KR102530483B1 - 메탄자화균을 이용한 유기산의 제조 방법 - Google Patents

메탄자화균을 이용한 유기산의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102530483B1
KR102530483B1 KR1020200130331A KR20200130331A KR102530483B1 KR 102530483 B1 KR102530483 B1 KR 102530483B1 KR 1020200130331 A KR1020200130331 A KR 1020200130331A KR 20200130331 A KR20200130331 A KR 20200130331A KR 102530483 B1 KR102530483 B1 KR 102530483B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
methane
organic acid
bacteria
producing
repeated
Prior art date
Application number
KR1020200130331A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20220046971A (ko
Inventor
김민식
이진석
이준표
박권우
이수연
이상민
문명훈
이지예
박정호
조재환
Original Assignee
한국에너지기술연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국에너지기술연구원 filed Critical 한국에너지기술연구원
Priority to KR1020200130331A priority Critical patent/KR102530483B1/ko
Publication of KR20220046971A publication Critical patent/KR20220046971A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102530483B1 publication Critical patent/KR102530483B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/54—Acetic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/26—Methylomonas
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/30—Fuel from waste, e.g. synthetic alcohol or diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명의 일 실시예에 의한 유기산의 제조 방법은 메탄자화균을 준비하는 준비 단계; 메탄자화균을 배지에 투입하여 30회 이상 배양하는 반복 배양 단계; 및 반복 배양 단계를 거친 메탄자화균을 메탄을 포함하는 반응용기에서 반응시켜 유기산을 생산하는 유기산 생산 단계를 포함한다.

Description

메탄자화균을 이용한 유기산의 제조 방법{MENUFACTURING METHOD FOR ORGANIC ACID USING METHANOTROPHS}
본 발명의 일 실시예는 메탄자화균을 이용한 유기산의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명의 일 실시예는 메탄자화균의 가스 소모 속도를 증진시키고 동시에 유기산의 생산을 증가시키는 메탄자화균을 이용한 유기산의 제조 방법에 관한 것이다.
메탄가스는 천연가스와 셰일가스의 주성분이며 온실효과를 일으키는 원인 물질로 알려져있다. 석유로 대표되는 액체 탄화수소와는 달리 메탄은 그 자체만으로는 기체이기 때문에 고부가가치 사물로의 전환이 어렵고 연료로서의 사용 또한 어렵다고 평가된다. 그에 따라 메탄가스를 유용성을 지닌 화합물로 전환하고자 하는 노력이 계속 되어 왔다.
메탄자화균(Methanotrophic bacteria)은 메탄을 유일한 에너지원으로 생육할 수 있는 미생물로, 1906년에 Sohngen에 의해 처음으로 분리되었다. 그 후, 분류학적 연구로 세포의 형태, 정지기의 세포 또는 세포내막구조의 형태에 따라 25종으로 분류되었다. 이러한 메탄산화세균은 메탄 모노옥시게나아제(monooxygenases, MMO)라는 효소를 함유하고 있어 상온, 상압하에서도 용이하게 메탄을 메탄올로 전환할 수 있다. 메탄은 메탄 모노옥시게나아제에 의해 메탄올로 산화되고, 그 다음, 메탄올은 메탄올탈수소효소(methanol dehydrogenase, MDH)에 의해 포름알데히드(formaldehyde) 또는 포름산으로 산화되어 이산화탄소가 된다. 이러한 메탄으로부터 탄소화합물의 생합성은 리불로오스 일인산 회로(ribulose monophosphate cycle; RuMP cycle)와 세린 회로(serine cycle)에 의해 진행되고, 일반적으로 type I의 메탄산화세균은 리불로오스 일인산 회로를, type II의 메탄산화세균은 세린 회로를 이용하여 바이오매스를 합성한다고 알려져 있다(Biocatalytic Conversion of Methane to Methanol as a Key Step for Development of Methane-Based BiorefineriesJ. Microbiol. Biotechnol. In Yeub Hwang et al(2014), 24(12), 1597-605). 이러한 메탄산화세균이 갖는 생리학적 특성으로 인해, 메탄산화세균을 이용하여 메탄을 유기화합물로 전환시켜, 유해한 메탄가스를 절감시키려는 노력과 에너지원으로 활용하려는 노력이 계속되어 왔다.
