をコードし得る。好ましくは、抗体の機能性断片は、Fabであり得る。特定の非限定的
実施形態において、前記Fabは、サイトカイン、サイトカインの受容体、ケモカインま
たは免疫/炎症活性化分子に結合し、かつ/またはその生物学的作用を阻害し得る。好ま
しい実施形態において、Fabは、例えば、制限なしに前記FabがcA2抗TNFまた
はCDP870抗TNFであり得ることなどのように、TNFαに結合し、かつ/または
その生物学的作用を阻害し得る。
ポリシストロン性発現のために転写可能または翻訳可能に結合される。好ましくは、VL
またはその機能性断片をコードする外因性遺伝子は、VHまたはその機能性断片をコード
する外因性遺伝子の3’末端に転写可能または翻訳可能に結合させることができる。この
遺伝子編成は、抗体またはその機能性断片の特に有効な発現および集合をもたらす。
よりin situで送達された場合に、相乗的効果、例えば、相乗的治療または予防効
果をもたらすために協力するタンパク質などの産物の共発現に特に適するものにし得る。
するタンパク質(単数または複数)、ポリペプチド(単数または複数)またはペプチド(
単数または複数)などの産物または複数の産物をコードする、本明細書で教示したグラム
陽性細菌を提供する。そのような細菌は、詳しくは薬剤として使用するため、より詳しく
は対象への前記産物または複数の産物の投与または送達に使用するため、より詳しくは前
記産物または複数の産物の投与または送達から恩恵を受け得る疾患の治療に使用するため
に提供する。また、そのようなグラム陽性細菌を含む医薬組成物を提供する。
ク質(単数または複数)、ポリペプチド(単数または複数)またはペプチド(単数または
複数)などの産物または複数の産物を送達する方法を提供し、1つまたは複数の外因性遺
伝子が前記産物または複数の産物をコードする。好ましくは、前記産物または複数の産物
は、対象における治療または予防効果を有し得る。
因性発現産物の配列のほかに、外因性または病原性配列を導入しないか、またはより少な
いそれを導入することにより、その内因性の特性をより厳密に保持する。それにより、規
制GRASまたは「安全と一般的に認識される」状態ができる限り多く維持され、ひいて
はヒトまたは動物における操作された菌株の使用のための臨床承認および販売許可を取得
する手続きを促進する。
結合された1つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含む、ポリシストロン性発現ユニッ
トを含むグラム陽性細菌。
伝子の3’末端に転写可能に結合された、グラム陽性細菌に対して外因性の1つまたは複
数の遺伝子を連続して含む、ポリシストロン性発現ユニットを含む組換え核酸。
を有するタンパク質、ポリペプチドおよび/もしくはペプチド、または免疫もしくは免疫
寛容を誘導する抗原、非ワクチン原性の治療活性のあるポリペプチド、抗体もしくはFa
bなどのその機能性断片、融合タンパク質もしくは多量体タンパク質をコードする、(i
)に記載のグラム陽性細菌または(ii)に記載の組換え核酸。
どの産物をコードし、産物が対象における治療または予防効果を有する、薬剤として使用
するための、好ましくは対象への前記産物の投与または送達に使用するための、(i)に
記載のグラム陽性細菌または(ii)に記載の組換え核酸。
伝子である、(i)、(iii)もしくは(iv)に記載のグラム陽性細菌または(ii
)〜(iv)に記載の組換え核酸。
菌に対して内因性のプロモーターにより転写制御される、(i)、(iii)、(iv)
もしくは(v)のいずれかに記載のグラム陽性細菌または(ii)〜(v)のいずれかに
記載の組換え核酸。
謝遺伝子プロモーターおよび/またはハウスキーピング遺伝子プロモーターである、(v
i)に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
陽性細菌または組換え核酸。
、rpmBおよびrplSのプロモーターからなる群から選択される、(vi)に記載の
グラム陽性細菌または組換え核酸。
、(i)または(ii)〜(x)のいずれか1つに記載のグラム陽性細菌。
よって、好ましくは内因性遺伝子の3’の1つまたは複数の外因性遺伝子を前記遺伝子座
に染色体上で組み込むことによって、内因性遺伝子が1つまたは複数の外因性遺伝子に転
写可能に結合されている、(xi)に記載のグラム陽性細菌。
いて活性な遺伝子間領域または複数領域によって転写可能に結合されており、遺伝子間領
域または複数領域が前記グラム陽性細菌に対して内因性である、(i)もしくは(iii
)〜(xii)のいずれか1つに記載のグラム陽性細菌または(ii)〜(x)のいずれ
かに記載の組換え核酸。
rpsE、rplN、rplM、rplEおよびrplFに先行する遺伝子間領域からな
る群から選択される、(xiii)に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
細菌において活性な遺伝子間領域を含み、遺伝子間領域がグラム陽性細菌の内因性遺伝子
間領域である、組換え核酸。
rpsE、rplN、rplM、rplEおよびrplFに先行する遺伝子間領域からな
る群から選択される、(xiv)に記載の組換え核酸。
し、他の外因性遺伝子が抗体またはその機能性断片の重鎖(VH)をコードし、より好ま
しくは、機能性断片がFabである、(i)もしくは(iii)〜(xiv)のいずれか
1つに記載のグラム陽性細菌または(ii)〜(x)もしくは(xiii)〜(xvi)
のいずれか1つに記載の組換え核酸。
機能性断片をコードする外因性遺伝子の3’末端に転写可能に結合されている、(xvi
i)に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
ラクトバシラス属(Lactobacillus)もしくはエンテロコッカス属(Enterococcus)、よ
り好ましくはラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)またはエンテロコッカ
ス・フェシウム(Enterococcus faecium)であり、またはグラム陽性細菌がビフィドバク
テリウム(Bifidobacterium)である、(i)、(iii)〜(xiv)、(xvii)
もしくは(xviii)のいずれか1つに記載のグラム陽性細菌または(ii)〜(x)
もしくは(xiii)〜(xviii)のいずれか1つに記載の組換え核酸。
1つに記載のグラム陽性細菌を含む医薬組成物。
チドなどの産物をコードし、産物が対象における治療または予防効果を有する、(xx)
に記載の医薬組成物。
の組換え核酸を含むベクター。
特許請求の範囲に記載する。添付の特許請求の範囲の主題は、本明細書に具体的に組み込
まれている。
の状態が明確に指示されない限り、単数形および複数形の両方の指示対象を含む。
を含む(comprised of)」という用語は、「包含すること(including)」、「包含する
(includes)」または「含有すること(containing)」、「含有する(contains)」と同
義であり、包含的または非制限的であり、追加の非列挙メンバー、エレメントまたは方法
ステップを除外しない。「含むこと(comprising)」、「含む(comprises)」および「
を含む(comprised of)」という用語が、本明細書で用いているように「からなっている
(consisting of)」、「なる(consists)」および「からなる(consists of)」という
用語ならびに「から本質的になっている(consisting essentially of)」、「本質的に
なる(consists essentially)」および「から本質的になる(consists essentially of
)」という用語を含むことが十分理解される。
された端点を含む。
ーター、量、持続時間などの測定可能な値に適用する場合、そのような変動が開示した本
発明において機能するのが適切である限りにおいて、指定された値の+/−20%以下、
好ましくは+/−10%以下、より好ましくは+/−5%以下、より好ましくは+/−1
%以下の変動を含むことを意味する。修飾語句「約」または「おおよそ」が適用される値
は、それ自体も具体的に、また好ましくは開示されることを理解すべきである。
などの「1つもしくは複数」または「少なくとも1つ」という用語は、さらなる例示によ
り、それ自体は明らかであるが、当用語は、前記メンバーのいずれか1つへの、または例
えば、前記メンバーのいずれか≧3、≧4、≧5、≧6もしくは≧7等およびすべての前
記メンバーまでなどの前記メンバーのいずれか2つ以上への言及をとりわけ含む。
み込まれる。特に、具体的に引用した本明細書におけるすべての参考文献の教示は、参照
により組み込まれる。
の用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味を有する。さ
らなるガイダンスとして、本発明の教示をより十分に理解するために用語の定義を含める
。
態様は、相反するものが明確に示されない限り、他の1つまたは複数の態様と組み合わせ
ることができる。特に、好ましいまたは有利であると示された特徴は、好ましいまたは有
利であると示された他の1つまたは複数の特徴と組み合わせることができる。
に関連して記載された特定の特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも1つの実施形
態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたる様々な箇所における「
1つの実施形態において」または「実施形態において」という語句の出現は、同じ実施形
態に必ずしもすべて言及するものでないが、そうであり得る。さらに、特定の特徴、構造
または特性は、1つまたは複数の実施形態において、この開示から当業者に明らかなよう
に、適切な方法で組み合わせることができる。さらに、本明細書で述べたいくつかの実施
形態は、他の実施形態に含まれた一部の特徴を含むが、他の特徴を含むものでないが、異
なる実施形態の特徴の組合せは、当業者により理解されるように、本発明の範囲内にあり
、異なる実施形態を構成することを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲において、
請求の範囲に記載されている実施形態の何らかの組合せで用いることができる。
る特定の実施形態の例示のみの目的で示す添付図面を参照する。本発明の範囲から逸脱す
ることなく、他の実施形態を利用することができ、構造または論理的変更を行うことがで
きることを理解すべきである。したがって、以下の詳細な説明は、限定的な意味で解釈す
べきでなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により定義されている。
aboratory Manual、第2版、1〜3巻、Sambrookら編、Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss、Cold Spring Harbor、N. Y.、1989年、Current Protocols in Molecular Biology、A
usubelら編、Greene Publishing and Wiley-Interscience、New York、1992年(定期的更
新を含む)(「Ausubelら1992年」)、Innisら、PCR Protocols: A Guide to Methods an
d Applications、Academic Press: San Diego、1990年を含む。微生物学の一般的原理は
、例えば、Davis, B. D.ら、Microbiology、第3版、Harper & Row, publishers、Philade
lphia、Pa.(1980年)に説明されている。
可能に結合された内因性遺伝子を含むグラム陽性細菌に関する。好ましくは、1つまたは
複数の外因性遺伝子は、内因性遺伝子の下流(すなわち、3’末端に)に転写可能または
翻訳可能に結合される。関連態様は、ポリシストロン性発現ユニットを含むグラム陽性細
菌を提供し、前記ポリシストロン性発現ユニットが内因性遺伝子および1つまたは複数の
外因性遺伝子を含む。好ましくは、ポリシストロン性発現ユニットは、1つまたは複数の
内因性遺伝子および1つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含む。さらなる態様は、グ
ラム陽性細菌に対して外因性の1つまたは複数の遺伝子が転写可能または翻訳可能に結合
されたグラム陽性細菌に対して内因性の遺伝子を含むポリシストロン性発現ユニットを含
む組換え核酸を提供する。好ましくは、1つまたは複数の外因性遺伝子は、内因性遺伝子
の下流(すなわち、3’末端に)に転写可能または翻訳可能に結合される。
発現ユニットの最も3’の遺伝子である。すなわち、1つまたは複数の外因性遺伝子(単
数または複数)は、ポリシストロン性発現ユニットの最後または最も下流の遺伝子(単数
または複数)である。例えば、内因性遺伝子がモノシストロン性である場合、1つまたは
複数の外因性遺伝子は、遺伝子のオープンリーディングフレームの後または下流(すなわ
ち、3’末端に)に位置し、それと転写可能に結合される。同様に、内因性遺伝子が、オ
ペロン(の一部)のように、それ自体ポリシストロン性である場合、1つまたは複数の外
因性遺伝子は、内因性ポリシストロン性遺伝子の最後の(すなわち、最も下流または最も
3’の)内因性遺伝子の後または下流に(すなわち、3’末端に)位置する。
である。したがって、内因性遺伝子は、好ましくは内因性オペロンの一部を構成しない。
つまたは複数のものであり得るまたは示し得るプロモーターによりもたらされる:構成的
プロモーター、中心代謝遺伝子プロモーター、必須遺伝子プロモーター、強プロモーター
、ハウスキーピング遺伝子プロモーター、リボソーム遺伝子プロモーター、解糖遺伝子プ
ロモーター。最も好ましくは、プロモーターは、構成的プロモーターである。
その一般的意味を有する。さらなるガイダンスとして、グラム陽性細菌は、クリスタルバ
イオレット染色を保持するのでグラム染色により同定することができる。
場合に害をもたらさない、または有害な効果をもたらさないという意味で非病原性である
。
トバシラス(Lactobacillus)、ロイコノストック(Leuconostoc)、ペディオコッカス(
Pediococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、アエロコッカス(Aerococcus)
、カルノバクテリウム(Carnobacterium)、エンテロコッカス(Enterococcus)、エノコ
ッカス(Oenococcus)、スポロラクトバシラス(Sporolactobacillus)、テトラゲノコッ
カス(Tetragenococcus)、バゴコッカス(Vagococcus)およびウェイセラ(Weisella)
属を含むが、これらに限定されない乳酸菌(LAB)である。より好ましくは、LABは
、例えば、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、ラクトコッカス・ガル
ビエ(Lactococcus garvieae)、ラクトコッカス・ピスシウム(Lactococcus piscium)
、ラクトコッカス・プランタラム(Lactococcus plantarum)およびラクトコッカス・ラ
フィノラクティス(Lactococcus raffinolactis)ならびにそれらの亜種および菌株など
であるが、これらに限定されないラクトコッカス種(Lactococcus species)である。最
も好ましくは、ラクトコッカス種(Lactococcus species)は、ラクトコッカス・ラクテ
ィス(Lactococcus lactis)ならびに例えば、制限なしにラクトコッカス・ラクティス亜
種クレモリス(Lactococcus lactis ssp. cremoris)、ラクトコッカス・ラクティス亜種
ホールドニエ(Lactococcus lactis ssp. hordniae)、ラクトコッカス・ラクティス亜種
ラクティス(Lactococcus lactis ssp. lactis)、ラクトコッカス・ラクティス亜種bv
.ジアセチラクティス(Lactococcus lactis ssp. bv. diacetylactis)などのそのあら
ゆる亜種および菌株である。本発明のさらなる好ましい実施形態において、ラクトコッカ
ス・ラクティス(Lactococcus lactis)は、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス
(Lactococcus lactis ssp. cremoris)またはラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティ
ス(Lactococcus lactis ssp. lactis)、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス亜
種クレモリス(Lactococcus lactis ssp. cremoris)であり、例えば、ラクトコッカス・
ラクティス亜種クレモリスSK11(Lactococcus lactis ssp. cremoris SK11)、ラク
トコッカス・ラクティス亜種クレモリスMG1363(Lactococcus lactis ssp. cremor
is MG1363)またはラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティスIL1403(Lactococc
us lactis ssp. lactis IL1403)などのそのあらゆる菌株を含む。他の好ましい実施形態
において、LABは、エンテロコッカス種(Enterococcus sp.)、好ましくはエンテロコ
ッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enter
ococcus faecium)ならびに例えば、制限なしにエンテロコッカス・フェシウム株LMG
15709(Enterococcus faecium strain LMG15709)などのそのあらゆる亜種および菌
株である。
ム属(Bifidobacterium)である。
岐嫌気性細菌の属である。ビフィドバクテリアは、本明細書で用いているように、B.ア
ドレセンチス(B. adolescentis)、B.アングラタム(B. angulatum)、B.アニマリ
ス(B. animalis)、B.アステリオデス(B.asteroides)、B.ビフィダム(B. bifidu
m)、B.ボウム(B. boum)、B.ブレーベ(B. breve)、B.カテヌラタム(B. caten
ulatum)、B.コエリナム(B. choerinum)、B.コリネホルメ(B. coryneforme)、B
.クニクリ(B. cuniculi)、B.デンチコレンス(B. denticolens)、B.デンチウム
(B. dentium)、B.ガリクム(B. gallicum)、B.ガリナルム(B. gallinarum)、B
.インディクム(B. indicum)、B.インファンチス(B. infantis)、B.イノピナタ
ム(B. inopinatum)、B.ラクティス(B. lactis)、B.ロンガム(B. longum)、B
.マグナム(B. magnum)、B.メリシクム(B. merycicum)、B.ミニマム(B. minimu
m)、B.シュードカテヌラタム(B. pseudocatenulatum)、B.シュードロンガム(B.
