CN109072172A

CN109072172A - 用于厌氧产生L-天冬氨酸和β-丙氨酸的重组宿主细胞和方法

Info

Publication number: CN109072172A
Application number: CN201680076240.7A
Authority: CN
Inventors: J·迪特里希
Original assignee: Lygos Inc
Current assignee: Lygos Inc
Priority date: 2015-11-12
Filing date: 2016-11-11
Publication date: 2018-12-21
Also published as: CA3042854A1; EP3374505A1; WO2017083683A1; AU2016353242A1; EP3374505A4

Abstract

用于在基本上厌氧的条件下生物产生L‑天冬氨酸和/或β‑丙氨酸的重组宿主细胞、材料和方法。

Description

用于厌氧产生L-天冬氨酸和β-丙氨酸的重组宿主细胞和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年11月12日提交的标题为“RECOMBINANT HOST CELLS ANDMETHODS FOR THE ANAEROBIC PRODUCTION OF L-ASPARTATE AND BETA-ALANINE”的美国临时专利申请系列号62/254,635的优先权，其完整公开内容通过引用明确地并入本文。

政府利益

本发明是在美国能源部授予的授予号DE-EE0007565的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。

背景技术

与石油化学工业相关的长期经济和环境顾虑已为增加对用于使碳原料转化成可替代由石油原料产生的化学品的化学品的方法的研究、开发和商业化提供推动力。一种方法是开发用以使可再生原料转化成可替代石油衍生化学品的产品的生物精制方法。改进生物精制方法的两个共同目标包括实现较低生产成本和降低二氧化碳排放。

天冬氨酸(“L-天冬氨酸酯”，CAS号56-84-8)目前是由富马酸(不可再生的石油衍生的化学原料)产生的。同样，β-丙氨酸(CAS编号107-96-9)由丙烯酰胺(另一种不可再生的石油原料)产生。

工业合成L-天冬氨酸和L-天冬氨酸衍生的化合物的当前优选途径是基于富马酸的。例如，其中L-天冬氨酸氨裂解酶催化由富马酸和氨形成L-天冬氨酸的酶促过程(参见“Amino Acids,”In:Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry,Wiley-VCH,Weinheim,New York(2002))。

现有的基于石化的L-天冬氨酸和β-丙氨酸产生路线是环境破坏性的，取决于不可再生的原料，并且是昂贵的。因此，仍然需要用于将可再生原料生物催化转化成L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸并纯化生物合成的L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸的方法和材料。

发明概述

在第一方面，本发明提供了能够在基本上厌氧的条件下产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸的重组宿主细胞，所述宿主细胞包含一种或多种编码L-天冬氨酸途径酶和任选地(在产生β-丙氨酸的宿主细胞的情况下)L-天冬氨酸1-脱羧酶的异源核酸。在一个实施方案中，重组宿主细胞已经工程化以在基本上厌氧的条件下产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸。

在本发明的方法的实践中可以使用任何合适的宿主细胞，用于本文提供的组合物和方法的示例性宿主细胞包括古细菌、原核或真核细胞。在一个重要的实施方案中，重组宿主细胞是酵母细胞。在某些实施方案中，本文提供的重组酵母细胞通过将一个或多个遗传修饰(包括例如编码酶的异源核酸和/或编码酶的天然核酸的破坏或缺失)引入Crabtree阴性酵母细胞。在某些这些实施方案中，宿主细胞属于毕赤酵母属(Pichia)/伊萨酵母属(Issatchenkia)/Saturnispora/德克酵母属(Dekkera)进化枝。在某些这些实施方案中，宿主细胞属于选自毕赤酵母属、伊萨酵母属或念珠菌属的属。在某些实施方案中，宿主细胞属于毕赤酵母属，并且在这些实施方案的一些中，宿主细胞是库德里阿兹威毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)。

本文在某些实施方案中提供了具有至少一种从磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸到L-天冬氨酸的活性L-天冬氨酸途径的重组宿主细胞。在其中宿主细胞产生β-丙氨酸的一些实施方案中，重组宿主细胞进一步表达L-天冬氨酸1-脱羧酶。在某些实施方案中，本文提供的重组宿主细胞具有经由磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸和草酰乙酸中间体进行的L-天冬氨酸途径。在许多实施方案中，重组宿主细胞包含一种或多种编码一种或多种选自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和L-天冬氨酸脱氢酶的L-天冬氨酸途径酶的异源核酸，其中异源核酸以足以在基本厌氧的条件下产生L-天冬氨酸的量表达。在其他实施方案中，重组宿主细胞包含一种或多种编码一种或多种选自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和L-天冬氨酸脱氢酶的L-天冬氨酸途径酶的异源核酸，其中异源核酸以足以在好氧条件下产生L-天冬氨酸的量表达。在一个实施方案中，重组宿主细胞包含编码选自丙酮酸羧化酶和L-天冬氨酸脱氢酶的一种或多种L-天冬氨酸途径酶的一种或多种异源核酸，其中异源核酸以足以在基本上厌氧的条件下产生L-天冬氨酸的量表达。在一个实施方案中，重组宿主细胞包含编码选自丙酮酸羧化酶和L-天冬氨酸脱氢酶的一种或多种L-天冬氨酸途径酶的一种或多种异源核酸，其中异源核酸以足以在好氧条件下产生L-天冬氨酸的量表达。在某些实施方案中，细胞还包含编码L-天冬氨酸1-脱羧酶的异源核酸，其中所述异源核酸以足以在基本厌氧的条件下产生β-丙氨酸的量表达。

在一些实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含编码L-天冬氨酸脱氢酶的异源核酸。在某些实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含编码铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)L-天冬氨酸脱氢酶(SEQ ID NO：1)的异源核酸并且能够产生L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸。在其他实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含编码Cupriavidustaiwanensis L-天冬氨酸脱氢酶的异源核酸(SEQ ID NO：2)并且能够产生L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸。

在各种实施方案中，重组宿主细胞还包含编码L-天冬氨酸1-脱羧酶的异源核酸，并且能够在合适条件下培养时产生β-丙氨酸。本文使用的L-天冬氨酸1-脱羧酶是指具有L-天冬氨酸脱羧酶活性(意指催化L-天冬氨酸脱羧成β-丙氨酸的能力)的任何蛋白质。在各种实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含一种或多种编码选自枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ ID NO：5)，棒状杆菌(Corynebacterium)L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ ID NO：4)和/或赤拟谷盗(Tribolium castaneum)L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ ID NO：3)的L-天冬氨酸1-脱羧酶的异源核酸并且能够产生β-丙氨酸。

在各种实施方案中，适合根据本发明的方法使用的L-天冬氨酸脱氢酶具有L-天冬氨酸脱氢酶活性并且包含与SEQ ID NO：14具有至少55％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在各种实施方案中，适合根据本发明的方法使用的L-天冬氨酸1-脱羧酶具有L-天冬氨酸1-脱羧酶活性并且包含与SEQ ID NO：15和/或16具有至少40％，至少45％，至少50％或至少55％序列同一性的氨基酸序列。

在第二方面，本发明提供了经遗传修饰以缺失内源蛋白质或以其他方式降低内源蛋白质活性的宿主细胞。乙醇发酵途径和编码乙醇发酵途径酶的核酸的缺失或破坏对于工程化能够在基本上厌氧的条件下有效产生L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸的重组宿主细胞是重要的。在各种实施方案中，包含编码乙醇发酵途径酶的一种或多种核酸的缺失或破坏的重组宿主细胞使乙醇产量减少至少10％，至少25％，至少50％，至少60％，至少70％，至少90％，至少95％或至少99％，与不包含该遗传修饰的亲本细胞相比。

在多个实施方案中，重组宿主细胞包含编码选自丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶和/或苹果酸脱氢酶的酶的一种或多种核酸的缺失或破坏。

在第三方面，本发明提供了用于通过本发明的重组宿主细胞产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸的方法。在某些实施方案中，这些方法包括在基本上厌氧的条件下在含有至少一种碳源和一种氮源的培养基中培养本文所述的重组宿主细胞以产生L-天冬氨酸的步骤。在各种实施方案中，选择条件以产生约0-25mmol/l/hr的氧摄取率。在一些实施方案中，选择条件以产生约2.5-15mmol/l/hr的氧摄取率。在其他实施方案中，这些方法包括在好氧条件下在含有至少一种碳源和一种氮源的培养基中培养本文所述的重组宿主细胞以产生L-天冬氨酸的步骤。

附图简述

图1提供了本发明提供的L-天冬氨酸途径酶和L-天冬氨酸1-脱羧酶的示意图。草酰乙酸向L-天冬氨酸的转化由L-天冬氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.21)催化，L-天冬氨酸向β-丙氨酸的转化由L-天冬氨酸1-脱羧酶(EC 4.1.1.11)催化。本发明提供的草酰乙酸形成酶包括丙酮酸羧化酶(EC 6.4.1.1)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(EC 4.1.1.31)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(EC 4.1.1.49)。丙酮酸转化为草酰乙酸由丙酮酸羧化酶催化；磷酸烯醇丙酮酸向草酰乙酸的转化由磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和/或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶催化。

发明详述

本发明提供了用于在基本上厌氧的条件下生物产生L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸的重组宿主细胞、材料和方法。

尽管本发明在本文中关于其方面和特定实施方案加以描述，但本领域技术人员将认识到可进行各种变化且可用等效物进行替代而不脱离本发明。本发明不限于特定核酸、表达载体、酶、生物合成途径、宿主微生物或方法，因为所述各物可改变。本文中使用的术语是仅出于描述特定方面和实施方案的目的，且不应解释为具有限制性。此外，可根据本发明进行许多修改以适应特定情况、材料、物质组成、方法、一个或多个工艺步骤。所有所述修改都在随附于此的权利要求的范围内。

本文引用的所有专利、专利申请和出版物以引用的方式整体并入本文。

第1部分：定义

在本说明书中和在随后权利要求中，将提及将被定义为具有以下含义的许多术语。

如说明书和随附权利要求中所用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述”包括复数个指示物。因此，举例来说，提及“表达载体”包括单个表达载体以及多个相同(例如相同操纵子)或不同的表达载体；提及“细胞”包括单个细胞以及多个细胞；等。

术语“登录号”以及诸如“蛋白质登录号”，“UniProt ID”，“基因ID”，“基因登录号”等类似术语是指对特定蛋白质或基因的指定。这些标识符描述了可公开访问的数据库(如NCBI)中的基因或酶序列。

共有序列中的短划线(-)表示在指定位置不存在氨基酸。共有序列中的加号(+)表示在指定位置可能存在任何氨基酸。因此，本文共有序列中的加号表示氨基酸通常不保守的位置；当与共有序列比对时，同源酶序列在指定的“+”位可以具有任何氨基酸。

如本文所用，术语“表达”在与编码酶的核酸或细胞中的酶本身关联使用时是指可为内源性或外源性(异源)酶的所述酶是在所述细胞中产生。在这些情形下，术语“过表达”是指在内源性酶的情况下，相较于野生型，酶是以较高水平产生，即酶水平增加。本领域技术人员了解的是酶的过表达可通过以下方式来实现：增加用于驱动编码序列的表达的启动子的强度或改变所述启动子的类型，增加核糖体结合位点或Kozak序列的强度，增加mRNA转录物的稳定性，改变密码子使用，增加酶的稳定性等。

术语“表达载体”或“载体”是指以下核酸和/或组合物：其包含可例如通过转导、转化或感染引入宿主细胞中，以使所述细胞接着产生(“表达”)不同于为所述细胞天然具有的核酸和/或蛋白质，或在某种意义上不为所述细胞天然具有的含于如此引入的核酸中或由如此引入的核酸编码的核酸和/或蛋白质的核酸。因此，“表达载体”含有待由宿主细胞表达的核酸(通常是DNA)。任选地，表达载体可含于用以有助于实现核酸进入宿主细胞中的材料中，如与病毒、脂质体、蛋白质包衣等相关的材料。适合用于本发明的各种方面和实施方案中的表达载体包括核酸序列可或已连同任何优选或所需操作元件一起插入其中的表达载体。因此，表达载体可被转移至宿主细胞中且通常在其中复制(但在一些实施方案中，也可采用提供“短暂”表达的非可复制载体)。在一些实施方案中，采用整合至染色体、线粒体或质粒DNA中的表达载体。在其它实施方案中，采用在染色体外复制的表达载体。典型表达载体包括质粒，且表达载体通常含有为转录载体中的核酸所需的操作元件。所述质粒以及其它表达载体在本文中加以描述或为本领域普通技术人员所熟知。

术语“发酵(ferment)”、“发酵性(fermentative)”和“发酵(fermentation)”在本文中用于描述在用以产生有用化学品的条件下培养微生物，所述条件包括但不限于发生微生物生长所处的好氧或厌氧条件。

如本文所用的术语“异源”是指物质不为细胞天然具有。举例来说，如果以下至少一者是成立的，那么核酸对于细胞而言是异源的，因此就那个细胞而言是“异源核酸”：(a)所述核酸不天然见于那个细胞中(也就是说它是“外源性”核酸)；(b)所述核酸天然见于给定宿主细胞中(也就是说“内源性”)，但所述核酸或由这个核酸的转录和翻译产生的RNA或蛋白质是以非天然(例如大于或小于天然存在)量在所述宿主细胞中产生或存在；(c)所述核酸包含编码宿主细胞内源性蛋白质，但在序列方面不同于编码相同蛋白质(具有相同或大致上相同氨基酸序列)的内源性核苷酸序列的核苷酸序列，从而通常导致蛋白质在细胞中以较大量产生，或在酶的情况下，产生具有改变的(例如较高或较低或不同)活性的突变形式；和/或(d)所述核酸包含两个或更多个不以相同彼此关系见于细胞中的核苷酸序列。作为另一实例，如果蛋白质是通过翻译RNA产生或相应RNA是通过转录异源核酸产生，那么所述蛋白质对于宿主细胞而言是异源的；如果蛋白质是内原性蛋白质的突变形式，且突变是通过遗传工程化引入，那么所述蛋白质对于宿主细胞而言也是异源的。

术语“同源”及其变体例如“同源性”是指核酸或氨基酸序列的相似性，通常在基因的编码序列或蛋白质的氨基酸序列的背景下。可以使用已知氨基酸或编码序列(“参考序列”)对有用蛋白质进行同源性检索，以鉴定具有相似序列并因此可能执行与由参考序列鉴定的蛋白质相同的有用功能的同源编码序列或蛋白质。如本领域技术人员将理解的，通过例如但不限于BLAST(blast.ncbi.nlm.nih.gov)搜索确定的与参考蛋白具有大于90％同一性的蛋白是高度可能与参考蛋白质进行相同的生化反应的。在一些情况下，具有大于20％同一性的两种酶将进行相同的生物化学反应，并且同一性越高，即40％或80％的同一性，这两种蛋白质越有可能具有相同或相似的功能。如本领域技术人员将理解的，可以通过BLAST搜索来鉴定同源酶。

术语“宿主细胞”与“宿主微生物”在本文中可互换用于指代可(或已)通过插入表达载体加以转化的活细胞。如本文所述的宿主微生物或细胞可为原核细胞(例如真细菌界的微生物)或真核细胞。如本领域技术人员所将了解，原核细胞缺乏膜束缚的核，而真核细胞具有膜束缚的核。

术语“分离的”或“纯净的”是指物质大致上(例如大于50％或大于75％或基本上例如大于90％、95％、98％或99％)不含在它的天然状态下通常伴随它的组分，所述天然状态例如是它天然所见的状态或当它最初被产生时它所存在的状态。

如本文所用，术语“核酸”及其变化形式将为聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)和聚核糖核苷酸(含有D-核糖)所通用。“核酸”也可指作为嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷的任何其它类型的聚核苷酸以及含有非核苷酸骨架的其它聚合物，前提是聚合物含有呈允许如DNA和RNA中所见的碱基配对和碱基堆积的构型的核苷碱基。如本文所用，核苷酸和聚核苷酸的符号是由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Commission of BiochemicalNomenclature)(Biochem.9:4022,1970)推荐的符号。“核酸”在本文中也可关于它的序列(即不同核苷酸在核酸中出现的次序)加以提及，因为核酸中的核苷酸序列通常限定它的生物活性，例如如在编码区域的序列中，即基因中主要由启动子和编码区域组成的核酸，所述编码区域编码基因的产物，其可为RNA(例如rRNA、tRNA或mRNA)或蛋白质(当基因编码蛋白质时，所述mRNA与所述蛋白质两者均是那个基因的“基因产物”)。

术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(如启动子、核糖体结合位点和转录终止子)与第二核酸序列、编码序列或编码区域之间的功能性键联，其中所述表达控制序列引导或另外调控所述编码序列的转录和/或翻译。

如本文所用的术语“任选的”或“任选地”是指随后描述的特征或结构可或可不存在，或随后描述的事件或事项可或可不发生，且描述包括特定特征或结构存在的情况和所述特征或结构不存在的情况，或事件或事项发生的情况以及它不发生的情况。

如本文所用，“重组”是指通过人介入来改变遗传物质。通常，重组是指通过分子生物学(重组DNA技术)方法，包括克隆和重组来操作细胞或病毒或表达载体中的DNA或RNA。重组也可指通过随机或定向突变诱发来操作细胞或病毒中的DNA或RNA。“重组”细胞或核酸可通常关于它如何不同于天然存在的对应物(“野生型”)加以描述。此外，对已“工程化”或“修饰”的细胞或核酸以及那些术语的变化形式的任何提及都意图指代重组细胞或核酸。

如本文所用的术语“转导”、“转化”、“转染”及其变化形式是指将一种或多种核酸引入细胞中。出于实际目的，对于待称为“被转导”、“被转化”或“被转染”细胞的细胞而言，核酸必须由细胞稳定维持或复制足以使得它编码的功能或产物能够表达的时期。如将为本领域技术人员所了解，核酸的稳定维持或复制可通过将核酸的序列并入细胞染色体DNA(例如基因组)中(如通过染色体整合而发生)，或通过染色体外复制(如用自由复制质粒来发生)来进行。当病毒具有“感染性”时，它可被稳定维持或复制：当它转导宿主微生物时，复制且(不利用任何互补病毒或载体)向其它微生物散布子代表达载体，例如与原始转导表达载体具有相同类型的病毒，其中所述子代表达载体具有相同繁殖能力。

如本文所用，“L-天冬氨酸”旨在表示具有化学式C₄H₅NO₄且分子量为131.10g/mol的氨基酸(CAS#56-84-8)。如本文所述的L-天冬氨酸可以是盐、酸、碱或衍生物，这取决于结构、pH和存在的离子。术语“L-天冬氨酸盐”、“L-天冬氨酸”，“L-天冬氨酸酯”和“天冬氨酸”在本文中可互换使用。