한편, 탄소화합물 중 높은 유용성을 가진 것으로 알려진 숙신산(succinic acid)은 무색의 주상 또는 관상 결정을 가지는 유기산으로, TCA 회로를 구성하는 주요 유기산 중 하나이며 카르복시산의 일종이다. 숙신산은 식품, 농업, 고분자산업 등 다양한 분야에 사용될 수 있으며, 약 150억 달러의 국제적 시장가치를 지닌 화합물로 판단되며, 생물공정을 이용하여 숙신산을 생산하는 방법이 계속 연구되고 있다.
본 발명의 일 실시예는 메탄자화균을 이용한 유기산의 제조 방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명의 일 실시예는 메탄자화균의 가스 소모 속도를 증진시키고 동시에 유기산의 생산을 증가시키는 메탄자화균을 이용한 유기산의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의한 유기산의 제조 방법은 메탄자화균을 준비하는 준비 단계; 메탄자화균을 배지에 투입하여 30회 이상 배양하는 반복 배양 단계; 및 반복 배양 단계를 거친 메탄자화균을 메탄을 포함하는 반응용기에서 반응시켜 유기산을 생산하는 유기산 생산 단계를 포함한다.
메탄자화균은 메틸로모나스 속(Methylomonas), 메틸로박터 속(Methylobacter), 메틸로코커스 속(Methylococcus), 메틸로마이크로븀 속(Methylomicrobium), 메틸로스페라 속(Methylosphaera), 메틸로칼덤 속(Methylocaldum), 메틸로글로버스 속(Methyloglobus), 메틸로사르시나 속(Methylosarcina), 메틸로프로펀더스 속(Methyloprofundus), 메틸로썰머스 속(Methylothermus), 메틸로할로비우스 속(Methylohalobius), 메틸로게아 속(Methylogaea), 메틸로마리넘 속(Methylomarinum), 메틸로벌럼 속(Methylovulum), 메틸로마리노범 속(Methylomarinovum), 메틸로러브럼 속(Methylorubrum), 메틸로파라코커스 속(Methyloparacoccus), 메틸로시너스 속(Methylosinus), 메틸로시스티스 속(Methylocystis), 메틸로셀라 속(Methylocella), 메틸로캡사 속(Methylocapsa), 메틸로퍼룰라 속(Methylofurula), 메틸아시디필럼 속(Methylacidiphilum) 및 메틸아시디마이크로븀 속(Methylacidimicrobium)중 1종 이상을 포함할 수 있다.
메탄자화균은 메틸로모나스 속(Methylomonas) DH-1을 포함할 수 있다.
반복 배양 단계에서 40 내지 60회 배양할 수 있다.
반복 배양 단계에서 메탄을 20 내지 50 부피% 및 산소를 20 부피% 이하 포함하는 분위기에서 배양할 수 있다.
반복 배양 단계에서 메탄자화균 투입시 OD600이 0.05 내지 0.5가 되도록 투입할 수 있다.
반복 배양 단계에서 배양 1회시 OD600이 1 내지 2.5가 되도록 배양할 수 있다.
반복 배양 단계에서 배양 1회당 1 내지 5일간 배양할 수 있다.
유기산 생산 단계에서 메탄을 20 내지 50 부피% 및 산소를 20 부피% 이하 포함하는 반응용기에서 반응시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 메탄자화균을 이용한 유기산의 제조 방법은 장시간 동안 안정적으로 가스를 소모한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 메탄자화균을 이용한 유기산의 제조 방법은 숙신산 및 아세트산의 생산을 동시에 증가시킬 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 반복 배양시 배양 시간에 따른 OD600 그래프이다.
