JPH01196296A - 動物細胞用発現ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、発現効率の高い動物細胞用発現ベクターに関
する。

［従来の技術］ 近年の分子生物学の進歩と、遺伝子組み換え技術の発展
により、種々の有用ヒト生理活性物質の遺伝子が単離さ
れ、また、細菌、酵母、動物細胞を宿主とした遺伝子発
現系を用いることにより、それらの生理活性物質を生産
できるようになった。

ヒト生理活性物質は、その分子内に糖鎖を含むものが多
く、生物活性、ｉｎ　　ｖｉｖｏでの安定性などの点で
糖鎖の重要性が明らかになってきた。

細菌は、その遺伝子産物に糖鎖をつける機構を持たず、
そのため糖鎖を含む形で生理活性物質を作るための宿主
として動物細胞が重要になってきた。現在までに、動物
細胞を宿主としてヒト生理活性物質を生産した例は多い
が、動物細胞の遺伝子発現機構に関する研究は大腸菌に
比べて遅れており、その発現ベクターも基本的にはプロ
モーターの下流に遺伝子をつなげただけのもので、特に
翻訳効率を高めることによる発現効率上昇の試みは少な
い。

コザックは、数多くの真核細胞遺伝子の翻訳開始コドン
周辺の塩基配列を詳細に検討した結果、５′・・・・・
・ＣＣＡＣＣＡＴＧ・・・・・・３′（下線は開始コド
ン） という配列を持つものが多いことを見い出した。

また、インスリン遺伝子を用いて、その翻訳開始コドン
周辺を元の配列から変えることによって、その発現世が
低下することを示した。これらの事実から、コザックは
翻訳開始コドン直前の配列が真核細胞遺伝子の発現に影
響を与えることを提唱した。

しかし、既存の動物細胞発現ベクターの翻訳開始コドン
周辺の配列を変換することにより、発現効率を改善しよ
うとした試みはなかった。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明の目的は、動物細胞を宿主とする遺伝子発現系に
おいて、その発現ベクターの翻訳効率を高めることによ
って発現効率の高い動物細胞用発現ベクターを作製する
ことにある。

［問題を解決するための手段］ 上記の目的は、以下の本発明により達成される。

すなわち本発明は、真核細胞型プロモーターの下流に生
理活性物質の蛋白質をコードする遺伝子を連結したベク
ターであって、翻訳開始コドンを含む直前の配列がＣＡ
ＡＡＧＡＴＧ、ＣＣＡＴＡＡＴＧＳＣＡＡＡＣＡＴＧあ
るいはＣＣＡＡＧＡＴＧであることを特徴とする動物細
胞用発現ベクターに関するものである。

本発明の真核細胞型プロモーターとは、動物ウィルスの
プロモーターもしくは動物細胞遺伝子のプロモーターで
あって、動物細胞の中で下流の蛋白質をコードする遺伝
子をｍ　ＲＮ　Ａへ転写する機能のあるものであれば何
でもよい。

−例として、マウス乳癌ウィルス（Ｍｏｕｓｅ　Ｍａｍ
ｍａｒｙ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓ　、以下ＭＭＴＶと
略す）のプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、Ｓ
Ｖ４０後期プロモーター、ＨＢウィルス遺伝子のプロモ
ーター、ヒトＴ細胞白血病ウィルスのプロモーター等が
動物ウィルスのプロモーターとして挙げられる。また、
チミジンキナーゼ遺伝子のプロモーター、メタロチオネ
イン遺伝子のプロモーター、熱シヨツク蛋白のプロモー
ター、インターフェロン遺伝子のプロモーター等が動物
細胞遺伝子のプロモーターとして挙げられる。

これらのうち、特にＳＶ４０初期プロモーター、ＭＭＴ
Ｖプロモーターが好ましく用いられる。

真核細胞型プロモーターは、１種でも２種以上併用して
もよい。なお、真核細胞型プロモーターの上流には、転
写効率を高めると言われているＨａｒｂｅｙマウス肉腫
ウィルスの５’ＬＴＲのエンハンサ−配列やＳＶ４０の
エンハンサ−配列を挿入することが好ましい。