如本文所用，β-丙氨酸旨在表示具有化学式C₃H₆NO₂和88.09g/mol的分子量的β氨基酸(CAS#107-95-9)。如本文所述的β-丙氨酸可以是盐、酸、碱或衍生物，这取决于结构、pH和存在的离子。β-丙氨酸也被称为“β-丙氨酸”，“3-氨基丙酸”和“3-氨基丙酸酯”，并且这些术语在本文中可互换使用。

如本文所使用的，当涉及培养或生长条件使用时，术语“基本上厌氧的”旨在表示氧的量小于液体培养基中溶解氧的饱和度的约10％。该术语还旨在包括液体或固体生长培养基的密封室，其保持在低于约1％的氧的气氛中。

第2部分：用于产生L-天冬氨酸和β-丙氨酸的重组宿主细胞

2.1宿主细胞

在一个方面，本发明提供了能够在基本上厌氧的条件下产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸的重组宿主细胞，所述宿主细胞包含一种或多种编码L-天冬氨酸途径酶和任选地(在产生β-丙氨酸的宿主细胞的情况)L-天冬氨酸1-脱羧酶的异源核酸。在一个实施方案中，重组宿主细胞已经工程化以在基本上厌氧的条件下产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸。在另一个实施方案中，重组宿主细胞在基本上厌氧的条件下天然产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸。在另一个实施方案中，重组宿主细胞已被工程化以在好氧条件下产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸。

在本发明的方法的实践中可以使用任何合适的宿主细胞，用于本文提供的组合物和方法的示例性宿主细胞包括古细菌、原核或真核细胞。

2.1.1酵母细胞

在一个重要的实施方案中，重组宿主细胞是酵母细胞。酵母细胞是用于构建重组代谢途径的优良宿主细胞，其包含催化小分子产物产生的异源酶。已经建立了分子生物学技术和编码酵母表达载体构建所必需的遗传元件(包括但不限于启动子，复制起点，抗生素抗性标记，营养缺陷型标记，终止子等)的核酸。其次，通过同源重组将核酸整合/插入酵母染色体的技术已经很完善。酵母还提供了许多作为工业发酵宿主的优点。酵母细胞通常可以耐受高浓度的有机酸并在低pH下维持细胞活力，并且可以在好氧和厌氧培养条件下生长，并且存在确定的发酵液和发酵方案。菌株在基本上厌氧的条件下繁殖和/或产生所需产物的能力提供了关于本发明的许多优点。首先，当向宿主细胞供应碳水化合物碳源时，该特征导致有效的产物生物合成。其次，从工艺的角度来看，在基本上厌氧的条件下进行发酵的能力降低了生产成本。

在各种实施方案中，可用于本发明方法的酵母细胞包括选自由以下组成的非限制性组的属的酵母：Aciculoconidium，Ambrosiozyma，Arthroascus，Arxiozyma，Ashbya，Babjevia，Bensingtonia，Botryoascus，Botryozyma，酒香酵母属(Brettanomyces)，布氏弹孢酵母属(Bullera)，Bulleromyces，假丝酵母属(Candida)，固囊酵母属(Citeromyces)，Clavispora，隐球酵母属(Cryptococcus)，Cystofilobasidium，德巴利氏酵母属(Debaryomyces)，德克酵母属(Dekkara)，Dipodascopsis，双足囊菌属(Dipodascus)，Eeniella，Endomycopsella，丝囊霉属(Eremascus)，假囊酵母属(Eremothecium)，Erythrobasidium，Fellomyces，Filobasidium，Galactomyces，地霉(Geotrichum)，小季氏酵母属(Guilliermondella)，有孢汉逊氏酵母属(Hanseniaspora)，汉逊氏酵母属(Hansenula)，Hasegawaea，胶珊瑚属(Holtermannia)，Hormoascus，Hyphopichia，Issatchenkia，克勒克氏酵母属(Kloeckera)，克勒克氏孢属(Kloeckeraspora)，克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)，Kondoa，Kuraishia，Kurtzmanomyces，白冬孢酵母属(Leucosporidium)，油脂酵母属(Lipomyces)，洛德酵母属(Lodderomyces)，鳞斑霉属(Malassezia)，梅奇酵母属(Metschnikowia)，Mrakia，Myxozyma，拿逊酵母属(Nadsonia)，Nakazawaea，针孢酵母属(Nematospora)，Ogataea，卵孢酵母属(Oosporidium)，管囊酵母属，achysolen)，Phachytichospora，Phaffia，毕赤酵母属，(Pichia)，红冬孢酵母属(Rhodosporidium)，红酵母属(Rhodotorula)，糖酵母属(Saccharomyces)，类糖酵母属(Saccharomycodes)，复膜孢糖酵母属(Saccharomycopsis)，Saitoella，Sakaguchia，Saturnospora，裂芽酵母属(Schizoblastosporion)，裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)，许旺氏酵母属(Schwanniomyces)，锁掷酵母属(Sporidiobolus)，掷孢酵母属(Sporobolomyces)，Sporopachydermia，Stephanoascus，梗孢酵母属(Sterigmatomyces)，Sterigmatosporidium，Symbiotaphrina，Sympodiomyces，Sympodiomycopsis，有孢圆酵母属(Torulaspora)，Trichosporiella，丝孢酵母属(Trichosporon)，三角酵母属(Trigonopsis)，Tsuchiyaea，Udeniomyces，Waltomyces，威克酵母属(Wickerhamia)，拟威克酵母属(Wickerhamiella)，Williopsis，Yamadazyma，Yarrowia，Zygoascus，接合糖酵母属(Zygosaccharomyces)，Zygowilliopsis，和Zygozyma等。

在各种实施方案中，酵母细胞是选自由以下组成的非限制性组的种：白色念珠菌(Candida albicans)，嗜酒念珠菌(Candida ethanolica)，季也蒙念珠菌(Candidaguilliermondii)，克柔念珠菌(Candida krusei,)，溶脂念珠菌(Candida lipolytica)，Candida methanosorbosa，萨纳瑞西斯假丝酵母(Candida sonorensis)，热带念珠菌(Candida tropicalis)，产蛋白念珠菌(Candida utilis)，弯曲隐球酵母(Cryptococcuscurvatus)，多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)，东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)，耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)，Komagataella pastoris，斯氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)，安格斯毕赤酵母(Pichiaangusta)，Pichia deserticola，Pichia galeiformis，Pichia kodamae，库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)，膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)，Pichiamethanolica，Pichia pastoris，Pichia salictaria，Pichia stipitis，Pichiathermotolerans，Pichia trehalophila，红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)，粘红酵母(Rhodotorula glutinis)，Rhodotorula graminis，贝酵母(Saccharomycesbayanus)，Saccharomyces boulardi，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，Saccharomyces kluyveri，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。本领域技术人员将认识到，该列表涵盖最广泛意义上的酵母。

在某些实施方案中，本文提供的重组酵母细胞通过将一个或多个遗传修饰(包括例如编码酶的异源核酸和/或编码酶的天然核酸的破坏或缺失)引入到Crabtree阴性酵母细胞中来工程化。在某些这些实施方案中，宿主细胞属于毕赤酵母属/伊萨酵母属/Saturnispora/德克酵母属进化枝。在某些这些实施方案中，宿主细胞属于选自毕赤酵母属、伊萨酵母属或念珠菌属的属。在某些实施方案中，宿主细胞属于毕赤酵母属，并且在这些实施方案的一些中，宿主细胞是库德里阿兹威毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)。

在某些实施方案中，本文提供的重组宿主细胞通过将一种或多种遗传修饰引入Crabtree阳性酵母细胞中而工程化。在某些这些实施方案中，宿主细胞属于Saccharomycesclad。在某些这些实施方案中，宿主细胞属于选自酵母属、汉逊酵母属和克鲁维酵母属的属。在某些实施方案中，宿主细胞属于酵母属(Saccharomyces)，并且在这些实施方案之一中，宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

毕赤酵母属/伊萨酵母属/Saturnispora/德克酵母属或酵母属进化枝的成员可以通过使用Kurtzman C.P.和Robnett C.J.(“Identification and Phylogeny ofAscomycetous Yeasts from Analysis of Nuclear Large Subunit(26S)Ribosomal DNAPartial Sequences”,Atonie van Leeuwenhoek 73(4):331-371；1998)描述的方法分析其26S核糖体DNA来鉴定。Kurtzman和Robnett报道分析了大约500个子囊菌酵母菌(ascomycetous yeast)，分析了大亚基(26S)核糖体DNA的可变D1/D2结构域的分歧程度。与进化枝外的宿主细胞相比，由进化枝涵盖的宿主细胞在26S核糖体亚基DNA的D1/D2结构域中显示与进化枝内的其他宿主细胞更大的序列同一性。因此，可以使用Kurtzman和Robnett的方法来鉴定作为进化枝成员的宿主细胞(例如，毕赤酵母属/伊萨酵母属/Saturnispora/德克酵母属或酵母属进化枝)。

2.1.2其他宿主细胞

除酵母细胞以外的重组宿主细胞也适合根据本发明的方法使用，只要工程化宿主细胞能够在基本上厌氧的条件下生长和/或形成产物。举例说明性实例包括各种真核、原核和古细菌宿主细胞。由本发明提供的真核宿主细胞的举例说明性实例包括，但不限于属于以下属的细胞：曲霉属(Aspergillus)，隐甲藻属(Crypthecodinium)，小克银霉属(Cunninghamella)，虫霉属(Entomophthora)，被孢霉属(Mortierella)，毛霉属(Mucor)，脉孢菌属(Neurospora)，腐霉属(Pythium)，裂殖壶菌属(Schizochytrium)，破囊壶菌属(Thraustochytrium)，木霉属(Trichoderma)，Xanthophyllomyces。真核生物菌株的实例包括但不限于：黑曲霉(Aspergillus niger)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，Crypthecodinium cohnii，Cunninghamella japonica，花冠虫霉(Entomophthoracoronata)，Mortierella alpina，卷枝毛霉菌(Mucor circinelloides)，粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)，终极腐霉(Pythium ultimum)，Schizochytrium limacinum，Thraustochytrium aureum，Trichoderma reesei和Xanthophyllomyces dendrorhous。

由本发明提供的重组古细菌宿主细胞的举例说明性实例包括，但不限于，属于以下属的细胞：气火菌属(Aeropyrum)，Archaeglobus，盐杆菌属(Halobacterium)，甲烷球菌属(Methanococcus)，甲烷杆菌属(Methanobacterium)，焦球菌属(Pyrococcus)，硫化叶菌属(Sulfolobus)和热原体属(Thermoplasma)。古细菌菌株的实例包括，但不限于闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)，嗜盐菌属的种(Halobacterium sp.)，詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)，Methanobacterium thermoautotrophicum，嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)，Thermoplasma volcanium，Pyrococcus horikoshii，Pyrococcus abyssi，和Aeropyrum pernix。

本发明提供的重组原核宿主细胞的举例说明性实例包括但不限于属于以下属的细胞：土壤杆菌属(Agrobacterium)、脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus)、鱼腥藻属(Anabaena)、组囊藻属(Anacystis)、节细菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、着色菌属(Chromatium)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、席藻属(Phormidium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、红杆菌属(Rhodobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红球菌属(Rhodococcus)、沙门氏菌属(Salmonella)、栅藻属(Scenedesmun)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphlococcus)、链霉菌属(Strepromyces)、Synnecoccus和发酵单胞菌属(Zymomonas)。原核生物菌株的例子包括但不限于枯草芽孢杆菌、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacines)、产氨短杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)、嗜氨短杆菌(Brevibacterium immariophilum)、拜氏梭菌(Clostridium beigerinckii)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、迈氏假单胞菌(Pseudomonas mevalonii)、Pseudomonas pudica、荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)、类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、深红红螺菌(Rhodospirillumrubrum)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、宋内志贺菌(Shigella sonnei)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。

根据本发明的方法使用的大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)是特别好的原核宿主细胞。大肠杆菌在基本上厌氧的条件下能够生长和/或形成产物(L-天冬氨酸或β-丙氨酸)，其在小分子产物的工业发酵中被充分利用，并且可以容易地工程化。与大多数野生型酵母菌株不同，野生型大肠杆菌可分解代谢戊糖和己糖作为碳源。本发明提供了适用于本发明方法的多种大肠杆菌宿主细胞。在一个实施方案中，重组宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞。谷氨酸棒状杆菌被很好地用于工业产生各种氨基酸。虽然通常认为是严格好氧菌，但如果硝酸盐作为电子受体供给发酵液，则野生型谷氨酸棒状杆菌在基本上厌氧的条件下能够生长。在一个实施方案中，重组宿主细胞是棒状杆菌宿主细胞。

在一些实施方案中，宿主细胞是能够在基本上厌氧的条件下生长和/或产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸的微生物。合适的宿主细胞可以在基本上厌氧的条件下自然生长，或者可以被工程化为能够在基本厌氧的条件下生长。

这些宿主细胞中的某些，包括酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌已被食品和药物管理局指定为通常被视为安全的(或GRAS)，并因此被用于本发明的方法的各种实施方案中。虽然从公共安全和监管立场来看是可取的，但GRAS状态不影响宿主菌株用于实施本发明的能力；因此，非GRAS甚至致病生物包括在适用于本发明实践的举例说明性宿主菌株列表中。

2.2 L-天冬氨酸途径酶和L-天冬氨酸1-脱羧酶

本文在某些实施方案中提供了具有至少一种从磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸至L-天冬氨酸的活性L-天冬氨酸途径的重组宿主细胞。在其中宿主细胞产生β-丙氨酸的一些实施方案中，重组宿主细胞进一步表达L-天冬氨酸1-脱羧酶。如本文所用，具有活性L-天冬氨酸途径的重组宿主细胞产生催化L-天冬氨酸发酵途径中的每个代谢反应所必需的活性酶，并且因此在合适的条件下培养能够以可测量的产率和/或滴度产生L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸。具有活性L-天冬氨酸途径的重组宿主细胞包含编码L-天冬氨酸途径酶的一种或多种异源核酸。

在某些实施方案中，本文提供的重组宿主细胞具有经由磷酸烯醇丙酮酸或丙酮酸和草酰乙酸中间体进行的L-天冬氨酸途径。在许多实施方案中，重组宿主细胞包含一种或多种编码一种或多种选自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和L-天冬氨酸脱氢酶的L-天冬氨酸途径酶的异源核酸，其中异源核酸以足以在基本厌氧的条件下产生L-天冬氨酸的量表达。在其他实施方案中，重组宿主细胞包含一种或多种编码一种或多种选自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和L-天冬氨酸脱氢酶的L-天冬氨酸途径酶的异源核酸，其中异源核酸以足以在好氧条件下产生L-天冬氨酸的量表达。在某些实施方案中，细胞还包含编码L-天冬氨酸1-脱羧酶的异源核酸，其中所述异源核酸以足以在基本厌氧的条件下产生β-丙氨酸的量表达。因此，人们将认识到，根据本发明的方法工程改造用于产生L-天冬氨酸的重组宿主细胞表达L-天冬氨酸途径，并且改造用于产生β-丙氨酸的重组宿主细胞除了L-天冬氨酸途径之外还表达L-天冬氨酸1-脱羧酶。

在一些实施方案中，重组宿主细胞包含编码L-天冬氨酸途径的一种或多种酶的一种或多种异源核酸。在一些实施方案中，重组宿主细胞包含编码一种L-天冬氨酸途径酶的一种或多种异源核酸。在一些实施方案中，所述一种L-天冬氨酸途径酶是L-天冬氨酸脱氢酶。在其他实施方案中，所述一种L-天冬氨酸途径酶是丙酮酸羧化酶。在其他实施方案中，所述一种L-天冬氨酸途径酶是磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。在更进一步的实施方案中，所述一种L-天冬氨酸途径酶是磷酸烯醇丙酮酸羧激酶。在各种实施方案中，重组宿主细胞包含编码两种L-天冬氨酸途径酶的一种或多种异源核酸。在一些实施方案中，所述两种L-天冬氨酸途径酶是L-天冬氨酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶。在其他实施方案中，所述两种L-天冬氨酸途径酶是L-天冬氨酸脱氢酶和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。在其他实施方案中，所述两种L-天冬氨酸途径酶是L-天冬氨酸脱氢酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶。在各种实施方案中，重组宿主细胞包含编码三种L-天冬氨酸途径酶的一种或多种异源核酸。在一些实施方案中，所述三种L-天冬氨酸途径酶是L-天冬氨酸脱氢酶，丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。在其他实施方案中，所述三种L-天冬氨酸途径酶是L-天冬氨酸脱氢酶，丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶。在其他实施方案中，所述三种L-天冬氨酸途径酶是L-天冬氨酸脱氢酶，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶。在各种实施方案中，所述重组宿主细胞包含编码所有四种L-天冬氨酸途径酶(即，L-天冬氨酸脱氢酶，丙酮酸羧化酶，磷酸烯醇丙酮酸羧，和磷酸烯醇丙酮酸羧)的一种或多种异源核酸。在某些实施方案中，重组宿主细胞还包含编码L-天冬氨酸1-脱羧酶的异源核酸。

本发明的重组宿主细胞包括采用代谢反应组合来生物合成地产生本发明化合物的微生物。生物合成的化合物可以在细胞内产生和/或分泌到培养基中。由重组宿主细胞产生的生物合成化合物是L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸。这些化合物关于本文所述的代谢反应的关系描述于图1中。在一个实施方案中，重组宿主细胞被工程化以在基本上厌氧的条件下产生L-天冬氨酸。在另一个实施方案中，重组宿主细胞被工程化以在好氧条件下产生L-天冬氨酸。在另一个实施方案中，重组宿主细胞被工程化以在基本上厌氧的条件下产生β-丙氨酸。

通过本发明的生物合成途径和重组宿主细胞产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸是特别有用的，因为L-天冬氨酸和β-丙氨酸可以在基本厌氧的条件下产生。微生物通常缺乏在基本上厌氧的条件下产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸(使用L-天冬氨酸1-脱羧酶从L-天冬氨酸衍生而来)的能力。如本文所述，本发明的重组宿主细胞在基本上厌氧的条件下生长和供应作为主要碳源的碳水化合物和可同化氮源时生成L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸。