도 2는 실험예 1에서 (A) ALE 이전의 메탄 소모 속도, (B) ALE 이전 산소 소모 속도, (C) ALE 이후 메탄 소모 속도, (D) ALE 이후 산소 소모 속도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실험예 2에서 ALE 이전 및 이후의 (A) 미생물 생장 곡선 (OD600, linear scale) (B) 미생물 생장 곡선 (log scale) 그래프이다.
도 4는 실험예 3에서 (A) ALE 이전, (B) ALE 50번 이후의 유기산 생산 패턴 그래프이다.
여기서 사용되는 전문 용어는 단지 특정 실시예를 언급하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것을 의도하지 않는다. 여기서 사용되는 단수 형태들은 문구들이 이와 명백히 반대의 의미를 나타내지 않는 한 복수 형태들도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함하는"의 의미는 특정 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분을 구체화하며, 다른 특성, 영역, 정수, 단계, 동작, 요소 및/또는 성분의 존재나 부가를 제외시키는 것은 아니다.
다르게 정의하지는 않았지만, 여기에 사용되는 기술용어 및 과학용어를 포함하는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 가진다. 보통 사용되는 사전에 정의된 용어들은 관련기술문헌과 현재 개시된 내용에 부합하는 의미를 가지는 것으로 추가 해석되고, 정의되지 않는 한 이상적이거나 매우 공식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명에서의 용어, “숙신산”은 HOOC-CH2CH2-COOH의 화학식을 갖는 무색의 주상 또는 관상 결정을 가지는 유기산이다. 숙신산은 TCA 회로를 구성하는 주요 유기산 중 하나로 카르복시산의 일종이다. TCA회로의 경우, 알파케토글루타르산이 탈수소화, 탈카르복시화되어 숙시닐조효소 A(succinyl Co-A)를 형성한 후, 다시 숙신산으로 전환되어 생성되며, 숙신산은 숙신산 탈수소효소에 의해 푸마르산으로 산화된다. 또한, 글리옥실산 회로의 경우, 이소시트르산이 이소시트르산 분해효소에 의해 숙신산 및 글리옥실산으로 전환되는 과정에서 숙신산이 생산되며, 글리옥실산은 글리옥실산 회로에 의해 말산, 옥살로아세트산, 시트르산의 과정을 거쳐 다시 이소시트르산으로 전환된다.
본 발명에서의 용어, “메탄자화균(methanotroph)”은 메탄을 주 탄소원 및 에너지원으로 사용하는 세균을 의미한다. 메탄의 산화경로를 이용하여 메탄을 CO2까지 완전히 산화함으로써 ATP를 획득한다. 메탄, 메탄올, 메틸아민 등의 탄소수 1개의 화합물을 에너지원으로 사용하는 메틸자화균(methylotroph) 중에서 메탄을 함께 사용할 수 있는 균주 또한 메탄자화균으로 간주한다.
본 발명에서의 용어, “배양”은 목적하는 세포 또는 조직 등을 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육하는 것을 의미한다. 인공적으로 조절하는 환경 조건은 대표적으로 영양소, 온도, 삼투압, pH, 기체 조성, 빛 등이 있으나, 직접적인 영향을 주는 것은 배지이며, 크게 액체배지와 고체배지로 나뉜다.
본 발명의 일 실시예에 의한 유기산의 제조 방법은 메탄자화균을 준비하는 준비 단계; 메탄자화균을 배지에 투입하여 30회 이상 배양하는 반복 배양 단계; 및 반복 배양 단계를 거친 메탄자화균을 메탄을 포함하는 반응용기에서 반응시켜 유기산을 생산하는 유기산 생산 단계를 포함한다.
이하에서는 각 단계별로 구체적으로 설명한다.
먼저, 준비 단계에서는 메탄자화균을 준비한다.