本発明のＣＡＡＡＧＡＴＧ、ＣＣＡＴＡＡＴＧ、ＣＡＡ
ＡＣＡＴＧ、ＣＣＡＡＧＡＴＧの配列をベクターに導入
するには、翻訳開始コドンＡＴＧの直前に、各々対応す
るＣＡＡＡＧ、ＣＣＡＴＡ、ＣＡＡＡＣあるいはＣＣＡ
ＡＧのデオキシオリゴヌクレオチドを化学合成等により
作成し、連結することにより導入することができる。上
記デオキシオリゴヌクレオチドをＡＴＧに連結するには
、発現ベクターのＡＴＧ直前を平滑末端となるように調
整し、一方、上記４種のデオキシオリゴヌクレオチドは
、各々対応する相補鎖を合成し、３′末端側が平滑末端
となるような２本ｇＤＮＡ断片を作成すれば容易に連結
することができる。また、上記２本鎖ＤＮＡ断片は、そ
の上流に任意の制限酵素の切断末端を持つように合成す
ると、発現ベクターへの導入を容易にすることができる
。

本発明の発現ベクターを簡便、大量かつ純粋に調製する
ために、大腸菌における複製開始点と薬剤耐性遺伝子を
結合することは有用なことである。

複製開始点としては、大腸菌染色体ＤＮＡの合成阻害剤
で複製の増幅が起こることが知られているコリシンＥ１
プラスミド由来のもの、例えばｐＢＲ３２２およびこれ
に類縁のプラスミドが望ましいが、これに限定されるも
のではない。

薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、テ
トラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、
ストレプトマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝
子等が挙げられる。

以上のような性質を持つ２つのＤＮＡ断片を結合するこ
とにより、発現効率の高い動物細胞用発現ベクターを作
製することができる。

本発明の生理活性物質としては特に限定されないが、糖
鎖を有する生理活性物質が好ましく用いられる。具体的
には、絨毛膜性生殖刺激ホルモン（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ
　ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｒｎ）、甲状腺刺激ホルモン（
ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｉｎ）、枦胞成熟ホルモン（ｆｏ！
　ｌ　１ｔｒＯｐｉｎ）および黄体形成ホルモン（１ｕ
ｔｒｏｐｉｎ）等の各種ホルモン、あるいはインターフ
ェロン（β、γ）、エリトリポイエチン、インターロイ
キン（１，２゜３．４，５．６＞、組織型プラスミノゲ
ンアクチベータ（ＴＰＡ）　、リポコルチン、コラゲナ
ーゼインヒビター等が挙げられる。これらの生理活性物
質の蛋白質をコードする遺伝子を導入することにより、
各々目的の糖付加生理活性物質を生産することができる
。本発明の発現ベクターは、例えばインターフェロン、
特にインターフェロンβを生産するためのベクターとし
て非常に適している。

本発明の発現ベクターを導入する宿主の動物細胞として
は、産生される生理活性物質で増殖阻害のかからない細
胞であれば特に限定されないが、例えばサルのＣ０８−
１ｍ胞、ＦＬ細胞（ヒト生膜由来）、ＰＣ−８細胞（ヒ
ト肺癌転移リンパ節由来）、ＰＣ−１２細胞（ヒト肺癌
転移リンパ節由来）、ＣＶ−１細胞（アフリカミドリザ
ル腎臓由来）、Ｌ−９２９細胞（マウス結合組織由来）
、マウスのＣ−１２７細服、ＣＨＯ細胞（チャイニーズ
・ハムスター卵巣由来細胞）等が挙げられる。

発現ベクターＤＮＡの調製は、−膜内な方法で行うこと
ができる（Ｔ、）ｌａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　
ＭＯｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｉ）、８６〜９
６１９８２）。

また、発現ベクターＤＮＡの動物細胞への導入は、既存
のリン酸カルシウム法により可能である（Ｆ、Ｌ、Ｇｒ
ａｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　５４
５３６．　（１９７３）　）。