pseudolongum)、B.プロルム(B. pullorum)、B.ルミナンチウム(B. ruminantium
)、B.サエクラレ(B. saeculare)、B.サブチル(B. subtile)、B.スイス(B. s
uis)、B.テルマシドフィラム(B. thermacidophilum)、B.テルモフィラム(B. the
rmophilum)を含み得る。好ましくは、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)は、
B.アドレセンチス(B. adolescentis)、B.ビフィダム(B. bifidum)、B.ブレー
ベ(B. breve)、B.インファンチス(B. infantis)、B.ロンガム(B. longum)であ
る。ビフィドバクテリアのすべての亜種および株も含まれることを理解すべきである。
」という用語は、ポリ核酸、ベクターまたは染色体における各遺伝子の5’から3’への
順序を意味する。例えば、1つまたは複数の内因性遺伝子および1つまたは複数の外因性
遺伝子を連続して含むポリシストロン発現ユニットは、1つまたは複数の内因性遺伝子が
1つまたは複数の外因性遺伝子の上流に位置するユニットに関する。したがって、1つま
たは複数の外因性遺伝子は、1つまたは複数の内因性遺伝子の3’末端の後に位置する。
本明細書で述べた連続的結合または順序付けは、内因性および外因性遺伝子の直接的な結
合を必ずしも意味しない。付加的な配列が内因性および外因性遺伝子の間に存在し得る。
例として、本明細書でさらに定義する遺伝子間領域が、連続的な内因性および外因性遺伝
子の間(すなわち、内因性遺伝子の下流または3’と外因性遺伝子の上流または5’との
)に存在し得る。本明細書で用いているように、「内因性遺伝子」、「内因性プロモータ
ー」、「内因性遺伝子間領域」、「内因性リボソーム結合部位」という用語は、それぞれ
グラム陽性細菌にとって自然である遺伝子、プロモーター、遺伝子間領域もしくはリボソ
ーム結合部位を意味し、またはグラム陽性細菌に天然で見いだすことができる。したがっ
て、内因性遺伝子、プロモーター、遺伝子間領域またはリボソーム結合部位という用語は
、グラム陽性細菌の異なる属、種、亜種または菌株間のオーソロガス遺伝子、プロモータ
ー、遺伝子間領域およびリボソーム結合部位を含む。特に、グラム陽性細菌の1つの属、
種、亜種または菌株から単離された遺伝子、プロモーター、遺伝子間領域またはリボソー
ム結合部位は、天然におけるグラム陽性細菌の他の属、種、亜種または菌株もそのような
遺伝子、プロモーター、遺伝子間領域またはリボソーム結合部位を含むならば、ポリ核酸
配列の差異にかかわりなく、グラム陽性細菌のすべての他の属、種、亜種または菌株に対
して内因性であると言われる。したがって、そのような互いに異なるが、天然に見いださ
れる遺伝子、プロモーター、遺伝子間領域またはリボソーム結合部位配列は、内因性であ
るとみなされることになる。例として、また制限なしに、ラクトコッカス・ラクティス亜
種ラクティス(Lactococcus lactis ssp. lactis)から単離されるエノラーゼをコードす
る遺伝子であるenoAは、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス(Lactococcus
lactis ssp. cremoris)についても内因性であるとみなされる。
は菌株の「内因性」遺伝子、プロモーターまたは遺伝子間領域は、天然に見いだされる、
すなわち、それぞれグラム陽性細菌の当該同じ属、種、亜種または菌株に固有または独特
の遺伝子、プロモーターまたは遺伝子間領域を意味し得る。例として、また制限なしに、
ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス(Lactococcus lactis ssp. lactis)から単
離されるエノラーゼをコードする遺伝子であるenoAは、好ましくはラクトコッカス・
ラクティス亜種ラクティス(Lactococcus lactis ssp. lactis)に対して「内因性」であ
るとみなすことができるが、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス(Lactococcus
lactis ssp. cremoris)に対してはそうではない。
でない、またはグラム陽性細菌に天然で見いだすことができない遺伝子を意味する。外因
性遺伝子という用語は、異種遺伝子という用語と同義である。外因性遺伝子は、全長遺伝
子であってもよい、または代わりになるべきものとして切断遺伝子もしくは遺伝子断片で
あってもよい。例として、外因性遺伝子は、ウイルス、グラム陰性細菌などの他の原核生
物に由来し得る、または代わりになるべきものとして、また好ましくは、植物、動物、好
ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトなどの真核生物に由来し得る。あるいは、外因性
遺伝子は、完全にまたは部分的に天然に存在しないという意味で、完全にまたは部分的に
合成物または人工物であり得る。さらに、外因性遺伝子は、異なる種に由来する配列また
は天然に存在する配列と合成もしくは人工配列との組合せから構成され得るという意味で
、キメラ型であり得る。また、グラム陽性細菌配列ならびに例えば、グラム陽性細菌分泌
シグナルペプチドおよび外因性タンパク質から構成された融合タンパク質をコードする配
列などのグラム陽性細菌の外因性配列から構成されたキメラ配列が含まれる。
明によれば、外因性遺伝子への言及がそのような遺伝子のイントロンレスオープンリーデ
ィングフレーム、すなわち、そのような遺伝子のタンパク質コーディング配列に関するも
のであることを十分に理解する。「オープンリーディングフレーム」またはORFという
用語は、翻訳開始コドン(例えば、ATGまたはGTG)で始まり、翻訳終止コドン(例
えば、TAA、TAGまたはTGA)で終わり、単一ポリペプチドをコードするコーディ
ングヌクレオチドトリプレットの連続を意味する。
って、原核生物遺伝子のコーディング配列またはオープンリーディングフレームは、翻訳
開始コドンで始まり、原核生物ゲノム、特に細菌染色体上に位置する翻訳終止コドンで終
わるコーディングヌクレオチドトリプレットの連続に対応する。
グフレームまたはコーディング配列が転写可能または翻訳可能に結合された内因性オープ
ンリーディングフレームまたはコーディング配列を含むグラム陽性細菌に関する。
ガルノ配列、オペレーター、ターミネーター、転写領域およびまたは他の機能性配列領域
などの転写および翻訳調節領域に関連する遺伝の単位に対応するゲノム配列の配置可能な
領域を意味し得るが、本明細書で述べる外因性配列との関連での「遺伝子」という用語へ
の言及は、それに反することが明確に示されない限り、好ましくは当遺伝子のコーディン
グ領域またはオープンリーディングフレームを意味することを理解する。本明細書で述べ
る内因性配列との関連での「遺伝子」という用語への言及は、調節領域、転写領域および
または他の機能性配列領域に関連する遺伝の単位に対応するゲノム配列の配置可能な領域
を意味し得るが、あるいは当遺伝子のコーディング領域またはオープンリーディングフレ
ームも意味し得る。
という用語は、「翻訳可能に連結される」または「翻訳可能に接続される」と同義である
。これらの用語は、本質的にポリシストロン性発現系またはユニットに関連する。特に共
通のプロモーターなどの共通の調節エレメント(単数または複数)が、その後に2つ以上
の個別のポリペプチド配列に翻訳され得る、2つ以上の遺伝子、オープンリーディングフ
レームまたはコーディング配列をコードする1つのmRNAとして前記2つ以上の遺伝子
の転写をもたらす場合、2つ以上の遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーデ
ィング配列は、翻訳可能に結合されると言われる。当業者は、細菌オペロンが2つ以上の
遺伝子が翻訳可能または転写可能に結合された天然に存在するポリシストロン性発現系ま
たはユニットであることを十分に理解する。本発明によれば、転写可能な結合は、翻訳可
能な結合の基礎となる。
ーディングフレームまたはコーディング配列が転写可能に結合された内因性遺伝子を含む
グラム陽性細菌に関する。好ましくは、グラム陽性細菌は、1つまたは複数の外因性遺伝
子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列が転写可能に結合された内因
性遺伝子を連続して含む。本明細書で用いているように、「転写可能に結合される(trans
criptionally coupled)」という用語は、「転写可能に接続される」または「転写可能に
連結される」と同義である。これらの用語は、1つのmRNAとして普通に転写され、2
つ以上の個別のポリペプチドに翻訳され得る2つ以上のオープンリーディングフレームま
たはコーディング配列を含むポリ核酸配列を一般的に意味する。
たは組換え核酸に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットが内因性遺伝子および1つま
たは複数の外因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列を含む
。
ロン性発現系」という用語は、2つ以上の遺伝子の発現が、プロモーター、オペレーター
などの共通の調節メカニズムにより調節されるユニットを意味する。ポリシストロン性発
現ユニットという用語は、本明細書で用いているように、マルチシストロン性発現ユニッ
トと同義である。ポリシストロン性発現ユニットの例は、制限なしにバイシストロン性、
トリシストロン性、テトラシストロン性発現ユニットである。タンパク質、ポリペプチド
および/またはペプチドなどの個別の発現産物をコードする例えば、3、4、5、6、7
、8、9、10またはそれ以上などの2つ以上のオープンリーディングフレームまたはコ
ーディング領域を含むあらゆるmRNAは、ポリシストロン性という用語に含まれる。
は複数の内因性遺伝子および1つまたは複数の外因性遺伝子は、グラム陽性細菌に対して
内因性であるプロモーターにより転写制御される。他の実施形態において、本明細書で述
べるポリシストロン性発現ユニットまたは系は、グラム陽性細菌に対して内因性であるプ
ロモーターにより転写制御される。
酸分子上、好ましくはDNA分子上の領域を意味する。プロモーターは、好ましくは、そ
れがその転写を制御する配列の上流、すなわち、5’に位置するが、必ずしもそうでない
。
つまたは複数の内因性遺伝子および1つまたは複数の外因性遺伝子は、前記1つまたは複
数の内因性遺伝子(の1つ)の天然のプロモーターにより転写制御される。他の実施形態
において、本明細書で述べるポリシストロン性発現ユニットまたは系は、前記ポリシスト
ロン性発現系またはユニットに含まれる前記1つまたは複数の内因性遺伝子(の1つ)の
天然のプロモーターにより転写制御される。他の実施形態において、本明細書で述べるポ
リシストロン性発現ユニットまたは系は、グラム陽性内因性プロモーターに作動可能に連
結する。
う用語は、調節DNA配列と発現させようとするDNA配列が、発現を可能にするような
方法で連結されている、連結である。連結または接続が前記遺伝子の転写を可能にする、
またはもたらすならば、例えば、プロモーターは、遺伝子、オープンリーディングフレー
ムまたはコーディング配列に作動可能に連結されると言われる。さらなる例において、連
結または接続が少なくとも3’遺伝子の翻訳を可能にする、またはもたらすならば、5’
および3’遺伝子、シストロン、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列
は、ポリシストロン性発現ユニットにおいて作動可能に連結されると言われる。
、(2)オープンリーディングフレームの転写を誘導するプロモーターの能力を妨げるこ
と、または(3)プロモーター領域配列により転写されるオープンリーディングフレーム
の能力を妨げることをしないならば、例えば、好ましくはプロモーターおよびオープンリ
ーディングフレームなどのDNA配列は、作動可能に連結されると言われる。
るオープンリーディングフレーム(単数または複数)の上流、すなわち、5’に配置する
ことができる。
ーと結合させることができることを十分に理解する。発現のために必要な調節領域の正確
な性質は、生物ごとに異なり得るが、原核生物において、プロモーター(RNA転写の開
始を誘導する)ならびにRNAに転写されたときに、タンパク質合成の開始をシグナルで
伝達するDNA配列の両方を含むプロモーター領域を一般的に含むべきである。そのよう
な領域は、例えば、プリブノーボックス(TATAボックス参照)、シャイン−ダルガル
ノ配列などの、転写および翻訳の開始と関連性を有する5’非コーディング配列を通常含
む。
最も5’、すなわち、最も上流の内因性遺伝子の天然のプロモーターである。
子発現に関連する延長による)「構成的」という用語は、その関連遺伝子の連続的転写を
可能にするプロモーターを意味する。特に、そのようなプロモーターの制御下での関連遺
伝子または複数遺伝子の転写は、インデューサーまたは他の調節シグナルとは無関係に起
こる。
プロモーター」という用語は、基本的な細胞機能の維持のために必要な遺伝子または遺伝
子のプロモーターを意味する。一部のハウスキーピング遺伝子は、比較的に一定のレベル
で発現するが、他のハウスキーピング遺伝子は、外的または実験条件によって変化し得る
。ハウスキーピング遺伝子は、例えば、代謝、遺伝子発現(基礎転写機構など)、シグナ
ル伝達に関与し得るが、構造遺伝子でもあり得る。
路に関与する遺伝子または遺伝子のプロモーターを意味し、解糖酵素、特に、ヘキソキナ
ーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、フルクトースビスリン
酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲ
ナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、エノラーゼおよび
ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子のプロモーターを含む。
」は、リボソームタンパク質をコードする遺伝子ならびにリボソームRNAに転写された
遺伝子を含む、遺伝子またはリボソーム遺伝子のプロモーターを意味する。好ましくは、
それは、リボソームタンパク質の遺伝子またはプロモーターを意味し得る。
または代わりになるべきものとして「基礎代謝遺伝子」もしくは「基礎代謝プロモーター
」は、重要な代謝経路に関与する遺伝子または遺伝子のプロモーターを意味し、解糖、ペ
ントースリン酸経路およびトリカルボン酸(TCA)回路に関与する遺伝子を含む。
ーターに関連する延長による)「必須」という用語は、宿主に対して例えば、特に致死性
など、有害である、あるいは、例えば、特に増殖または成長などの正常な生理または機能
を変化させる、抑制するまたは妨げるその天然の発現産物が存在しない遺伝子に関連する
。本明細書で用いているように、遺伝子または遺伝子のプロモーターとの関連での「必須
」という用語は、条件付きで必須と対立するものとして、構成的に必須に関する。例えば
、いくつかのグラム陽性細菌、特にラクトコッカス属種(Lactococcus sp.)などの乳酸
菌におけるベータガラクトシダーゼ遺伝子などのラクトースオペロンの遺伝子は、細菌が
主なまたは唯一の炭素源としてのラクトースを含む培地中で培養される場合には必須であ
り得る。細菌が代替炭素源を含む培地中で培養される場合、これらの遺伝子は、必須では
ない。したがって、これらの遺伝子は、条件付きで必須であるにすぎないが、本明細書で
意図するように構成的に必須ではない。
性遺伝子は、以下のラクトコッカス属(Lactococcus)プロモーターおよび/または遺伝
子、より詳細にはラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス株MG1363(Lactococ
cus lactis ssp. cremoris strain MG1363)プロモーターおよび/または遺伝子に対応す
るグラム陽性細菌プロモーターおよび/または遺伝子を含むまたはそれからなる群から選
択される:1)DNA依存性RNAポリメラーゼ、ベータ’サブユニット/160kDサ
ブユニット(rpoC)、2)DNA依存性RNAポリメラーゼ、ベータサブユニット/
140kDサブユニット(rpb2またはrpoB)、3)DNA結合フェリチン様タン
パク質(酸化損傷プロテクタント)(dps)、4)ピルビン酸キナーゼ(pyk)、5
)グルタミル−およびグルタミニル−tRNAシンテターゼ(glnSまたはgltX)
、6)エノラーゼ(eno)、7)グルタミンシンテターゼ(glnA)、8)HTH型
転写レギュレーター(glnR)、9)Xaa−Hisジペプチダーゼ(argEまたは
pepV)、10)F0F1型ATPシンターゼベータサブユニット(ATPシンターゼ
F1ベータサブユニット)(atpD)、11)3−ホスホグリセリン酸キナーゼ(pg
k)、12)グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ/エリスロース−4−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ(gapAまたはgapB)、13)酢酸キナーゼ(ackA)、
14)3−オキソアシル−(アシル−担体タンパク質)シンターゼ(fabBまたはfa
bF)、15)3−オキソアシル−(アシル−担体タンパク質)レダクターゼ(fabG
)、16)DNA依存性RNAポリメラーゼ、アルファサブユニット/40kDサブユニ
ット(rpoA)、17)Xaa−Proアミノペプチダーゼ(pepP)、18)フル
クトース/タガトースビスリン酸アルドラーゼ(tbpまたはfbaA)、19)リボソ
ームタンパク質S4(rpsD)、20)スーパーオキシドジスムターゼ(sodA)、
21)リボソームタンパク質S12(rpsL)およびリボソームタンパク質S7(rp
sG)、22)リボソームタンパク質L18(rplR)およびリボソームタンパク質S
5(rpsE)およびリボソームタンパク質L30/L7E(rpmD)、23)S−リ
ボシルホモシステインリアーゼ(luxS)、24)リボソームタンパク質L19(rp
lS)、25)リボソームタンパク質S11(rpsK)、26)リボソームタンパク質
L10(rplJ)、27)リボソームタンパク質L7/L12(rplL)、28)細
菌核様体DNA結合タンパク質/DNA結合タンパク質HU(hupまたはhllA)、
29)50Sリボソームタンパク質L28(rpmB)、30)ホスホトランスフェラー
ゼ系セロビオース特異的成分IIB(laceまたはptcB)、31)F0F1型AT
Pシンターゼアルファサブユニット(atpA)、32)ABC型糖輸送系(ATPアー
ゼ成分)(malKまたはmsmK)、33)アセトインデヒドロゲナーゼ複合体E1成
分アルファサブユニット(acoAまたはpdhA)、34)細胞分裂タンパク質(di
flVAまたはftsA)、35)UDP−ガラクトピラノースムターゼ(glf)、3
6)グルタミルアミノペプチダーゼ(frvXまたはpepA)、37)予測デヒドロゲ
ナーゼ関連タンパク質(mviMまたはllmg_0272)、38)リボソームタンパ
ク質S2(rpsB)、39)翻訳開始因子3(IF−3)(infC)、40)リボソ
ームタンパク質L4(rplD)およびリボソームタンパク質L23(rplW)および
リボソームタンパク質L2(rplB)、41)EMAPドメイン(ydjD)、42)
転写伸長因子(greA)、43)ATP依存性Clpプロテアーゼ(clpP)のプロ
テアーゼサブユニット、44)リボソームタンパク質L15(rplO)、45)リボソ
ームタンパク質L11(rplK)、46)リボソームタンパク質S8(rpsH)、4
7)リボソームタンパク質L21(rplU)、48)リボソームタンパク質S13(r
psM)、49)リボソームタンパク質S19(rpsS)およびリボソームタンパク質
L22(rplUまたはrplV)およびリボソームタンパク質L16(rplP)およ
びリボソームタンパク質L14(rplN)、50)リボソームタンパク質S10(rp
sJ)、51)コシャペロニンGroES(Hsp10)(cpn10)、52)リボソ
ームタンパク質L24(rplX)、53)仮想タンパク質LACR_0137(duf
965)ならびに54)分泌45kDaタンパク質(usp45)。好ましくは、内因性
プロモーターおよび/または内因性遺伝子は、enoA、usp45、gapB、pyk
、rpmBおよびrplSを含む、またはそれからなる群から選択される。これらのプロ
モーターおよびそれらの配列は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第
2008/08411号、例えば、その表1および図1A〜Hに開示されている。一実施
形態において、本発明は、内因性遺伝子および1つまたは複数の外因性遺伝子が、グラム
陽性細菌に対して内因性のプロモーターにより、好ましくは前記グラム陽性細菌のeno
、usp45、gap、pyk、rpmBおよびrplSのプロモーターからなる群から
選択される内因性プロモーターにより転写制御される、本明細書で述べたグラム陽性細菌
または組換え核酸に関する。さらなる実施形態において、内因性遺伝子は、グラム陽性細
菌におけるその天然の染色体遺伝子座に位置する。
グフレームまたはコーディング配列は、前記1つまたは複数の内因性遺伝子、オープンリ
ーディングフレームまたはコーディング配列の3’末端に翻訳可能または転写可能に結合
される。したがって、一実施形態において、本発明は、ポリシストロン性発現ユニットを
含むグラム陽性細菌を提供し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、1つまたは複数の
5’内因性遺伝子および1つまたは複数の3’外因性遺伝子を含む。好ましくは、ポリシ