메탄자화균은 메탄을 주 탄소원으로 사용하여 유기산을 생산하는 균주이다. 구체적으로 메틸로모나스 속(Methylomonas), 메틸로박터 속(Methylobacter), 메틸로코커스 속(Methylococcus), 메틸로마이크로븀 속(Methylomicrobium), 메틸로스페라 속(Methylosphaera), 메틸로칼덤 속(Methylocaldum), 메틸로글로버스 속(Methyloglobus), 메틸로사르시나 속(Methylosarcina), 메틸로프로펀더스 속(Methyloprofundus), 메틸로썰머스 속(Methylothermus), 메틸로할로비우스 속(Methylohalobius), 메틸로게아 속(Methylogaea), 메틸로마리넘 속(Methylomarinum), 메틸로벌럼 속(Methylovulum), 메틸로마리노범 속(Methylomarinovum), 메틸로러브럼 속(Methylorubrum), 메틸로파라코커스 속(Methyloparacoccus), 메틸로시너스 속(Methylosinus), 메틸로시스티스 속(Methylocystis), 메틸로셀라 속(Methylocella), 메틸로캡사 속(Methylocapsa), 메틸로퍼룰라 속(Methylofurula), 메틸아시디필럼 속(Methylacidiphilum) 및 메틸아시디마이크로븀 속(Methylacidimicrobium)중 1종 이상을 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로 메틸로모나스 속, 보다 구체적으로 기탁번호 KCTC18400P로 기탁된 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1일 수 있다. 더욱 구체적으로 야생형 균주 게놈에 cre 유전자가 삽입 되어 있고 여기에 succinate dehydrogenase 유전자가 결손되어 있으며 isocitrate lyase 유전자와 malate synthase 유전자를 지닌 균주일 수 있다. 전술한 재조합 메탄자화균은 한국등록특허 제10-1954530호에 구체적으로 설명되어 있으므로, 구체적인 설명은 생략한다.
다음으로, 반복 배양 단계에서는 메탄자화균을 배지에 투입하여 30회 이상 배양한다.
배지는 메탄자화균을 배양할 수 있는 배지이면 특별히 제한되지 않으며, 액체배지 또는 고체배지일 수 있다. 구체적으로 NMS (nitrate mineral salt solution) 배지일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 30회 이상 반복 배양함으로써, 메탄자화균의 가스 소모 속도를 증진시키고, 동시에 유기산의 생산을 증가시킬 수 있다. 이는 메탄자화균을 반복배양하는 동안 미생물의 대사가 배양 조건에 좀 더 적합하도록 적응하였기 때문이다.
배양 횟수는 메탄자화균의 배양 이후, 배지에서 분리하고, 새로운 배지로 투입하는 것을 기준으로 한다. 배양 횟수가 너무 적을 시 충분한 효과를 얻기 어려울 수 있다. 배양 횟수를 증가시키더라도 가스 소모 속도를 증진 및 유기산의 생산을 증가에 한계가 있을 수 있다. 더욱 구체적으로 30 내지 70회 반복 배양할 수 있다. 더욱 구체적으로 40 내지 60회 반복 배양할 수 있다. 더욱 구체적으로 45 내지 55회 반복 배양할 수 있다.
반복 배양 단계에서 메탄을 20 내지 50 부피% 및 산소를 20 부피% 이하 포함하는 분위기에서 배양할 수 있다.
메탄은 메탄자화균이 생장하는데 필요한 탄소원이 된다. 메탄이 너무 적으면 메탄자화균이 생장하기 어려울 수 있다. 더욱 구체적으로 메탄을 25 내지 35 부피% 포함할 수 있다.
산소는 메탄을 메탄올로 전환하거나 미생물 대사에서 final electron accepter로 사용된다. 더욱 구체적으로 산소를 1 내지 20 부피% 포함할 수 있다.
나머지는 불활성 기체, 구체적으로 질소가 될 수 있다. 더욱 구체적으로 질소를 30 내지 80 부피% 포함할 수 있다.