L-天冬氨酸途径和L-天冬氨酸1-脱羧酶和编码所述酶的核酸可以是内源的或异源的。在某些实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含编码L-天冬氨酸途径和/或L-天冬氨酸1-脱羧酶的一种或多种异源核酸。在某些实施方案中，重组宿主细胞包含编码L-天冬氨酸途径或L-天冬氨酸1-脱羧酶基因的单一异源核酸。在其他实施方案中，细胞包含编码L-天冬氨酸途径和/或L-天冬氨酸1-脱羧酶的多种异源核酸。在这些实施方案中，重组宿主细胞可以包含单一异源核酸的多个拷贝和/或两种或更多种异源核酸的多个拷贝。包含多种异源核酸的重组宿主细胞可以包含任何数量的异源核酸。

在某些实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含编码L-天冬氨酸途径和/或L-天冬氨酸1-脱羧酶的一种或多种内源核酸。在这些实施方案的某些中，细胞可以被工程化以表达更多的这些内源性酶。在某些这些实施方案中，以较高水平(以与亲本或对照细胞相比较高的量产生)表达的内源酶可以可操作地连接至一个或多个外源启动子或其他调控元件。

在某些实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含编码L-天冬氨酸途径和/或L-天冬氨酸1-脱羧酶的一种或多种内源核酸和编码L-天冬氨酸途径和/或L-天冬氨酸1-脱羧酶的一种或多种异源核酸。在这些实施方案中，重组宿主细胞可以具有活性L-天冬氨酸途径和/或L-天冬氨酸1-脱羧酶，其包含一种或多种编码L-天冬氨酸途径和/或L-天冬氨酸1-脱羧酶的内源核酸和一种或多种编码L-天冬氨酸途径和/或L-天冬氨酸1-脱羧酶的异源核酸。在某些实施方案中，重组宿主细胞可以包含编码L-天冬氨酸途径或L-天冬氨酸1-脱羧酶的内源和异源核酸。

2.2.1草酰乙酸形成酶

可以使用三种酶从糖酵解中间体磷酸烯醇丙酮酸和/或丙酮酸形成草酰乙酸，图1提供了显示三种草酰乙酸形成酶与L-天冬氨酸和β-丙氨酸生成的生物合成关系的示意图。本发明提供的一种草酰乙酸形成酶是丙酮酸羧化酶(EC 6.4.1.1)，其催化丙酮酸和碳酸氢盐转化为草酰乙酸以及伴随的三磷酸腺苷(ATP)水解为二磷酸腺苷(ADP)。另一种草酰乙酸形成酶是磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(EC 4.1.1.31)，其催化磷酸烯醇丙酮酸和碳酸氢盐向草酰乙酸转化以及伴随的磷酸盐释放。第三种草酰乙酸形成酶是磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(EC4.1.1.49)，其催化由磷酸烯醇丙酮酸和二氧化碳形成草酰乙酸以及伴随从ADP形成ATP。在各种实施方案中，重组宿主细胞包含编码草酰乙酸形成酶的一种或多种异源核酸，所述草酰乙酸形成酶选自丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，其导致在基本上厌氧的条件下与不包含所述一种或多种异源核酸的亲本细胞相比增加的L-天冬氨酸或β-丙氨酸产生。在各种实施方案中，重组宿主细胞包含编码草酰乙酸形成酶的一种或多种异源核酸，所述草酰乙酸形成酶选自丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，其导致在好氧条件下与不包含所述一种或多种异源核酸的亲本细胞相比增加的L-天冬氨酸或β-丙氨酸产生。

本发明的被工程化用于在基本上厌氧条件下通过增加草酰乙酸形成酶的表达而产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸的重组宿主细胞通常包含编码至少一种草酰乙酸形成酶的一种或多种异源核酸。在一些实施方案中，工程化用于在基本上厌氧的条件下产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸的重组宿主细胞包含编码一种草酰乙酸形成酶的一种或多种异源核酸。在其他实施方案中，工程化用于在基本上厌氧的条件下产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸的重组宿主细胞包含编码两种草酰乙酸形成酶的异源核酸。在又一个实施方案中，工程改造用于在基本上厌氧的条件下产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸的本发明的重组宿主细胞包含编码所有三种草酰乙酸形成酶的异源核酸。

2.2.1.1丙酮酸羧化酶

一种草酰乙酸形成酶是丙酮酸羧化酶，并且在一个实施方案中，本发明的重组宿主细胞包含一种或多种编码丙酮酸羧化酶的异源核酸，其中所述宿主细胞能够在基本上厌氧的条件下产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸。在另一个实施方案中，本发明的重组宿主细胞包含一种或多种编码丙酮酸羧化酶的异源核酸，其中所述宿主细胞能够在好氧条件下产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸。

在一些实施方案中，编码丙酮酸羧化酶的核酸源自真菌来源。适合根据本发明的方法使用的来源于真菌来源的丙酮酸羧化酶的非限制性实例包括选自以下的那些：黑曲霉(UniProt ID：Q9HES8)，土曲霉(UniProt ID：O93918)，米曲霉(UniProt ID：Q2UGL1；SEQ IDNO：7)，烟曲霉(UniProt ID：Q4WP18)，多变拟青霉(Paecilomyces variotii)(UniProt ID：V5FWI7)和酿酒酵母(UniProt ID：P11154)丙酮酸羧化酶。在一个具体的实施方案中，本发明的重组宿主细胞包含编码米曲霉丙酮酸羧化酶(SEQ ID NO：7)的一种或多种异源核酸，其中所述宿主细胞能够在基本厌氧的条件下产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸。在另一个具体的实施方案中，本发明的重组宿主细胞包含编码米曲霉丙酮酸羧化酶(SEQ ID NO：7)的一种或多种异源核酸，其中所述宿主细胞能够在好氧条件下产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸。

2.2.1.2磷酸烯醇丙酮酸羧化酶

草酰乙酸也可以从作为磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶两者的底物的磷酸烯醇丙酮酸产生。在一些实施方案中，编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸来源于真菌来源。适用于本发明方法的源自真菌来源的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的具体非限制性实例是黑曲霉磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(UniProt ID：A2QM99)。

在其他实施方案中，编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的核酸来源于细菌来源。根据本发明的方法使用的源自细菌来源的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的非限制性实例包括大肠杆菌(UniProt ID：H9UZE7；SEQ ID NO：8)，结核分枝杆菌(UniProt ID：P9WIH3)和谷氨酸棒杆菌(UniProt ID：P12880)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶。在一个具体实施方案中，所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶是大肠杆菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(SEQ ID NO：8)。

在各种实施方案中，重组宿主细胞包含一种或多种编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的异源核酸，所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶在基本上厌氧的条件下导致与不包含所述一种或多种异源核酸的亲本细胞相比增加的L-天冬氨酸或β-丙氨酸产生。在一个具体实施方案中，所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶是大肠杆菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(SEQ ID NO：8)。

2.2.1.3磷酸烯醇丙酮酸羧化酶

适合根据本发明的方法使用的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的非限制性实例包括大肠杆菌(UniProt ID：P22259)，产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)(UniProt ID：O09460)，产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)(UniProt ID：A6VKV4)，产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimiasucciniciproducens)(SEQ ID NO：6)和流感嗜血杆菌(UniProt ID：A5UDR5)PEP羧激酶。在又一个实施方案中，所述重组宿主细胞包含一种或多种编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的异源核酸，所述磷酸烯醇丙酮酸羧激酶在基本上厌氧的条件下导致与不包含所述一种或多种异源核酸的亲本细胞相比增加的L-天冬氨酸或β-丙氨酸产生。在一个具体的实施方案中，所述磷酸烯醇丙酮酸羧激酶是产琥珀酸曼氏杆菌磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(SEQ ID NO：6)。

2.2.2 L-天冬氨酸脱氢酶

本文提供了能够产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸的重组宿主细胞，所述细胞包含编码L-天冬氨酸脱氢酶的一种或多种异源核酸。如本文所用的L-天冬氨酸脱氢酶是指具有L-天冬氨酸脱氢酶活性(意指催化草酰乙酸转化为L-天冬氨酸的能力)的任何蛋白质。

能够催化该反应的适用于本文提供的组合物和方法的蛋白质包括NAD依赖性L-天冬氨酸脱氢酶和NADP依赖性L-天冬氨酸脱氢酶。使用NADH作为电子供体，NAD依赖性L-天冬氨酸脱氢酶催化草酰乙酸和氨向L-天冬氨酸的转化。同样，NADP依赖性L-天冬氨酸脱氢酶利用NADPH作为电子供体催化草酰乙酸和氨向L-天冬氨酸的转化。许多L-天冬氨酸脱氢酶能够使用NADH和NADPH两者作为电子受体；因此，NAD依赖性L-天冬氨酸脱氢酶也可以是NADP依赖性L-天冬氨酸脱氢酶(反之亦然)。在这些情况下，使用NADH或NADPH作为电子供体取决于L-天冬氨酸脱氢酶分别对NADH或NADPH表现出的相对浓度和亲和常数。

在一些实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含编码L-天冬氨酸脱氢酶的异源核酸，其能够产生L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸。适合根据本发明的方法使用的L-天冬氨酸脱氢酶包括选自由以下组成的非限制性组的那些：不动杆菌属的种SH024(UniProt ID：D6JRV1；SEQ ID NO：22)，节杆菌(Arthrobacter aurescens)(UniProt ID：A1R621)，类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)(UniProt ID：Q3JFK2；SEQ ID NO：20)，Burkholderia thailandensis(UniProt ID：Q2T559；SEQ ID NO：19)，睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)(UniProt ID：D0IX49)，Cupriavidus taiwanensis(UniProtID：B3R8S4；SEQ ID NO：2)，Dinoroseobacter shibae(UniProt ID：A8LLH8；SEQ ID NO：24)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)(UniProt ID：A6TDT8；SEQ ID NO:23)，人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)(UniProt ID：A6X792；SEQ ID NO：21)，Polaromonassp.(UniProt ID：Q126F5；SEQ ID NO：18)，铜绿假单胞菌(UniProt ID：Q9HYA4；SEQ ID NO：1)，青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)(UniProt ID：Q8XRV9；SEQ ID NO：17)，Comamonas testosterone(UniProt ID：D0IX49；SEQ ID NO：26)，Cupriaviduspinatubonensis(UniProt ID：Q46VA0；SEQ ID NO：27)和Ruegeria pomeroyi(UniProt ID：Q5LPG8；SEQ ID NO：25)L-天冬氨酸脱氢酶。在某些实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含编码铜绿假单胞菌L-天冬氨酸脱氢酶(SEQ ID NO：1)的异源核酸，其能够产生L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸。在其他实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含编码Cupriavidustaiwanensis L-天冬氨酸脱氢酶(SEQ ID NO：2)的异源核酸，其能够产生L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸。在一些实施方案中，本发明的重组宿主细胞包含编码选自SEQ ID NO：17,18,19,20,21,22,23,24,25,25和27的L-天冬氨酸脱氢酶的异源核酸，其中重组宿主细胞能够产生L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸。在一些实施方案中，本发明的重组宿主细胞包含多种异源核酸，其各自编码选自SEQ ID NO：17,18,19,20,21,22,23,24,25,25和27的L-天冬氨酸脱氢酶，其中所述重组宿主细胞能够产生L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸。

L-天冬氨酸脱氢酶的同源物

也可用于本文提供的组合物和方法中的L-天冬氨酸脱氢酶包括据称与本文所述的任何L-天冬氨酸脱氢酶“同源”的那些酶。这些同源物具有以下特征：(1)能够催化草酰乙酸转化为L-天冬氨酸；(2)它与本文所述的任何L-天冬氨酸脱氢酶共享实质性的序列同一性；(3)包含对应于本文所述任何L-天冬氨酸脱氢酶中高度保守的氨基酸的实质量的氨基酸；和(4)包含对应于本文所述的任何L-天冬氨酸脱氢酶中严格保守的氨基酸的一个或多个特定氨基酸。

如果同源物的氨基酸序列与本文所述的L-天冬氨酸脱氢酶氨基酸序列为至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少97％相同，则认为同源物与L-天冬氨酸脱氢酶共享实质性的序列同一性。

本发明提供的L-天冬氨酸脱氢酶中的许多氨基酸是高度保守的，并且与本发明的L-天冬氨酸脱氢酶同源的蛋白通常将包含对应于高度保守的氨基酸的实质量的氨基酸。如果至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或超过95％的参考序列中高度保守的氨基酸在同源蛋白中发现，则认为同源物包含相当于参考序列中高度保守的氨基酸的实质量的氨基酸。

铜绿假单胞菌L-天冬氨酸脱氢酶(SEQ ID NO：1)中的高度保守氨基酸为G8,G10,A11,I12,G13,E69,C70,A71,A75,L84,V92,S94,G96,A97,G123,A124,I125,G126,D129,L131,A134,V142,K148,P149,F174,G176,A178,A181,L184,P186,N188,N190,V191,A192,A193,T194,L197,A198,G201,V207,A211,D212,P213,N218,G226,A227,F228,G229,P239,N243,P244,K245,T246,S247,L249,T250,S253,R256,L258和N260。在一些实施方案中，与铜绿假单胞菌L-天冬氨酸脱氢酶(SEQ ID NO：1)同源的L-天冬氨酸酶包含对应于至少50％的这些高度保守氨基酸的氨基酸。在一些实施方案中，与铜绿假单胞菌L-天冬氨酸脱氢酶(SEQ ID NO：1)同源的L-天冬氨酸酶包含对应于至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或超过95％的这些高度保守的氨基酸的氨基酸。

Cupriavidus taiwanensis L-天冬氨酸脱氢酶(SEQ ID NO：2)中的高度保守氨基酸是G8,G10,A11,I12,G13,C69,A70,A74,L83,V91,S93,G95,A96,S121,G122,A123,I124,G125,D128,L130,A133,V141,K147,P148,F173,E174,G175,A177,A180,L183,P185,N187,N189,V190,A191,A192,T193,L196,A197,G200,V206,A210,D211,P212,N217,G225,A226,F227,G228,P238,N242,P243,K244,T245,S246,L248,T249,S252,S252,R255,A256,L257,L257和N259。在一些实施方案中，与Cupriavidus taiwanensis L-天冬氨酸脱氢酶(SEQ IDNO：2)同源的L-天冬氨酸酶包含对应于至少50％的这些高度保守氨基酸的氨基酸。在一些实施方案中，与Cupriavidus taiwanensis L-天冬氨酸脱氢酶(SEQ ID NO：2)同源的L-天冬氨酸酶包含对应于至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少85％，至少90％，至少95％或超过95％的这些高度保守氨基酸的氨基酸。

L-天冬氨酸脱氢酶中严格保守的氨基酸

本发明提供的L-天冬氨酸脱氢酶中的一些氨基酸是严格保守的，并且与本发明的L-天冬氨酸脱氢酶同源的蛋白质必须包含对应于这些严格保守的氨基酸的氨基酸。

SEQ ID NO：1中的氨基酸H220用作一般性酸/碱(尽管本发明不受任何作用机制理论的限制)并且是酶活性所必需的；因此，在与SEQ ID NO：1同源的所有酶中都存在对应于SEQ ID NO：1中的H220的氨基酸。SEQ ID NO：1中的氨基酸H220对应于SEQ ID NO：2中的氨基酸H119，并且与SEQ ID NO：2同源的L-天冬氨酸脱氢酶必须包含对应于SEQ ID NO：2中的H119的氨基酸。

其他的L-天冬氨酸脱氢酶

除了与上述那些同源的L-天冬氨酸脱氢酶之外，可以在工程化的库德里阿兹威毕赤酵母中表达以从草酰乙酸生成L-天冬氨酸的另一类L-天冬氨酸脱氢酶是L-天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)酶，其催化草酰乙酸还原为L-天冬氨酸以及伴随的谷氨酸氧化为α-酮戊二酸。使用这种酶，重要的是将α-酮戊二酸循环回至谷氨酸以提供额外的L-天冬氨酸转氨酶催化回合所需的谷氨酸底物。这可以通过表达使用NADH作为电子供体将α-酮戊二酸还原成谷氨酸的谷氨酸脱氢酶(EC1.4.1.2)来完成。这种从草酰乙酸产生L-天冬氨酸的替代代谢途径在L-天冬氨酸脱氢酶活性不足以以所需速率产生L-天冬氨酸的情况下最为有用。在本发明的一些实施方案中，重组宿主细胞包含编码L-天冬氨酸脱氢酶的异源核酸，所述L-天冬氨酸脱氢酶是L-天冬氨酸转氨酶。

合适的L-天冬氨酸转氨酶的实例包括选自由以下组成的非限制性组的那些：酿酒酵母AAT2(UnitProt ID：P23542)，粟酒裂殖酵母L-天冬氨酸转氨酶(UniProt ID：O94320)，大肠杆菌AspC(UniProt ID：P00509)，铜绿假单胞菌AspC(UniProt ID：P72173)和苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)AatB(UniProt ID：Q06191)等等。

2.2.3 L-天冬氨酸1-脱羧酶

在各种实施方案中，重组宿主细胞还包含编码L-天冬氨酸1-脱羧酶的异源核酸。本文使用的L-天冬氨酸1-脱羧酶是指具有L-天冬氨酸脱羧酶活性(意指催化L-天冬氨酸脱羧成β-丙氨酸的能力)的任何蛋白质。

能够催化该反应的适用于本文提供的组合物和方法的蛋白质包括细菌L-天冬氨酸1-脱羧酶和真核L-天冬氨酸脱羧酶两者。细菌L-天冬氨酸1-脱羧酶是丙酮酰-依赖性脱羧酶，其中共价结合的丙酮酰辅因子是通过特定丝氨酸残基(例如SEQ ID NO：4和5中的S25)的自催化重排产生的。相反，真核L-天冬氨酸脱羧酶不具有丙酮酰辅因子，而是具有吡哆醛5'-磷酸辅因子。在一些实施方案中，重组宿主细胞包含编码细菌L-天冬氨酸1-脱羧酶的异源核酸并能够产生β-丙氨酸。在其他实施方案中，重组宿主细胞包含编码真核L-天冬氨酸1-脱羧酶的异源核酸并能够产生β-丙氨酸。

适合根据本发明的方法使用的细菌L-天冬氨酸1-脱羧酶包括选自由以下组成的非限制性组的那些：金色节杆菌(Arthrobacter aurescens)(UniProt ID：A1RDH3)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)(UniProt ID：A7GN78)，枯草芽孢杆菌(UniProt ID：P52999；SEQID NO：5)，Burkholderia xenovorans(UniProt ID：Q143J3)，丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)(UniProt ID：P58285)，拜季林斯基梭菌(Clostridium beijerinckii)(UniProt ID：A6LWN4)，Corynebacterium efficiens(UniProt ID：Q8FU86)，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)(UniProt ID：Q9X4N0；SEQ ID NO：4)，杰氏棒状杆菌(Corynebacterium jeikeium)(UniProt ID：Q4JXL3)，台湾贪铜菌(Cupriavidus necator)(UniProt ID：Q9ZHI5)，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(UniProt ID：Q833S7)，大肠杆菌(UniProt ID:Q0TLK2)，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)(UniProt ID:P56065),胚芽乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(UniProt ID：Q88Z02)，耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)(UniProt ID：A0QNF3)，铜绿假单胞菌(UniProt ID：Q9HV68)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(UniProt ID：Q848I5)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(UniProt ID：A6U4X7)和天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)(UniProt ID：P58286)L-天冬氨酸1-脱羧酶。在一个实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含编码枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ ID NO：5)的异源核酸并且能够产生β-丙氨酸。在另一个实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含编码棒状杆菌L-谷氨酸1-脱羧酶(SEQ IDNO：4)的异源核酸并且能够产生β-丙氨酸。