ストロン性発現ユニットの最も5’遺伝子は、内因性遺伝子である。例として、また制限
なしに、ポリシストロン性発現ユニットは、5’末端から3’末端までの内因性遺伝子と
それに続く1つまたは複数の内因性遺伝子とそれに続く1つまたは複数の外因性遺伝子を
含みまたはそれから本質的になり得る。あるいは、また制限なしに、ポリシストロン性発
現ユニットは、5’末端から3’末端までの内因性遺伝子とそれに続く1つまたは複数の
外因性遺伝子を含みまたはそれから本質的になり得る。あるいは、ポリシストロン性発現
ユニットは、5’末端から3’末端までの内因性遺伝子とそれに続く1つまたは複数の外
因性遺伝子とそれに続く1つまたは複数の内因性遺伝子を含みまたはそれから本質的にな
り得る。
複数の内因性遺伝子および1つもしくは複数の外因性遺伝子、またはポリシストロン性発
現ユニットもしくは系は、本明細書で述べた本発明によるグラム陽性細菌における内因性
および外因性遺伝子の維持および/または増殖および発現を可能にするレプリコンに含ま
れ得る。
よって含む、翻訳可能に結合されたかまたは転写可能に結合された1つもしくは複数の内
因性遺伝子および1つもしくは複数の外因性遺伝子、または本明細書で述べた、ポリシス
トロン性発現ユニットもしくは系は、ベクター、好ましくはグラム陽性細菌における発現
を可能にする発現ベクターに含まれ得る。したがって、本発明はまた、本明細書で述べた
組換え核酸を含むベクターに関する。
なわち、増殖させることができる、核酸分子、一般的にDNAを意味する。したがって、
ベクターは、一般的に1つまたは複数の独特な制限部位を含み、クローニングされた配列
が再現可能なように定義された宿主またはビヒクル生物において自己複製の能力があり得
る。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージ、バク
テリオファージ由来のベクター、PAC、BAC、直鎖核酸、例えば、直鎖DNA等を制
限なしに含み得る(例えば、Sambrookら、1989年、Ausubel、1992年参照)。
ターを含む受容細胞が認識され、ベクターを含まない受容細胞から選択され得る容易さ、
特定の宿主における望ましいベクターのコピー数、ベクターを異なる種の宿主細胞間で「
往復させる」ことができることが望ましいかどうかなどを含む。好ましい原核生物ベクタ
ーは、例えば、大腸菌(E. coli)において複製の能力のあるものなどのプラスミド(例
えば、pBR322、ColE1、pSC101、pUC19等など)を含む。そのよう
なプラスミドは、Sambrookら、1989年、Ausubel、1992年に記載されている。特に好まし
いベクターは、大腸菌(E. coli)(または他のグラム陰性細菌)ならびにグラム陽性細
菌、乳酸菌、好ましくはラクトコッカス属(Lactococcus)、より好ましくはラクトコッ
カス・ラクティス(Lactococcus lactis)などの対象の他の宿主細胞において複製できる
ものであり得る(例えば、Kokら、Appl. Environ. Microbiol.、1984年、48巻(4号)、726
〜31頁)。他の好ましいベクターは、複製し、かつ/または1つもしくは複数のグラム陽
性細菌の間を往復することができるものであり得るが、グラム陰性細菌にはない。好まし
い実施形態において、ベクターは、参照により本明細書に特に組み込まれる、Steidlerら
、Appl. Environ. Microbiol.、1995年、61巻(4号)、1627〜1629頁に記載されているpT
1NXである。
結合された1つもしくは複数の内因性遺伝子および1つもしくは複数の外因性遺伝子、ま
たはポリシストロン性発現ユニットもしくは系は、グラム陽性細菌ゲノムまたは染色体に
組み込まれる。組換えグラム陽性細菌およびランダムならびに相同的組換えを得る方法、
ならびに組換えを達成するためのベクターは、当技術分野で周知である。さらなるガイダ
ンスとして、そのような方法およびベクターは、例えば、参照により全体として組み込ま
れる、Steidlerら(2003年、Nature Biotechnology、21巻、785〜789頁)、Lawら(1995
年、J Bacteriol、177巻(24号)、7011〜7018頁)、Leenhoutsら(1998年、Methods in Ce
ll Science、20巻、35〜50頁)および国際公開第2004/046346号に開示されて
いる。好ましくは、本明細書で述べたポリシストロン性発現ユニットは、相同的組換えに
よる細菌染色体における必須の配列の部位特異的組込みによって発生または導入する。
ーターおよび場合による付加的な調節配列ならびに本明細書で述べたポリシストロン性発
現ユニットを含む。好ましくは、内因性プロモーターとポリシストロン性発現ユニットは
、作動可能に連結されている。相同的組換えは、所定の遺伝子座において達成することが
できる。そのような系は、高度にモジュール式であり、プロモーター、調節配列、内因性
遺伝子および外因性遺伝子の個別の選択および組合せならびに挿入部位の選択を可能にす
る。
子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列および1つまたは複数の外因
性遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列を含むポリシストロン
性発現ユニットが作動可能に連結している、その天然の遺伝子座における、すなわち、細
菌染色体上のその天然のゲノムコンテクスト(native genomic context)における本明細
書における他所で述べた内因性プロモーターを含む。作動可能な連結は、プロモーターを
含む遺伝子座と相同的組換えを達成するように構成された配列が隣接した、ポリシストロ
ン性発現ユニットを含む組換えベクターとの間の相同的組換えによって達成することがで
きる。したがって、一実施形態において、本発明は、1つまたは複数の外因性遺伝子を前
記遺伝子座に染色体上で組み込むことにより、好ましくは1つまたは複数の外因性遺伝子
を前記遺伝子座における内因性遺伝子の3’に染色体上で組み込むことにより、内因性遺
伝子が1つまたは複数の外因性遺伝子に転写可能に結合されている、本明細書で述べたグ
ラム陽性細菌に関する。
グフレームまたはコーディング配列が単に対象とする染色体遺伝子座に組み込まれるよう
に選択することができる。この場合、転写および/または翻訳をもたらすプロモーターそ
れ自体の傍らの調節配列、例えば、オペレーター、転写開始部位、シャイン−ダルガルノ
配列、ターミネーター配列等は、プロモーターの天然のゲノム遺伝子座によって備えられ
ている。あるいは、そのような配列は、ポリシストロン性発現ユニットを含む組換えベク
ター上に備えることができる。後者の場合、必要に応じて、内因性プロモーターと結合し
た天然の調節配列を相同的組換え時に除去することができる。ここで述べる系は、内因性
遺伝子、外因性遺伝子および場合による調節配列の個別の選択に関してモジュール式であ
るが、選択されるプロモーターの内因性遺伝子座における挿入部位をあらかじめ定める。
遺伝子および1つまたは複数の外因性遺伝子のポリシストロン性発現をもたらすような、
1つまたは複数の外因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列
が作動可能に連結している、その(それらの)天然の遺伝子座における、すなわち、細菌
染色体上のその(それらの)天然のゲノムコンテクストにおける本明細書における他所で
述べた内因性プロモーターならびに1つまたは複数の内因性遺伝子を含む。この系では、
内因性プロモーターおよび1つまたは複数の内因性遺伝子、ならびに前記1つまたは複数
の内因性遺伝子の転写および翻訳をもたらす調節配列がそれらの天然の遺伝子座に存在す
る。そのような系は、グラム陽性細菌の天然の特性を最大限保存している。
レームまたはコーディング配列を含む。すべての遺伝子の翻訳を開始するために、これら
の遺伝子のそれぞれは、一般的にリボソーム結合をもたらす配列、すなわち、リボソーム
結合部位と結合している。原核生物において、リボソーム結合部位は、一般的コンセンサ
ス配列5’−AGGAGG−3’を有する表示シャイン−ダルガルノ(SD)配列である
。SD配列は、翻訳開始コドンまたは出発コドンの平均で約8塩基対上流(すなわち、そ
の5’)に位置する。5’遺伝子の停止コドンと3’遺伝子の出発コドンとの間の距離(
ヌクレオチドの量としての)によって、SD配列は、一般的に1)距離がSD配列の少な
くともサイズである場合、両遺伝子の間の遺伝子間領域に、2)5’遺伝子と3’遺伝子
の間がより小さい距離の場合、両遺伝子の間の遺伝子間領域であるが、5’遺伝子の停止
コドンと重複した領域に、または3)5’遺伝子の停止コドンと3’遺伝子の出発コドン
との距離が非常に近いか、または重複している場合、5’から5’遺伝子の停止コドンま
でに配置することができる。
に構成されたリボソーム結合部位を含む1つまたは複数のポリ核酸配列をさらに含む、本
明細書で述べたグラム陽性細菌または組換え核酸に関する。他の実施形態において、本発
明は、1つまたは複数の外因性遺伝子の翻訳をもたらすように構成された1つまたは複数
のリボソーム結合部位をさらに含む、本明細書で述べたグラム陽性細菌または組換え核酸
に関する。さらなる実施形態において、本発明は、前記1つまたは複数の内因性遺伝子お
よび前記1つまたは複数の外因性遺伝子が、リボソーム結合部位により転写可能または翻
訳可能に結合された、本明細書で述べたグラム陽性細菌または組換え核酸に関する。さら
に他の実施形態において、本発明は、リボソーム結合部位を含むまたはそれから(本質的
に)なるポリ核酸配列により5’遺伝子が3’遺伝子に結合している、本明細書で述べた
ポリシストロン性発現ユニットを含む、グラム陽性細菌または組換え核酸に関する。好ま
しい実施形態において、前記リボソーム結合部位は、グラム陽性細菌に対して内因性であ
る。さらなる好ましい実施形態において、前記リボソーム結合部位は、遺伝子間領域、好
ましくはオペロン遺伝子間領域に含まれる。
うに構成された遺伝子間領域を含む1つまたは複数のポリ核酸配列をさらに含む、本明細
書で述べたグラム陽性細菌または組換え核酸に関する。さらなる実施形態において、本発
明は、1つまたは複数の外因性遺伝子の翻訳をもたらすように構成された1つまたは遺伝
子間領域をさらに含む、本明細書で述べたグラム陽性細菌または組換え核酸に関する。さ
らなる実施形態において、本発明は、前記1つまたは複数の内因性遺伝子および前記1つ
または複数の外因性遺伝子が、遺伝子間領域により転写可能または翻訳可能に結合された
、本明細書で述べたグラム陽性細菌または組換え核酸に関する。さらに他の実施形態にお
いて、本発明は、遺伝子間領域を含むまたはそれからなるポリ核酸配列により5’遺伝子
が3’遺伝子に結合している、本明細書で述べたポリシストロン性発現ユニットを含む、
グラム陽性細菌または組換え核酸に関する。好ましい実施形態において、前記遺伝子間領
域は、グラム陽性細菌に対して内因性である。さらなる好ましい実施形態において、前記
遺伝子間領域は、オペロン遺伝子間領域である。
または「遺伝子間スペーサー」と同義である。遺伝子間領域は、隣接する(すなわち、同
じポリ核酸配列上に位置する)遺伝子、オープンリーディングフレーム、シストロンまた
はコーディング配列の間のポリ核酸配列と定義される。伸長により、遺伝子間領域は、前
記遺伝子間領域によって連結されている5’遺伝子の停止コドンおよび/または3’遺伝
子の出発コドンを含み得る。本明細書で定義されているように、遺伝子間領域という用語
は、具体的にはポリシストロン性発現ユニットにおける隣接する遺伝子の間の遺伝子間領
域に関する。例えば、本明細書で定義した遺伝子間領域は、オペロンにおける隣接する遺
伝子の間に見いだすことができる。したがって、一実施形態において、本明細書で定義し
た遺伝子間領域は、オペロン遺伝子間領域である。
rplW、rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsEまたはrplNに先行す
る、すなわちその5’にある、より詳細には直接5’にある遺伝子間領域を含むまたはそ
れからなる遺伝子間領域の群から選択される。一実施形態において、前記グラム陽性細菌
は、乳酸菌、好ましくはラクトコッカス属(Lactococcus)種、より好ましくはラクトコ
ッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)およびその亜種または菌株である。一実施形
態において、前記遺伝子間領域は、rplW、rplP、rpmD、rplB、rpsG
、rpsEもしくはrplNの出発コドンおよび/または先行する、すなわち、5’にあ
る遺伝子の停止コドンを含む。好ましい実施形態において、本発明は、内因性遺伝子およ
び1つまたは複数の外因性遺伝子がグラム陽性細菌において活性な1つまたは複数の遺伝
子間領域により転写可能に結合され、好ましくは1つまたは複数の遺伝子間領域が前記グ
ラム陽性細菌に対して内因性であり、より好ましくは内因性遺伝子間領域がrplW、r
plP、rpmD、rplB、rpsG、rpsE、rplN、rplM、rplEおよ
びrplFに先行する遺伝子間領域からなる群から選択される、本明細書で述べたグラム
陽性細菌または組換え核酸に関する。
正しい翻訳開始および/または終止に影響を及ぼし得る二重の出発および/または停止コ
ドンを避けるために、これらのそれぞれのコドンが好ましくは、前記遺伝子間領域により
連結される遺伝子に存在しないことを十分に理解する。遺伝子間領域を同定する方法は、
当技術分野で公知である。さらなるガイダンスとして、遺伝子間領域は、例えば、十分な
ソフトウエアが当技術分野で公知であり、利用できるオペロン、ならびに関連プロモータ
ーおよびオープンリーディングフレームの予測に基づいて同定することができる。
かを含む、それから本質的になるまたはそれからなる群から選択される。
配列番号1 TAATG
配列番号2 TAATCCATG
配列番号3 TAAGGAGGAAAAAATG
配列番号4 TAATAGAGGAGGAAAATCGTG
配列番号5 TAAGAAGGGAGATAAGTAAGAATG
配列番号6 TAAGGAAAGGGGTAATTAAACATG
配列番号7 TAAGCAAAACTAGGAGGAATATAGCATG。
比べて1つのヌクレオチドの1つのミスマッチまたは欠失または挿入を示す配列、配列番
号3または配列番号4と比べて1つ、2つもしくは3つのミスマッチ、または1つ、2つ
もしくは3つのヌクレオチドの欠失もしくは挿入を示す配列、および配列番号5、配列番
号6または配列番号7と比べて1つ、2つ、3つもしくは4つのミスマッチ、または1つ
、2つ、3つもしくは4つのヌクレオチドの欠失もしくは挿入を示す配列を含む、それか
ら本質的になるまたはそれからなる群から選択される。
7は、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス(Lactococcus lactis ssp. cremoris
)株MG1363(Genbank寄託番号AM406671.1)のそれぞれrplW
、rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsEおよびrplNに先行する遺伝子
間領域に対応する。これらの配列は、とりわけ、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクテ
ィス(Lactococcus lactis ssp. lactis)株CV56(Genbank寄託番号CP00
2365.1)、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス(Lactococcus lactis ssp
. cremoris)株NZ9000(Genbank寄託番号CP002094.1)、ラクト
コッカス・ラクティス亜種ラクティス(Lactococcus lactis ssp. lactis)株KF147
(Genbank寄託番号CP001834.1)、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラ
クティス(Lactococcus lactis ssp. lactis)株IL1403(Genbank寄託番号
AE005176.1)およびラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス(Lactococcu
s lactis ssp. cremoris)株SK11(Genbank寄託番号CP000425.1)
の対応する配列と同じである。
のrplP、rpmD、rplM、rpsE、rplEまたはrplFに先行する、すな
わちその5’にある、より詳細には直接5’にある遺伝子間領域を含むまたはそれからな
る遺伝子間領域の群から選択される。一実施形態において、前記グラム陽性細菌は、乳酸
菌、好ましくはエンテロコッカス属(Enterococcus)種、より好ましくはエンテロコッカ
ス・フェシウム(Enterococcus faecium)およびその亜種または菌株である。一実施形態
において、前記遺伝子間領域は、rplP、rpmD、rplM、rpsE、rplEま
たはrplFの出発コドンおよび/または先行する、すなわち、5’にある遺伝子の停止
コドンを含む。当業者は、遺伝子間領域が5’停止コドンおよび/または3’出発コドン
を含む場合、正しい翻訳開始および/または終止に影響を及ぼし得る二重の出発および/
または停止コドンを避けるために、これらのそれぞれのコドンが好ましくは、前記遺伝子
間領域により連結される遺伝子に存在しないことを十分に理解する。遺伝子間領域を同定
する方法は、当技術分野で公知である。さらなるガイダンスとして、遺伝子間領域は、例
えば、十分なソフトウエアが当技術分野で公知であり、利用できるオペロン、ならびに関
連プロモーターおよびオープンリーディングフレームの予測に基づいて同定することがで
きる。
れかを含む、それから本質的になるまたはそれからなる群から選択される。
配列番号8 TAATC
配列番号9 TAAGGAGGACAACAATA
配列番号10 TAATAGGAGGGAATTTCA
配列番号11 TTAGAAGAAGGAGGAATACCATTC
配列番号12 TAAAAGTTTAAGGAAGGAGGGTCTTACTGA
配列番号13 TAATCAAGTAGAATCTACAAGGAGGTGTCTTTA
A
マッチ、または1つのヌクレオチドの欠失または挿入を示す配列、配列番号9または配列
番号10と比べて1つ、2つもしくは3つのミスマッチ、または1つ、2つもしくは3つ
のヌクレオチドの欠失もしくは挿入を示す配列、および配列番号11、配列番号12また
は配列番号13と比べて1つ、2つ、3つもしくは4つのミスマッチ、または1つ、2つ
、3つもしくは4つのヌクレオチドの欠失もしくは挿入を示す配列を含む、それから本質
的になるまたはそれからなる群から選択される。配列番号8〜13は、エンテロコッカス
・フェシウム(Enterococcus faecium)株LMG15709のrplP、rpmD、rp
lM、rpsE、rplEおよびrplFにそれぞれ先行する遺伝子間領域に対応する。
述べた遺伝子間領域は、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25また
はそれ以上などの1個超のヌクレオチド、好ましくは5超のヌクレオチド、より好ましく
は10以上のヌクレオチドを含むまたはそれからなることができる。他の実施形態におい
て、遺伝子間領域は、例えば、1〜40、1〜30、1〜25、1〜20、1〜15また
は1〜10個などの1〜50個のヌクレオチド、好ましくは5〜50、5〜40、5〜3
0、5〜25、5〜20、5〜15または5〜10個のヌクレオチド、より好ましくは1
0〜50、10〜40、10〜30、10〜25、10〜20または10〜15個のヌク
レオチドを含み得る。
実施形態を表1および2に示し、前記グラム陽性細菌は、内因性プロモーター、表1およ
び2に示された遺伝子間領域に結合したその3’側の内因性遺伝子、遺伝子間領域に結合
したその3’側の1つまたは複数の外因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたは
コーディング配列を含む。好ましい実施形態において、表1および2に示された各遺伝子
は、その天然のプロモーターおよび場合によって調節配列により転写制御される。他の好
ましい実施形態において、前記ポリシストロン性発現ユニットは、細菌染色体に組み込ま
れる。さらなる好ましい実施形態において、前記内因性プロモーターおよび/または内因
性遺伝子は、細菌ゲノムまたは染色体上のそれらの天然の遺伝子座に存在する。好ましく
は、出発および停止コドンは、存在する場合、それぞれ前記外因性遺伝子および前記内因
性遺伝子の出発および停止コドンを置き換える。
性遺伝子>>遺伝子間領域>>外因性遺伝子を含みまたはそれから本質的になり得、内因
性遺伝子および遺伝子間領域は、以下の組合せから選択される。
ッカス属(Lactococcus)の種、亜種または菌株、好ましくはラクトコッカス・ラクティ
ス(Lactococcus lactis)に由来する。好ましくは、遺伝子間領域rplP、rplMお
よびrplEは、エンテロコッカス属(Enterococcus)の種、亜種または菌株、好ましく
はエンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)またはエンテロコッカス・
フェシウム(Enterococcus faecium)に由来する。好ましくは、遺伝子間領域rplP、
rpmDおよびrpsEは、ラクトコッカス属(Lactococcus)の種、亜種または菌株、
好ましくはラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)に、またはエンテロコッ
カス属(Enterococcus)の種、亜種または菌株、好ましくはエンテロコッカス・フェカリ