반복 배양 단계에서 메탄자화균 투입시 OD600이 0.05 내지 0.5가 되도록 투입할 수 있다. 메탄자화균이 너무 적거나, 너무 많이 투입되면, 메탄자화균의 생장에 악영향을 줄 수 있다. 더욱 구체적으로 메탄자화균 투입시 OD600이 0.07 내지 0.2가 되도록 투입할 수 있다. OD600에 대해서는 널리 알려져 있으므로, 구체적인 설명은 생략한다.
반복 배양 단계에서 배양 1회시 OD600이 1 내지 2.5가 되도록 배양할 수 있다. 전술한 범위에서 배양함으로써, 메탄자화균의 가스 소모 속도를 더욱 증진시키고 유기산의 생산을 더욱 증가시킬 수 있다. 더욱 구체적으로 OD600이 1.3 내지 2.3이 되도록 배양할 수 있다.
전술한 OD600까지 배양하기 위해서는 배양 1회당 1 내지 5일간 배양할 수 있다.
메탄자화균의 배양 온도는 15℃ 내지 45℃, 구체적으로 20℃ 내지 40℃, 보다 구체적으로 25℃ 내지 35℃일 수 있으며, 메탄과 메탄자화균의 원활한 접촉을 위해, 150rpm 내지 300rpm, 구체적으로 180rpm 내지 270rpm, 보다 구체적으로 200rpm 내지 250rpm으로 교반할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
다음으로, 유기산 생산 단계에서는 메탄자화균을 메탄을 포함하는 반응용기에서 반응시켜 유기산을 생산한다.
이 때, 유기산은 숙신산 및 아세트산을 포함할 수 있다.
이 때, 분위기는 메탄을 20 내지 50 부피% 및 산소를 20 부피% 이하 포함할 수 있다.
메탄은 유기산을 생산하는데 필요한 탄소원이 된다. 메탄이 너무 적으면 유기산을 적절히 생산하기 어려울 수 있다. 메탄이 너무 많으면 배양중 미생물에 의해 소비되지 못하고 버려지는 메탄가스양이 많아지는 문제가 발생할 수 있다. 더욱 구체적으로 메탄을 25 내지 35 부피% 포함할 수 있다.
산소는 메탄을 메탄올로 바꾸는데 필요하거나 또는 미생물 대사의 final electron accepter로 사용된다. 산소가 너무 많으면 배양중 미생물에 의해 소비되지 못하고 버려지는 산소양이 많아지는 문제가 발생할 수 있다. 더욱 구체적으로 산소를 1 내지 20 부피% 포함할 수 있다.
나머지는 불활성 기체, 구체적으로 질소가 될 수 있다. 더욱 구체적으로 질소를 30 내지 80 부피% 포함할 수 있다.
전술한 혼합 가스를 100 내지 500mL/min의 속도로 공급할 수 있다.
온도는 15℃ 내지 45℃, 구체적으로 20℃ 내지 40℃, 보다 구체적으로 25℃ 내지 35℃일 수 있으며, 메탄과 메탄자화균의 원활한 접촉을 위해, 500rpm 내지 1000rpm, 구체적으로 750rpm 내지 900rpm으로 교반할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
이 때, 생산되는 숙신산 및 아세트산의 중량 비율(숙신산:아세트산)은 1:0.7 내지 1:1일 수 있다.
전술한 반복 배양 단계를 거치지 않은 메탄자화균에 비해 반복 배양 단계를 거친 메탄자화균이 숙신산을 1.5 내지 3배, 아세트산을 1.5 내지 3배 생산할 수 있다.
이하에서는 실험예를 통하여 본 발명을 좀더 상세하게 설명한다. 그러나 이러한 실험예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
하기 NMS 배지, 메탄자화균을 준비하였다.