除了细菌L-天冬氨酸1-脱羧酶之外，本发明还提供了适用于本发明组合物和方法的真核L-天冬氨酸1-脱羧酶。适合根据本发明的方法使用的真核L-天冬氨酸1-脱羧酶包括选自由以下组成的非限制性组的那些：赤拟谷盗(UniProt ID：A9YVA8；SEQ ID NO：3)，埃及伊蚊(Aedes aegypti)(UniProt ID：Q171S0)，Drosophila mojavensis(UniProt ID：B4KIX9)，以及Dendroctonus ponderosae(UniProt ID：U4UTD4)L-天冬氨酸1-脱羧酶。在一个实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含编码赤拟谷盗L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ IDNO：3)的异源核酸并且能够产生β-丙氨酸。

也可用于本文提供的组合物和方法的L-天冬氨酸1-脱羧酶包括据称与本文所述的任何L-天冬氨酸1-脱羧酶“同源”的那些酶。这样的同源物具有以下特征：(1)能够催化L-天冬氨酸脱羧成β-丙氨酸；(2)它与本文所述的任何L-天冬氨酸1-脱羧酶共享实质性的序列同一性；(3)包含对应于本文所述任何L-天冬氨酸1-脱羧酶中的高度保守氨基酸的实质量的氨基酸；和(4)包含对应于本文所述的任何L-天冬氨酸1-脱羧酶中严格保守的氨基酸的一个或多个特定氨基酸。

序列同一性百分比

如果同源物的氨基酸序列与本文所述的L-天冬氨酸1-脱羧酶氨基酸序列至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少97％与相同，则认为同源物与L-天冬氨酸1-脱羧酶共享实质性的序列同一性。

L-天冬氨酸1-脱羧酶中高度保守的氨基酸

本文提供的细菌和真核生物L-天冬氨酸1-脱羧酶中的许多氨基酸是高度保守的，并且与本发明的细菌或真核生物L-天冬氨酸脱氢酶同源的蛋白通常将包含对应于高度保守的氨基酸的实质量的氨基酸。如上所述，如果至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或超过95％的参考序列中高度保守的氨基酸在同源蛋白中发现，则认为同源物包含相当于参考序列中高度保守氨基酸的实质量的氨基酸。

谷氨酸棒状杆菌L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ ID NO：4)中的高度保守氨基酸是K9,H11,R12,A13,V15,T16,A18,L20,Y22,G24,S25,D29,E42,N51,G52,R54,T57,Y58,I60,G62,G65,G67,N72,G73,A74,A75,A76,G82,D83,V85,I86,Y90,E97,P103和N112。在一些实施方案中，与谷氨酸棒状杆菌L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ ID NO：4)同源的L-天冬氨酸1-脱羧酶包含对应于至少50％的这些高度保守氨基酸的氨基酸。在一些实施方案中，与谷氨酸棒状杆菌L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ ID NO：4)同源的L-天冬氨酸1-脱羧酶包含对应于至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或超过95％的这些高度保守的氨基酸的氨基酸。

枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ ID NO：5)中的高度保守氨基酸是K9,H11,R12,A13,V15,T16,A18,L20,Y22,G24,S25,D29,E42,N51,G52,R54,T57,Y58,I60,G62,G65,G67,N72,G73,A74,A75,A76,G82,D83,V85,I86,Y90,E97,P103和N112。在一些实施方案中，与枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ ID NO：5)同源的L-天冬氨酸1-脱羧酶包含对应于至少50％的这些高度保守氨基酸的氨基酸。在一些实施方案中，与枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ ID NO：5)同源的L-天冬氨酸1-脱羧酶包含对应于至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或超过95％的这些高度保守的氨基酸的氨基酸。

赤拟谷盗L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ ID NO：3)中高度保守的氨基酸为V88,P94,D102,L115,S126,V127,T129,H131,P132,F134,N136,Q137,L138,S140,D143,Y145,Q150,T153,D154,L156,N157,P158,S159,Y161,T162,E164,V165,P167,L171,M172,E173,E174,V176,L177,E179,M180,R181,I183,G185,G191,G193,F195,P197,G198,G199,S200,A202,N203,G204,Y205,I207,A210,R211,P216,K219,G222,L229,F232,T233,S234,E235,A237,H238,Y239,S240,K243,A245,F247,G249,G251,G264,P285,V288,T291,G293,T294,T295,V296,G298,A299,F300,D301,C310,K312,W316,H318,D320,A321,A322,W323,G324,G325,G326,A327,L328,S330,R334,L336,L337,G339,D344,S345,V346,T347,W348,N349,P350,H351,K352,L353,L354,A356,Q358,Q359,C360,S361,T362,L364,H367,L371,H375,A379,Y381,L382,F383,Q384,D386,K387,F388,Y389,D390,D394,G396,D397,H399,Q401,C402,G403,R404,A406,D407,V408,K410,F411,W412,M414,W415,A417,K418,G419,G422,H426,F431,R444,G446,P454,N458,F461,Y463,P465,R469,L481,A485,P486,K489,E490,M492,G496,M498,T501,Y502,Q503,N510,F511,F512,R513,V515,Q517,S519,L521,D525,M526,E532,E534,L536。在一些实施方案中，与赤拟谷盗L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ ID NO：3)同源的L-天冬氨酸1-脱羧酶包含对应于至少50％的这些高度保守氨基酸的氨基酸。在一些实施方案中，与赤拟谷盗L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ ID NO：3)同源的L-天冬氨酸1-脱羧酶包含对应于至少60％，至少70％，至少80％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或超过95％的这些高度保守的氨基酸的氨基酸。

L-天冬氨酸1-脱羧酶严格保守的氨基酸

本发明提供的L-天冬氨酸1-脱羧酶中的一些氨基酸是严格保守的，并且与本发明的L-天冬氨酸1-脱羧酶同源的蛋白必须包含对应于这些严格保守的氨基酸的氨基酸。

枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ ID NO：5)和谷氨酸棒状杆菌L-天冬氨酸1-脱碳基酶(SEQ ID NO：4)氨基酸序列中的严格保守的氨基酸是K9，G24，S25，R54和Y58。认为K9上的ε-胺基与L-天冬氨酸上的α-羧基形成离子对，R54被认为与L-天冬氨酸上的γ-羧基形成离子对，并且认为Y58提供质子给延长的烯醇化物反应中间体；因此，这三种氨基酸对于L-天冬氨酸结合和随后的脱羧是重要的。此外，残基G24和S25之间的蛋白水解切割产生也是脱羧酶活性所必需的N端丙酮酰部分。因此，与SEQ ID NO：4和/或SEQ ID 5同源的酶将包含对应于SEQ ID NO：4和/或5中的K9，G24，S25，R54和Y58的氨基酸。

赤拟谷盗L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ ID NO：3)氨基酸序列中严格保守的氨基酸是Q137，H238，K352和R513。Q137和R513与L-天冬氨酸上的γ-羧基形成盐桥，H238是吡哆醛5'-磷酸辅助因子的吡啶环的碱基堆积残基，K352与吡哆醛5'磷酸盐辅因子形成席夫碱键。因此，这四种氨基酸对于L-天冬氨酸或辅因子结合和随后的L-天冬氨酸脱羧是重要的，并且与SEQ ID NO：3同源的酶将包含对应于SEQ ID NO：3中的Q137，H238，K352和R513的氨基酸。

2.2.4共有序列

本发明还提供用于鉴定和/或构建适用于本发明方法的L-天冬氨酸脱氢酶和L-天冬氨酸1-脱羧酶的共有序列。在各种实施方案中，如下所述，这些共有序列包含被认为是底物识别和反应催化所必需的活性位点氨基酸残基(尽管本发明不受任何作用机理理论的限制)。因此，由本文提供的L-天冬氨酸脱氢酶共有序列涵盖的L-天冬氨酸脱氢酶在将草酰乙酸还原成L-天冬氨酸的能力上具有与本文例举的酶之一相同或基本上相同或至少基本类似的酶活性。同样地，由本文提供的L-天冬氨酸1-脱羧酶共有序列涵盖的L-天冬氨酸1-脱羧酶在将L-天冬氨酸脱羧成β-丙氨酸的能力上具有与本文例举的酶之一相同或基本上相同或至少基本类似的酶活性。

也可用于本文提供的组合物和方法中的酶包括与本发明提供的共有序列同源的那些酶。如上所述，与本文描述的酶基本上同源的任何酶都可以用于本发明的宿主细胞中。

通过将酶序列与共有序列比对来确定酶相对于共有序列的百分比序列同一性。本领域技术人员将认识到各种序列比对算法适合于将酶与共有序列比对。参见例如Needleman，SB等人“A general method applicable to the search for similaritiesin the amino acid sequence of two proteins.”Journal of Molecular Biology 48(3):443–53(1970)。在将酶序列相对于共有序列比对之后，其中酶具有由共有序列中相同位置描述的氨基酸(或短划线)的位置的百分比决定了序列同一性百分比。

2.2.4.1 L-天冬氨酸脱氢酶共有序列

L-天冬氨酸脱氢酶共有序列(SEQ ID NO：14)提供了氨基酸序列，其中每个位置鉴定最有可能在L-天冬氨酸脱氢酶的特定位置被发现的氨基酸(如果特定氨基酸被鉴定)或氨基酸子集(如果位置被鉴定为可变的)。本领域技术人员将认识到，这些共有序列中的固定氨基酸和保守氨基酸与共同序列所基于的野生型序列相同(在固定氨基酸的情况下)或一致(在保守氨基酸的情况下)。在将查询蛋白质与本文提供的共有序列进行比对后，在比对的查询蛋白质序列中出现短划线表示相对于指示位置处的共有序列，查询蛋白质序列中的氨基酸缺失。同样，在比对的共有序列中出现短划线表示相对于指定位置上的共有序列，查询蛋白质序列中的氨基酸添加。氨基酸添加和缺失是由本发明的共有序列包含的蛋白质共有的，并且它们的出现反映为较低的序列同一性百分比(即，当计算序列同一性百分比时，氨基酸添加或缺失与氨基酸错配相同地处理)。

在各种实施方案中，适合根据本发明的方法使用的L-天冬氨酸脱氢酶具有L-天冬氨酸脱氢酶活性并且包含与SEQ ID NO：14具有至少55％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少95％的序列同一性的氨基酸序列。例如，铜绿假单胞菌L-天冬氨酸脱氢酶(SEQ ID NO：1)和Cupriavidus taiwanensis L-天冬氨酸脱氢酶SEQ ID NO：2)序列与共有序列SEQ ID NO：14具有79％和83％的同一性，因此被共有序列SEQ ID NO：14涵盖在内。

在与SEQ ID NO：14同源的酶中，高度保守的氨基酸是G8,G10,A11,I12,G13,E69,A71,G72,H73,A75,H79,P82,L84,G87,S94,G96,A97,L98,A110,A111,G114,L120,G123,A124,I125,G126,D129,A130,A133,A134,G137,G138,L139,V142,Y144,G146,R147,K148,P149,W153,T156,P157,E159,D163,L164,I173,F174,G176,A178,A181,A182,P186,K187,N188,A189,N190,V191,A192,A193,T194,A198,G199,G201,L202,T205,V207,L209,A211,D212,P213,N218,H220,A224,G226,A227,F228,G229,L233,P239,L240,N243,P244,K245,T246,S247,A248,L249,T250,S253,R256,A257,N260,和I267。在各种实施方案中，与SEQ IDNO：14同源的L-天冬氨酸脱氢酶在对应于SEQ ID NO：14中鉴定的高度保守的氨基酸的位置上包含至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或有时全部这些高度保守的氨基酸。在一些实施方案中，这些高度保守的氨基酸中的每一个都存在于所需的L-天冬氨酸脱氢酶中，如SEQ ID NO：1和2中提供的。

SEQ ID NO：14中的氨基酸H220起到一般性酸/碱的作用(尽管本发明不受任何作用机理理论的限制)并且是酶活性所必需的；因此，在与SEQ ID NO：14同源的酶中发现对应于共有序列SEQ ID NO：14中H220的氨基酸。例如，对应于共有序列SEQ ID NO：14中的H220的严格保守氨基酸存在于SEQ ID NO：1和2所示的L-天冬氨酸脱氢酶中。

2.2.4.2 L-天冬氨酸1-脱羧酶共有序列

也可用于本文提供的组合物和方法中的L-天冬氨酸1-脱羧酶包括与本文所述的L-天冬氨酸1-脱羧酶共有序列同源的那些。与本文所述的L-天冬氨酸1-脱羧酶共有序列基本同源的任何L-天冬氨酸1-脱羧酶可用于本发明的宿主细胞中。

本发明提供了两种L-天冬氨酸1-脱羧酶共有序列：(i)基于细菌L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ ID NO：15)的L-天冬氨酸1-脱羧酶和(ii)基于真核L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ IDNO：16)的L-天冬氨酸1-脱羧酶。共有序列提供了氨基酸序列，其中每个位置鉴定最有可能在该类L-天冬氨酸脱氢酶中的指定位置发现的氨基酸(如果特定氨基酸被鉴定)或氨基酸子集(如果位置被鉴定为可变的)。本领域技术人员将认识到，这些共有序列中的固定氨基酸和保守氨基酸与共同序列所基于的野生型序列相同(在固定氨基酸的情况下)或一致(在保守氨基酸的情况下)。在将查询蛋白质与本文提供的共有序列进行比对后，在比对的查询蛋白质序列中出现短划线表示相对于指示位置处的共有序列，查询蛋白质序列中的氨基酸缺失。同样，在比对的共有序列中出现短划线表示相对于指定位置上的共有序列，查询蛋白质序列中的氨基酸添加。氨基酸添加和缺失是由本发明的共有序列包含的蛋白质共有的，并且它们的出现反映为较低的序列同一性百分比(即，当计算序列同一性百分比时，氨基酸添加或缺失与氨基酸错配相同地处理)。

细菌L-天冬氨酸1-脱羧酶共有序列

本发明提供了基于细菌L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ ID NO：15)的L-天冬氨酸1-脱羧酶共有序列，并且在各种实施方案中，适合用于本发明的方法的L-天冬氨酸1-脱羧酶共同序列具有L-天冬氨酸1-脱羧酶活性并且包含与SEQ ID NO：15具有至少40％，至少45％，至少50％或至少55％序列同一性的氨基酸序列。枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQID NO：5)和谷氨酸棒状杆菌L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ ID NO：4)氨基酸序列与共有序列SEQ ID NO：15具有55％和79％的同一性并且因此涵盖在共有序列SEQ ID NO：15中。

在与SEQ ID NO：15同源的酶中，高度保守的氨基酸是K9,H11,R12,A13,V15,T16,A18,L20,Y22,G24,S25,D29,E42,N51,G52,R54,T57,Y58,I60,G62,G65,G67,N72,G73,A74,A75,A76,G82,D83,V85,I86,Y90,E97,P103和N112。在各种实施方案中，与SEQ ID NO：15同源的L-天冬氨酸1-脱羧酶在对应于SEQ ID NO：15中鉴定的高度保守的氨基酸的位置上包含至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或有时全部这些高度保守的氨基酸。例如，所有高度保守的氨基酸都存在于如SEQ ID NO：4和5所示的L-天冬氨酸1-脱羧酶序列中。

在共有序列SEQ ID NO：15中存在五个严格保守的氨基酸(K9，G24，S25，R54和Y58)，并且这些残基对于L-天冬氨酸1-脱羧酶活性是重要的。尽管本发明不受任何作用机制理论的限制，但每个严格保守的氨基酸的功能如下。K9上的ε-胺基与L-天冬氨酸上的α-羧基形成离子对，R54与L-天冬氨酸上的γ-羧基形成离子对，Y58将质子贡献给延长的烯醇化物反应中间体。SEQ ID NO：15中另外的严格保守的残基是G24和S25，并且G24和S25之间的蛋白水解切割导致产生脱羧酶活性所需的N-末端丙酮酰部分。与共有序列SEQ ID NO：15同源的酶包含对应于共有序列SEQ ID NO：15中鉴定的全部五种严格保守氨基酸的氨基酸。

真核L-天冬氨酸1-脱羧酶共有序列

本发明提供了基于真核L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ ID NO：16)的第二L-天冬氨酸1-脱羧酶共有序列。在不同的实施方案中，适合根据本发明的方法使用的L-天冬氨酸1-脱羧酶具有L-天冬氨酸1-脱羧酶活性并且包含与SEQ ID NO：16具有至少55％，至少60％，至少65％，至少70％或至少75％的序列同一性的氨基酸序列。赤拟谷盗L-天冬氨酸1-脱羧酶(SEQ ID NO：3)氨基酸序列与共有序列SEQ ID NO：16具有70％同一性，并且因此涵盖在共有序列SEQ ID NO：16中。

在与SEQ ID NO：16同源的酶中，高度保守的氨基酸是V130,P136,D144,L157,S168,V169,T171,H173,P174,F176,N178,Q179,L180,S182,D185,Y187,Q192,T195,D196,L198,N199,P200,S201,Y203,T204,E206,V207,P209,L213,M214,E215,E216,V218,L219,E221,M222,R223,I225,G227,G234,G236,F238,P240,G241,G242,S243,A245,N246,G247,Y248,I250,A253,R254,P259,K262,G265,L272,F275,T276,S277,E278,A280,H281,Y282,S283,K286,A288,F290,G292,G294,G307,P328,V331,T334,G336,T337,T338,V339,G341,A342,F343,D344,C353,K355,W359,H361,D363,A364,A365,W366,G367,G368,G369,A370,L371,S373,R377,L379,L380,G382,D387,S388,V389,T390,W391,N392,P393,H394,K395,L396,L397,A399,Q401,Q402,C403,S404,T405,L407,H410,L414,H418,A422,Y424,L425,F426,Q427,D429,K430,F431,Y432,D433,D437,G439,D440,H442,Q444,C445,G446,R447,A449,D450,V451,K453,F454,W455,M457,W458,A460,K461,G462,G465,H469,F474,R487,G489,P497,N501,F504,Y506,P508,R512,L525,A529,P530,K533,E534,M536,G540,M542,T545,Y546,Q547,N554,F555,F556,R557,V559,Q561,S563,L565,D569,M570,E576,E578和L580。在各种实施方案中，与SEQ ID NO：16同源的L-天冬氨酸1-脱羧酶在对应于SEQ IDNO：16中鉴定的高度保守的氨基酸的位置包含至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％或有时全部这些高度保守的氨基酸。所有这些高度保守的氨基酸都存在于如SEQ ID NO：3中所示的赤拟谷盗L-天冬氨酸1-脱羧酶中。