ス(Enterococcus faecalis)またはエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faec
ium)に由来する。
む場合、内因性プロモーター>>内因性遺伝子>>遺伝子間領域>>外因性遺伝子>>遺
伝子間領域>>外因性遺伝子と表される構造は、次の通りであり得る:usp45>>u
sp45>>rpmD>>外因性遺伝子1>>rplN>>外因性遺伝子2;enoA>
>enoA>>rpmD>>外因性遺伝子1>>rplN>>外因性遺伝子2;gapB
>>gapB>>rpmD>>外因性遺伝子1>>rplN>>外因性遺伝子2。例えば
、そのような配置は、本明細書で教示した抗TNFα抗体などの抗体の重および軽鎖の発
現(好ましくはその順序の)に特に適する可能性がある。
性遺伝子>>遺伝子間領域>>外因性遺伝子を含みまたはそれから本質的になり得、内因
性遺伝子および遺伝子間領域は、以下の組合せから選択される。
グラム陽性細菌は、ラクトコッカス属(Lactococcus)の種、亜種または菌株、好ましく
はラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)である。好ましくは、配列番号8
〜13のいずれかを含むポリシストロン性発現ユニットを有するグラム陽性細菌は、エン
テロコッカス属(Enterococcus)の種、亜種または菌株、好ましくはエンテロコッカス・
フェカリス(Enterococcus faecalis)またはエンテロコッカス・フェシウム(Enterococ
cus faecium)である。
ング配列を、特定の目的を達成する付加的配列に結合させることができることを十分に理
解する。例えば、外因性遺伝子の分泌を増加させるために、遺伝子を分泌シグナルペプチ
ドをコードする核酸配列に結合させることができる。特に好ましい実施形態において、本
発明による外因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列を、好
ましくはラクトコッカス属(Lactococcus)の種、より好ましくはラクトコッカス・ラク
ティス(Lactococcus lactis)ならびにその亜種および菌株に由来するUsp45分泌シ
グナルをコードするポリ核酸配列にその5’末端において結合させる。
、宿主細胞からの随伴タンパク質またはペプチド配列の分泌を可能にし、当タンパク質ま
たはペプチドから通常切断される疎水性アミノ酸を通常含む、約16〜約35アミノ酸セ
グメントである。好ましくは、分泌シグナル配列は、前記シグナル配列を含む核酸ととも
に用いることを目的とした宿主細胞において非常に活性であり得る。
としてのラクトコッカス属(Lactococcus)シグナル配列は、usp45(米国特許第5
,559,007号参照)およびその他のシグナル配列を含む。例えば、Perez-Martinez
ら、Mol. Gen. Genet.、1992年、234巻、401〜11頁、Sibakovら、Appl. Environ. Microb
iol.、1991年、57巻(2号)、341〜8頁を参照のこと。好ましくは、シグナル配列は、プロ
モーター配列とORFとの間に位置する。すなわち、シグナル配列は、プロモーター配列
の3’側に位置し、対象のポリペプチドのORFに先行する。好ましい実施形態において
、シグナル配列は、アミノ酸配列MKKKIISAILMSTVILSAAAPLSGV
YA(usp45)をコードする。あるいは、対象のポリペプチドのさらなる制御可能な
産生および分泌をもたらす突然変異usp45シグナル配列(usp45N)を用いるこ
とができる。特に、突然変異体は、4位にリシン(K)の代わりにアスパラギン(N)を
、またはK4N突然変異を含む。好ましい実施形態において、シグナル配列は、アミノ酸
配列MKKNIISAILMSTVILSAAAPLSGVYADTNをコードする。
リ核酸配列に関する。特に、一態様において、本発明は、本明細書で述べた本発明による
ポリシストロン性発現ユニットを含むポリ核酸配列に関し、前記ポリシストロン性ユニッ
トは、グラム陽性細菌に対して内因性の1つまたは複数の遺伝子ならびにグラム陽性細菌
に対して外因性の1つまたは複数の遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーデ
ィング配列を含み、1つまたは複数の内因性遺伝子および1つまたは複数の外因性遺伝子
は、本明細書で述べた仕方で翻訳可能または転写可能に結合される。好ましくは、1つま
たは複数の内因性遺伝子は、1つまたは複数の外因性遺伝子の5’末端に結合する。好ま
しくは、1つまたは複数の内因性遺伝子および1つまたは複数の外因性遺伝子は、本明細
書で述べた遺伝子間領域、好ましくは、本明細書の他所で述べたrplW、rplP、r
pmD、rplB、rpsG、rpsEおよびrplNに先行する遺伝子間領域または配
列番号1〜7のいずれかに対応する遺伝子間領域または本明細書の他所で述べたrplP
、rpmD、rplM、rpsE、rplEもしくはrplFに先行する遺伝子間領域ま
たは配列番号8〜13のいずれかに対応する遺伝子間領域または上述の関連配列により接
続される。一実施形態において、ポリ核酸配列は、プロモーター、好ましくはグラム陽性
細菌の内因性のプロモーターをさらに含む。他の実施形態において、ポリ核酸配列は、調
節配列、例えば、オペレーター、ターミネーターなどをさらに含む。好ましい実施形態に
おいて、プロモーターは、内因性遺伝子の天然のプロモーターである。
関する。好ましくは、前記レプリコンは、本明細書の他所で述べたベクターである。一実
施形態において、前記ベクターは、原核生物発現に適する。他の実施形態において、前記
ベクターは、グラム陽性細菌における相同的組換えに適する。
対して外因性の遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列を含むポ
リ核酸配列に関し、リボソーム結合部位は、外因性遺伝子、オープンリーディングフレー
ムまたはコーディング配列の翻訳を達成するように構成されている。一実施形態において
、ポリ核酸配列は、グラム陽性細菌のリボソーム結合部位および前記細菌に対して外因性
の遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列を含み、リボソーム結
合部位は、外因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列の5’
末端に接続されている。
伝子間領域および前記細菌に対して外因性の遺伝子、オープンリーディングフレームまた
はコーディング配列を含むポリ核酸配列に関し、遺伝子間領域は、外因性遺伝子、オープ
ンリーディングフレームまたはコーディング配列の翻訳を達成するように構成されている
。一実施形態において、ポリ核酸配列は、グラム陽性細菌の遺伝子間領域、好ましくはオ
ペロン遺伝子間領域および前記細菌に対して外因性の遺伝子、オープンリーディングフレ
ームまたはコーディング配列を含み、遺伝子間領域は、外因性遺伝子、オープンリーディ
ングフレームまたはコーディング配列の5’末端に接続されている。好ましくは、遺伝子
間領域は、本明細書の他所で述べたrplW、rplP、rpmD、rplB、rpsG
、rpsEもしくはrplNに先行する遺伝子間領域または配列番号1〜7のいずれかに
対応する遺伝子間領域または本明細書の他所で述べたrplP、rpmD、rplM、r
psE、rplEもしくはrplFに先行する遺伝子間領域または配列番号8〜13のい
ずれかに対応する遺伝子間領域または上述の関連配列である。
mD、rplB、rpsG、rpsEもしくはrplNに先行する遺伝子間領域または配
列番号1〜7のいずれかに対応する遺伝子間領域または本明細書の他所で述べたrplP
、rpmD、rplM、rpsE、rplEもしくはrplFに先行する遺伝子間領域ま
たは配列番号8〜13のいずれかに対応する遺伝子間領域または上述の関連配列を含むポ
リシストロン性発現ベクターに関する。一実施形態において、前記ベクターは、前記遺伝
子間領域の3’末端における遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング
配列、好ましくはグラム陽性細菌に対して外因性である遺伝子をクローニングするのに適
している。一実施形態において、前記ベクターは、グラム陽性細菌において複製されるの
に適している。さらなる実施形態において、前記ベクターは、グラム陽性細菌における相
同的組換えを達成するために、特に、前記遺伝子間領域および前記遺伝子間領域の3’末
端における遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列の染色体組込
みに適している。一実施形態において、前記ベクターは、1つまたは複数のプロモーター
、好ましくはグラム陽性細菌プロモーターをさらに含む。さらなる実施形態において、前
記ベクターは、調節配列、例えば、オペレーター、ターミネーターなどをさらに含む。さ
らに他の実施形態において、前記ベクターは、抗生物質耐性遺伝子などの1つまたは複数
の選択マーカーをさらに含む。
ーディング配列を含み、本明細書で述べた(内因性)プロモーターを場合によってさらに
含むベクターを用いて前記グラム陽性細菌を形質転換するステップを含む、グラム陽性細
菌における外因性遺伝子発現の方法に関する。
遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列のポリシストロン性発現
のための本明細書で述べたグラム陽性細菌の遺伝子間領域を含むポリ核酸配列の使用に関
する。一実施形態において、本発明は、グラム陽性細菌に対して外因性の1つまたは複数
の遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコーディング配列および前記グラム陽性
細菌に対して内因性の1つまたは複数の遺伝子、オープンリーディングフレームまたはコ
ーディング配列のポリシストロン性発現のための本明細書で述べたグラム陽性細菌の遺伝
子間領域を含むポリ核酸配列の使用に関する。一実施形態において、前記グラム陽性細菌
に対して外因性の1つまたは複数の遺伝子は、前記内因性遺伝子の3’末端に結合してい
る。好ましくは、遺伝子間領域は、本明細書の他所で述べたrplW、rplP、rpm
D、rplB、rpsG、rpsEもしくはrplNに先行する遺伝子間領域または配列
番号1〜7のいずれかに対応する遺伝子間領域または本明細書の他所で述べたrplP、
rpmD、rplM、rpsE、rplEもしくはrplFに先行する遺伝子間領域また
は配列番号8〜13のいずれかに対応する遺伝子間領域または上述の関連配列である。
で述べた1つまたは複数の外因性タンパク質をコードするポリ核酸配列またはベクターを
グラム陽性細菌に導入するステップを含む、グラム陽性細菌における1つまたは複数の外
因性タンパク質を発現させる方法に関する。
明細書で述べた1つまたは複数の外因性タンパク質をコードするポリ核酸配列またはベク
ターをグラム陽性細菌に導入するステップを含む、1つまたは複数の外因性タンパク質を
発現することができるグラム陽性細菌を発生させる方法に関する。
ィングフレームは、あらゆる種類または起源のものであり得る。一実施形態において、1
つまたは複数の外因性遺伝子は、タンパク質、ポリペプチドおよび/またはペプチド、好
ましくは対象における治療もしくは予防効果を有するタンパク質、ポリペプチドおよび/
もしくはペプチド、または好ましくは免疫もしくは免疫寛容を誘導するための抗原などの
抗原、非ワクチン原性の治療活性のあるポリペプチド、抗体もしくはFabなどのその機
能性断片、融合タンパク質もしくは多量体タンパク質をコードする。好ましい実施形態に
おいて、1つまたは複数の外因性遺伝子は、抗体または機能性抗体断片をコードする。本
明細書で用いているように、「機能性」という用語は、その意図された機能、すなわち、
抗原結合を依然として発揮し得る抗体断片に適用される。抗体という用語は、本明細書で
用いているように、通常の抗体、キメラ抗体、dAb、二重特異性抗体、三重特異性抗体
、多重特異性抗体、二価抗体、三価抗体、多価抗体、VHH、ナノボディ、Fab、Fa
b’、F(ab’)2、scFv、Fv、dAb、Fd、ジアボディ、トリアボディ、単
鎖抗体、単ドメイン抗体、単一抗体可変ドメインを含むが、これらに限定されない。
操作されたかにかかわりなく、免疫グロブリンを記述するために用いる。抗体は多くの方
法で修飾することができるので、「抗体」という用語は、特異的結合性分子または分子の
対の他のメンバー、すなわち、上文で定義した標的分子に対する所要の結合特異性を有す
る結合ドメインを有する物質を対象とするものと解釈すべきである。したがって、この用
語は、抗体断片、抗体の誘導体、機能性同等物および同族体、ならびに天然であるか、ま
たは部分的もしくは完全に操作されたかにかかわりなく、免疫グロブリン結合ドメインを
含むポリペプチドを含む、単鎖抗体、2機能性抗体、二価抗体、VHH、ナノボディ、F
ab、Fab’、F(ab’)2、scFv、Fv、dAb、Fd、ジアボディ、トリア
ボディおよびラクダ科動物抗体を対象とする。免疫グロブリンの結合ドメインを含むキメ
ラ分子、または他のポリペプチドと融合した同等物は、したがって含まれる。この用語は
、抗体の結合ドメインである、またはそれと同族である結合ドメインを有するポリペプチ
ドまたはタンパク質、例えば、抗体模倣体も対象とする。抗体の例は、IgG(IgG1
、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4)、IgA、IgD、IgMおよびIg
Eを含む、免疫グロブリンアイソタイプおよびそれらのアイソタイプサブクラスである。
したがって、当業者は、本発明が、VHH、ナノボディ、Fab、scFv、Fv、dA
b、Fd、ジアボディおよびトリアボディなどの抗原結合ドメインを含む抗体断片にも関
することを十分に理解する。一実施形態において、本発明は、1つの外因性遺伝子が抗体
またはその機能性断片の軽鎖(VL)をコードし、他の外因性遺伝子が抗体またはその機
能性断片の重鎖(VH)をコードし、より好ましくは機能性断片がFabである、本明細
書で述べたグラム陽性細菌または組換え核酸に関する。一実施形態において、VLまたは
その機能性断片をコードする外因性遺伝子は、VHまたはその機能性断片をコードする外
因性遺伝子の3’末端に転写可能に結合される。
標的分子の生物学的活性を少なくとも部分的または完全に阻害、抑制または中和する。本
明細書で用いているように、「中和する」または「中和」という表現は、例えば、実施例
で詳述するような当技術分野で公知の方法によりin vivoまたはin vitro
で測定されるサイトカインの生物学的活性の抑制または低下を意味する。特に、抑制また
は低下は、大腸炎スコアを測定することにより、または組織もしくは血液試料中の標的分
子を測定することにより、測定することができる。本明細書で用いているように、「中和
する」または「中和」という表現は、少なくとも10%以上、好ましくは少なくとも20
%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、より好ましくは100
%の、in vivoまたはin vitroで測定されるサイトカインの生物学的活性
の抑制または低下を意味する。
、IL−7、IL−8、IL−9、IL−12(またはそのサブユニットIL−12p3
5およびIL12p40)、IL−13、IL−15、IL−16、IL−17、IL−
18、IL−21、IL−23(またはそのサブユニットIL−23p19)、IL−2
7、IL−32(およびそのスプライス変異体)、IFN(α、β、γ)およびTNFα
のリストから選択されるサイトカインに結合し、その生物学的作用を抑制する。好ましく
は、前記結合分子は、gp130などの可溶性サイトカイン受容体であるか、または前記
サイトカインの受容体、例えば、炎症性シグナルを誘起せずに、IL−2R(CD25、
CD122、CD132)、IL−12R(ベータ1、ベータ2)、IL−15R、IL
−17R、IL−23RまたはIL−6Rに結合している。好ましくは、前記結合分子は
、MIF、MIP−1α、MCP−1、RANTESおよびエオタキシンのリストから選
択されるケモカインを中和する。好ましくは、前記結合分子は、CD3/CD28、HV
EM、B7.1/B7.2、CD40/CD40L(CD154)、ICOS/ICOS
L、OX40/X40L、CD27/CD27L(CD70)、CD30/CD30L(
CD153)および41BB/41BBLのリストからの共刺激分子に結合することによ
り、免疫活性化の阻害を解消する。好ましくは、前記結合分子は、I−CAM1、α4イ
ンテグリンおよびα4β7インテグリンのリストからの接着分子に結合することにより炎
症の阻害を解消する。好ましくは、前記結合分子は、CD3、CTLA4および/または
PD1に対する共刺激およびアゴニスト作用を有する。好ましくは、前記結合分子は、C
D25、CD20、CD52、CD95、BAFF、APRILおよび/またはIgEを
標的にすることによりT細胞またはB細胞活性を中和する。好ましくは、前記結合分子は
、MMPファミリーからの酵素に結合することにより炎症の阻害を解消する。好ましくは
、前記結合分子は、αvβ3/α5β1およびIL−8活性を中和することなどの抗血管
新生作用を実証する。さらなる好ましい実施形態において、前記結合分子は、TNFα、
IL−12、IFNγ、IL−23またはIL−17の生物学的作用を中和することがで
きる。好ましくは、前記結合分子は、以下のものからなる群から選択される。
− 抗TNFα抗体、抗TNFα抗体断片、抗TNFα単一抗体可変ドメイン、可溶性T
NF受容体またはTNFαのドミナントネガティブ変異体;
− 抗IL−12抗体、抗IL−12抗体断片、抗IL−12単一抗体可変ドメイン、可
溶性IL−12受容体、IL−12のドミナントネガティブ変異体またはIL−12dA
b;
− 抗IL−12p35抗体、抗IL−12p35抗体断片、抗IL−12p35単一抗
体可変ドメイン、可溶性IL−12p35受容体、IL−12p35のドミナントネガテ
ィブ変異体またはIL−12p35dAb;
− 抗IL−12p40抗体、抗IL−12p40抗体断片、抗IL−12p40単一抗
体可変ドメイン、可溶性IL−12p40受容体、IL−12p40のドミナントネガテ
ィブ変異体またはIL−12p40dAb;
− 抗IL−23抗体、抗IL−23抗体断片、抗IL−23単一抗体可変ドメイン、可
溶性IL−23受容体、IL−23のドミナントネガティブ変異体またはIL−23dA
b;
− 抗IL−23p19抗体、抗IL−23p19抗体断片、抗IL−23p19単一抗
体可変ドメイン、可溶性IL−23p19受容体、IL−23p19のドミナントネガテ
ィブ変異体またはIL−23p19dAb;
− 抗IFNγ抗体、抗IFNγ抗体断片、抗IFNγ単一抗体可変ドメイン、可溶性I
FNγ受容体、IFNγのドミナントネガティブ変異体;
− 抗IL−17抗体、抗IL−17抗体断片、抗IL−17単一抗体可変ドメイン、可
溶性IL−17受容体、IL−17のドミナントネガティブ変異体またはIL−17dA
b;
− 抗MCP−1抗体、抗MCP−1抗体断片、抗MCP−1単一抗体可変ドメイン、可
溶性IL−17受容体、MCP−1のドミナントネガティブ変異体またはMCP−1dA
b。
断片は、当技術分野で周知である。さらなるガイダンスとして、Fab断片は、抗原に結
合する抗体上の領域である。それは、重および軽鎖のそれぞれの1つの定常ドメインと1
つの可変ドメインから構成されている。
ドメインのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、米国特許第6,790,444
号にそれぞれ配列番号4および5(重鎖)ならびに配列番号2および3(軽鎖)として開
示されている)またはCDP870抗TNF Fab(その重鎖および軽鎖のポリヌクレ
オチドおよびポリペプチド配列は、国際公開第01/94585にそれぞれ配列番号11
4および115(重鎖)ならびに配列番号112および113(軽鎖)として開示されて
いる)である。
橋により共有結合していてもよい異なる個々のポリペプチドから構成されている。特に、
重鎖および軽鎖は、別個の個々のコーディング配列によりコードされる。
トロン性発現ユニットに含まれ得る。重および軽鎖をコードするポリ核酸配列は、異なる
ポリシストロン性発現ユニットに組み込むことができる。好ましくは、重鎖および軽鎖を
コードするポリ核酸配列は、同じポリシストロン性発現ユニットに組み込む。したがって
、一実施形態において、本発明は、翻訳可能または転写可能に結合された、1つまたは複
数の内因性遺伝子、抗体重鎖をコードする1つまたは複数のポリ核酸配列、またはその断
片、好ましくは機能性断片および抗体軽鎖をコードする1つまたは複数のポリ核酸配列、
またはその断片、好ましくは機能性断片を含む、本明細書で述べたグラム陽性細菌に関す
る。他の実施形態において、本発明は、ポリシストロン性発現ユニットを含むグラム陽性
細菌に関し、前記ポリシストロン性発現ユニットは、1つまたは複数の内因性遺伝子、抗
体重鎖をコードする1つまたは複数のポリ核酸配列、またはその断片、好ましくは機能性
断片および抗体軽鎖をコードする1つまたは複数のポリ核酸配列、またはその断片、好ま
しくは機能性断片を含む。さらに他の実施形態において、軽鎖をコードするポリ核酸配列
は、重鎖をコードするポリ核酸配列の3’末端に転写可能または翻訳可能に結合される。
有利なことに、そのような結合は、重および軽鎖の両方の発現をさらに増大させる。
する。本発明はさらに、本明細書で述べた本発明によるグラム陽性細菌を含む医薬組成物
に関する。
本発明によるグラム陽性細菌またはグラム陽性細菌を含む医薬組成物に関する。他の態様
において、本発明は、療法または治療用の本明細書で述べた本発明によるグラム陽性細菌
またはグラム陽性細菌を含む医薬組成物に関する。さらなる態様において、本発明は、薬
剤の製造のための本明細書で述べた本発明によるグラム陽性細菌またはグラム陽性細菌を
含む医薬組成物の使用に関する。さらに他の態様において、本発明は、本明細書で述べた