NMS media (MgSO4·7H2O: 1.0 g/L, KNO3: 1.0 g/L, CaCl2·H2O　0.2 g/L, Fe-EDTA (wrapping by aluminum foil):　0.0038 g/L, NaMoO4·2H2O:　0.0005 g/L, FeSO4·7H2O:　0.0005 g/L, ZnSO4·7H2O:　0.0004 g/L, MnCl2:　0.00001 g/L, CoCl2·6H2O:　0.00005 g/L, NiCl2·6H2O:　0.00001 g/L, H3BO3 (boric acid)　0.000015 g/L, EDTA　0.00025 g/L, KH2PO4　0.26 g/L, Na2HPO4·7(H2O):　0.62 g/L, Biotin:　0.00002 g/L, Folic acid: 0.00002 g/L, Thiamine-HCl:　0.00005 g/L, Ca- pantothenate:　0.00005 g/L, Vitamin B12:　0.00001 g/L, Riboflavin:　0.00005 g/L, Nicotiamide:　0.00005 g/L)
Methylomonas sp . DH-1 (기탁번호 KCTC18400P) 야생형 균주 게놈에 cre 유전자가 삽입 되어 있고 여기에 succinate dehydrogenase 유전자가 결손되어 있으며 isocitrate lyase 유전자와 malate synthase 유전자를 지닌 균주. 이하 CS 균주로 표현.
반복 배양 Adaptive laboratory evolution (ALE)
CS 균주를 initial OD600이 0.1이 되도록 NMS 배지에 접종하고 30v% CH4, 3.5v% O2, 66.5v% N2 가스로 serum bottle의 head space를 치환한다. Serum bottle을 30℃ shaking incubator에서 2 ~ 3일 배양 후 이를 새로운 NMS 배지에 접종하고 위와 동일한 조성의 가스로 head space를 치환한 다음 다시 2~3 일을 배양한다. 이와 같은 방법으로 배양을 50번 반복하였다. 도 1은 배양 시간에 따른 OD600 그래프를 나타내었다.
미생물 gas fermentation
50번 계대한 균주 2ml을 200ml NMS 배지를 포함한 baffled flask에 접종하고 flask의 head space를 30v% CH4, 3.5v% O2, 66.5v% N2 가스로 치환하였다. 이를 30℃ shaking incubator에서 200 rpm으로 shaking하면서 2~3일간 배양하여 OD600 1.5 이상으로 키웠다. 이렇게 키운 flask culture를 initial OD600 0.1로 설정하여 3L NMS 배지를 포함한 fermeter에 접종하였다. 30v% CH4, 3.5v% O2, 66.5v% N2 조성을 가진 혼합가스를 300 ml/min의 속도로 스파져를 통해 공급하였다. 30℃, 800 rpm의 stirring 속도를 유지하면서 배양을 계속하였다. UV Spectrophotometer를 이용해 OD600 값을 측정하여 미생물의 성장을 판단하고 Quadrupole Mass를 이용해 미생물이 공급된 가스를 소모하는 속도를 측정하였다. 배양 중 일부 샘플을 이용해 HPLC 분석을 수행하여 유기산의 생산량을 모니터링 하였다.
실험예 1 : 가스소모속도 변화
도 2에서는 (A) ALE 이전의 메탄 소모 속도, (B) ALE 이전 산소 소모 속도, (C) ALE 이후 메탄 소모 속도, (D) ALE 이후 산소 소모 속도를 나타내었다.
도 2에서 나타나듯이, ALE 이전의 메탄 가스 소모 속도의 경우 배양 ~ 27 hr 시점에 4.47 mmol/L/hr 까지 증가하였다. 이후 가스 소모 속도는 빠르게 감소하기 시작한다. 반면에 ALE 과정을 거친 셀을 배양하는 경우 배양 13 ~ 65 시간 사이에서 높은 가스 소모 속도가 유지 되며 그 최대 값은 6.30 mmol/L/h로 약 40% 증가하였다.
실험예 1에서 나타나듯이, 장시간 안정적인 가스 소모 패턴은 메탄자화균을 산업적으로 응용함에 있어 매우 유용한 특징이다.