真核L-天冬氨酸1-脱羧酶共有序列(SEQ ID NO：16)中严格保守的氨基酸是Q179，H281，K395和R557。尽管本发明不受任何作用机制理论的限制，但每个严格保守的氨基酸的功能如下。Q179和R557与L-天冬氨酸上的γ-羧基形成盐桥，H281是吡哆醛5'-磷酸辅助因子的吡啶环的碱基堆积残基，K395与吡哆醛5'磷酸盐辅因子形成席夫碱键。因此，这四种氨基酸对于L-天冬氨酸或辅因子结合和随后的L-天冬氨酸脱羧是重要的。与共有序列SEQ IDNO：16同源的酶包含对应于在共有序列SEQ ID NO：16中鉴定的所有四种严格保守的氨基酸的氨基酸。这些严格保守的氨基酸中的所有四种均存在于SEQ ID NO：3所示的赤拟谷盗L-天冬氨酸1-脱羧酶中。

第3部分：内源性核酸的缺失或破坏

另一方面，本发明提供了经遗传修饰以缺失内源蛋白质或以其他方式降低内源蛋白质活性的宿主细胞。为了部分地、基本上或完全地减少或消除它们编码的活性如例如酶的表达或活性，特定的核酸序列被部分地、基本上或完全缺失或破坏、沉默、失活或下调。如本文所用，关于核酸的“缺失或破坏”意指蛋白编码区、启动子、终止子和/或其他调控元件的全部或部分被修饰(例如通过核酸的缺失、插入或突变)，使得核酸不再产生蛋白质、产生减少量的蛋白质或产生具有降低的活性(例如降低的酶活性)的蛋白质。

如本文所用，关于酶的“缺失或破坏”是指缺失或破坏编码具有特定活性的酶的核酸的至少一个，并且通常多于一个，并且有时是所有的拷贝。适用于本发明组合物和方法的许多宿主细胞包含两种或更多种编码具有相同活性的两种或更多种酶的内源核酸。例如，二倍体、三倍体和四倍体微生物分别包含2、3和4组染色体，并且在每对染色体上发现编码具有相同酶活性的两种酶的两种核酸。同样，基因复制事件可导致在编码两种或更多种具有相同活性的酶的宿主细胞的基因组上存在两种或更多种核酸。在一些实施方案中，重组宿主细胞包含编码酶的一种核酸的缺失或破坏。在其他实施方案中，重组宿主细胞包含超过一种编码酶的核酸并且有时包含编码酶的所有核酸的缺失或破坏。

在某些实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含一种或多种代谢途径的缺失或破坏。如本文所用，关于代谢途径的“缺失或破坏”意指该途径产生代谢途径的减少量的一种或多种终产物。在某些实施方案中，代谢途径的缺失或破坏通过缺失或破坏编码代谢途径酶的一种或多种核酸来完成。在这些实施方案的一些中，包含所述缺失或破坏的代谢途径的重组宿主细胞不再产生代谢途径的终产物，或产生与亲本细胞相比至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或多于95％更少的代谢途径终产物。

在某些实施方案中，如本文所述的缺失或破坏的核酸对于微生物的天然菌株可以是内源的，并且可以理解为“天然核酸”或“内源核酸”。如果核酸没有通过人为干预以有意改变微生物的基因型和/或表型的方式进行遗传修饰或操作，则核酸是内源性核酸。例如，野生型生物的核酸可以被认为是内源核酸。在其他实施方案中，被靶向缺失或破坏的核酸对于微生物可以是异源的。

在某些实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含编码酶的一种或多种核酸的缺失或破坏。在这些实施方案的一些中，包含一种或多种缺失或破坏的核酸的宿主细胞不再产生酶，或产生由亲代细胞产生的酶的量的少于10％，少于25％，少于50％，少于75％，少于90％，少于95％或少于97％。在其他实施方案中，包含缺失或破坏的核酸的重组宿主细胞产生与亲本细胞相同量的酶，但与未修饰的核酸编码的酶相比，该酶表现出降低的活性。在这些实施方案中的一些中，缺失或破坏的核酸不再编码活性酶，或编码与由内源核酸编码的酶相比具有至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或大于90％的活性降低。本领域技术人员将认识到，核酸的缺失或破坏可以同时导致由重组宿主细胞产生的酶的量的减少以及由缺失或缺失的核酸编码的酶的活性的降低。

3.1.内源厌氧途径和编码内源性厌氧途径酶的酶的缺失或破坏

本发明描述了重组宿主细胞的工程改造，以将各种内源性厌氧发酵途径转化为厌氧L-天冬氨酸盐和任选的β-丙氨酸途径。除非发酵途径是氧化还原平衡的(即没有NADH、NADPH或其他氧化还原辅因子的净累积)，否则微生物不会在厌氧生长条件下生长。

还原和氧化(氧化还原)反应在无氧代谢中起关键作用，允许电子从一种化合物转移到另一种化合物，从而产生用于细胞代谢的自由能。氧化还原辅助因子促进宿主细胞内电子从一种化学物质转移到另一种化学物质。几种化合物和蛋白质可以作为氧化还原辅因子。在碳水化合物的厌氧分解代谢过程中，最相关的辅因子是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH和NADPH)和铁硫蛋白铁氧还蛋白(Fd)。通常，NADH是碳水化合物厌氧分解代谢过程中酵母细胞中最相关的辅因子。

为了细胞生长，氧化还原辅因子必须释放它们接受的相同数量的电子；因此，宿主细胞中的净电子累积为零。在碳水化合物分解代谢期间，电子被置于氧化还原辅因子上，并且在终产物形成过程中必须从氧化还原辅因子中除去。为了在厌氧条件下以高产率产生最终产物，在碳水化合物分解代谢期间使用的氧化还原辅因子的类型和数量必须与最终产物形成期间使用的氧化还原辅因子的类型和数量相匹配。

碳水化合物分解代谢终止于丙酮酸的形成，并且在甘油醛3-磷酸转化成1,3-二磷酸甘油酸(提供两个电子)期间电子被去除。该反应由磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH；EC1.2.1.12)催化，并且在酵母中使用内源性酶使用NAD+作为电子受体。当使用葡萄糖作为碳水化合物时，理论上每摩尔葡萄糖可产生两摩尔甘油醛3-磷酸，因此理论上每摩尔葡萄糖可在表达NAD依赖性GAPDH的宿主细胞中产生两摩尔NADH。GAPDH酶可以使用替代的辅因子，包括NADPH；NADP依赖性GAPDH酶分类在酶委员会编号EC1.2.1.13下，并且包括在Chlamydomonas reinhardtii、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、甘蓝菠菜(Spinacia oleracea)和硫矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)等中发现的酶。包含NAD依赖性GAPDH酶的宿主细胞可以使用标准微生物工程技术工程化以表达NADP依赖性GAPDH酶，并由此在碳水化合物分解代谢为丙酮酸期间产生NADPH或NADH与NADPH的组合。

在碳水化合物分解代谢为丙酮酸期间接受电子的氧化还原辅因子必须在产生发酵终产物期间释放这些电子以使厌氧生长和/或高产率产生终产物成为可能。能够在基本上厌氧的条件下生长的微生物包含一种或多种内源性厌氧发酵途径，其活性导致在碳水化合物分解代谢期间产生的氧化还原辅因子的重新消耗(reconsumption)。内源性厌氧发酵途径的活性降低了本发明的异源L-天冬氨酸途径酶使用的氧化还原辅因子的可用性，从而降低了从碳水化合物的L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸产率。因此，内源性厌氧发酵途径和编码内源性厌氧发酵途径酶的核酸的缺失或破坏可用于增加由在基本上厌氧的条件下生长的本发明的重组宿主细胞产生的L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸的产量。

厌氧发酵途径是这样的任何代谢途径，其：(i)包含在碳水化合物分解代谢过程中产生的重新消耗氧化还原辅因子的酶，和(ii)其活性导致在基本上厌氧条件下生长的宿主细胞中可检测水平的终产物。厌氧发酵途径的实例包括但不限于乙醇、甘油、苹果酸盐、乳酸盐、1-丁醇、异丁醇、1,3-丙二醇和1,2-丙二醇厌氧发酵途径。例如，乙醇是大多数野生型微生物尤其是在碳水化合物上无氧生长的酵母的主要发酵终产物，并且在将丙酮酸转化为乙醇期间，碳水化合物分解代谢期间产生的氧化还原辅因子被重新消耗。在本发明的重组宿主细胞中，典型地但不限于乙醇发酵途径的内源发酵途径已被缺失或破坏。通过L-天冬氨酸脱氢酶的活性在L-天冬氨酸产生过程中重新消耗由葡萄糖形成丙酮酸过程中产生的氧化还原辅因子，最终的结果是氧化还原平衡，和因此能够以高产率产生L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸的厌氧发酵途径。

3.2.乙醇发酵途径和编码乙醇发酵途径酶的核酸的缺失或破坏

乙醇发酵途径和编码乙醇发酵途径酶的核酸的缺失或破坏对于工程化能够在基本上厌氧的条件下有效产生L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸的重组宿主细胞是重要的。

在酵母宿主细胞中，乙醇发酵途径包含两种酶：丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶。丙酮酸脱羧酶(EC 4.1.1.1)催化丙酮酸脱羧为乙醛；醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)催化乙醛还原成乙醇，伴随着NADH氧化成NAD+和/或NADPH氧化成NADP+。在本发明的酵母细胞中，乙醇发酵途径可以通过缺失或破坏编码丙酮酸脱羧酶和/或醇脱氢酶的一种或多种核酸而被缺失或破坏。在某些实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含编码乙醇发酵途径酶的一种或多种内源核酸的缺失或破坏。在一些实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含编码丙酮酸脱羧酶的一种或多种核酸的缺失或破坏。在一些实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含编码醇脱氢酶的一种或多种核酸的缺失或破坏。在一些实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含编码丙酮酸脱羧酶和醇脱氢酶的一种或多种核酸的缺失或破坏。

编码乙醇发酵途径酶的核酸的缺失或破坏降低了重组宿主细胞产生乙醇的能力和/或提高了重组宿主细胞产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸的能力。在各种实施方案中，包含编码乙醇发酵途径酶的一种或多种核酸的缺失或破坏的重组宿主细胞使乙醇产量减少至少10％，至少25％，至少50％，至少60％，至少70％，至少90％，至少95％或至少99％，与不包含该遗传修饰的亲本细胞相比。在一些实施方案中，包含编码乙醇发酵途径酶的一种或多种核酸的缺失或破坏的重组宿主细胞将L-天冬氨酸或β-丙氨酸产量增加至少10％，至少25％，至少50％，至少75％，至少100％，或高于100％，与不包含该遗传修饰的亲本细胞相比。

3.2.1编码丙酮酸脱羧酶的核酸的缺失或破坏

在各种实施方案中，重组宿主细胞包含编码丙酮酸脱羧酶的一种或多种核酸的缺失或破坏。在一些实施方案中，编码丙酮酸脱羧酶的一种核酸被缺失或破坏。在其他实施方案中，编码丙酮酸脱羧酶的两种核酸被缺失或破坏。在其他实施方案中，编码丙酮酸脱羧酶的多于两种核酸被缺失或破坏。在更进一步的实施方案中，编码丙酮酸脱羧酶的所有核酸都被缺失或破坏。

在各种实施方案中，重组宿主细胞包含编码具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的丙酮酸脱羧酶的一种或多种核酸的缺失或破坏，或编码具有与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少95％，至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的酶的一种或多种核酸序列的缺失或破坏。在其中本发明的重组宿主细胞是库德里阿兹威毕赤酵母的具体实施方案中，重组宿主细胞包含编码具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的丙酮酸脱羧酶的两种核酸的缺失或破坏，或编码具有与SEQ ID NO：9的氨基酸序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少95％，至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的酶的两种核酸的缺失或破坏。

一些酵母细胞具有多于一种编码丙酮酸脱羧酶的核酸，并且在这些宿主细胞中，为了缺失或破坏乙醇发酵途径的目的，编码丙酮酸脱羧酶的一种或多种核酸可以被缺失或破坏。例如，野生型酿酒酵母具有三种内源性丙酮酸酯脱羧酶：PDC1(SEQ ID NO：10)，PDC5和PDC6。PDC1是酿酒酵母中主要的异构体(具有最高表达水平和/或活性)，而PDC5和PDC6是次要异构体。在其中本发明的重组宿主细胞是酿酒酵母的某些实施方案中，重组宿主细胞包含编码具有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的丙酮酸脱羧酶的一种或多种核酸的缺失或破坏，或者编码具有与SEQ ID NO：10的氨基酸序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少95％，至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的酶的一种或多种核酸的缺失或破坏。例如，酿酒酵母丙酮酸酯脱羧酶PDC5和PDC6分别与SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列具有88％和84％的氨基酸序列同一性。

3.2.2编码醇脱氢酶的核酸的缺失或破坏

除了缺失或破坏编码丙酮酸脱羧酶的核酸之外，酵母乙醇发酵途径可以通过缺失或破坏编码醇脱氢酶的核酸而被缺失或破坏。在各种实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含编码醇脱氢酶的一种或多种核酸的缺失或破坏。在一些实施方案中，编码醇脱氢酶的一种核酸被缺失或破坏。在其他实施方案中，编码醇脱氢酶的两种核酸被缺失或破坏。在其他实施方案中，多于两种编码醇脱氢酶的核酸被缺失或破坏。在更进一步的实施方案中，编码醇脱氢酶的所有核酸都被缺失或破坏。

在某些实施方案中，重组宿主细胞包含编码具有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列或与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有至少50％，至少60％与SEQ ID NO：11具有至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％或大于97％序列同一性的醇脱氢酶的核酸的缺失或破坏。在其中本发明的宿主细胞是库德里阿兹威毕赤酵母的特定实施方案中，重组宿主细胞包含编码具有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列的醇脱氢酶的两种核酸的缺失或破坏，或编码具有与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少95％，至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的酶的两种核酸的缺失或破坏。

3.3苹果酸发酵途径和编码苹果酸脱氢酶的核酸的缺失或破坏

苹果酸发酵途径包含一种酶，苹果酸脱氢酶(EC 1.1.1.37)，其催化草酰乙酸形成苹果酸(苹果酸发酵途径的最终产物)以及伴随的NADH氧化成NAD+。本领域技术人员将认识到苹果酸脱氢酶和L-天冬氨酸脱氢酶使用相同的底物(草酰乙酸)，并将经常使用相同的氧化还原辅因子(NADH或NADPH)来产生它们各自的产物。因此，内源苹果酸脱氢酶，特别是位于酵母细胞胞质溶胶中的苹果酸脱氢酶的表达可以减少L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸的厌氧产生。因此，苹果酸发酵途径的缺失或破坏可用于增加在基本上厌氧的条件下生长的本发明的重组宿主细胞中L-天冬氨酸或β-丙氨酸的产生。苹果酸发酵途径可以通过缺失或破坏编码苹果酸脱氢酶的核酸而被缺失或破坏。

在各种实施方案中，重组宿主细胞包含编码苹果酸脱氢酶的一种或多种核酸的缺失或破坏。在一些实施方案中，编码苹果酸脱氢酶的一种核酸被缺失或破坏。在其他实施方案中，编码苹果酸脱氢酶的两种核酸被缺失或破坏。在其他实施方案中，多于两种编码苹果酸脱氢酶的核酸被缺失或破坏。在更进一步的实施方案中，编码苹果酸脱氢酶的所有核酸都被缺失或破坏。

在各种实施方案中，重组宿主细胞包含缺失或破坏编码具有SEQ ID NO：13所示氨基酸序列的苹果酸脱氢酶的一种或多种核酸的缺失或破坏，或编码具有与SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少95％，至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的酶的一种或多种核酸序列的缺失或破坏。在其中本发明的重组宿主细胞是库德里阿兹威毕赤酵母的具体实施方案中，重组宿主细胞包含编码具有SEQ IDNO：13所示氨基酸序列的苹果酸脱氢酶的两种核酸的缺失或破坏，或编码具有与SEQ IDNO：13的氨基酸序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少95％，至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的酶的两种核酸的缺失或破坏。

3.4另外的副产物代谢途径和编码副产物代谢途径酶的核酸的缺失或破坏

除乙醇和苹果酸之外，通过本发明的宿主细胞形成另外的副产物，包括甘油、乙酸和各种四碳二羧酸(例如富马酸盐和琥珀酸盐)。这些副产物代谢途径和编码副产物代谢途径酶的核酸的缺失或破坏也可用于增加本发明宿主细胞的L-天冬氨酸或β-丙氨酸的产生。

在某些实施方案中，本文提供的重组宿主细胞包含甘油发酵途径的缺失或破坏。甘油发酵途径包含一种酶，NAD依赖性甘油-3-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.8)，其催化甘油-3-磷酸甘油(甘油代谢途径的终产物)的形成以及伴随的将NADH氧化成NAD+。在基本上厌氧的条件下生长的本发明的重组宿主细胞中，甘油发酵途径活性降低在从草酰乙酸产生L-天冬氨酸中可用于L-天冬氨酸脱氢酶的NADH库。因此，甘油发酵途径的缺失或破坏可用于增加本发明重组宿主细胞中L-天冬氨酸或β-丙氨酸的产生。甘油代谢途径可以通过缺失或破坏编码NAD依赖性甘油-3-磷酸脱氢酶的核酸而被缺失或破坏。

在各种实施方案中，重组宿主细胞包含编码NAD依赖性甘油-3-磷酸脱氢酶的一种或多种核酸的缺失或破坏。在一些实施方案中，编码NAD依赖性甘油-3-磷酸脱氢酶的一种核酸被缺失或破坏。在其他实施方案中，编码NAD依赖性甘油-3-磷酸脱氢酶的两种核酸被缺失或破坏。在其他实施方案中，多于两种编码NAD依赖性甘油-3-磷酸脱氢酶的核酸被缺失或破坏。在更进一步的实施方案中，编码NAD依赖性甘油-3-磷酸脱氢酶的所有核酸都被缺失或破坏。