本発明の発現ベクターにより形質転換された動物細胞を
、通常の方法で培養することにより生理活性物質を培養
液中に分泌させることができる。

また生産された生理活性物質は、培養液から一般的な精
製法により精製することができる。

［実　施　例］ 以下に、ＳＶ４０プロモーターの支配下に置かれたヒト
インターフェロン遺伝子の開始コドン直前に効率的な翻
訳開始に必要な配列を導入することにより作製した動物
細胞発現ベクターを動物細胞宿主に導入し、高い効率で
ヒトインターフェロンを発現させた例を示すが、本発明
は無論これに限定されるものではない。

実施例１ ヒトインターフェロンβ発現ベクターｐＳＶ２ＩＦＮ（
ｒ）βの作製： ｐＳＶ２　Ｉ　ＦＮ　（ｒ）βは、ヒトインターフェロ
ンβ発現ベクターｐＳＶ２ＩＦＮβ（特開昭６１−５２
２８３号公報）のヒトインターフェロン遺伝子の翻訳開
始コドン直前に、ＣＡＡＡＧのＤＮＡ配列を導入するこ
とにより作製した。作製方法は以下の通りである（第１
図参照）。

まず、ｐＳＶ２　Ｉ　ＦＮβをヒトインターフェロンβ
遺伝子の上流にある制限酵素ＸｂａＩ部位で切断後、Ｓ
Ｉヌクレアーゼを用いて平滑末端化した後、ＳＶ４０初
期プロモーターの下流にある制限酵素Ｈｉｎｄ１部位で
切断することにより、ヒトインターフェロンβ遺伝子の
翻訳開始コドンの直前に任意の配列を挿入できるように
した。

次に、化学合成した２本のオリゴヌクレオチド（ＡＧＣ
ＴＴＴＧＣＡＡＡＧ＞と（ＣＴＴＴＧＣＡＡ）をアニー
リングすることにより、一方にＨｉｎｄＩ［Ｉ切断末端
を、他方に平滑末端を持つ抑大配列を作製した。

上記２断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合するこ
とにより、ｐｓＶ２　Ｉ　ＦＮ　（ｒ）βを得た。オリ
ゴヌクレオチド挿入部分付近の塩基配列をＭａｘａａ＋
とＧ１１ｂｅｒｔの方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ。

Ｓｅｔ、、　ＵＳＡ、　７４．５６０．１９７７）によ
り決定し、ＣＡＡＡＧＡＴＧ　（下線のＡＴＧは翻訳開
始コドン）であることを確認した。

実施例２ ヒトインターフェロンβ発現ベクターｐＳＶ２ＩＦＮ（
ｒＭ）βの作製： ｐＳＶ２１　ＦＮ　（ｒＭ）βは、ヒトインターフェロ
ンβ発現ベクターｐｓＶ２ＩＦＮβのヒトインターフェ
ロン遺伝子の翻訳開始コドン直前に、ＣＣＡＴＡのＤＮ
Ａ配列を導入することにより作製した。作製方法は以下
の通りである（第２図参照）。

実施例１と同様の方法で、ｐｓＶ２１ＦＮβのヒトイン
ターフェロンβ遺伝子の翻訳開始コドンの直前に任意の
配列を挿入できるようにした。次に、化学合成した２本
のオリゴヌクレオチド（ＡＧＣＴＴＴＧＣＣＡＴＡ）と
（ＴＡＴＧＧＣＡＡ）をアニーリングすることにより、
＝方にＨｉｎｄ■切断末端を、他方に平滑末端を持つ挿
入配列を作製した。

上記２断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合するこ
とにより、ｐＳＶ２１　ＦＮ　（ｒＭ）βを得た。オリ
ゴヌクレオチド挿入部分付近の塩基配列をＭａｘａｍと
Ｇｉ　Ｉｂｅｒｔの方法により決定し、ＣＣＡＴＡＡＴ
Ｇ　（下線のＡＴＧは翻訳開始コドン）であることを確
認した。

実施例３ ヒトインターフェロンβ発現ベクターｐＳＶ２ＩＦＮ（
ｒ２）βの作製： ｐＳＶ２ＩＦＮ　（ｒ２）βは、ヒトインターフェロン
β発現ベクターｐＳＶ２　Ｉ　ＦＮβのヒトインターフ
ェロン遺伝子の翻訳開始コドン直前に、ＣＡＡＡＣのＤ
ＮＡ配列を導入することにより作製した。作製方法は以
下の通りである（第３図参照）。

実施例１と同様の方法で、ｐＳＶ２　Ｉ　ＦＮβのヒト
インターフェロンβ遺伝子の翻訳開始コドンの直前に任
意の配列を挿入できるようにした。次に、化学合成した
２本のオリゴヌクレオチド（ＡＧＣＴＴＴＧＣＡＡＡＣ
）と（ＧＴＴＴＧＣＡＡ）をアニーリングすることによ
り、一方にＨｉｎｄ■切断末端を、他方に平滑末端を持
つ挿入配列を作製した。

上記２断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合するこ
とにより、ｐｓＶ２ＩＦＮ　（ｒ２）βを得た。オリゴ
ヌクレオチド挿入部分付近の塩基配列をＭａｘａｍとＧ
ｉ　Ｉｂｅｒｔの方法により決定し、ＣＡＡＡＣＡＴＧ
　（下線のＡＴＧは翻訳開始コドン）であることを確認
した。

実施例４ ヒトインターフェロンβ発現ベクターｐＳＶ２１ＦＮ（
ｒ３）βの作製： ｐｓＶ２ＩＦＮ　（ｒ３）βは、ヒトインターフェロン
β発現べ久ターｐｓＶ２１　ＦＮβのヒトインターフェ
ロン遺伝子の翻訳開始コドン直前に、ＣＣＡＡＧのＤＮ
Ａ配列を導入することにより作製した。作製方法は以下
の通りである（第４図参照）。

実施例１と同様の方法で、ｐＳＶ２ＩＦＮβのヒトイン
ターフェロンβ遺伝子の翻訳開始コドン直前に任意の配
列を挿入できるようした。次に、化学合成した２本のオ
リゴヌクレオチド（ＡＧＣＴＴＴＧＣＣＡＡＧ）と（Ｃ
ＴＴＧＧＣＡＡ）をアニーリングすることにより、一方
にＨｉｎｄＩＩＩ切断末端を、他方に平滑末端を持つ挿
入配列を作製した。

上記２断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合するこ
とにより、ｐＳＶ２　Ｉ　ＦＮ　（ｒ３）βを得た。オ
リゴヌクレオチド挿入部分付近の塩基配列をＭａｘａｍ
とＧｉ　１ｂｅｒｔの方法により決定し、ＣＣＡＡＧＡ
ＴＧ　（下線のＡＴＧは翻訳開始コドン）であることを
確認した。

実施例５ ｐＳＶ２ＩＦＮ　（ｒ）βにょるＣＨＯ細胞宿主でのイ
ンターフェロン発現： 実施例１のｐｓＶ２１ＦＮ　（ｒ）βとｐＳＶ２ＩＦＮ
β、ｐｓＶ２１ＦＮ　（ｒＫ）β（ｐｓＶ２ＩＦＮβの
インターフェロン遺伝子の翻訳開始コドン直前に、コザ
ックの提唱した配列ＣＣＡＣＣを導入し作製した）を、
リン酸カルシウム法（前述）にて１〜２Ｘ１０５個のＣ
ＨＯ細胞に導入した。１０％牛脂児血清、６０１．ｔｇ
／ｍｌカナマイシン、１０　ｍｇ／　ｍｌアデノシン、
１０ｍｇ／ｍｌデオキシアデノシン、１０ｍｇ／ｌｎｌ
チミジンを含むアルファ（−）培地（ＧＩＢＣＯ社）に
て２４時間培養した後、培養上清中の抗ウィルス活性（
すなわちヒトインターフェロンβ活性）をＳ、Ｒｕｂｉ
ｎｓｔｅｉｎらの方法（Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　３７
．７５５．１９８１）に基づき、ヒトＦＬ細胞とｖＳｖ
を用いたＣＰＥ阻止法で測定した。