실험예 2 : 성장 변화
미생물의 생장 곡선을 위해 UV spectrophotometer를 이용해 600 nm 파장에서 optical density (OD600)을 측정하였다.
도 3에서는 ALE 이전 및 이후의 (A) 미생물 생장 곡선 (OD600, linear scale) (B) 미생물 생장 곡선 (log scale)을 나타내었다.
도 3에서 나타나듯이, ALE 이전과 이후의 성장 곡선을 비교하였을 때 접종 후 7시간 전까지 생장 초반에는 큰 차이가 없는 것으로 보이나 이후 mid-exponential phase에서는 ALE 50번을 거친 미생물이 더 빠른 성장을 보이며 maximum OD600도 3.3에서 11.9로 3.6배 증가하였다.
실험예 3 : 유기산 생성 패턴 변화
도 4에서는 (A) ALE 이전, (B) ALE 50번 이후의 유기산 생산 패턴을 나타내었다.
도 4에서 나타나듯이, ALE를 거치기 전의 미생물은 fermenter culture 중 숙신산 생산 maximum titer가 230 mg/L, 아세트산 생산 maximum titer는 143 mg/L로 측정되었다. 반면, 50번의 ALE를 거친 미생물을 seed로 사용한 경우 숙신산 titer가 최대 509 mg/L로 2.2배 증가하였고 아세트산이 419 mg/L로 2.93배 증가하는 패턴을 나타내었다.
이처럼, ALE와 실험방법에 쓰인 fermenter 배양을 통해 숙신산과 아세트산의 생산을 동시에 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있다.
본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (9)

  1. 메틸로모나스 속(Methylomonas sp.) DH-1 (기탁번호 KCTC18400P) 야생형 균주 게놈에 cre 유전자가 삽입 되어 있고 여기에 숙신산 탈수소효소 (succinate dehydrogenase) 유전자가 결손되어 있으며 이소시트르산 분해효소 (isocitrate lyase) 유전자와 산 합성효소 (malate synthase) 유전자를 지닌 메탄자화균을 준비하는 준비 단계;
    상기 메탄자화균을 배지에 투입하여 40회 내지 60회 배양하는 반복 배양 단계; 및
    상기 반복 배양 단계를 거친 상기 메탄자화균을 메탄을 포함하는 반응용기에서 반응시켜 숙신산 및 아세트산을 생산하는 유기산 생산 단계를 포함하고,
    상기 반복 배양 단계에서 메탄을 20 내지 50 부피% 및 산소를 1 내지 20 부피% 및 나머지 질소를 포함하는 분위기에서 배양하는 메탄자화균을 이용한 유기산의 제조 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 반복 배양 단계에서 메탄자화균 투입시 OD600이 0.05 내지 0.5가 되도록 투입하는 메탄자화균을 이용한 유기산의 제조 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    반복 배양 단계에서 배양 1회시 OD600이 1 내지 2.5가 되도록 배양하는 메탄자화균을 이용한 유기산의 제조 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    반복 배양 단계에서 배양 1회당 1 내지 5일간 배양하는 메탄자화균을 이용한 유기산의 제조 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    유기산 생산 단계에서 메탄을 20 내지 50 부피% 및 산소를 20 부피% 이하 포함하는 반응용기에서 반응시키는 메탄자화균을 이용한 유기산의 제조 방법.