在各种实施方案中，重组宿主细胞包含编码具有SEQ ID NO：12所示氨基酸序列的NAD依赖性甘油-3-磷酸脱氢酶的一种或多种核酸的缺失或破坏，或编码具有与SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少95％，至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的酶的一种或多种核酸的缺失或破坏。在其中本发明的重组宿主细胞是库德里阿兹威毕赤酵母的具体实施方案中，重组宿主细胞包含编码具有SEQ IDNO：12所示氨基酸序列的NAD依赖性甘油-3-磷酸脱氢酶的两种核酸的缺失或破坏，或编码具有与SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少95％，至少97％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的酶的两种核酸的缺失或破坏。

第4部分：增加L-天冬氨酸产生的遗传修饰

另一方面，本发明提供了经遗传修饰的宿主细胞，以表达编码使得能够能量高效地产生L-天冬氨酸的酶的异源核酸。如本文所定义的“能量高效”是指与亲本或对照菌株相比，L-天冬氨酸的产生需要较少的ATP。减少ATP的消耗是在基本上厌氧的条件下L-天冬氨酸产生的重要方面。如果宿主细胞ATP需要变得足够高，则必须向培养物提供额外的氧以支持L-天冬氨酸产生。用于提高本发明的经遗传修饰的宿主细胞中L-天冬氨酸产生的能量效率的两种酶是尿素酶(EC3.5.1.5)和L-天冬氨酸通透酶。

尿素酶

氨是使用L-天冬氨酸脱氢酶进行L-天冬氨酸产生所必需的共底物，并且必须向发酵物提供氮源以用于L-天冬氨酸产生。发酵产生小分子产物的两种常用氮源是氨和尿素。至少由于三个原因，与氨相比，尿素是首选的氮源。首先，尿素是无毒的，可以高浓度添加；相比之下，氨(工业上另一种常用的氮源)是碱性的，并且高浓度对许多宿主细胞有毒性。其次，尿素是中性电荷，可以跨宿主细胞质膜扩散(即，没有消耗能量用于运输)，并且发酵pH不受其添加到发酵培养基中的影响。相比之下，氨带电荷并且必须被酶促转运到细胞中。第三，尿素的分解还释放出二氧化碳，这是所有L-天冬氨酸生物合成途径中的酶的共底物。氨分解代谢期间不释放CO₂。

尿素酶催化一分子尿素水解成一分子氨基甲酸酯和一分子氨；在酶促产生之后，一分子氨基甲酸酯随后降解为氨和碳酸。因此，总之，尿素酶活性导致每个催化循环产生两个分子尿素和一个分子二氧化碳。重要的是，尿素酶在不消耗ATP的情况下进行此反应。相反，能够催化尿素转化为氨和二氧化碳的替代代谢途径确实需要消耗ATP。例如，许多宿主细胞(包括许多酵母宿主细胞)使用包含尿素羧化酶和allophenate水解酶的尿素分解代谢途径；使用该途径，每分子尿素分解代谢消耗一分子ATP。

在本发明的许多实施方案中，工程化用于产生L-天冬氨酸的宿主细胞表达编码尿素酶的异源核酸。在许多这些实施方案中，表达的尿素酶是粟酒裂殖酵母尿素酶。粟酒裂殖酵母尿素酶由四个蛋白质亚基组成，即Ure2，UreD，UreF和UreG蛋白质。粟酒裂殖酵母尿素酶还使用镍金属作为辅因子，并且在一些实施方案中，工程化宿主细胞表达编码镍转运蛋白的一种或多种异源基因。一种合适的镍转运蛋白是粟酒裂殖酵母Nic1镍转运蛋白。

天冬氨酸通透酶

低成本的L-天冬氨酸产生受益于L-天冬氨酸从胞质溶胶、宿主细胞膜和周围培养基中的排出。同样，希望排出L-天冬氨酸而不需ATP消耗，从而实现更加能量高效的L-天冬氨酸产生。

适用于本发明的工程化宿主细胞中L-天冬氨酸输出的一种L-天冬氨酸转运蛋白是拟南芥SIAR1及其同源物。另一种合适的L-天冬氨酸转运蛋白是拟南芥双向氨基酸转运蛋白1(BAT1)

第5部分：产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸的方法

另一方面，本文提供了通过本发明的重组宿主细胞产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸的方法。在某些实施方案中，这些方法包括以下步骤：(a)在基本上厌氧的条件下，在含有至少一种碳源和一种氮源的培养基中培养本文所述的重组宿主细胞，从而产生L-天冬氨酸；和(b)从培养基中回收所述L-天冬氨酸。在其他实施方案中，这些方法包括以下步骤：(a)在好氧条件下，在含有至少一种碳源和一种氮源的培养基中培养本文所述的重组宿主细胞，从而产生L-天冬氨酸；和(b)从培养基中回收所述L-天冬氨酸。在其他实施方案中，这些方法包括以下步骤：(a)在基本上厌氧的条件下，在含有至少一种碳源和一种氮源的培养基中培养本文所述的重组宿主细胞，从而产生β-丙氨酸；和(b)从培养基中回收所述β-丙氨酸。L-天冬氨酸或β-丙氨酸可以分泌到培养基中。

应理解的是，在本发明的方法中，可以将任何一种或多种异源核酸引入宿主细胞以产生本发明的重组宿主细胞。例如，可以引入异源核酸以赋予宿主细胞L-天冬氨酸发酵途径。重组宿主细胞可以进一步包含编码L-天冬氨酸1-脱羧酶的异源核酸，以赋予重组宿主细胞产生β-丙氨酸的能力。或者，可以引入异源核酸以产生具有生物合成能力的中间宿主细胞，以催化一些所需的代谢反应以赋予L-天冬氨酸或β-丙氨酸生物合成能力。

可以培养本文所述的任何重组宿主细胞以产生和/或分泌L-天冬氨酸或β-丙氨酸。例如，可以培养产生L-天冬氨酸的重组宿主细胞用于L-天冬氨酸的生物合成产生。可以如下文所述分离或处理L-天冬氨酸以产生β-丙氨酸或聚L-天冬氨酸。类似地，可以培养产生β-丙氨酸的重组宿主细胞用于β-丙氨酸的生物合成产生。可以分离β-丙氨酸并进行化学合成β-丙氨酸家族化合物的进一步处理，化合物包括但不限于泛酸，β-丙氨酸烷基酯(例如β-丙氨酸甲酯，β-丙氨酸乙酯，β-丙氨酸丙酯等)和聚(β-丙氨酸)。

本文提供的产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸的方法可以在合适的发酵容器中的合适的发酵液中进行，合适的发酵容器包括但不限于培养板、烧瓶或发酵罐。此外，本发明的方法可以以本领域已知的任何发酵规模进行以支持微生物产生的小分子的工业生产。可以使用任何合适的发酵罐，包括搅拌罐发酵罐，气升式发酵罐，鼓泡塔发酵罐，固定床生物反应器或其任何组合。

在一些实施方案中，发酵液是其中能够产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸的重组宿主细胞可存活(维持生长和/或生存力)的任何发酵液。在一些实施方案中，发酵液是包含可同化碳源、氮源和磷源的水性介质。这种培养基还可以包含适当的盐，矿物质，金属和其他营养素。在一些实施方案中，将碳源和每种基本细胞营养物递增地或连续地提供给发酵液，并且将基本细胞营养基本上维持在生长细胞有效同化所需的最低水平。

在一些实施方案中，培养本文提供的细胞以产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸可以分成几个阶段。例如，细胞培养过程可以分成生长阶段，生产阶段和/或恢复阶段。以下段落提供了可用于这些阶段的具体条件的示例。本领域技术人员将认识到，这些条件可基于使用的宿主细胞、期望的L-天冬氨酸或β-丙氨酸产量、滴度和/或生产力或其他因素而变化。

碳源。提供给发酵液的碳源可以是可以由宿主细胞发酵的任何碳源。合适的碳源包括但不限于单糖，二糖，多糖，乙酸酯，乙醇，甲醇，甲烷或其一种或多种组合。适合根据本发明的方法使用的示例性单糖包括但不限于右旋糖，果糖，半乳糖，木糖，阿拉伯糖及其组合。适合根据本发明的方法使用的示例性二糖包括但不限于蔗糖，乳糖，麦芽糖，海藻糖，纤维二糖及其组合。适合根据本发明的方法使用的示例性多糖包括但不限于淀粉，糖原，纤维素及其组合。在一些实施方案中，碳源是葡萄糖。在其他实施方案中，碳源是蔗糖。

氮。L-天冬氨酸或β-丙氨酸的每个分子均包含氮原子，并且为了以高产率产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸，必须在宿主细胞培养期间向发酵液提供合适的可同化氮源。如本文所用，可同化的氮是指能够被本发明的宿主细胞代谢并用于产生L-天冬氨酸的氮。氮源可以是任何可被宿主细胞利用的可同化氮源，包括但不限于无水氨，硫酸铵，硝酸铵，磷酸二铵，磷酸一铵，多磷酸铵，硝酸钠，尿素，蛋白胨，蛋白质水解产物和酵母提取物。在一个实施方案中，氮源是无水氨。在另一个实施方案中，氮源是硫酸铵。在又一个实施方案中，氮源是尿素。本领域技术人员将认识到，可同化的氮的摩尔数取决于氮源，并且例如1摩尔的无水氨(NH₃)包含1摩尔可同化的氮，而1摩尔的磷酸二铵(NH₄)₂PO₄包含2摩尔可同化的氮。

必须在宿主细胞培养期间向发酵提供最小量的可同化氮以实现高L-天冬氨酸或β-丙氨酸产量。在本文提供的方法的其中碳源是右旋糖的某些实施方式中，在宿主细胞培养期间提供给发酵液的可同化氮与右旋糖的摩尔比为至少0.25:1，至少0.5:1，至少0.75:1，1：1，至少1.25：1，至少1.5：1，至少1.75：1，至少2：1或大于2：1。在本文提供的方法的其中碳源是蔗糖的某些实施方案中，可同化的氮与蔗糖的摩尔比为至少0.1:1，至少0.2:1，至少0.3:1，至少0.4:1，至少0.5：1，至少0.6：1，至少0.7：1，至少0.8：1，至少0.9：1，至少1：1或大于1：1。

pH。培养基的pH可通过向培养基中加入酸或碱来控制。优选地，将pH保持在约3.0至约8.0。

天冬氨酸在水中表现出相对低的溶解度并将从溶液中结晶。仅约6g/l的天冬氨酸在30℃下是可溶的。当L-天冬氨酸的完全质子化的天冬氨酸形式的浓度增加至高于溶解度极限时发生结晶。出于几个原因，在发酵过程中结晶天冬氨酸是有利的。首先，结晶提供天冬氨酸沉降，使得跨细胞膜保持高浓度梯度并且有助于增加产物输出到宿主细胞外的动力学。其次，从发酵溶液中结晶的L-天冬氨酸可以更容易地从大部分细胞和发酵液中分离出来，完成纯化步骤。

为了促进有效的纯化，在许多情况下，希望大部分L-天冬氨酸在纯化之前处于不溶的结晶形式(即结晶的天冬氨酸)。优选地，在从发酵液中纯化天冬氨酸之前，多于约50g/l的天冬氨酸呈不溶的结晶形式。更优选地，在从发酵液中纯化天冬氨酸之前，产生的多于约75g/l的天冬氨酸是不溶的结晶的形式。

为了从发酵液中结晶天冬氨酸，在L-天冬氨酸纯化之前，应将发酵液的pH降低至低于pH 3.86，即天冬氨酸R-链的pKa。在发酵过程中(即，当宿主细胞产生天冬氨酸时)，发酵液的pH值可以降低，并且/或者在发酵结束时可以降低发酵液的pH值。由于天冬氨酸的内源性产生，发酵液pH可降低，和/或由于向发酵添加酸，发酵液pH可降低。合适的酸的非限制性实例包括天冬氨酸，乙酸，盐酸和硫酸。

温度。发酵液的温度可以是适合重组宿主细胞生长和/或产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸的任何温度。优选地，在宿主细胞产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸期间，发酵液的温度保持在约20℃至约45℃的范围内，优选在约25℃至约37℃的范围内，并且更优选在约28℃至约32℃的范围内。

氧。在培养期间，选择通气和搅拌条件以产生期望的氧摄取率。在各种实施方案中，选择条件以产生约0-25mmol/l/hr的氧摄取率。在一些实施方案中，选择条件以产生约2.5-15mmol/l/hr的氧摄取率。如本文所用的氧摄取率是指在发酵过程中消耗氧的体积速率。通过废气分析，例如通过质谱仪可以测量入口和出口氧浓度。氧摄取率可以由本领域的普通技术人员使用Bioreaction Engineering Principles 3^rdEdition,2011,SpringScience+Business Media,p.449中描述的直接方法计算。

虽然本文所述的L-天冬氨酸途径优选用于在基本上厌氧的条件下产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸，但它们能够在一定的氧浓度范围下产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸。在一些实施方案中，L-天冬氨酸途径在好氧条件下产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸。在优选的实施方案中，L-天冬氨酸途径在基本上厌氧的条件下产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸。

为了降低生产成本，从所提供的碳源和氮源获得L-天冬氨酸或β-丙氨酸的高产率是合乎需要的。如本文所用，产率计算为由本发明的宿主细胞分解代谢并用于产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸的碳源质量的百分比。在一些情况下，提供给发酵液的碳源中仅有一部分通过宿主细胞分解代谢，其余部分在发酵液中未被消耗或被发酵中的污染微生物消耗。因此，重要的是确保发酵液基本上不含污染微生物，和测量发酵完成时未消耗碳源的浓度。例如，如果向宿主细胞提供100克葡萄糖，并且在发酵结束时产生25克β-丙氨酸并保留10克葡萄糖，则β-丙氨酸产率为27.7％(即，来自90克葡萄糖的10克β-丙氨酸)。在本文提供的方法的某些实施方案中，碳源上的L-天冬氨酸盐的最终产率为至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％或大于50％。在某些实施方案中，本文提供的宿主细胞能够将至少80重量％，至少85重量％或至少90重量％的碳源产生为L-天冬氨酸。在本文提供的方法的某些实施方案中，碳源上β-丙氨酸的最终产率为至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％或大于50％。在某些实施方案中，本文提供的宿主细胞能够将至少80重量％，至少85重量％或至少90重量％的碳源产生为β-丙氨酸。

除了产率之外，发酵中产生的L-天冬氨酸或β-丙氨酸的效价或浓度是降低产量的另一个重要指标，并且假定所有其他度量是相等的，则相较于较低的效价优选较高的效价。一般而言，滴度以每升发酵液产生的产物克数(例如L-天冬氨酸或β-丙氨酸)(即g/l)提供。在一些实施方案中，在发酵过程中的某一点，优选在发酵结束时，L-天冬氨酸效价为至少1g/l，至少5g/l，至少10g/l，至少15g/l，至少20g/l，至少25g/l，至少30g/l，至少40g/l，至少50g/l，至少60g/l，至少70g/l，至少80g/l，至少90g/l，至少100g/l或大于100g/l。在其他实施方案中，在发酵过程中的某一点，优选在发酵结束时，β-丙氨酸效价为至少1g/l，至少5g/l，至少10g/l，至少15g/l，至少20g/l，至少25g/l，至少30g/l，至少40g/l，至少50g/l，至少60g/l，至少70g/l，至少80g/l，至少90g/l，至少100g/l或大于100g/l。

此外，生产率或产物(即L-天冬氨酸或β-丙氨酸)形成的速率对于降低生产成本是重要的，并且假设所有其他度量相等，则较高的生产率优于较低的生产率。一般而言，生产率是以每小时每升发酵液产生的产物克数(即，g/l/hr)提供的。在一些实施方案中，在发酵期间的一段时间内L-天冬氨酸生产力为至少0.1g/l，至少0.25g/l，至少0.5g/l，至少0.75g/l，至少1.0g/l，至少1.25g/l，至少1.25g/l，至少1.5g/l或大于1.5g/l。在其他实施方案中，在发酵期间的一段时间内β-丙氨酸生产率为至少0.1g/l，至少0.25g/l，至少0.5g/l，至少0.75g/l，至少1.0g/l，至少1.25g/l，至少1.25g/l，至少1.5g/l或大于1.5g/l。

减少副产物的形成对于降低生产成本也是重要的，并且一般而言，副产物浓度越低，生产成本越低。根据本发明的方法在产生L-天冬氨酸或β-丙氨酸的宿主细胞的生产过程中可能发生的副产物包括乙醇，乙酸和丙酮酸。在本文提供的方法的某些实施方案中，重组宿主细胞以低产率从所提供的碳源产生乙醇。在某些实施方案中，乙醇可以在发酵结束时以10％或更低的产率产生，优选以5％或更低的产率产生。在本文提供的方法的某些实施方案中，重组宿主细胞以低产率从所提供的碳源产生乙酸酯。在某些实施方案中，乙酸盐可以在发酵结束时以10％或更低的产率产生，优选以5％或更低的产率产生。在本文提供的方法的某些实施方案中，重组宿主细胞以低产率从所提供的碳源产生丙酮酸。在某些实施方案中，丙酮酸盐可以在发酵结束时以10％或更低的产率产生，优选以5％或更低的产率产生。

发酵程序对于生物合成产生商业量的L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸是特别有用的。发酵程序可以按比例扩大用于制造L-天冬氨酸或β-丙氨酸。示例性的发酵程序包括例如补料分批发酵和分批产物分离；补料分批发酵和连续产物分离；分批发酵和分批产物分离；和连续发酵和连续产物分离。所有这些工艺在本领域中都是众所周知的。

除了如本文所述的L-天冬氨酸和β-丙氨酸的生物合成之外，本发明的重组宿主细胞和方法也可以彼此组合使用以及与本领域已知的其他微生物和方法的各种组合使用以用于通过其他途径实现产物生物合成。例如，除了使用本发明的产生L-天冬氨酸的宿主细胞和化学转化或除了使用本发明的产生β-丙氨酸的宿主细胞之外，产物β-丙氨酸的一种替代方式是通过添加能够将L-天冬氨酸转化为β-丙氨酸的第二种微生物。

一种这样的程序包括例如培养本发明的产生L-天冬氨酸的宿主细胞以产生如本文所述的L-天冬氨酸。然后L-天冬氨酸可用作将L-天冬氨酸转化成β-丙氨酸的第二种微生物的底物。可以将L-天冬氨酸直接添加到第二种微生物的另一种培养物中，或者可以通过例如细胞分离去除原始培养物中产生L-天冬氨酸的微生物，并且第二种微生物能够从以足够的量添加到培养物中以使得能够从发酵液中的L-天冬氨酸产生β-丙氨酸的L-天冬氨酸产生β-丙氨酸。