本発明によるグラム陽性細菌またはグラム陽性細菌を含む医薬組成物を投与するステップ
を含む、治療の方法に関する。一実施形態において、本発明は、1つまたは複数の外因性
遺伝子がタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドなどの産物をコードし、産物が対象に
おける治療または予防効果を有する、好ましくは薬剤として使用するための、好ましくは
対象への前記産物の投与または送達に使用するための、本明細書で述べたグラム陽性細菌
またはグラム陽性細菌を含む医薬組成物に関する。
性細菌に含まれる1つまたは複数の外因性遺伝子、オープンリーディングフレームまたは
コーディング配列によりコードされるポリペプチドの送達の方法であって、治療上有効量
の本明細書で述べた本発明によるグラム陽性細菌を前記ヒトまたは動物に投与するステッ
プを含む、上記方法を提供する。動物は、好ましくは例えば、イヌ、ネコ、モルモット、
ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、乳牛などの家畜、圃場家畜、動物園動物、スポー
ツ用動物、ペットおよび実験動物、類人猿、サル、オランウータン、チンパンジーなどの
霊長類、イヌおよびオオカミなどのイヌ科動物、ネコ、ライオンおよびトラなどのネコ科
動物、ウマ、ロバおよびシマウマなどのウマ科動物、ウシ、ブタおよびヒツジなどの食用
動物、シカおよびキリンなどの有蹄動物、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモット
などのげっ歯類動物などの哺乳動物であり得る。
置および予防処置の両方を意味し、目的は、望ましくない生理的変化または障害を予防ま
たは遅くする(軽減する)ことである。「治療を必要とするヒトまたは動物」は、所定の
状態の治療により恩恵を受ける者を含む。
害を治療するのに、すなわち、所望の局所または全身効果および成果を得るのに有効な治
療用物質または組成物を意味する。例として、治療上有効量の細菌は、例えば、単回また
は反復投与で少なくとも1個の細菌、または少なくとも10個の細菌、または少なくとも
102個の細菌、または少なくとも103個の細菌、または少なくとも104個の細菌、
または少なくとも105個の細菌、または少なくとも106個の細菌、または少なくとも
107個の細菌、または少なくとも108個の細菌、または少なくとも109個、または
少なくとも1010個、または少なくとも1011個、または少なくとも1012個、ま
たは少なくとも1013個、または少なくとも1014個、または少なくとも1015個
、またはそれ以上のグラム陽性細菌を含み得る。
することができる。後者は、グラム陽性細菌の投与の前、後または同時に投与することが
できる。
存在し、そのような開示は、本発明のグラム陽性細菌によりさらに有利に修正することが
できることが十分に理解されなければならない。例として、また制限なしに、インターロ
イキン、特に、大腸炎を治療するためのIL−10(例えば、国際公開第00/2347
1号)、炎症反応を調節するためのIL−27(国際公開第2004/069177号)
の細菌送達、ワクチンとしての抗原の送達(例えば、国際公開第97/14806号)、
GLP−2および関連類似体の送達は、短腸病、クローン病、骨粗鬆症を治療するのに、
また癌化学療法時のアジュバント療法等として用いることができる。さらに、トレフォイ
ルペプチドの細菌送達は、消化管の疾患を治療するのに用いることができる(例えば、国
際公開第01/02570号)。特に、口、食道、胃ならびに大および小腸を含む消化管
の障害および損傷の治療のためのならびに消化管外にある組織の保護および治療のための
トレフォイルタンパク質またはペプチドの使用は、国際公開第97/38712号および
国際公開第92/14837号に記載されている。これらのタンパク質は、これらの部位
の病変を治療するために、または病変の形成を抑制するために用いることができる。これ
らの病変は、癌の治療のための放射線療法または化学療法、消化管を損傷するアルコール
を含む他の薬物、放射線または原因物質への偶発的曝露、口腔粘膜炎、腸粘膜炎、食道炎
、直腸炎、非潰瘍性消化不良症、胃炎、消化性または十二指腸潰瘍、胃癌、大腸癌、MA
LTリンパ腫、メネトリエ症候群、胃食道逆流疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎および化
学物質、細菌または不明瞭な原因による急性大腸炎を含むが、これらに限定されない消化
器疾患によって引き起こされ得る。本発明のプロモーターおよび宿主細胞を用いたさらな
る治療への応用が想定される。
の種類のさらなる非限定的な例は、例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性
腸疾患(例えば、IL−Ira、IL−10、IL−27またはトレフォイルペプチドに
より治療可能)、乾癬、慢性関節リウマチ、紅斑性狼瘡を含むが、これらに限定されない
自己免疫疾患(例えば、IL−Ira、IL−27、IL−10または関連自己抗原によ
り治療可能)、喘息、食物アレルギーを含むが、これらに限定されないアレルギー性疾患
(関連アレルゲンにより治療可能)、セリアック病(グルテンアレルゲンにより治療可能
)、アルツハイマー病、パーキンソン病および筋委縮側索硬化症を含むが、これらに限定
されない神経疾患(例えば、脳由来神経栄養因子および毛様体神経栄養因子により治療可
能)、癌(例えば、IL−1、コロニー刺激因子またはインターフェロンWにより治療可
能)、骨粗鬆症(例えば、形質転換成長因子f3により治療可能)、糖尿病(例えば、イ
ンスリンにより治療可能)、心血管疾患(例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子によ
り治療可能)、アテローム動脈硬化症(例えば、サイトカインおよびサイトカインアンタ
ゴニストにより治療可能)、血友病(例えば、凝固因子により治療可能)、変性肝疾患(
例えば、肝細胞増殖因子またはインターフェロンaにより治療可能)、嚢胞性線維症など
の肺疾患(例えば、アルファ抗トリプシンにより治療可能)、肥満、病原体感染、例えば
、ウイルスまたは細菌感染症(任意の数の上述の組成物または抗原により治療可能)等を
含むが、これらに限定されない。
施形態において、本発明によるグラム陽性細菌により局所的に産生され、分泌される毒素
中和抗体によるクロストリジウム属(Clostridium)、好ましくはクロストリジウム・デ
ィフィシレ(Clostridium dificile)関連疾患(CDAD)に対する受動免疫を得ること
できる。好ましくは、前記グラム陽性細菌は、ラクトコッカス属の菌種(Lactococcus sp
.)、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)またはその亜
種またはその菌株である。
ank NC_009089.1参照、領域:DNA配列について795843..80
3975またはタンパク質配列についてYP_001087137.1)および毒素B(
サイトトキシン;例えば、Genbank NC_009089.1参照、領域:DNA
配列について787393..794493またはタンパク質配列についてYP_001
087135.1)により媒介される。両者は、腸上皮細胞の表面に結合する高分子量タ
ンパク質であり、そこで内部移行し、細胞死、炎症および下痢をもたらす細胞質rhoタ
ンパク質のグルコシル化を触媒する。それらは、C.ディフィシレ(C. difficile)の病
原性、定着および好中球の走化性および活性化の促進にも関与していた。細菌自体は、侵
襲性でなく、組織損傷を引き起こさない。抗体によりC.ディフィシレ(C. difficile)
毒素を中和することにより、病原体の病原機構が遮断され、腸内で生育するその能力を低
下させることができ、微生物の生態に対する影響を最小限にすることができ、正常な細菌
叢の回復が可能となる。このアプローチの医学的利点は、より速やかな回復、より少ない
再発および正常な腸細菌叢における抗生物質耐性に対する選択的圧力の軽減などであり得
る。
トリジウム属(Clostridium)の毒素Aおよび/または毒素Bに対する本明細書の他所で
述べた抗体またはその断片、好ましくはFabを含む、本明細書で述べたグラム陽性細菌
に関する。最も好ましくは、前記抗体またはその断片は、中和抗体である。さらなる実施
形態において、本発明は、好ましくは細菌染色体に組み込まれたポリシストロン性発現ユ
ニットを含む、グラム陽性細菌、好ましくはラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus
lactis)などのラクトコッカス属種(Lactococcus sp.)またはエンテロコッカス・フェ
カリス(Enterococcus faecalis)もしくはエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcu
s faecium)などのエンテロコッカス属種(Enterococcus sp.)に関し、前記ポリシスト
ロン性発現ユニットは、好ましくはラクトコッカス属種(Lactococcus sp.)またはエン
テロコッカス属種(Enterococcus sp.)に由来するeno、usp45、gap、pyk
、rpmBおよびrplSからなる群から選択される内因性遺伝子ならびにクロストリジ
ウム属(Clostridium)、好ましくはクロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium dif
icile)の毒素Aおよび/または毒素Bに対する中和抗体または抗体断片、好ましくはF
abをコードする1つまたは複数の外因性遺伝子を含み、前記ポリシストロン性発現ユニ
ットは、好ましくは前記内因性遺伝子の天然の遺伝子座において染色体に組み込まれてお
り、前記毒素Aおよび/または毒素B抗体(断片)遺伝子は、好ましくは前記内因性遺伝
子の3’末端に転写可能に結合され、前記転写可能な結合は、グラム陽性細菌、好ましく
はラクトコッカス属種(Lactococcus sp.)またはエンテロコッカス属種(Enterococcus
sp.)のrplW、rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsE、rplN、r
plM、rplEおよびrplFに先行する遺伝子間領域からなる群から好ましくは選択
される遺伝子間領域によってもたらされる。本明細書で述べたクロストリジウム属(Clos
tridium)毒素Aおよび毒素Bの抗体は、当技術分野で公知である(例えば、Leungら、J
Pediatr、1991年、118巻(4Pt1)、633〜637頁、Wilcox. J Antimicrob Chemother、2004年
、53巻(5号)、882〜884頁、Sougioultzisら、Gastroenterology、2005年、128巻(3号)、
764〜770頁、Kyneら、N Engl J Med、2000年、342巻(6号)、390〜397頁、Lowyら、N Engl
J Med、362巻(3号)、197〜205頁参照)。両抗体またはその断片は、同じまたは異なるグ
ラム陽性細菌における別個のポリシストロン性発現ユニットに配置することができるが、
好ましくは単一ポリシストロン性発現ユニットに配置する。本発明はさらに、そのような
グラム陽性細菌を投与するステップを含む、CDADを予防および/または治療する方法
に関する。
の列挙は、本発明により提供される試薬、例えば、本発明のプロモーター、核酸、ベクタ
ーおよび宿主細胞の使用をこれらの特定の疾患に限定することを意図するものではないこ
とを十分に理解しなければならない。それよりも、熟練した読者は、本発明の試薬は、列
挙したものにおいてだけでなく、ヒトおよび動物の様々なさらなる疾患または状態におい
ても治療上関連性のあり得る、対象の発現産物、好ましくはポリペプチドを原理上は発現
させるのに用いることができることを理解する。したがって、適切な発現産物、好ましく
はポリペプチド、例えば、抗原、抗体(断片)および/または非ワクチン原性の治療活性
のあるポリペプチドが所定の病気について選択または決定されたならば、当業者は、その
発現、単離および/または送達を本発明の試薬を用いて達成することができるであろう。
る。イヌにおける疾患は、イヌジステンパー(パラミクソウイルス)、イヌ肝炎(アデノ
ウイルスCav−1)、ケンネルコフまたは咽頭気管炎(アデノウイルスCav−2)、
伝染性イヌ腸炎(コロナウイルス)および出血性腸炎(パルボウイルス)を含むが、これ
らに限定されない。
感染症(カリシウイルス)、ネコ伝染性腹膜炎(パルボウイルス)およびネコ白血病(ネ
コ白血病ウイルス)を含むが、これらに限定されない。ウマおよび鳥における他のウイル
ス性疾患も、本発明の方法および組成物を用いて治療可能であると考えられる。この目的
に向けて、組換えインターフェロンを発現する微生物の使用は特に好ましい。
ム陽性細菌ならびに薬学的に許容される担体、すなわち、1つまたは複数の薬学的に許容
される担体物質および/または添加物、例えば、緩衝剤、担体、賦形剤、安定化剤等を含
む。
和し、医薬組成物の他の成分と適合性があり、その受容者に対して有害でないことを意味
する。
医薬製剤中に懸濁することができる。そのような医薬製剤は、生存グラム陽性細菌および
投与に適する媒体を含むが、これらに限定されない。グラム陽性細菌は、ラクトース、他
の糖、アルカリおよび/またはアルカリ土類ステアリン酸塩、炭酸塩および/または硫酸
塩(例えば、ステアリン酸マグネシウム、炭酸ナトリウムおよび硫酸ナトリウム)、カオ
リン、シリカ、着香料および香料などの一般的な賦形剤の存在下で凍結乾燥することがで
きる。そのように凍結乾燥されたグラム陽性細菌は、それぞれを経口経路により投与する
ことができる、カプセル剤、錠剤、顆粒剤および散剤(例えば、口内洗浄散剤)の形態で
調製することができる。あるいは、一部のグラム陽性細菌は、適切な媒体中水性懸濁剤と
して調製することができ、または凍結乾燥細菌は、使用直前に適切な媒体、本明細書で言
及した賦形剤ならびにグルコース、グリシンおよびサッカリン酸ナトリウムなどの他の賦
形剤を含むそのような媒体に懸濁することができる。
細菌の制御放出をもたらす化合物も含み、それにより、その中にコードされている所望の
タンパク質の制御放出をもたらし得る。例えば、経口剤形(カプセル剤、錠剤、ペレット
剤、顆粒剤および散剤を含む)は、胃内の溶解または崩壊に抵抗するが、腸内ではそうで
なく、それにより、腸内での崩壊、溶解および吸収のために胃を通過することを可能にす
る賦形剤(通常ポリマー、セルロース誘導体および/または親油性物質)の薄層で被覆す
ることができる。
剤として、グラム陽性細菌および産生された外因性タンパク質の徐放を可能にするように
設計することができる。これらの剤形は、通常、親油性、重合性、セルロース系、不溶性
、膨潤性賦形剤などの従来型で、周知の賦形剤を含む。制御放出製剤は、腸、結腸、生体
接着または舌下送達(すなわち、歯粘膜送達)および気管支送達を含む他の送達部位にも
用いることができる。本発明の組成物を直腸または膣に投与すべきである場合、医薬製剤
は、軟膏剤、坐剤およびクリーム剤を含み得る。この場合、グラム陽性細菌を脂質も含む
一般的な賦形剤の混合物中に懸濁する。前述の製剤のそれぞれは、当技術分野で周知であ
り、例えば、以下の参考文献に記載されている。Hanselら、Pharmaceutical dosage form
s and drug delivery systems、5版、WilliamおよびWilkins、1990年、Chien、1992年、N
ovel drug delivery system、2版、M. Dekker、Prescottら(1989年、Novel drug deliver
y、J. Wiley & Sons)、Cazzanigaら、1994年、Oral delayed release system for coloni
c specific delivery、Int. J. Pharm.i08;7'。
用の液体製剤をカバーするために用いられる。浣腸は、1回量容器入りで通常供給され、
水、グリセロールまたはマクロゴールまたは他の適切な溶媒に溶解または分散させた1つ
または複数の活性物質を含む。
ドする本明細書で述べた本発明によるグラム陽性細菌は、特定の経路に適用できる最先端
技術を用いた製剤のいずれか1つにより粘膜、例えば、経口、鼻、直腸、膣または気管支
経路を経て動物またはヒトに投与することができる。投与のためのグラム陽性細菌の用量
は、細菌の種類およびそれによりコードされる遺伝子、治療される疾患の種類および重症
度ならびに使用される投与経路などのかなり多数の因子によって異なる。
ことはできないが、本発明があるならば当業者に容易に明らかになる。用量は、ELIS
Aまたはビアコア(Biacore)(実施例参照)として公知のものなどの周知の方法を用い
てあらかじめ定めた数の細胞の投与後の組換えタンパク質の血清レベル濃度を測定するこ
とにより個別的方法で決定することができる可能性がある。送達された組換えタンパク質
の速度論的プロファイルおよび半減期の解析は、形質転換宿主細胞の有効量範囲の決定を
可能にするのに十分な情報を提供する。
場合、本発明は、ワクチンも提供し得る。
含まれる免疫原に対する抗体を誘導し、かつ/または対象における防御免疫を誘起するこ
とができる薬学的に許容される組成物を指す。
形剤を場合によって含むことになる。そのようなワクチンは、アジュバント、すなわち、
抗原に対する免疫応答を増強する化合物または組成物も含み得る。アジュバントは、完全
フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウ
ムなどの鉱物ゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオールなどの界面活性物質、多価陰
イオン、ペプチド、油または炭化水素エマルジョンならびにBCG(カルメット−ゲラン
桿菌)およびコリネバクテルム・パルバム(Corynebacterium parvum)などの潜在的に有
用な薬学的に許容されるヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない。
ける実質的な利点をもたらすバイオマーカー、使用および方法が提供されたことが明らか
になる。本発明をその特定の実施形態とともに記述したが、前述の説明に照らして多くの
代替形態、修正形態および変形形態が当業者には明らかであることは明白である。したが
って、すべてのそのような代替形態、修正形態および変形形態は、以下のように特許請求
の精神および広い範囲に含まれるものである。
。
図1に示すように、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモリス(Lactococcus lactis
ssp. cremoris)株MG1363の対数末期培養の細胞タンパク質をタンパク質ゲル上で
クーマシーブルー染色により視覚化した。レーンAおよびBは、それぞれ29μgおよび
58μgのMG1363タンパク質を含んでいた。レーンAからの12の明確なタンパク
質バンドをゲルから単離した。タンパク質を単離し、遺伝子間領域を以下により同定した
。
1)部分的ペプチド配列決定(MALDI−TOF/TOF)ならびにペプチドの質量
および配列の複合情報を用いたデータベース検索による断片における多量に発現したタン
パク質の同定
2)オペロンに存在する多量に発現したタンパク質(1)をコードする遺伝子のラクト
コッカス・ラクティス亜種クレモリス(Lactococcus lactis ssp. cremoris)株MG13
63の染色体配列(Wegmannら)を用いた同定、ただし、「第1の遺伝子」としてでない
3)これらの多量に発現した遺伝子に先行する遺伝子間領域の同定
合部位である。
表4に高レベル発現を推進するものとして実施例1で同定された標的プロモーターを示
す。これらのプロモーターは、外因性遺伝子のポリシストロン性発現の標的部位として用
いることができる。
子としてラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)MG1363に導入した。
uidA遺伝子産物β−グルクロニダーゼは、組織化学的および分光光度測定基質として
市販されている様々なβ−グルクロニドの開裂を触媒する。菌株sAGX0090は、t
hyA遺伝子座においてPhllA>>uidA発現カセットを有する(図2)。このプ
ロモーターは、菌株sAGX0037およびsAGX0085においても用いられた。
ococcus lactis)MG1363染色体におけるいくつかの内因性遺伝子(遺伝子X)の3
’末端にuidAを挿入することにより作製した。これによって、rpmDを表4からの
対象の内因性遺伝子とuidAとの間の遺伝子間配列として用いて、sAGX0090と
比較して高いβ−グルクロニダーゼ(GUS)活性をもたらす部位を同定した。
添加したGM17中で30℃で16時間増殖させた。1mlの培養の細胞を洗浄し、1m
lの脱鉱物化水に再懸濁した。細胞を、MP Biomedicals溶解マトリックス
BおよびFasprep−24装置を用いて6m/秒で40秒間破壊した。管を遠心分離
し、細胞上清の希釈系列を調製した。GUS活性は、p−ニトロフェニル基質およびβ−
グルクロニダーゼの存在により溶液に黄色をもたらすβ−メルカプトエタノールを加える
ことにより測定した。GUS活性を405nmで測定し、対照標準菌株sAGX0090
に対して相対的に表した。すべての菌株を並行して処理した。
を示す。GUS活性は、PhllA>>uidA発現カセットを運搬する対照標準菌株s
AGX0090に対して相対的に表し、Y軸上に示す。すべてのデュアルシストロン菌株
におけるGUS活性は、対照標準菌株より高いことが認められた。特に、sAGX016
8(enoA>>rpmD>>uidA)およびsAGX0222(gapB>>rpm
D>>uidA)におけるGUS活性は、それぞれsAGX0090と比較したとき6.
89および20.99倍高いことがわかった。
の増大をもたらすことを明確に確認するものである。
プロインスリンの分泌を得るためにusp45分泌リーダー(SS)をヒトプロインス
リン(ins)に融合させた(SS::ins)。[SS::ins]発現カセットを、
ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)MG1363染色体にthyA遺伝
子座において組み込み、PthyAから直接発現させた(sAGX0121)か、または
SS::insに先行するrpmD遺伝子間領域とともにusp45(sAGX0121
)もしくはenoA(sAGX0164)から下流の第2のシストロンとして挿入した(
図4a)。インスリン分泌能力をELISAにより定量して、thyA遺伝子座における
PthyA促進発現と比較してカーゴ(cargo)のバイシストロン性発現を評価した。
中に接種し、30℃で16時間増殖させた。プロインスリン分泌の定量のために、これら
の飽和一夜培養を5mlの新鮮GM17培地で1/25に希釈し、30℃で4時間増殖さ
せた。細胞を、3220×gで10分間の遠心分離により収集し、等量のBAM9培地に
再懸濁し、30℃でさらに3時間培養した。BAM9は、M9塩、0.5%アミノプラス
マル、0.5%グルコース、25mM NaHCO3、25mM Na2CO3、2mM
MgSO4、0.1mM CaCl2および200μMチミジンを含む。細胞および培
養上清を3220×gで10分間の遠心分離により分離した。培養上清中の分泌ヒトプロ
インスリンの量をMercodiaにより提供されたELISAにより定量した。すべて
の菌株を並行して処理した。
AGX0121およびsAGX0164により分泌されたヒトプロインスリンの定量を示
す。分泌されたプロインスリンの量をng/mlとして表し、Y軸上に示した。図からバ
イシストロン性発現カセットを含む菌株が対照標準菌株より有意に高いカーゴ発現を有す
ることが明瞭にわかる。特に、インスリン分泌は、SS::insをrpmDを介してe
noAに結合させた場合に最も高かった。
cA2抗hTNF Fabの重鎖および軽鎖を用いて、デュアルシストロン発現構築物
を作製した。すべての発現ユニットは、thyAプロモーターにより促進され、プラスミ
ド上に位置する。軽鎖VLCL(L)および重鎖のFab断片VHCH1(H)のすべて
の運搬遺伝子は、cA2インフリキシマブモノクローナル抗体に由来していた。L>>H
およびH>>L配置をrpmD、rplB、rpsG、rpsEまたはrplNに先行す
る遺伝子間領域により結合させる。すべての構築物は、プラスミド由来である。
高レベルの機能性cA2抗TNF Fabにつながったことがわかる。図5でさらに重鎖
を軽鎖の前に配置した場合に、遺伝子間領域にかかわりなく、cA2抗TNFの発現が増
大したことがわかる。
、30℃で16時間増殖させた。これらの飽和一夜培養を5mlの新鮮GM17培地で1
/25に希釈し、30℃で4時間増殖させた。細胞を、3220×gで10分間の遠心分
離により収集し、等量のBAM9培地に再懸濁し、30℃でさらに3時間培養した。BA
M9は、M9塩、0.5%アミノプラスマル、0.5%グルコース、25mM NaHC
O3、25mM Na2CO3、2mM MgSO4、0.1mM CaCl2および2
00μMチミジンを含む。細胞および培養上清を3220×gで10分間の遠心分離によ
り分離した。個々の構築物を運搬する菌株からの粗上清を並行して調製し、抗TNF活性
の存在について分析した。これは、捕捉タンパク質としてヒトTNFを用いて直接ELI
SAにより行った。VLCL部分は、ウサギ抗ヒトIgG抗血清により検出され、アルカ
リホスファターゼコンジュゲート抗ウサギ抗血清により明らかにされた。ホスファターゼ
活性は、比色分析により測定し、OD402として読み取った。すべての菌株を並行して
処理した。
CDP870抗TNF Fabの重鎖および軽鎖を用いて、デュアルシストロン発現構
築物を作製した。すべての発現ユニットは、細菌染色体上に位置している。
H1)をコードするusp45分泌リーダーとのCDP870軽および重鎖Fab融合体
を、usp45から下流に第2および第3のシストロンとして挿入した(sAGX021
9、sAGX0220)。sAGX0219およびsAGX0220において、rpmD
を用いてSS::CD870遺伝子をusp45に結合させた。遺伝的不安定性を避ける
ために、軽および重鎖遺伝子をrplNに先行する遺伝子間領域を介して結合させた。s
AGX0219では、軽鎖遺伝子が重鎖遺伝子に先行するのに対して、sAGX0220
では、重鎖遺伝子が軽鎖遺伝子に先行する。
、30℃で16時間増殖させた。これらの飽和一夜培養を5mlの新鮮GM17培地で1
/25に希釈し、30℃で4時間増殖させた。細胞を、3220×gで10分間の遠心分
離により収集し、等量のBAM9培地に再懸濁し、30℃でさらに3時間培養した。BA
M9は、M9塩、0.5%アミノプラスマル、0.5%グルコース、25mM NaHC
O3、25mM Na2CO3、2mM MgSO4、0.1mM CaCl2および2
00μMチミジンを含む。細胞および培養上清を3220×gで10分間の遠心分離によ
り分離した。個々の構築物を運搬する菌株からの粗上清を並行して調製し、抗TNF活性
の存在について分析した。これは、レミケード(Remicade)を対照標準として、補足タン
パク質としてヒトTNFを用いて直接ELISAにより行った。VLCL部分は、ウサギ
抗ヒトIgG抗血清により検出され、アルカリホスファターゼコンジュゲート抗ウサギ抗
血清により示された。ホスファターゼ活性は、比色分析により測定し、OD402として
読み取った。すべての菌株を並行して処理した。
が高レベルの機能性CDP870抗TNF Fabにつながったことがわかる。図6bで
さらに重鎖を軽鎖の前に配置した場合に、CDP870抗TNFの発現が実質的に増大し
たことがわかる。
hTFF1に融合したusp45分泌リーダーコーディング配列(SS::hTFF1
)を用いて発現構築物を作製した。すべての発現ユニットは、細菌染色体上に位置してい
る。PhllAより強いプロモーターを用いてモノシストロン性hTFF1発現のための
組込みプラスミドを構築することは、可能でなかった。
S)をhTFF1に融合させた(SS::hTFF1)。SS::hTFF1発現カセッ
トを、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)MG1363染色体にthy
A遺伝子座において組み込み、PhllAから直接発現させた(sAGX0085)か、
またはSS::hTFF1に先行するrpmD遺伝子間領域とともにgapBから下流の
第2のシストロンとして挿入した(sAGX0276)。
ロン性発現を評価するために、hTFF1分泌能力をELISAにより定量した。
、30℃で16時間増殖させた。これらの飽和一夜培養を5mlの新鮮GM17培地で1
/25に希釈し、30℃で4時間増殖させた。細胞を、3220×gで10分間の遠心分
離により収集し、等量のBAM9培地に再懸濁し、30℃でさらに3時間培養した。BA
M9は、M9塩、0.5%アミノプラスマル、0.5%グルコース、25mM NaHC
O3、25mM Na2CO3、2mM MgSO4、0.1mM CaCl2および2
00μMチミジンを含む。この段階で、すべての培養のコロニー形成単位(CFU)を測
定した。細胞および培養上清を3220×gで10分間の遠心分離により分離した。個々
の構築物を運搬する菌株からの粗上清を並行して調製し、精製hTFF1を対照標準とし
て用いてELISAにより分析した。分泌hTFF1の量をng/mlおよびng/10
9CFUとして表した。すべての菌株を並行して処理した。
株(sAGX0085)より有意に高いカーゴ発現を有することが示されている。分泌h
TFF1発現の量は、hTFF1をrpmDを介してgapBに結合させた場合、実質的
に増大した(ml当たり>5倍;CFU当たり>12倍)。
選択
図8に示すように、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)株LMG
15709(Enterococcus faecium [Orla-Jensen 1919] Schleifer and Kilpper-Balz 1
984 VP; LMG15709; ATCC6057; DSM2146; NCIMB8842)の対数末期培養の細胞タンパク質を
タンパク質ゲル上でクーマシーブルー染色により視覚化した。レーンA、BおよびCは、
それぞれエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)LMG15709の2
84μl、142μlおよび56.8μlの対数末期培養の溶解細胞相当物の細胞タンパ
ク質を含んでいた。レーンCからの12の明確なタンパク質バンドをゲルから単離した。
タンパク質を単離し、遺伝子間領域を以下により同定した。
1)部分的ペプチド配列決定(NALDI−TOF/TOF)ならびにペプチドの質量
および配列の複合情報を用いたデータベース検索による断片における多量に発現したタン
パク質の同定
2)オペロンに存在する多量に発現したタンパク質(1)をコードする遺伝子のエンテ
ロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)PC4.1の染色体配列(NCBI
Genome databankから検索、GenBank寄託番号ADMM01000
000)を用いた同定、ただし、「第1の遺伝子」としてでない
3)これらの多量に発現した遺伝子に先行する遺伝子間領域の同定(表5)
ける同定された遺伝子間領域を示す。下線を引いた配列は、リボソーム結合部位である。
)ゲノムにおける部位の選択
表6に高レベル発現を推進するものとして実施例7で同定された高度に発現したエンテ
ロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)遺伝子を示す。これらの遺伝子を促進
するプロモーターは、外因性遺伝子のポリシストロン性発現のための標的部位として用い
ることができる。これらの内因性遺伝子はさらに、下流外因性遺伝子に遺伝子間領域を介
して転写可能または翻訳可能に結合されたポリシストロン性発現モジュールにおける第1
の遺伝子として用いることができる。
子をリポーター遺伝子としてエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)L
MG15709に導入した。uidA遺伝子産物β−グルクロニダーゼは、組織化学的お
よび分光光度測定基質として市販されている様々なβ−グルクロニドの開裂を触媒する。
図9に示すように、デュアルシストロン構築物は、エンテロコッカス・フェシウム(Ente
rococcus faecium)LMG15709染色体におけるいくつかの内因性遺伝子(この実施
例では遺伝子X、gapおよびeno;図9)の3’末端にuidAを挿入することによ
り作製した。これによって、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)の
rpmDを表6からの対象の内因性遺伝子とuidAとの間の遺伝子間領域として用いて
、最高のβ−グルクロニダーゼ(GUS)活性をもたらす部位を同定した(図10)。
GM17中で30℃で16時間増殖させた。1mlの培養の細胞を洗浄し、1mlの脱鉱
物化水に再懸濁した。細胞を、MP Biomedicals溶解マトリックスBおよび
Fasprep−24装置を用いて6m/秒で40秒間破壊した。管を遠心分離し、細胞
上清の希釈系列を調製した。GUS活性は、p−ニトロフェニル基質およびβ−グルクロ
ニダーゼの存在により溶液に黄色をもたらすβ−メルカプトエタノールを加えることによ
り測定した。GUS活性を405nmで測定し、対照標準ラクトコッカス・ラクティス(
Lactococcus lactis)株sAGX0090に対して相対的に表した。すべての菌株を並行
して処理した。
性を示す。GUS活性は、PhllA>>uidA発現カセットを運搬する対照標準菌株
sAGX0090に対して相対的に表し、Y軸上に示す。すべてのデュアルシストロン菌
株におけるGUS活性は、対照標準菌株より高いことが認められた。
(eno>>rpmD>>uidA)におけるGUS活性は、それぞれsAGX0090
と比較したとき30.6および26.9倍高いことがわかった。
の増大をもたらすことを明確に確認するものである。
10(hIL10)のバイシストロン性発現
hIL10の分泌を得るために、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)
のusp45分泌リーダーのDNAコーディング配列(SS)を成熟hIL10のDNA
配列にフレームで融合させた。[SS::hIL10]発現カセットをSS::hIL1
0に先行するエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)のrpmD遺伝子
間領域とともに、gapから下流の第2のシストロンとして挿入した(sAGX0279
;図11a)。hIL10分泌能力をELISAにより定量して、エンテロコッカス・フ
ェシウム(Enterococcus faecium)におけるカーゴのバイシストロン性発現を評価した。
エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)sAGX0270を陰性対照と
した。
7(GM17T)中に接種し、30℃で16時間増殖させた。hIL10分泌の定量のた
めに、これらの飽和一夜培養を5mlの新鮮GM17T培地で1/25に希釈し、30℃
で4時間増殖させた。細胞を、3220×gで10分間の遠心分離により収集し、等量の
BAM9T培地に再懸濁し、30℃でさらに3時間培養した。BAM9Tは、M9塩、0
.5%アミノプラスマル、0.5%グルコース、25mM NaHCO3、25mM N
a2CO3、2mM MgSO4、0.1mM CaCl2および200μMチミジンを
含む。細胞および培養上清を3220×gで10分間の遠心分離により分離した。培養上
清中の分泌ヒトhIL10の量をサンドイッチhIL10 ELISAにより定量した。
すべての菌株を並行して処理した。
0およびsAGX0279により分泌されたヒトhIL10の定量を示す。分泌されたh
IL10の量を3時間におけるng/109CFUとして表し、Y軸上に示す。図からバ
イシストロン性発現カセットを含むエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faeci
um)株がかなりの量のカーゴタンパク質hIL10を分泌することができることが明瞭に
わかる。
27(hIL27)のバイシストロン性発現
hIL27の分泌を得るために、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)
のusp45分泌リーダーのDNAコーディング配列(SS)を成熟hIL27のDNA
配列にフレームで融合させた。[SS::hIL27]発現カセットをSS::hIL2
7に先行するエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)のrpmD遺伝子
間領域とともに、gapから下流の第2のシストロンとして挿入した(sAGX0317
;図12a)。hIL27分泌能力をELISAにより定量して、hIL27のバイシス
トロン性発現を評価した。エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)sA
GX0270を陰性対照とした。
T)中に接種し、30℃で16時間増殖させた。hIL27分泌の定量のために、これら
の飽和一夜培養を5mlの新鮮GM17T培地で1/25に希釈し、30℃で4時間増殖
させた。細胞を、3220×gで10分間の遠心分離により収集し、等量のBM9T培地
に再懸濁し、30℃でさらに3時間培養した。BM9Tは、M9塩、0.5%カジトン、
0.5%グルコース、25mM NaHCO3、25mM Na2CO3、2mM Mg
SO4、0.1mM CaCl2および200μMチミジンを含む。細胞および培養上清
を3220×gで10分間の遠心分離により分離した。培養上清中の分泌ヒトhIL27
の量をサンドイッチhIL27 ELISA(R&D systems)により定量した
。すべての菌株を並行して処理した。
0およびsAGX0317により分泌されたヒトhIL27の定量を示す。分泌されたh
IL27の量を3時間におけるng/109CFU細胞として表し、Y軸上に示す。図か
らエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)gap遺伝子の下流に位置し
たバイシストロン性発現カセットを含むエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus f
aecium)株sAGX0317がかなりの量の外因性タンパク質hIL27を効率的に分泌
することができることが明瞭にわかる。
バイシストロン性発現
CDP870Fabの重鎖および軽鎖遺伝子を用いてデュアルシストロン発現構築物を
作製した。すべての発現ユニットは、細菌染色体上に位置している。
VLCL)をコードするラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)MG13
63 usp45分泌リーダー(SS)とのCDP870重および軽鎖Fab融合体を、
エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)LMG15709 gap遺伝
子から下流に第2および第3のシストロンとして挿入した(sAGX0278)。sAG
X0278において、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)rpmD
の遺伝子間領域を用いてSS::CD870発現カセットをgapに結合させた。遺伝的
不安定性を避けるために、重および軽鎖遺伝子をラクトコッカス・ラクティス(Lactococ
cus lactis)rpmDに先行する遺伝子間領域を介して結合させ、異なるコドン使用頻度
を2つのSS::CD870発現カセットのusp45分泌シグナルに用いた。重鎖発現
カセットがsAGX0278における軽鎖発現カセットに先行する。
T中に接種し、30℃で16時間増殖させた。これらの飽和一夜培養を5mlの新鮮GM
17T培地で1/25に希釈し、30℃で4時間増殖させた。細胞を、3220×gで1
0分間の遠心分離により収集し、等量のBAM9T培地に再懸濁し、30℃でさらに3時
間培養した。BAM9Tは、M9塩、0.5%アミノプラスマル、0.5%グルコース、
25mM NaHCO3、25mM Na2CO3、2mM MgSO4、0.1mM
CaCl2および200μMチミジンを含む。細胞および培養上清を3220×gで10
分間の遠心分離により分離した。個々の構築物を運搬する菌株からの粗上清を並行して調
製し、TNF結合活性の存在について分析した。これは、ヒトTNFを捕捉タンパク質と
して用い、Cimzia(登録商標)(PEGに連結したCDP870fab)を対照標
準として直接ELISAにより行った。CDP870fabは、ヤギ抗ヒトFab抗血清
により検出し、HRPコンジュゲートロバ抗ヤギIgG(H+L)抗血清により示した。
HRP活性をTMB基質により視覚化した。反応は、30分後にHClを加えることによ
り停止させた。吸光度は、595nmを参照波長として450nmで測定した。すべての
菌株を並行して処理した。
)における多シストロン構築物により発現し、機能性CDP870抗TNF Fabの分
泌につながったことがわかる。
KOマウスにおけるhTNF誘発性腸損傷を防御する
組織特異的A20欠損マウスの作製
tnfaip3遺伝子のエクソンIVおよびVが2つのLoxP部位により隣接されて
いる、条件付きA20/tnfaip3ノックアウトマウスを記載されたように作製した
(Piguetら、1999年、Lab Invest、79巻、495〜500頁)。A20フロックスマウスをVi
llin−Creトランスジェニックマウスと交配して、IEC特異的A20ノックアウ
トマウス(A20IEC−KO)を作製した(Madisonら、2002年、J Biol Chem、277巻
、33275〜33283頁)。実験は、少なくとも4世代にわたってC57BL/6遺伝的バック
グラウンドに戻し交配されたマウスにおいて実施した。
マウスに各種用量のhTNF(50、10、8、6、4および2μg hTNF/20
g体重)をi.p.注射した。大腸菌(E. coli)由来組換えhTNFは、6.8×10
7IU/mgの比活性を有していた。ヒトTNFは、我々の研究室で産生させ、均一にな
るまで精製したところ、エンドトキシンレベルは、1ng/mgのタンパク質を超えなか
った。A20IEC−KOマウスにおけるhTNF注射により、腸損傷を示すいくつかの
病理学的および免疫学的変化が誘発される。低用量のhTNFは、高度な全身性の影響お
よび致死性をもたらさないが、血清および小腸のホモジネートの両方において測定するこ
とができる炎症誘発性サイトカインおよびケモカイン発現を誘導する。マウスは、組織学
的分析のために4または5時間後に安楽死させた。治療試験のために、A20IEC−K
OマウスにhTNF(2μgおよび6μg hTNF/20g体重)の腹腔内注射の前に
抗TNF産生L.ラクティス(L. lactis)細菌(本発明による)を経口強制投与により
5回投与した(30分間隔で5×1010CFU)。対照群は親L.ラクティス(L. lac
tis)株MG1363または細菌培地BM9T(媒体)で処置した。さらに、陽性対照群
をレミケード(30mg/kg)の単回注射により処置した。体温を毎時モニターした。
新たに単離した結腸および回腸セグメントをPBSでフラッシュして、糞内容物を除去
し、その後ホルマリン(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中4%ホルムアルデヒド)でフ
ラッシュし、10倍過剰のホルマリン中で4℃で一夜のインキュベーションにより固定し
た。ホルマリンを除去し、標準的な方法でパラフィンワックスに包埋する前に腸をPBS
で2回洗浄した。
4μmの組織切片を切りだし、標準的な技法を用いてヘマトキシリン/エオシンで染色
した。複合アルシアンブルー(AB)およびPAS染色のために、脱ろう切片を蒸留水に
水和し、アルシアンブルー中で20分間インキュベートした。その後、切片を1%過ヨウ
素酸中で10分間インキュベートした後、シッフ試薬中で10分間インキュベートした。
核をMayerのヘマトキシリンで30秒間対比染色した。アルカリホスファターゼの検
出は、暗所でNBT/BCIP溶液中での脱ろうおよび水和組織切片のインキュべーショ
ンにより実施した(70μl NBT+70μl BCIP+4860μl緩衝液A、N
BT=70%ジメチルホルムアミド中1.5%塩化ニトロブルーテトラゾリウム溶液、B
CIP=100%ジメチルホルムアミド中1%5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル
ホスファターゼ、緩衝液A=0.1M TrisHCl、0.1M NaCl、0.05
M MgCl2、pH9.5)。免疫化学のために、切片を脱ろうし、Dako抗原性賦
活化溶液中でインキュベートし、Pick細胞クッキングユニット(cell cooking unit
)中で20分間煮沸し、2.5時間にわたって冷却した。スライド標本をペルオキシダー
ゼブロッキング緩衝液(0.040Mクエン酸、0.121Mリン酸水素二ナトリウム、
0.030Mアジ化ナトリウム、1.5%過酸化水素)中に室温で15分間にわたり浸漬
することにより、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。ブロッキング緩衝液(P
BS中1%ウシ血清アルブミン)を室温で30分間スライド標本に加えた。一次抗体(ウ
サギ抗リゾチーム;1:1,750希釈−Dako;ウサギ抗ムチン2;1:500 2
2)をブロッキング緩衝液に加え、組織切片を一夜インキュベートした。二次抗体(ポリ
マー西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギ、Envision)を室温で30分にわ
たって加えた。ジアミノブテン酸(DAB)基質を室温で10分間加えることによってペ
ルオキシダーゼを検出し、核をMayerのヘマトキシリンで2分間対比染色した。パネ
ート(Paneth)細胞顆粒の半径の顕微鏡による測定は、Leica Image man
ager 500ソフトウエアを用いて行った。
血清および組織ホモジネート中のサイトカインおよびケモカインをCellQuest
ProおよびCBAソフトウエア(BD Biosciences)を搭載したFAC
S CaliburサイトメーターでCytometric Bead Arrayキッ
ト(CBA)(BD Biosciences)により定量した。
長さ5cmの回腸セグメントを新たに単離し、PBSでフラッシュして、糞内容物を除
去した。一端を結紮し、セグメントにRNA溶解緩衝液(Aurum Total RN
A Miniキット、Bio−Rad Laboratories)を満たし、氷上で5
分間インキュベートした。Aurum Total RNA Miniキット(Bio−
Rad Laboratories)を用いて、RNAを溶解物溶液から精製した。cD
NA合成は、iScript cDNA合成キット(Bio−Rad Laborato
ries)を用いて製造業者の指示に従って実施した。LightCycler 480
(Roche)上でLightCycler 480 SYBR Green I Ma
ster Mix(Roche)および特異的プライマーを用いて、10μlの総容積で
、10ngのcDNAを定量的PCRに用いた。実時間PCR反応を3連で実施した。次
のマウス特異プライマーを用いた:ユビキチンフォワード、5’−AGGTCAAACA
GGAAGACAGACGTA−3’(配列番号14);ユビキチンリバース、5’−T
CACACCCAAGAACAAGCACA−3’(配列番号15)。リゾチームPフォ
ワード、5’−GCCAAGGTCTAACAATCGTTGTGAGTTG−3’(配
列番号16);リゾチームPリバース、5’−CAGTCAGCCAGCTTGACAC
CACG−3’(配列番号17);クリプチジン1フォワード、5’−TCAAGAGG
CTGCAAAGGAAGAGAAC−3’(配列番号18);クリプチジン1リバース
、5’−TGGTCTCCATGTTCAGCGACAGC−3’(配列番号19)。
結果は、平均値±SEMとして表す。実験群間の統計的有意性は、対応のない2標本S
tudentのt検定を用いて評価した。
する抗hTNF産生L.ラクティス(L. lactis)細菌の特徴付け
2μgのhTNFを注射した両対照群は、抗hTNF産生L.ラクティス(L. lactis
)細菌で処置したA20IEC−KOマウスと比較して大幅な体温の低下を示した(図1
4a、左パネル)。2μgのhTNFで処置したマウスで認められたsAGX0220投
与の防御効果は、マウスにより高い濃度のhTNF(6μg)を注射した場合にもはや認
めることができなかったが、レミケードでの処置は、防御効果を明らかに示した(図14
a、右パネル)。sAGX0220の前投与は、媒体処置マウスと比較して、2μgのh
TNFで処置したマウスの回腸および結腸ホモジネート中ならびに血清中のMCP−1、
KCおよびIL−6レベルを有意に低下させた(図14b、c)。しかし、親L.ラクテ
ィス(L. lactis)株MG1363で処置したマウスにおいて同等の低下があり、細菌自
体の投与が既にプロバイオティック防御効果を有し得ることがわかる。6μgのhTNF
をチャレンジ投与したマウスは、sAGX0220の前投与により、レミケードの投与と
同程度に、血清および組織サイトカインおよびケモカインレベルの同様な低下を示した(
図14d、e)。しかし、この状況において、親MG1363株の防御効果は、大部分失
われている(図14d、e)。
れた毒素中和抗体によるクロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)関
連疾患に対する受動免疫
a)C.ディフィシレ(C. difficile)毒素AおよびC.ディフィシレ(C. difficile
)毒素B中和mAbのVLCLおよびVHCH1の遺伝子合成
常用の方法(Stemmerら、Gene、1995年、164巻(1号)、49〜53頁)に従ってVHおよび
VLアミノ酸配列情報に基づいて、デノボ遺伝子合成(L.ラクティス(L. lactis)コ
ドン使用頻度について最適化)を行う。この方法は、コーディング鎖のすべてのオリゴヌ
クレオチドが、非コーディング鎖における2つの連続オリゴヌクレオチドのそれぞれ最後
および最初の20塩基対と100%相補的である(逆もまた同様)ように、全コーディン
グならびに非コーディング鎖にわたる合成40量体オリゴヌクレオチドを利用する。
ク質(Usp45)の分泌リーダーをコードする遺伝情報をVLCLおよびVHCH1遺
伝子の5’末端に加える。
に配置し、rpmD遺伝子間領域により結合させる。これが、機能性VLCL>>VHC
H1オペロンの形成をもたらす。C末端EおよびFLAGペプチドタグもコードする上述
の合成遺伝子の変異体も構築する。これは、全サイズおよび/または潜在的分解産物を視
覚化し、軽鎖および重鎖アセンブリならびに毒素の結合の確認を可能にする。
45遺伝子座における組込み
この課題は、以下の段階からなる。
1.以下のusp45遺伝子座の下流の組込みのための組込みベクターの構築
・ C.ディフィシレ(C. difficile)毒素A中和MabのVLCL>>VHCH1
・ C.ディフィシレ(C. difficile)毒素B中和MabのVLCL>>VHCH1
・ 上述のものの3’EおよびFLAG標識変異体
合成VLCL>>VHCH1オペロンは、L.ラクティス(L. lactis)usp45遺
伝子の3’末端の1kbとそれに続くrplN遺伝子間領域によって5’末端において隣
接されている。VLCL>>VHCH1オペロンは、L.ラクティス(L. lactis)us
p45遺伝子の3’下流フランキング領域の1kb断片によって3’末端において隣接さ
れている。構築物は、オーバーラップPCR DNAアニーリングにより作製される。得
られたプラスミドは、配列が確認されている。
3のusp45遺伝子への翻訳可能な結合による組込みのために用いられる。組込みは、
5’および3’フランキング領域(usp45の3’末端に隣接する1kb領域に対応す
る)の両方における二重相同的組換えによって行われ、PCRおよびDNA配列決定によ
り確認される。
A遺伝子座における組込み
この課題は、以下の段階からなる。
1.以下のenoA遺伝子座の下流の組込みのための組込みベクターの構築
・ C.ディフィシレ(C. difficile)毒素A中和MabのVLCL>>VHCH1
・ C.ディフィシレ(C. difficile)毒素B中和MabのVLCL>>VHCH1
・ 上述のものの3’EおよびFLAG標識変異体
課題7からの合成VLCL>>VHCH1オペロンは、L.ラクティス(L. lactis)
enoA遺伝子の3’末端の1kbとそれに続くrplN遺伝子間領域によって5’末端
において隣接されている。VLCL>>VHCH1オペロンは、L.ラクティス(L. lac
tis)enoA遺伝子の3’下流フランキング領域の1kb断片によって3’末端におい
て隣接されている。構築物は、オーバーラップPCR DNAアニーリングにより作製さ
れる。得られたプラスミドは、配列が確認されている。
3のenoA遺伝子への翻訳可能な結合による組込みのために用いられる。組込みは、5
’および3’フランキング領域(enoAの3’末端に隣接する1kb領域に対応する)
の両方における二重相同的組換えによって行われ、PCRおよびDNA配列決定により確
認される。
CDADのハムスターモデルは、毒素誘発性抗生物質関連下痢および大腸炎の研究のた
めの十分に確立されたモデルである。ハムスターにおけるC.ディフィシレ(C. diffici
le)感染症の最も広範に研究されたモデルは、一次チャレンジモデルである。手短かに述
べると、ハムスターの結腸における正常細菌叢を破壊するためのC.ディフィシレ(C. d
ifficile)胞子の投与の24時間前に、ハムスターにクリンダマイシン(10〜30mg
/kg)を経口胃内経路により(orogastrically)前投与する。C.ディフィシレ(C. d
ifficile)胞子(例えば、株630またはB1の100個の胞子;Gouldingら、Infect I
mmun、2009年、77巻(12号)、5478〜5485頁)を経口胃内投与し、ハムスターを観察する(
CDAD一次チャレンジモデル)。一般的に、ハムスターの100%が、胞子の投与後3
6時間から72時間までの間に疾患のために死亡する。死亡の前には、疾患の症状は、下
痢および体重減少を含む。一般的に、症状は、ヒトに見られるものよりもはるかに重症で
あるが、ハムスターモデルは、バンコマイシンによる治療などの臨床的疾患に用いられる
治療戦略に反応する。したがって、CDADの研究に広く用いられている。
モデルを用いる。バンコマイシンは、ヒトにおけるのと同様に、ハムスターをC.ディフ
ィシレ(C. difficile)疾患から保護する。バンコマイシン治療を中止した場合、ハムス
ターは重度の疾患を再発するが、発病率は異なる。手短かに述べると、ハムスターにクリ
ンダマイシンの単回投与を行い、続いて、1日後にC.ディフィシレ(C. difficile)株
B1胞子を経口胃内投与する。バンコマイシン治療は、胞子チャレンジの当日または24
時間後に開始し、その後2〜4日間毎日続ける(CDAD再発モデル)。このプロトコー
ルは、バンコマイシンによる救助の後の再発を保証するためにさらに最適化することがで
きる。
L.ラクティス(L. lactis)により腸に送達された毒素中和Fabの恩恵を評価するた
めに、L.ラクティス(L. lactis)の増殖およびFab産生能力に対するクリンダマイ
シンおよびバンコマイシンによる影響を実証することは重要である。したがって、Fab
分泌L.ラクティス(L. lactis)株の生存率および代謝活性を測定するために、以下の
ようなin vitroおよび/またはin vivo研究を行う。
・ in vitro評価:クリンダマイシン/バンコマイシン添加L.ラクティス(
L. lactis)培養からのFab産生(ELISAによる)および増殖(平板培養による)
を、抗生物質不含有培養および5μg/mlのクロラムフェニコール(Cm)を添加した
培養と比較する。この濃度では、Cmは、L.ラクティス(L. lactis)が感受性を示す
、タンパク質合成および増殖の公知の阻害剤である。
・ in vivo評価:ハムスターへの強制経口投与および各種用量のクリンダマイ
シン/バンコマイシンとの併用投与後のFab産生(ELISAによる)および生存率(
平板培養による)を小/大腸において測定する。
送達システムの評価に十分に適する、すなわち、L.ラクティス(L. lactis)の生存率
および代謝活性に対する負の影響なしに、C.ディフィシレ(C. difficile)感染症に対
する感受性を示す、(より低い)クリンダマイシン(およびバンコマイシン)濃度および
/または抗生物質の異なるカクテルを用いるCDADのハムスターモデル(チャレンジお
よび再発)をデザインし、適用することを可能にする。
ハムスター一次チャレンジモデルにおいて、シリアンゴールデンハムスター(70〜8
0g)にC.ディフィシレ(C. difficile)胞子の投与の3日前から開始して4日間にわ
たり選択される抗毒素A/B分泌L.ラクティス(L. lactis)(抗毒素Aおよび抗毒素
B単独ならびに併用)の各種経口投与(qd、bidもしくはtid)を行うか、または
1mlの抗毒素A/B mAb(陽性対照として)を腹腔内投与する。クリンダマイシン
(上記で定義した抗生物質の用量または他のカクテル)は、標準的小動物給餌針を用いて
C.ディフィシレ(C. difficile)胞子チャレンジの24時間前に経口胃内投与する。動
物を病的状態および死亡について観察し、腸組織を組織学的および肉眼的損傷について評
価し、腸管内容物および糞中のC.ディフィシレ(C. difficile)毒素の産生を測定する
。
リンダマイシン(上で定義した抗生物質の用量または他のカクテル)を経口胃内投与し、
24時間後にC.ディフィシレ(C. difficile)B1胞子を経口胃内経路でチャレンジ投
与する。胞子投与時または24時間後に、バンコマイシン処置(上で定義した用量)を経
口胃内経路で開始し、合計2〜4日間にわたって毎日継続した。バンコマイシンの投与後
1、2、3、4または5日目に開始して、合計5〜10日間にわたり選択される抗毒素A
/B分泌L.ラクティス(L. lactis)(抗毒素Aおよび抗毒素B単独ならびに併用)の
各種経口投与(qd、bidもしくはtid)を行うか、または1mlの抗毒素A/B
mAb(陽性対照として、腹腔内)を投与する。動物を病的状態および死亡について観察
し、腸組織を組織学的および肉眼的損傷について評価し、腸管内容物および糞中のC.デ
ィフィシレ(C. difficile)毒素の産生を測定する。
ると結論することができる。特に、本発明によるグラム陽性細菌は、CDADの発生を防
ぎ、CDADの再発を予防し、ならびにCDADを治療することができる。
口内洗浄製剤の製剤原料(DS)は、本発明による操作された菌株の均一な凍結乾燥粉
末であり、凍結防止剤(デキストリン、ソルビトールおよびグルタミン酸ナトリウム)と
混合される。
フィルトレーショナー(diafiltrationor)遠心分離)、凍結防止剤を用いた製剤化、適
切なトレーへの充填およびバルク凍結乾燥。凍結乾燥ケーキの均質化およびふるい分けは
、賦形剤との混合および所望の医薬剤形への充填に適する均一な粉末(製剤原料)を製造
するために実施する。
た凍結乾燥L.ラクティス(L. lactis)細菌からなり、(圧縮)粉末として提供される
。臨床製剤は、口内洗浄剤の形態での経口、局所投与である。この口内洗浄剤懸濁液は、
DPの選択される溶液への再構成により調製される。
・ バルクDSをマンニトールと混合するステップ、
・ 500mgのDP粉末混合物を500mgの分散性粉末圧粉体に圧縮するステップ
、
・ 圧縮粉末をガラスバイアルに充填するステップ、
・ 不正開封防止小児用安全ネジ蓋によりバイアルを閉鎖するステップ、および
・ アルミニウム(Alu)バッグにバイアルを包装するステップ。
CDP870抗TNF Fabの重鎖および軽鎖を用いて、デュアルシストロン発現構
築物を作製した。すべての発現ユニットが細菌染色体上に位置する。
S::CDP870 VLCLおよびSS::CDP870 VHCH1)をコードする
usp45分泌リーダーとのCDP870軽および重鎖Fab融合体を、usp45(s
AGX0309、sAGX0319)、enoA(sAGX0275)およびgapB(
sAGX0323、sAGX0326)から下流に第2および第3のシストロンとして挿
入した。これらの菌株において、rpmDを用いてSS::CD870遺伝子をそれぞれ
usp45、enoAまたはgapBに結合させた。遺伝的不安定性を避けるために、軽
および重鎖遺伝子をrplNに先行する遺伝子間領域を介して結合させた。図15Bおよ
びCにおいて、sAGX0326の4つの同一のクローン(クローン1〜4)を分析し、
報告した。菌株は、実験を通して並行に処理した。
0mlのGM17T(Difco(商標)M17、BD、Sparks、MD、+0.5
%グルコース+200μMチミジン)中に接種し、30℃で16時間増殖させた。これら