ｐＳＶ２　Ｉ　ＦＮ　（ｒ）βを導入したＣＨＯ細胞の
培養上清中のＩＦＮβ活性は、ｐｓＶ２ＩＦＮβを導入
したときに比べて１１．２倍、ｐＳＶ２ＩＦＮ（ｒＫ）
βを導入したときに比べて２．７倍高かった。

実施例６ ｐｓＶ２　Ｉ　ＦＮ　（ｒＭ）βによるＣＨＯ細胞宿主
でのインターフェロン発現： 実施例２のｐＳＶ２ＩＦＮ　（ｒＭ）βとｐｓＶ２ＩＦ
Ｎβを実施例５と同様の方法でＣＨＯ細胞に導入し、培
養上清中のＩＦＮβ活性を測定した。

ｐＳＶ２１　ＦＮ　（ｒＭ）βを導入したＣＨＯ細胞の
培養上清中のＩＦＮβ活性は、ｐｓＶ２１ＦＮβを導入
したときに比べて２．２倍高かった。

実施例７ ｐｓＶ２１ＦＮ　（ｒ２）βによるＣＨＯ細胞宿主での
インターフェロン発現： 実施例３のｐＳＶ２ＩＦＮ　（ｒ２）βと、ｐＳＶ２１
　ＦＮβ、ｐｓＶ２　Ｉ　ＦＮ　（ｒＫ）βを実施例５
と同様の方法でＣＨＯ細胞に導入し、培養上清中のＩＦ
Ｎβ活性を測定した。

ｐｓＶ２　Ｉ　ＦＮ　（ｒ２）βを導入したＣＨＯ細胞
の培養上清中のＩＦＮβ活性は、ｐｓＶ２ＩＦＮβを導
入したときに比べて５．９倍、ｐＳＶ２ＩＦＮ（ｒＫ）
βを導入したときに比べて１．４倍高かった。

実施例８ ｐＳＶ２ＩＦＮ　（ｒ３）βによるＣＨＯ細胞宿主での
インターフェロン発現： 実施例４のｐｓＶ２１ＦＮ　（ｒ３）βと、ｐＳＶ２１
ＦＮβ、ｐＳＶ２１ＦＮ　（ｒＫ）βを実施例５と同様
の方法でＣＨＯ細胞に導入し、培養上清中のＩＦＮβ活
性を測定した。

ｐｓＶ２１ＦＮ　（ｒ３）βを導入したＣＨＯ細胞の培
養上清中のＩＦＮβ活性は、ｐｓＶ２１　ＦＮβを導入
したときに比べて５．２倍、ｐＳＶ２１ＦＮ（ｒＫ）β
を導入したときに比べて１．３倍高かった。

［発明の効果］ 本発明により、既存の動物細胞発現ベクターの開始コド
ン上流の塩基配列を特定の配列に変換することにより、
効率の高い動物細胞発現系を作製することができた。

【図面の簡単な説明】 第１図は、本発明のベクターｐＳＶ２　Ｉ　ＦＮ（ｒ）
βの作製方法を示すものである。 第２図は、本発明のベクターｐＳＶ２１　ＦＮ（ｒＭ）
βの作製方法を示すものである。 第３図は、本発明のベクターｐＳＶ２１　ＦＮ（ｒ２）
βの作製方法を示すものである。 第４図は、本発明のベクターｐＳＶ２ＩＦＮ（ｒ３）β
の作製方法を示すものである。 特許出願人　　東　し　株　式　会　社ＥｃｏｒＬ　Ｉ ＡＡＯＧＧＴＴＯ 第 Ｅｃｏ几１

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）真核細胞型プロモーターの下流に生理活性物質の
   蛋白質をコードする遺伝子を連結したベクターであって
   、翻訳開始コドンを含む直前の配列がＣＡＡＡＧＡＴＧ
   、ＣＣＡＴＡＡＴＧ、ＣＡＡＡＣＡＴＧあるいはＣＣＡ
   ＡＧＡＴＧであることを特徴とする動物細胞用発現ベク
   ター。