实施例

实施例1：构建表达L-天冬氨酸脱氢酶的工程化库德里阿兹威毕赤酵母菌株及其在酵母中产生L-天冬氨酸盐中的应用

编码不同L-天冬氨酸脱氢酶的核酸对于酵母进行密码子优化、合成并整合到库德里阿兹威毕赤酵母基因组中；L-天冬氨酸脱氢酶的体内表达导致产生L-天冬氨酸。编码每种L-天冬氨酸脱氢酶的经密码子优化的DNA首先由商业DNA合成公司(例如，Gen9，Inc.)合成。然后通过PCR使用引物扩增合成的DNA，以添加帮助将DNA分子克隆克隆到表达构建体中的DNA序列。所用的引物如下(列为由模板DNA编码的蛋白质的UniProt ID，正向引物的名称和序列，反向引物的名称和序列)：Q9HYA4编码模板DNA,YO1504正向引物(5’-CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGTTGAATATCGTTATGATTGGTTG-3’)和YO1505反向引物(5’-GAGTATGGATTTTACTGGCTGGATTAAATAGAGATAGCGTGAGCATG)；B3R8S4编码模板DNA,YO1506正向引物(5’-CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGTTGCACGTTTCTATGGTTGG-3’)和YO1507反向引物(5’-GAGTATGGATTTTACTGGCTGGATTAGATAGAAACGGCGTGGG-3’)；Q8XRV9编码模板DNA,YO1508正向引物(5’-CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGTTACATGTTTCTATGGTCGG-3’)和YO1509反向引物(5’-GAGTATGGATTTTACTGGCTGGATTAGATAGAGACAGCATGAGCTC-3’)；Q126F5编码模板DNA,YO1510正向引物(5’-CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGTTGAAGATCGCTATGATTGG-3’)和YO1511反向引物(5’-GAGTATGGATTTTACTGGCTGGATTAAATAACCAAAGCTCTACCTCTG-3’)；Q2T559编码模板DNA,YO1512正向引物(5’-CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGAGAAACGCTCATGCCC-3’)和YO1513反向引物(5’-GAGTATGGATTTTACTGGCTGGATTAAATGACACAATGGGAAGCAC-3’)；Q3JFK2编码模板DNA,YO1514正向引物(5’-CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGCGTAACGCCCATGCTC-3’)和YO1515反向引物(5’-GAGTATGGATTTTACTGGCTGGATTAAATAACACAATGGGAGGCTC-3’)；A6X792编码模板DNA,YO1516正向引物(5’-CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGTCTGTCTCTGAAACTATCGTC-3’)和YO1517反向引物(5’-GAGTATGGATTTTACTGGCTGGATTAAATAACGGTGGTAGCAACTC-3’)；D6JRV1编码模板DNA,YO1518正向引物(5’-CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGAAGAAGTTGATGATGATCGG-3’)和YO1519反向引物(5’-GAGTATGGATTTTACTGGCTGGATTAAATTTGGATGGCCTCAACAG-3’)；A6TDT8编码模板DNA,YO1520正向引物(5’-CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGATGAAGAAGGTCATGTTAATTG-3’)和YO1521反向引物(5’-GAGTATGGATTTTACTGGCTGGATTAGGCCAATTCTCTACAAGC-3’)；A8LLH8编码模板DNA,YO1522正向引物(5’-CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGAGATTGGCTTTGATCGG-3’)和YO1523反向引物(5’-GAGTATGGATTTTACTGGCTGGATTAAACAACCCAGGCAGCG-3’)；Q5LPG8编码模板DNA,YO1524正向引物(5’-CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGTGGAAGTTGTGGGGTTC-3’)和YO1525反向引物(5’-GAGTATGGATTTTACTGGCTGGATTAGAAGGATGGTCTAATGGCAG-3’)；DOIX49编码模板DNA,YO1526编码正向引物(5’-CACAAACAAACACAATTACAAAAAATGAAAAACATCGCCTTAATTGG-3’)和YO1527编码反向引物(5’-GAGTATGGATTTTACTGGCTGGATTAAATAGCCAATGGAGCGAC-3’)。对于编码L-天冬氨酸脱氢酶Q46VA0的DNA，在合成期间包括与分子克隆所需的相邻部分具有同源性的5'-和3'-DNA序列，并且在克隆编码Q46VA0的DNA时不使用PCR扩增步骤。

使用常规分子克隆方法在含有氨苄青霉素抗性盒和pUC复制起点的质粒载体中将得到的DNA片段纯化并克隆到库德里阿兹威毕赤酵母TDH1启动子的下游和酿酒酵母GRE3终止子的上游，其在5'由库德里阿兹威毕赤酵母Adh6c基因上游的473bp序列侧接和在3'由Ura3选择标记的非功能性部分侧接。将得到的质粒转化到大肠杆菌感受态宿主细胞中并在含有Amp¹⁰⁰的LB琼脂平板上选择。在37℃孵育过夜后，将单个菌落接种于在振荡器上于37℃下过夜生长的5mlLB-Amp¹⁰⁰，然后分离质粒并通过测序确认构建体的同一性和完整性，产生质粒s393-405。类似地构建了含有Ura3标记的剩余部分和对应于库德里阿兹威毕赤酵母Adh6c基因下游385bp的区域的用于基因组整合的互补构建体，以产生质粒s376。

将库德里阿兹威毕赤酵母菌株LPK15434用作用于L-天冬氨酸脱氢酶表达构建体的基因组整合的背景菌株。LPK15434是通过缺失URA3基因从野生型库德里阿兹威毕赤酵母产生的尿嘧啶营养缺陷型。首先用限制酶MssI消化编码各种L-天冬氨酸脱氢酶表达盒的质粒(s393-405)以释放线性整合盒并使用标准程序与MssI消化的s376共转化到宿主菌株中，并在缺乏尿嘧啶的确定琼脂培养基上进行选择。在30℃孵育3天后，将尿嘧啶原养型转化体在缺乏尿嘧啶的选择培养基上重新划线，并且通过PCR证实了L-天冬氨酸脱氢酶表达盒的正确整合。

将PCR验证的转化体(每种菌株2-6个)与对照菌株LPK15419一起接种到含有0.5ml培养基(YNB，2％葡萄糖，100mM柠檬酸盐缓冲液pH 5.0)的96孔板中，并在30℃生长3天，在保持在80％r.h的培养箱中以50mm投掷(throw)以300rpm摇动。对照菌株LPK15419与LPK15434相同，除了URA3基因未被缺失。3天后，将培养物沉淀，并将培养基上清液在0.2微米PVDF膜上过滤并在4℃下储存直至分析。

对于HPLC分析，根据标准程序用一倍体积的邻苯二甲醛试剂衍生样品和L-天冬氨酸标准物，并立即在如下配置的Shimadzu HPLC系统上分析：40℃的Agilent C18Plus(2.1×150mm，5μm)柱，在340nm处的UV检测器；0.4mL/分钟等梯度流动相(40mM NaH₂PO₄，pH＝7.8)流动；5μL进样量；总运行时间18分钟。

对照菌株LPK15419不产生可检测量的L-天冬氨酸。在为表达L-天冬氨酸脱氢酶蛋白而工程化的LPK15434背景中，测量了可检测水平的L-天冬氨酸。以下L-天冬氨酸脱氢酶蛋白的表达导致指示量的L-天冬氨酸(平均值+/-标准偏差)：Q9HYA4,13±2mg/L；B3R8S4,9±0mg/L；Q8XRV9,13±3mg/L；Q126F5,13±1mg/L；Q2T559,11±1mg/L；Q3JFK2,15±2mg/L；A6X792,13±3mg/L；D6JRV1,13±4mg/L；A6TDT8,12±1mg/L；A8LLH8,11±2mg/L；Q5LPG8,14±1mg/L；D0IX49,12±2mg/L；和Q46VA0,10±2mg/L。因此，表达异源L-天冬氨酸脱氢酶蛋白质的所有工程化库德里阿兹威毕赤酵母菌株导致产生L-天冬氨酸，而在亲代、对照菌株中未观察到L-天冬氨酸。根据本发明，该实施例证明用于产生L-天冬氨酸的工程化库德里阿兹威毕赤酵母中编码L-天冬氨酸脱氢酶蛋白的核酸的表达。

序列表

SEQ ID NO：1。铜绿假单胞菌L-天冬氨酸脱氢酶。

1-MLNIVMIGCG AIGAGVLELL ENDPQLRVDA VIVPRDSETQ

41-VRHRLASLRR PPRVLSALPA GERPDLLVEC AGHRAIEQHV

81-LPALAQGIPC LVVSVGALSE PGLVERLEAA AQAGGSRIEL

121-LPGAIGAIDA LSAARVGGLE SVRYTGRKPA SAWLGTPGET

161-VCDLQRLEKA RVIFDGSARE AARLYPKNAN VAATLSLAGL

201-GLDRTQVRLI ADPESCENVH QVEASGAFGG FELTLRGKPL

241-AANPKTSALT VYSVVRALGN HAHAISI-267

SEQ ID NO：2。Cupriavidus taiwanensis L-天冬氨酸脱氢酶。

1-MLHVSMVGCG AIGRGVLELL KSDPDVVFDV VIVPEHTMDE

41-ARGAVSALAP RARVATHLDD QRPDLLVECA GHHALEEHIV

81-PALERGIPCM VVSVGALSEP GMAERLEAAA RRGGTQVQLL

121-SGAIGAIDAL AAARVGGLDE VIYTGRKPAR AWTGTPAEQL

161-FDLEALTEAT VIFEGTARDA ARLYPKNANV AATVSLAGLG

201-LDRTAVKLLA DPHAVENVHH VEARGAFGGF ELTMRGKPLA

241-ANPKTSALTV FSVVRALGNR AHAVSI-266

SEQ ID NO：3。赤拟谷盗L-天冬氨酸1-脱羧酶。

1-MPATGEDQDL VQDLIEEPAT FSDAVLSSDE ELFHQKCPKP

41-APIYSPISKP VSFESLPNRR LHEEFLRSSV DVLLQEAVFE

81-GTNRKNRVLQ WREPEELRRL MDFGVRGAPS THEELLEVLK

121-KVVTYSVKTG HPYFVNQLFS AVDPYGLVAQ WATDALNPSV

161-YTYEVSPVFV LMEEVVLREM RAIVGFEGGK GDGIFCPGGS

201-IANGYAISCA RYRFMPDIKK KGLHSLPRLV LFTSEDAHYS

241-IKKLASFEGI GTDNVYLIRT DARGRMDVSH LVEEIERSLR

281-EGAAPFMVSA TAGTTVIGAF DPIEKIADVC QKYKLWLHVD

321-AAWGGGALVS AKHRHLLKGI ERADSVTWNP HKLLTAPQQC

361-STLLLRHEGV LAEAHSTNAA YLFQKDKFYD TKYDTGDKHI

401-QCGRRADVLK FWFMWKAKGT SGLEKHVDKV FENARFFTDC

441-IKNREGFEMV IAEPEYTNIC FWYVPKSLRG RKDEADYKDK

481-LHKVAPRIKE RMMKEGSMMV TYQAQKGHPN FFRIVFQNSG

521-LDKADMVHFV EEIERLGSDL-540

SEQ ID NO：4。谷氨酸棒状杆菌L-天冬氨酸1-脱羧酶。

1-MLRTILGSKI HRATVTQADL DYVGSVTIDA DLVHAAGLIE

41-GEKVAIVDIT NGARLETYVI VGDAGTGNIC INGAAAHLIN

81-PGDLVIIMSY LQATDAEAKA YEPKIVHVDA DNRIVALGND

121-LAEALPGSGL LTSRSI-136

SEQ ID NO：5。枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸1-脱羧酶。

1-MYRTMMSGKL HRATVTEANL NYVGSITIDE DLIDAVGMLP

41-NEKVQIVNNN NGARLETYII PGKRGSGVIC LNGAAARLVQ

81-EGDKVIIISY KMMSDQEAAS HEPKVAVLND QNKIEQMLGN

121-EPARTIL-127

SEQ ID NO：6。产琥珀酸曼氏杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶。

1-MTDLNQLTQE LGALGIHDVQ EVVYNPSYEL LFAEETKPGL

41-EGYEKGTVTN QGAVAVNTGI FTGRSPKDKY IVLDDKTKDT

81-VWWTSEKVKN DNKPMSQDTW NSLKGLVADQ LSGKRLFVVD

121-AFCGANKDTR LAVRVVTEVA WQAHFVTNMF IRPSAEELKG

161-FKPDFVVMNG AKCTNPNWKE QGLNSENFVA FNITEGVQLI

201-GGTWYGGEMK KGMFSMMNYF LPLRGIASMH CSANVGKDGD

241-TAIFFGLSGT GKTTLSTDPK RQLIGDDEHG WDDEGVFNFE

281-GGCYAKTINL SAENEPDIYG AIKRDALLEN VVVLDNGDVD

321-YADGSKTENT RVSYPIYHIQ NIVKPVSKAG PATKVIFLSA

361-DAFGVLPPVS KLTPEQTKYY FLSGFTAKLA GTERGITEPT

401-PTFSACFGAA FLSLHPTQYA EVLVKRMQES GAEAYLVNTG

441-WNGTGKRISI KDTRGIIDAI LDGSIDKAEM GSLPIFDFSI

481-PKALPGVNPA ILDPRDTYAD KAQWEEKAQD LAGRFVKNFE

521-KYTGTAEGQA LVAAGPKA-538

SEQ ID NO：7。米曲霉丙酮酸羧化酶氨基酸序列。

1-MAAPFRQPEE AVDDTEFIDD HHEHLRDTVH HRLRANSSIM

41-HFQKILVANR GEIPIRIFRT AHELSLQTVA IYSHEDRLSM

81-HRQKADEAYM IGHRGQYTPV GAYLAGDEII KIALEHGVQL

121-IHPGYGFLSE NADFARKVEN AGIVFVGPTP DTIDSLGDKV

161-SARRLAIKCE VPVVPGTEGP VERYEEVKAF TDTYGFPIII

201-KAAFGGGGRG MRVVRDQAEL RDSFERATSE ARSAFGNGTV

241-FVERFLDKPK HIEVQLLGDS HGNVVHLFER DCSVQRRHQK

281-VVEVAPAKDL PADVRDRILA DAVKLAKSVN YRNAGTAEFL

321-VDQQNRHYFI EINPRIQVEH TITEEITGID IVAAQIQIAA

361-GASLEQLGLT QDRISARGFA IQCRITTEDP AKGFSPDTGK

401-IEVYRSAGGN GVRLDGGNGF AGAIITPHYD SMLVKCTCRG

441-STYEIARRKV VRALVEFRIR GVKTNIPFLT SLLSHPTFVD

481-GNCWTTFIDD TPELFSLVGS QNRAQKLLAY LGDVAVNGSS

521-IKGQIGEPKL KGDVIKPKLF DAEGKPLDVS APCTKGWKQI

561-LDREGPAAFA KAVRANKGCL IMDTTWRDAH QSLLATRVRT

601-IDLLNIAHET SYAYSNAYSL ECWGGATFDV AMRFLYEDPW

641-DRLRKMRKAV PNIPFQMLLR GANGVAYSSL PDNAIYHFCK

681-QAKKCGVDIF RVFDALNDVD QLEVGIKAVH AAEGVVEATM

721-CYSGDMLNPH KKYNLEYYMA LVDKIVAMKP HILGIKDMAG

761-VLKPQAARLL VGSIRQRYPD LPIHVHTHDS AGTGVASMIA

801-CAQAGADAVD AATDSMSGMT SQPSIGAILA SLEGTEQDPG

841-LNLAHVRAID SYWAQLRLLY SPFEAGLTGP DPEVYEHEIP

881-GGQLTNLIFQ ASQLGLGQQW AETKKAYEAA NDLLGDIVKV

921-TPTSKVVGDL AQFMVSNKLT PEDVVERAGE LDFPGSVLEF

961-LEGLMGQPFG GFPEPLRSRA LRDRRKLEKR PGLYLEPLDL

1001-AKIKSQIREK FGAATEYDVA SYAMYPKVFE DYKKFVQKFG

1041-DLSVLPTRYF LAKPEIGEEF HVELEKGKVL ILKLLAIGPL

1081-SEQTGQREVF YEVNGEVRQV AVDDNKASVD NTSRPKADVG

1121-DSSQVGAPMS GVVVEIRVHD GLEVKKGDPL AVLSAMKMEM

1161-VISAPHSGKV SSLLVKEGDS VDGQDLVCKI VKA-1193

SEQ ID NO：8。大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶氨基酸序列。

1-MNEQYSALRS NVSMLGKVLG ETIKDALGEH ILERVETIRK

41-LSKSSRAGND ANRQELLTTL QNLSNDELLP VARAFSQFLN

81-LANTAEQYHS ISPKGEAASN PEVIARTLRK LKNQPELSED

121-TIKKAVESLS LELVLTAHPT EITRRTLIHK MVEVNACLKQ

161-LDNKDIADYE HNQLMRRLRQ LIAQSWHTDE IRKLRPSPVD

201-EAKWGFAVVE NSLWQGVPNY LRELNEQLEE NLGYKLPVEF

241-VPVRFTSWMG GDRDGNPNVT ADITRHVLLL SRWKATDLFL

281-KDIQVLVSEL SMVEATPELL ALVGEEGAAE PYRYLMKNLR

321-SRLMATQAWL EARLKGEELP KPEGLLTQNE ELWEPLYACY

361-QSLQACGMGI IANGDLLDTL RRVKCFGVPL VRIDIRQEST

401-RHTEALGELT RYLGIGDYES WSEADKQAFL IRELNSKRPL

441-LPRNWQPSAE TREVLDTCQV IAEAPQGSIA AYVISMAKTP

481-SDVLAVHLLL KEAGIGFAMP VAPLFETLDD LNNANDVMTQ

521-LLNIDWYRGL IQGKQMVMIG YSDSAKDAGV MAASWAQYQA

561-QDALIKTCEK AGIELTLFHG RGGSIGRGGA PAHAALLSQP

601-PGSLKGGLRV TEQGEMIRFK YGLPEITVSS LSLYTGAILE

641-ANLLPPPEPK ESWRRIMDEL SVISCDVYRG YVRENKDFVP

681-YFRSATPEQE LGKLPLGSRP AKRRPTGGVE SLRAIPWIFA

721-WTQNRLMLPA WLGAGTALQK VVEDGKQSEL EAMCRDWPFF

761-STRLGMLEMV FAKADLWLAE YYDQRLVDKA LWPLGKELRN

801-LQEEDIKVVL AIANDSHLMA DLPWIAESIQ LRNIYTDPLN

841-VLQAELLHRS RQAEKEGQEP DPRVEQALMV TIAGIAAGMR

881-NTG-883

SEQ ID NO：9。库德里阿兹威毕赤酵母丙酮酸脱羧酶。

1-MTDKISLGTY LFEKLKEAGS YSIFGVPGDF NLALLDHVKE

41-VEGIRWVGNA NELNAGYEAD GYARINGFAS LITTFGVGEL

81-SAVNAIAGSY AEHVPLIHIV GMPSLSAMKN NLLLHHTLGD

121-TRFDNFTEMS KKISAKVEIV YDLESAPKLI NNLIETAYHT

161-KRPVYLGLPS NFADELVPAA LVKENKLHLE EPLNNPVAEE

201-EFIHNVVEMV KKAEKPIILV DACAARHNIS KEVRELAKLT

241-KFPVFTTPMG KSTVDEDDEE FFGLYLGSLS APDVKDIVGP

281-TDCILSLGGL PSDFNTGSFS YGYTTKNVVE FHSNYCKFKS

321-ATYENLMMKG AVQRLISELK NIKYSNVSTL SPPKSKFAYE

361-SAKVAPEGII TQDYLWKRLS YFLKPRDIIV TETGTSSFGV

401-LATHLPRDSK SISQVLWGSI GFSLPAAVGA AFAAEDAHKQ

441-TGEQERRTVL FIGDGSLQLT VQSISDAARW NIKPYIFILN

481-NRGYTIEKLI HGRHEDYNQI QPWDHQLLLK LFADKTQYEN

521-HVVKSAKDLD ALMKDEAFNK EDKIRVIELF LDEFDAPEIL

561-VAQAKLSDEI NSKAA-575

SEQ ID NO：10。酿酒酵母PDC1。

1-MSEITLGKYL FERLKQVNVN TVFGLPGDFN LSLLDKIYEV

41-EGMRWAGNAN ELNAAYAADG YARIKGMSCI ITTFGVGELS

81-ALNGIAGSYA EHVGVLHVVG VPSISAQAKQ LLLHHTLGNG

121-DFTVFHRMSA NISETTAMIT DIATAPAEID RCIRTTYVTQ

161-RPVYLGLPAN LVDLNVPAKL LQTPIDMSLK PNDAESEKEV

201-IDTILALVKD AKNPVILADA CCSRHDVKAE TKKLIDLTQF

241-PAFVTPMGKG SIDEQHPRYG GVYVGTLSKP EVKEAVESAD

281-LILSVGALLS DFNTGSFSYS YKTKNIVEFH SDHMKIRNAT

321-FPGVQMKFVL QKLLTTIADA AKGYKPVAVP ARTPANAAVP

361-ASTPLKQEWM WNQLGNFLQE GDVVIAETGT SAFGINQTTF

401-PNNTYGISQV LWGSIGFTTG ATLGAAFAAE EIDPKKRVIL

441-FIGDGSLQLT VQEISTMIRW GLKPYLFVLN NDGYTIEKLI

481-HGPKAQYNEI QGWDHLSLLP TFGAKDYETH RVATTGEWDK

521-LTQDKSFNDN SKIRMIEIML PVFDAPQNLV EQAKLTAATN

561-AKQ-563

SEQ ID NO：11。库德里阿兹威毕赤酵母醇脱氢酶(ADH1)。

1-MFASTFRSQA VRAARFTRFQ STFAIPEKQM GVIFETHGGP

41-LQYKEIPVPK PKPTEILINV KYSGVCHTDL HAWKGDWPLP

81-AKLPLVGGHE GAGIVVAKGS AVTNFEIGDY AGIKWLNGSC

121-MSCEFCEQGD ESNCEHADLS GYTHDGSFQQ YATADAIQAA

161-KIPKGTDLSE VAPILCAGVT VYKALKTADL RAGQWVAISG

201-AAGGLGSLAV QYAKAMGLRV LGIDGGEGKK ELFEQCGGDV

241-FIDFTRYPRD APEKMVADIK AATNGLGPHG VINVSVSPAA

281-ISQSCDYVRA TGKVVLVGMP SGAVCKSDVF THVVKSLQIK

321-GSYVGNRADT REALEFFNEG KVRSPIKVVP LSTLPEIYEL

361-MEQGKILGRY VVDTSK-376

SEQ ID NO：12。库德里阿兹威毕赤酵母甘油3-磷酸脱氢酶。

1-MVSPAERLST IASTIKPNRK DSTSLQPEDY PEHPFKVTVV

41-GSGNWGCTIA KVIAENTVER PRQFQRDVNM WVYEELIEGE

81-KLTEIINTKH ENVKYLPGIK LPVNVVAVPD IVEACAGSDL

121-IVFNIPHQFL PRILSQLKGK VNPKARAISC LKGLDVNPNG

161-CKLLSTVITE ELGIYCGALS GANLAPEVAQ CKWSETTVAY

201-TIPDDFRGKG KDIDHQILKS LFHRPYFHVR VISDVAGISI

241-AGALKNVVAM AAGFVEGLGW GDNAKAAVMR IGLVETIQFA

281-KTFFDGCHAA TFTHESAGVA DLITTCAGGR NVRVGRYMAQ

321-HSVSATEAEE KLLNGQSCQG IHTTREVYEF LSNMGRTDEF

361-PLFTTTYRII YENFPIEKLP ECLEPVED-388

SEQ ID NO：13。库德里阿兹威毕赤酵母胞质苹果酸脱氢酶

1-MSNVKVALLG AAGGIGQPLA LLLKLNPNIT HLALYDVVHV

41-PGVAADLHHI DTDVVITHHL KDEDGTALAN ALKDATFVIV

81-PAGVPRKPGM TRGDLFTINA GICAELANAI SLNAPNAFTL

121-VITNPVNSTV PIFKEIFAKN EAFNPRRLFG VTALDHVRSN

161-TFLSELIDGK NPQHFDVTVV GGHSGNSIVP LFSLVKAAEN

201-LDDEIIDALI HRVQYGGDEV VEAKSGAGSA TLSMAYAANK

241-FFNILLNGYL GLKKTMISSY VFLDDSINGV PQLKENLSKL

281-LKGSEVELPT YLAVPMTYGK EGIEQVFYDW VFEMSPKEKE

321-NFITAIEYID QNIEKGLNFM VR-342

SEQ ID NO：14。L-天冬氨酸脱氢酶共有序列

1-MLHIAMIGCG AIGAGVLELL KSDPDLRVDA VIVPEESMDA

41-VREAVAALAP VARVLTALPA DARPDLLVEC AGHRAIEEHV

81-VPALERGIPC AVASVGALSE PGLAERLEAA ARRGGTQVQL

121-LSGAIGAIDA LAAARVGGLD SVVYTGRKPP LAWKGTPAEQ

161-VCDLDALTEA TVIFEGSARE AARLYPKNAN VAATLSLAGL

201-GLDRTQVRLI ADPAVTENVH HVEARGAFGG FELTMRGKPL

241-AANPKTSALT VYSVVRALGN RAHALSI-267

SEQ ID NO：15。细菌L-天冬氨酸1-脱羧酶共有序列

1-MLRTMLKSKI HRATVTQADL HYVGSVTIDA DLLDAADILE

41-GEKVAIVDIT NGARLETYVI AGERGSGVIG INGAAAHLVH

81-PGDLVIIIAY AQMSDAEARA YEPRVVFVDA DNRIVE-LGN

121-DPAEALPGG-129

SEQ ID NO：16。真核生物L-天冬氨酸1-脱羧酶共有序列

1-MPANGNFPVA LEVISIFKPY NSAVEDLASM AKTDTSASSS

41-GSDSAGSSED EDVQLFASKG NLLNSKLLKK SNNNNKNNNI

81-NENNNKNAAA GLKRFASLPN RAEHEEFLRD CVDEILKLAV

121-FEGTNRSSKV VEWHDPEELK KLFDFELRAE PDSHEKLLEL

161-LRATIRYSVK TGHPYFVNQL FSSVDPYGLV GQWLTDALNP

201-SVYTYEVAPV FTLMEEVVLR EMRRIVGFPN DGEGDGIFCP

241-GGSIANGYAI SCARYKYAPE VKKKGLHSLP RLVIFTSEDA

281-HYSVKKLASF MGIGSDNVYK IATDEVGKMR VSDLEQEILR

321-ALDEGAQPFM VSATAGTTVI GAFDPLEGIA DLCKKYNLWM

361-HVDAAWGGGA LMSKKYRHLL KGIERADSVT WNPHKLLAAP

401-QQCSTFLTRH EGILSECHST NATYLFQKDK FYDTSYDTGD

441-KHIQCGRRAD VLKFWFMWKA KGTSGFEAHV DKVFENAEYF

481-TDSIKARPGF ELVIEEPECT NICFWYVPPS LRGMERDNAE

521-FYEKLHKVAP KIKERMIKEG SMMITYQPLR DLPNFFRLVL

561-QNSGLDKSDM LYFINEIERL GSDLV-585

SEQ ID NO：17。青枯雷尔氏菌L-天冬氨酸脱氢酶。

1-MLHVSMVGCG AIGQGVLELL KSDPDLCFDT VIVPEHGMDR

41-ARAAIAPFAP RTRVMTRLPA QADRPDLLVE CAGHDALREH

81-VVPALEQGID CLVVSVGALS EPGLAERLEA AARRGHAQMQ

121-LLSGAIGAID ALAAARVGGL DAVVYTGRKP PRAWKGTPAE

161-RQFDLDALDR TTVIFEGKAS DAALLFPKNA NVAATLALAG

201-LGMERTHVRL LADPTIDENI HHVEARGAFG GFELIMRGKP

241-LAANPKTSAL TVFSVVRALG NRAHAVSI-268

SEQ ID NO：18。Polaromonas sp.L-天冬氨酸脱氢酶。

1-MLKIAMIGCG AIGASVLELL HGDSDVVVDR VITVPEARDR

41-TEIAVARWAP RARVLEVLAA DDAPDLVVEC AGHGAIAAHV

81-VPALERGIPC VVTSVGALSA PGMAQLLEQA ARRGKTQVQL

121-LSGAIGGIDA LAAARVGGLD SVVYTGRKPP MAWKGTPAEA

161-VCDLDSLTVA HCIFDGSAEQ AAQLYPKNAN VAATLSLAGL

201-GLKRTQVQLF ADPGVSENVH HVAAHGAFGS FELTMRGRPL

241-AANPKTSALT VYSVVRALLN RGRALVI-267

SEQ ID NO：19。Burkholderia thailandensis L-天冬氨酸脱氢酶。

1-MRNAHAPVDV AMIGFGAIGA AVYRAVEHDA ALRVAHVIVP

41-EHQCDAVRGA LGERVDVVSS VDALAYRPQF ALECAGHGAL

81-VDHVVPLLRA GTDCAVASIG ALSDLALLDA LSEAADEGGA

121-TLTLLSGAIG GVDALAAAKQ GGLDEVQYIG RKPPLGWLGT

161-PAEALCDLRA MTAEQTIFEG SARDAARLYP KNANVAATVA

201-LAGVGLDATK VRLIADPAVT RNVHRVVARG AFGEMSIEMS

241-GKPLPDNPKT SALTAFSAIR ALRNRASHCV我-271

SEQ ID NO：20。类鼻疽伯克霍尔德菌L-天冬氨酸脱氢酶。

1-MRNAHAPVDV AMIGFGAIGA AVYRAVEHDA ALRVAHVIVP

41-EHQCDAVRGA LGERVDVVSS VDALACRPQF ALECAGHGAL

81-VDHVVPLLKA GTDCAVASIG ALSDLALLDA LSNAADAGGA

121-TLTLLSGAIG GIDALAAARQ GGLDEVRYIG RKPPLGWLGT

161-PAEAICDLRA MAAEQTIFEG SARDAAQLYP RNANVAATIA

201-LAGVGLDATR VCLIADPAVT RNVHRIVARG AFGEMSIEMS

241-GKPLPDNPKT SALTAFSAIR ALRNRASHCV我-271

SEQ ID NO：21。人苍白杆菌L-天冬氨酸脱氢酶。

1-MSVSETIVLV GWGAIGKRVA DLLAERKSSV RIGAVAVRDR

41-SASRDRLPAG AVLIENPAEL AASGASLVVE AAGRPSVLPW

81-GEAALSTGMD FAVSSTSAFV DDALFQRLKD AAAASGAKLI

121-IPPGALGGID ALSAASRLSI ESVEHRIIKP AKAWAGTQAA

161-QLVPLDEISE ATVFFTDTAR KAADAFPQNA NVAVITSLAG

201-IGLDRTRVTL VADPAARLNT HEIIAEGDFG RMHLRFENGP

241-LATNPKSSEM TALNLVRAIE NRVATTVI-268

SEQ ID NO：22。不动杆菌属的种(Acinetobacter sp.)SH024 L-天冬氨酸脱氢酶。

1-MKKLMMIGFG AMAAEVYAHL PQDLQLKWIV VPSRSIEKVQ

41-SQVSSEIQVI SDIEQCDGTP DYVIEVAGQA AVKEHAQKVL

81-AKGWTIGLIS VGTLADSEFL IQLKQTAEKN DAHLHLLAGA

121-IAGIDGISAA KEGGLQKVTY KGCKSPKSWK GSYAEQLVDL

161-DHVVEATVFF TGTAREAATK FPANANVAAT IALAGLGMDE

201-TMVELTVDPT INKNKHTIVA EGGFGQMTIE LVGVPLPSNP

241-KTSTLAALSV IRACRNSVEA IQI-263

SEQ ID NO：23。肺炎克雷伯氏菌L-天冬氨酸脱氢酶。

1-MMKKVMLIGY GAMAQAVIER LPPQVRVEWI VARESHHAAI

41-CLQFGQAVTP LTDPLQCGGT PDLVLECASQ QAVAQYGEAV

81-LARGWHLAVI STGALADSEL EQRLRQAGGK LTLLAGAVAG

121-IDGLAAAKEG GLERVTYQSR KSPASWRGSY AEQLIDLSAV

161-NEAQIFFEGS AREAARLFPA NANVAATIAL GGIGLDATRV

201-QLMVDPATQR NTHTLHAEGL FGEFHLELSG LPLASNPKTS

241-TLAALSAVRA CRELA-255

SEQ ID NO：24。Dinoroseobacter shibae L-天冬氨酸脱氢酶。

1-MRLALIGLGA INRAVAAGMA GQAEMVALTR SGAEAPGVMA

41-VSDLSALRVF APDLVVEAAG HGAARAYLPG LLAAGIDVLM

81-ASVGVLADPE TEAAFRAAPA HGAQLTIPAG AIGGLDLLAA

121-LPKDSLRAVR YTGVKPPAAW AGSPAADGRD LSALDGPVTL

161-FEGTARQAAL RFPNNANVAA TLALAGAGFD RTEARLVADP

201-DAAGNGHAYD VISDTAEMTF SVRARPSDTP GTSATTAMSL

241-LRAIRNRDAA WVV-267

SEQ ID NO：25。Ruegeria pomeroyi L-天冬氨酸脱氢酶。

1-MWKLWGSWPE GDRVRIALIG HGPIAAHVAA HLPVGVQLTG

41-ALCRPGRDDA ARAALGVSVA QALEGLPQRP DLLVDCAGHS

81-GLRAHGLTAL GAGVEVLTVS VGALADAVFC AELEDAARAG

121-GTRLCLASGA IGALDALAAA AMGTGLQVTY TGRKPPQGWR

161-GSRAEKVLDL KALTGPVTHF TGTARAAAQA YPKNANVAAA

201-VALAGAGLDA TRAELIADPG AAANIHEIAA EGAFGRFRFQ

241-IEGLPLPGNP RSSALTALSL LAALRQRGAA IRPSF-275

SEQ ID NO：26。睾丸酮丛毛单胞菌L-天冬氨酸脱氢酶。

1-MKNIALIGCG AIGSSVLELL SGDTQLQVGW VLVPEITPAV

41-RETAARLAPQ AQLLQALPGD AVPDLLVECA GHAAIEEHVL

81-PALARGIPAV IASIGALSAP GMAERVQAAA ETGKTQAQLL

121-SGAIGGIDAL AAARVGGLET VLYTGRKPPK AWSGTPAEQV

161-CDLDGLTEAF CIFEGSAREA AQLYPKNANV AATLSLAGLG

201-LDKTMVRLFA DPGVQENVHQ VEARGAFGAM ELTMRGKPLA

241-ANPKTSALTV YSVVRAVLNN VAPLAI-266

SEQ ID NO：27。Cupriavidus pinatubonensis L-天冬氨酸脱氢酶。

1-MSMLHVSMVG CGAIGRGVLE LLKADPDVAF DVVIVPEGQM

41-DEARSALSAL APNVRVATGL DGQRPDLLVE CAGHQALEEH

81-IVPALERGIP CMVVSVGALS EPGLVERLEA AARRGNTQVQ

121-LLSGAIGAID ALAAARVGGL DEVIYTGRKP ARAWTGTPAA

161-ELFDLEALTE PTVIFEGTAR DAARLYPKNA NVAATVSLAG

201-LGLDRTSVRL LADPNAVENV HHIEARGAFG GFELTMRGKP

241-LAANPKTSAL TVFSVVRALG NRAHAVSI-268

Claims

1.重组酵母细胞，其包含：

(a)编码L-天冬氨酸脱氢酶的异源核酸；和

(b)编码草酰乙酸形成酶的异源核酸，所述草酰乙酸形成酶选自丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶。

2.权利要求1的重组酵母细胞，其中编码草酰乙酸形成酶的异源核酸是丙酮酸羧化酶。

3.重组酵母细胞，其包含：

(a)编码L-天冬氨酸脱氢酶的异源核酸；

(b)编码草酰乙酸形成酶的异源核酸，所述草酰乙酸形成酶选自丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶；和

(c)编码丙酮酸脱羧酶的核酸的缺失或破坏。

4.权利要求2的重组酵母细胞，其中所述重组宿主细胞能够在基本上厌氧的条件下产生L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸。

5.权利要求2的重组酵母细胞，其中所述重组宿主细胞能够在好氧条件下产生L-天冬氨酸和/或β-丙氨酸。

6.权利要求3的重组酵母细胞，其中编码草酰乙酸形成酶的异源核酸是丙酮酸羧化酶。

7.权利要求1的重组宿主细胞，其进一步包含编码L-天冬氨酸1-脱羧酶的异源核酸，其中所述重组宿主细胞能够在基本上厌氧的条件下产生β-丙氨酸。