の飽和一夜培養からの細菌を3220×gで10分間の遠心分離により収集し、10ml
の新鮮なGM17T培地に再懸濁し、30℃で2時間増殖させた。細菌および粗培養上清
を3220×gで10分間の遠心分離により分離した。すべての菌株からの粗上清を並行
して調製し、分析のために菌株ごとに分割した(図15BおよびC)。
殿させ、SDS−PAGE試料緩衝液に再懸濁した。1mlの粗培養上清の相当物をヤギ
抗ヒトFabを一次抗血清として用いてウエスタンブロットにより分析し、ウサギ抗ヤギ
APおよびNBT/BCIP染色により明らかにした(図15B;菌株はそれぞれのレー
ンの右に示す)。
。これは、Cimziaを対照標準とし、hTNFを捕捉タンパク質として用いて直接E
LISAにより行った。VLCL部分は、ヤギ抗ヒトIgG抗血清により検出され、西洋
ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗ヤギ抗血清により明らかにされた。
HRP活性は、比色分析により測定した。データを図15Cに示し、菌株を各バーの下に
示す。
に発現し、これが、高レベルの機能性CDP870抗TNF Fabにつながったことが
わかる。図15(BおよびC)で重および軽鎖遺伝子をenoAから下流に第2および第
3のシストロンとして挿入した場合、usp45の下流の挿入と比べたときCDP870
抗TNF発現がわずかに増加したことがわかる。図15(BおよびC)でさらに重および
軽鎖遺伝子をgapBから下流に第2および第3のシストロンとして挿入した場合、us
p45またはenoAから下流の挿入と比べたときCDP870抗TNF発現が実質的に
増加したことがわかる。
に、菌株を単一コロニーから5mlのGM17T中に接種し、30℃で16時間増殖させ
た。これらの飽和一夜培養からの細菌を3220×gで10分間の遠心分離により収集し
、5mlのBM9T培地に再懸濁し、30℃で2時間増殖させた。細菌および粗培養上清
を3220×gで10分間の遠心分離により分離した。個々の菌株を運搬する菌株からの
粗上清を並行して調製し、分析のために菌株ごとに分割した(図15DおよびE)。
これは、Cimziaを対照標準とし、ヒトTNFを捕捉タンパク質として用いて直接E
LISAにより行った。VLCL部分は、ヤギ抗ヒトIgG抗血清により検出され、西洋
ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗ヤギ抗血清により明らかにされた。
HRP活性は、比色分析により測定した。すべての菌株は、並行に処理した。データを図
15Dに示し、菌株を各バーの下に示す。
これは、hTNF感受性WEHI細胞をヒトTNFとともにインキュベートし、抗TNF
を加えることにより行った。抗TNFは、hTNFを除去し、WEHI細胞を細胞死から
保護する。粗上清の1/2希釈系列ならびに対照標準(63ng/mlのCimzia)
をhTNFに曝した細胞培養に加えた。細胞死に対する影響を確認した。データを図15
Eに示し、菌株を各バーの下に示す。
れが、高レベルの機能性CDP870抗TNF Fabにつながったことがわかる。図1
5Dで重および軽鎖遺伝子をgapBから下流に第2および第3のシストロンとして挿入
した場合、usp45の下流の挿入と比べたときCDP870抗TNF発現が実質的に増
加したことがわかる。
DP870抗TNFの比TNF中和能力(TNF結合タンパク質の量当たりの生物学的活
性)がCimziaのそれと同じであることが示されている。
実験の構成は、マウスTNFの非存在下で正常に調節されたヒトTNF発現を有するト
ランスジェニックマウスであるTg1278TNFkoマウスに基づいている(Kefferら
、EMBO.J、10巻、4025〜4031頁、1991年)。大腸炎は、1回の皮膚前感作の後の40%エ
タノール中4%TNBSの直腸投与チャレンジにより誘発された。手短かに述べると、マ
ウスを、背部の剃毛した1.5×1.5cmの皮膚の部位に1容量の5%TNBS+4容
量の4:1アセトン:オリーブ油を適用することによって直腸内チャレンジの7日前(−
7日目)に感作した。チャレンジの当日(0日目)に、マウスを最初にケタミン/キシラ
ジンにより麻酔し、その後、直腸内に4cm挿入した柔軟なカテーテルを介して100μ
lの4%TNBS/40%EtOHを投与した。結腸内の浣腸剤の均等な分布を保証する
ために、直腸チャレンジ直後の30秒間マウスを垂直位に保持した。
日目)継続した。マウスの3群は、1010CFUのMG1363(陰性対照)、101
0CFUのsAGX0309または10μgのCimzia(陽性対照)の胃内接種を1
日1回受けた。0日目に開始して毎日、マウスを体重、病的状態および生存についてモニ
ターした。+3日目にマウスを屠殺し、結腸試料および血清を組織学検査(結腸)および
サイトカイン(結腸および血清)分析のために採取した。
X0309)による治療は、野生型L.ラクティス(L. lactis)株MG1363と比較
して高い生存率(図16および表7)を、また、驚くべきことに、Cimziaで処置し
たマウスより高い生存率をもたらした。
aによる治療と比較して本発明の実施形態による菌株による治療後に低いことは明らかで
ある。
8に示す。図18から、組織学的スコアの有意な改善と、したがって、結腸の病的状態の
減少が、本発明の実施形態による菌株による治療後に明らかである。
サイトカインの分泌の抑制をもたらしたことは明らかである。
上記の開示によって提供される本発明の態様として、以下が挙げられる。
[1] ポリシストロン性発現ユニットを含むグラム陽性細菌であって、前記ポリシストロン性発現ユニットが、内因性遺伝子、および前記1つまたは複数の内因性遺伝子の3’末端に転写可能に結合された1つまたは複数の外因性遺伝子を連続して含み、前記1つまたは複数の外因性遺伝子がポリシストロン性発現ユニットの最も3’側の遺伝子である、グラム陽性細菌。
[2] ポリシストロン性発現ユニットを含む組換え核酸であって、前記ポリシストロン性発現ユニットが、グラム陽性細菌に対して内因性の遺伝子、および前記1つまたは複数の内因性遺伝子の3’末端に転写可能に結合された、グラム陽性細菌に対して外因性の1つまたは複数の遺伝子を連続して含み、前記1つまたは複数の外因性遺伝子がポリシストロン性発現ユニットの最も3’側の遺伝子である、組換え核酸。
[3] 前記1つまたは複数の外因性遺伝子が、免疫または免疫寛容を誘導するための抗原、非ワクチン原性の治療活性のあるポリペプチド、抗体またはFabなどのその機能性断片、融合タンパク質または多量体タンパク質など、対象における治療または予防効果を有するタンパク質、ポリペプチドおよび/またはペプチドなどの産物をコードする、[1]に記載のグラム陽性細菌または[2]に記載の組換え核酸。
[4] 1つまたは複数の外因性遺伝子が、免疫または免疫寛容を誘導するための抗原、非ワクチン原性の治療活性のあるポリペプチド、抗体またはFabなどのその機能性断片、融合タンパク質または多量体タンパク質など、対象における治療または予防効果を有するタンパク質、ポリペプチドおよび/またはペプチドなどの産物をコードする、薬剤として使用するための、好ましくは対象への前記産物の投与または送達に使用するための、[1]に記載のグラム陽性細菌または[2]に記載の組換え核酸。
[5] 前記内因性遺伝子および前記1つまたは複数の外因性遺伝子がグラム陽性細菌に対して内因性であるプロモーターにより転写制御される、[1]、[3]もしくは[4]のいずれかに記載のグラム陽性細菌または[2]から[4]までのいずれかに記載の組換え核酸。
[6] 前記プロモーターが必須遺伝子プロモーター、構成的プロモーター、中心的代謝
遺伝子プロモーターおよび/またはハウスキーピング遺伝子プロモーターである、[5]に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
[7] 前記プロモーターがリボソーム遺伝子プロモーターである、[5]に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
[8] 前記プロモーターが解糖系遺伝子プロモーターである、[5]に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
[9] 前記プロモーターが前記グラム陽性細菌のeno、usp45、gap、pyk、rpmBおよびrplSのプロモーターからなる群から選択される、[5]に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
[10] 前記内因性遺伝子がグラム陽性細菌における天然の染色体遺伝子座に位置する、[1]または[3]〜[9]のいずれか1項に記載のグラム陽性細菌。
[11] 1つまたは複数の外因性遺伝子を前記遺伝子座に染色体上で組み込むことにより、好ましくは1つまたは複数の外因性遺伝子を前記遺伝子座における前記内因性遺伝子の3’に染色体上で組み込むことにより、前記内因性遺伝子が1つまたは複数の外因性遺伝子に転写可能に結合された、[10]に記載のグラム陽性細菌。
[12] 前記内因性遺伝子および前記1つまたは複数の外因性遺伝子が、前記グラム陽性細菌において活性な遺伝子間領域によって転写可能に結合されており、好ましくは前記遺伝子間領域が前記グラム陽性細菌に対して内因性である、[1]もしくは[3]〜[11]のいずれか1項に記載のグラム陽性細菌または[2〜[9のいずれかに記載の組換え核酸。
[13] 前記遺伝子間領域がrplW、rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsE、rplN、rplM、rplEおよびrplFに先行する遺伝子間領域からなる群から選択される、[12]に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
[14] 好ましくは遺伝子間領域がグラム陽性細菌の内因性遺伝子間領域である、前記グラム陽性細菌に対して外因性の遺伝子に作動可能に連結されたグラム陽性細菌において活性な遺伝子間領域を含む、組換え核酸。
[15] 前記遺伝子間領域がrplW、rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsE、rplN、rplM、rplEおよびrplFに先行する遺伝子間領域からなる群から選択される、[14]に記載の組換え核酸。
[16] 1つの外因性遺伝子が抗体またはその機能性断片の軽鎖(V L )をコードし、別の外因性遺伝子が抗体またはその機能性断片の重鎖(V H )をコードし、より好ましくは機能性断片がFabである、[1]もしくは[3]〜[13]のいずれか1項に記載のグラム陽性細菌または[2]〜[9]もしくは[12]〜[15]のいずれか1項に記載の組換え核酸。
[17] 前記V L またはその機能性断片をコードする外因性遺伝子が、前記V H またはその機能性断片をコードする外因性遺伝子の3’末端と転写可能に結合された、[16]に記載のグラム陽性細菌または組換え核酸。
[18] 前記グラム陽性細菌が、乳酸菌、好ましくはラクトコッカス属(Lactococcus)、ラクトバシラス属(Lactobacillus)もしくはエンテロコッカス属(Enterococcus)、より好ましくはラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)またはエンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)であるか、または前記グラム陽性細菌がビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)である、[1]、[3]〜[13]、[16]もしくは[17]のいずれか1項に記載のグラム陽性細菌または[2]〜[9]もしくは[12]〜[17]のいずれか1項に記載の組換え核酸。
[19] [1]、[3]〜[13]または[16]〜[18]のいずれか1項に記載のグラム陽性細菌を含む医薬組成物。
[20] 前記1つまたは複数の外因性遺伝子が、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドなどの産物をコードし、前記産物が対象における治療または予防効果を有する、[19]に記載の医薬組成物。
[21] [2]〜[9]または[12]〜[18]のいずれか1項に記載の組換え核酸を含むベクター。
Claims (34)
- ポリシストロン性発現ユニットを含むグラム陽性細菌であって、前記ポリシストロン性発現ユニットが機能性内因性遺伝子および1つまたは複数の外因性遺伝子を含み、
前記内因性遺伝子および前記1つまたは複数の外因性遺伝子が前記グラム陽性細菌に対して内因性のプロモーターによって転写制御され、
前記プロモーターが構成的必須リボソーム遺伝子プロモーターまたは構成的必須解糖遺伝子プロモーターであり、
前記プロモーターが前記内因性遺伝子の天然のプロモーターであり、
前記プロモーターおよび前記内因性遺伝子が前記グラム陽性細菌における天然の染色体遺伝子座に位置しており、
前記内因性遺伝子が、前記遺伝子座への前記1つまたは複数の外因性遺伝子の染色体組込みによって前記1つまたは複数の外因性遺伝子と転写可能に結合されており、
前記1つまたは複数の外因性遺伝子が(i)対象において治療活性のあるポリペプチドであるポリペプチド、または(ii)対象において予防効果を有するポリペプチドをコードするものである、グラム陽性細菌。 - 前記1つまたは複数の外因性遺伝子が前記内因性遺伝子の3’末端に転写可能に結合された、請求項1に記載のグラム陽性細菌。
- 前記1つまたは複数の外因性遺伝子が前記ポリシストロン性発現ユニットの最も3’側の遺伝子である、請求項2に記載のグラム陽性細菌。
- 前記内因性遺伝子および前記1つまたは複数の外因性遺伝子が、前記グラム陽性細菌において活性な遺伝子間領域によって転写可能に結合された、請求項1に記載のグラム陽性細菌。
- 前記遺伝子間領域が前記グラム陽性細菌に対して内因性である、請求項4に記載のグラム陽性細菌。
- 前記遺伝子間領域がrplW、rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsE、rplN、rplM、rplEおよびrplFに先行する遺伝子間領域からなる群から選択される、請求項4に記載のグラム陽性細菌。
- 前記ポリペプチドが、免疫または免疫寛容を誘導するための抗原、非ワクチン原性の治療活性のあるポリペプチド、抗体またはその機能性断片、融合タンパク質、あるいは多量体タンパク質である、請求項1に記載のグラム陽性細菌。
- 前記機能性断片がFab断片である、請求項7に記載のグラム陽性細菌。
- 1つの外因性遺伝子が抗体の軽鎖(VL)またはその機能性断片をコードし、別の外因性遺伝子が前記抗体の重鎖(VH)またはその機能性断片をコードする、請求項1に記載のグラム陽性細菌。
- 前記機能性断片がFab断片である、請求項9に記載のグラム陽性細菌。
- 前記VLまたはその機能性断片をコードする外因性遺伝子が、前記VHまたはその機能性断片をコードする外因性遺伝子の3’末端と転写可能に結合された、請求項9に記載のグラム陽性細菌。
- 前記グラム陽性細菌が、乳酸菌またはビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)である、請求項1に記載のグラム陽性細菌。
- 前記乳酸菌が、ラクトコッカス属(Lactococcus)、ラクトバシラス属(Lactobacillus)またはエンテロコッカス属(Enterococcus)の細菌である、請求項12に記載のグラム陽性細菌。
- 前記乳酸菌が、ラクトコッカス属(Lactococcus)、またはエンテロコッカス属(Enterococcus)である、請求項13に記載のグラム陽性細菌。
- 免疫もしくは免疫寛容、炎症性腸疾患、自己免疫疾患、または糖尿病の治療のための医薬の製造における、請求項1〜14のいずれか1項に記載のグラム陽性細菌の使用。
- ポリシストロン性発現ユニットを含む組換え核酸であって、前記ポリシストロン性発現ユニットが、グラム陽性細菌に対して機能性の内因性の遺伝子、および前記グラム陽性細菌に対して外因性の1つまたは複数の遺伝子を含み、
前記内因性遺伝子および前記1つまたは複数の外因性遺伝子が前記グラム陽性細菌に対して内因性のプロモーターによって転写制御され、
前記プロモーターが構成的必須リボソーム遺伝子プロモーターまたは構成的必須解糖遺伝子プロモーターであり、
前記内因性遺伝子および前記1つまたは複数の外因性遺伝子が、転写可能に結合されて、前記内因性遺伝子の天然のプロモーターによって制御されるものであり、
前記1つまたは複数の外因性遺伝子が(i)対象において治療活性のあるポリペプチドであるポリペプチドもしくは(ii)対象において予防効果を有するポリペプチドをコードするものである、組換え核酸。 - 請求項16に記載の組換え核酸を含むベクター。
- 前記1つまたは複数の外因性遺伝子が前記内因性遺伝子の3’末端に転写可能に結合された、請求項16に記載の組換え核酸。
- 前記1つまたは複数の外因性遺伝子が前記ポリシストロン性発現ユニットの最も3’側の遺伝子である、請求項18に記載の組換え核酸。
- 前記内因性遺伝子および前記1つまたは複数の外因性遺伝子が、前記グラム陽性細菌において活性な遺伝子間領域によって転写可能に結合された、請求項16に記載の組換え核酸。
- 前記遺伝子間領域が前記グラム陽性細菌に対して内因性である、請求項20に記載の組換え核酸。
- 前記遺伝子間領域がrplW、rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsE、rplN、rplM、rplEおよびrplFに先行する遺伝子間領域からなる群から選択される、請求項20に記載の組換え核酸。
- 前記ポリペプチドが、免疫または免疫寛容を誘導するための抗原、非ワクチン原性の治療活性のあるポリペプチド、抗体またはその機能性断片、融合タンパク質、あるいは多量体タンパク質である、請求項16に記載の組換え核酸。
- 前記機能性断片がFab断片である、請求項23に記載の組換え核酸。
- 1つの外因性遺伝子が抗体の軽鎖(VL)またはその機能性断片をコードし、別の外因性遺伝子が前記抗体の重鎖(VH)またはその機能性断片をコードする、請求項16に記載の組換え核酸。
- 前記機能性断片がFab断片である、請求項25に記載の組換え核酸。
- 前記VLまたはその機能性断片をコードする外因性遺伝子が、前記VHまたはその機能性断片をコードする外因性遺伝子の3’末端と転写可能に結合された、請求項25に記載の組換え核酸。
- 前記グラム陽性細菌が、乳酸菌またはビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)である、請求項16に記載の組換え核酸。
- 前記乳酸菌が、ラクトコッカス属(Lactococcus)、ラクトバシラス属(Lactobacillus)またはエンテロコッカス属(Enterococcus)の細菌である、請求項28に記載の組換え核酸。
- 前記乳酸菌が、ラクトコッカス属(Lactococcus)、またはエンテロコッカス属(Enterococcus)である、請求項29に記載の組換え核酸。
- 免疫もしくは免疫寛容、炎症性腸疾患、自己免疫疾患、または糖尿病の治療のための医薬の製造における、請求項16および18〜30のいずれか1項に記載の組換え核酸の使用。
- 免疫もしくは免疫寛容、炎症性腸疾患、自己免疫疾患、または糖尿病の治療のための医薬の製造における、請求項17に記載のベクターの使用。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載のグラム陽性細菌、請求項16および18〜30のいずれか1項に記載の組換え核酸、または請求項17に記載のベクターを含む医薬組成物。
- 薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項33に記載の医薬組成物。
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