KR1020200130331A 2020-10-08 2020-10-08 메탄자화균을 이용한 유기산의 제조 방법 KR102530483B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200130331A KR102530483B1 (ko) 2020-10-08 2020-10-08 메탄자화균을 이용한 유기산의 제조 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200130331A KR102530483B1 (ko) 2020-10-08 2020-10-08 메탄자화균을 이용한 유기산의 제조 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220046971A KR20220046971A (ko) 2022-04-15
KR102530483B1 true KR102530483B1 (ko) 2023-05-09

Family

ID=81211874

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200130331A KR102530483B1 (ko) 2020-10-08 2020-10-08 메탄자화균을 이용한 유기산의 제조 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102530483B1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016136972A (ja) 2010-12-28 2016-08-04 合同会社パラ微生物研究所 微生物の新規な培養方法、新規な元素構成を有する微生物細胞を製造する方法、及び製造された微生物
KR101954530B1 (ko) 2017-09-13 2019-05-23 경희대학교 산학협력단 메탄을 이용하여 숙신산을 생성하는 재조합 미생물 및 이의 용도
KR102112286B1 (ko) * 2018-12-05 2020-05-19 서울대학교산학협력단 내산성 관련 유전자 및 이를 포함하는 메탄자화균

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190033890A (ko) * 2017-09-22 2019-04-01 이화여자대학교 산학협력단 메탄 및 악취 동시 분해용 미생물제제 및 이를 이용한 메탄 및 악취 동시 분해 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016136972A (ja) 2010-12-28 2016-08-04 合同会社パラ微生物研究所 微生物の新規な培養方法、新規な元素構成を有する微生物細胞を製造する方法、及び製造された微生物
KR101954530B1 (ko) 2017-09-13 2019-05-23 경희대학교 산학협력단 메탄을 이용하여 숙신산을 생성하는 재조합 미생물 및 이의 용도
KR102112286B1 (ko) * 2018-12-05 2020-05-19 서울대학교산학협력단 내산성 관련 유전자 및 이를 포함하는 메탄자화균

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220046971A (ko) 2022-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Biebl Fermentation of glycerol by Clostridium pasteurianum—batch and continuous culture studies
Mathews et al. Metabolic pathway engineering for enhanced biohydrogen production
Hansen Carbon metabolism of sulfate-reducing bacteria
CN108779429A (zh) 单加氧酶的功能性表达和使用方法
CN104884609B (zh) 重组细胞、以及异戊二烯的生产方法
IL148762A (en) Preparation of 1,3- propanediol by fermentaiton of glycerol
Krishnan et al. Recent advances in process improvement of dark fermentative hydrogen production through metabolic engineering strategies
KR101954530B1 (ko) 메탄을 이용하여 숙신산을 생성하는 재조합 미생물 및 이의 용도
Liang et al. Bioconversion of volatile fatty acids from organic wastes to produce high-value products by photosynthetic bacteria: A review
KR102530483B1 (ko) 메탄자화균을 이용한 유기산의 제조 방법
KR102550049B1 (ko) 메탄자화균을 이용한 유기산의 제조 방법
KR20210036298A (ko) 메탄으로부터 탄소 수 4 이상인 화합물을 생산하는 방법 및 조성물
Oh et al. Biohydrogen production from carbon monoxide and water by Rhodopseudomonas palustris P4
KR101875564B1 (ko) 포도당 및 글리세롤을 이용한 유가식 배양을 통한 리시놀레산으로 오메가-하이드록시운덱-9-에논산의 생물전환공정
Grimm et al. Biocatalytic applications of autotrophic organisms
CN101029316B (zh) 大肠杆菌生产琥珀酸的方法
US9650651B2 (en) Method for production of n-propanol and other C3-containing products from syngas by symbiotic co-cultures of anaerobic microorganisms
KR101781294B1 (ko) 글리세롤을 탄소원으로 이용하는 고생장성 대장균
WO2021254927A1 (en) Methods for producing biotin in genetically modified microorganisms
CN114214219A (zh) 一种利用甲酸根助力游离脂肪酸生产的基因工程菌
US20100003734A1 (en) Production of recombinant photosynthetic bacteria which produces molecular hydrogen in a light independent manner and hydrogen evolution method using above strain
Maman et al. Biohydrogen production–An overview on the factors affecting, microbes and enzymes involved
Schmidt Applications of mixed microbial cultures in industrial biotechnology
KR102245145B1 (ko) 바이오매스 생산능이 향상된 형질전환체 및 이를 이용한 바이오매스 생산 방법
CN118048246B (zh) 一种生产pha的重组罗氏真养菌及其构建方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant