KR20100124793A

KR20100124793A - 재조합 미생물 및 ｌ－리신을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20100124793A
Application number: KR1020107021947A
Authority: KR
Inventors: 셩 양; 헤 후앙; 데후이 왕
Original assignee: 글로벌 바이오-켐 테크놀로지 그룹 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2008-03-03
Filing date: 2009-03-02
Publication date: 2010-11-29
Also published as: US8268597B2; JP2011512823A; WO2009109102A1; EP2262894A4; ES2510865T3; RU2451748C1; RU2010140217A; DK2262894T3; WO2009109102A8; US20120107882A1; EP2262894B1; PL2262894T3; KR101368922B1; EP2262894A1

Abstract

본 발명은 B. 서브틸리스(B. subtilis)의 야생형 또는 변종 dapA 유전자를 포함하는, 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아, 특히 E. 콜라이(E. coli)를 이용하여 높은 수율로 L-리신을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 L-리신을 제조하는데 사용하기 위하여, 관련 재조합 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아, 특히 E. 콜라이(E. coli)를 제공한다.

Description

재조합 미생물 및 Ｌ－리신을 생산하는 방법{RECOMBINANT MICROORGANISM AND METHOD FOR PRODUCING L-LYSINE}

관련 출원 교차 인용

본 출원은, 그 전체 내용이 인용에 의해 본 발명에 명확하게 통합되는, 2008년 3월 3일에 출원된 미국 가출원 제61/033,099호의 우선권을 주장한다.

서열 목록

본 출원은, 첨부된 서열 목록이 인용에 의해 본 발명에 통합된다.

본 발명은 생물공학의 분야에 속한다. 구체적으로, 본 발명은 야생형 또는 변종 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) dapA 유전자를 포함하는, 형질전환된 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아, 특히 E. 콜라이(E. coli)를 성장시킴으로써 L-리신을 제조하는 방법을 제공한다.

L-리신은 동물에서 합성되지 않는 필수 아미노산이다. 많은 야생형 및 돌연변이 박테리아 균주가 L-리신을 생산하는 것으로 알려져 있다. 사료 첨가물, 약제, 화학제 및 식품 원료로 널리 사용되고 있는, L-리신은 주로 코리네 형(Coryneform) 박테리아 또는 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아를 이용하여 대규모 발효에 의해 생산되어 왔다.

대부분의 박테리아에서, L-리신은 메티오닌 및 트레오닌의 생합성 경로에 의해 공유되는 2 단계를 포함하는, 9 단계의 효소 경로에서 아스파테이트로부터 천연적으로 합성된다(Anastassiadis, S., Recent patents on Biotechnology 2007, 1(1):11-24; Chen, N. et al., J. Biol . Chem . 1993, 268(13):9448-66). 리신 생합성의 조절 메커니즘은 복잡하며 다양한 박테리아 종에서 크게 달라진다(Chen, N. et al., J. Biol . Chem . 1993, 268(13):9448-66). 예를 들어, 디히드로디피콜리네이트 신타아제("DDPS"), 즉 리신 생합성 계열로 첫 번째 단계를 촉진시키는 효소는, 그램-음성 박테리아(예를 들어, E. 콜라이(E. coli), 바실러스 스파에리쿠스(Bacillus sphaericus) 및 메타노박테리움 테르모아우토트로피쿰(Methanobacterium thermoautotrophicum)에서 L-리신에 의해 피드백 억제되나, 그램-양성 박테리아(예를 들어, 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 및 바실러스 락토페르멘툼(Bacillus lactofermentum))에서는 그러하지 않다(Dobson, R. et al., Acta Cryst . 2005, D61:1116-24). 또한, 리신 및 리신의 전구체 중 하나인 디아미노피멜레이트에 의한 이중 조절을 포함하기 때문에 바실러스 서브틸리스("Bacillus subtilis")에서 리신 생합성 경로의 조절은 특이하다(Chen, N. et al., J. Biol . Chem . 1993, 268(13):9448-66).

L-리신에 의한 DDPS의 피드백 억제에 대한 다양한 민감성과 일치하여, DDPS 단백질 서열 및 그에 대응되는 유전자인 dapA에서의 제한된 상동성은, 다양한 속(genera)의 박테리아 균주에서 관찰된다. B. 서브틸리스(B. subtilis)의 DDPS는 E. 콜라이(E. coli) 및 코리네박테리움 글루타미쿰("Corynebacterium Glutamicum")의 각각의 DDPS와 동일한 약 43% 및 40%의 아미노산 서열을 갖는다(Chen, N. et al., J. Biol . Chem . 1993, 268(13):9448-66). 심지어 동일한 박테리아 속(genus)에서도, 서로 다른 박테리아 균주는 오직 크지 않은 상동성을 보여준다. 예를 들어, 바실러스 메타노리쿠스("B. methanolicus")에서의 dapA 유전자는 이미 알려진 B. 서브틸리스(B. subtilis)에서의 dapA 유전자의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 약 65% 동일하다(미국 특허등록 제6,878,533호).

에쉐리키아(Escherichia) 박테리아에 의한 L-리신 생산을 개선하기 위한 하나의 방법은 L-리신에 의한 DDPS의 피드백 억제를 극복하는 것이다. L-리신에 대하여 DDPS를 탈감작(desensitize)시키기 위하여 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아의 야생형 dapA 유전자에서 돌연변이가 이루어졌다(미국 특허등록 제6,040,160호). DDPS가 L-리신에 의한 피드백 억제를 겪지 않는, 비-에쉐리키아(non-Escherichia) 박테리아의 야생형 dapA 유전자를 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아에 도입하기 위한 시도가 있어 왔으나, 일정하고 만족스러운 결과를 얻는 데에는 실패하였다.

야생형 dapA 유전자를 C. 글루타미쿰(C. glutamicum) 균주를 과잉생산하는 리신으로부터 돌연변이 E. 콜라이(E. coli) 균주(TF1)를 생산하는 리신으로 도입하는 것은 리신-민감성 DDPS 활성 및 리신 생산의 병행 증가를 유발하는 것으로 한국에서 보고되었다(Oh, J. et al., Biotech . Ltrs . 1991, 13(10):727-32; 한국 등록공고 제10-1992-0008382호). 그러나, 두 개의 다른 E. 콜라이(E. coli) 균주(TF13 및 TF23)의 동일한 야생형 dapA 유전자의 발현은 높은 수득률의 리신 생산을 유발하는 데에는 실패하였다. 이러한 일관성 없는 결과에 대하여, 리신 생합성에 관련된 조절 메커니즘이 코리네 형(Coryneform) 박테리아에서 보다 E. 콜라이(E. coli)에서 더욱 복잡하다는 사실이 언급되었다.

외부 DDPS 단백질은 프로테아제에 의해 분해되기 쉽고 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아의 불용성 봉입체(inclusion body)를 형성하기 쉽기 때문에 외부 dapA 유전자의 발현은 힘들다(미국 특허등록 제6,040,160호). 또한, C. 글루타미쿰(C. Glutamicum) 또는 B. 메탄올리커스(B. methanolicus)에 대한 최적의 배양 온도는 E. 콜라이(E. coli)에 대한 최적의 배양 온도로부터 약 10도 이상 차이가 나기 때문에, C. 글루타미쿰(C. Glutamicum)의 DDPS(Oh, J. et al., Biotech . Ltrs., 1991, 13(10):727-32; 한국 등록공고 제10-1992-0008382호) 또는 B. 메탄올리커스(B. methanolicus)의 DDPS(미국 특허등록 제6,878,533호)는 유리한 활성, 예를 들어, E. 콜라이(E. coli)에서 부분적으로, 높은 수득률의 리신 생산을 유발하는 리신-둔감성 DDPS 활성을 나타낼 것으로 예상되지 않는다.

B. 서브틸리스(B. subtilis)에서의 리신 생합성에 관련된 유전자가 발현된, E. 콜라이(E. coli) 세포에서, 리신 합성의 매우 복합한 조절이 관찰되었다(Shevchenko, T.N. et al., Tsitol Genet . 1984, 18(1):58-60). 구체적으로, E. 콜라이(E. coli) 세포에서, 외부 dapA 유전자를 포함하는 상기 외부 유전자의 발현은 리신 생산을 높고 만족스러운 정도로 증가시키는 데에는 실패하였다. 리신 생합성에서의 상당한 증가는 리신 및 디아미노피멜레이트에 의한 피드백 억제를 탈감작(desensitize)시키기 위한 리신 생합성에 관련된 천연 유전자에 돌연변이를 갖는 E. 콜라이(E. coli) 또는 B. 서브틸리스(B. subtilis) 균주를 이용함으로써 달성될 수 있다는 것이 제안되었다.

현재까지, 야생형 또는 변종 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자를 포함하는 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아를 이용하여 L-리신을 생산하는 효과적인 방법은 없었다. L-리신, 특히 동물 사료용 L-리신의 수요가 세계적인 인구 증가와 함께 꾸준히 증가함에 따라, 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아 균주를 사용하여 L-리신의 생산을 개선하기 위한 새롭고 효과적인 방법을 개발할 필요성이 있다.

본 발명에 따라서, B. 서브틸리스(B. subtilis)의 야생형 또는 변종 dapA 유전자를 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아로 도입하는 것은 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아에 의한 L-리신 생산을 산업적 규모로 개선시킨다. 또한, 형질전환된 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아는 배양 배지에서 L-리신을 높은 수득률(예를 들어, 적어도 25, 50, 75, 100, 125 또는 150 g/l)로 생산하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아에서 자발적으로 복제가능하며, B. 서브틸리스(B. subtilis)의 야생형 또는 변종 dapA 유전자를 포함하는 재조합 DNA를 제공한다. 변종 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자는 야생형 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자의 서열과 동일하지는 않지만 실질적으로(예를 들어, 90%, 95%, 또는 99%) 동일한 서열을 갖는다. 재조합 DNA는 L-리신 생산을 증가시키기 위하여 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자를 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아로 도입하는데 사용될 수 있다.

B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자는 유전자은행(GenBank) 기탁번호 L08471(서열번호 1) 및 Chen, N. et al., J. Biol . Chem . 1993, 268(13):9448-66)에 제시된 바와 같은 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자의 핵산 서열과 동일하거나 실질적으로(예를 들어, 90%, 95%, 또는 99%) 동일한 핵산 서열을 가질 수 있다. 변종 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자는 서열번호 1에서 하나 이상의 뉴클레오티드 변형을 포함할 수 있다. 비제한 일 실시예에서, 변종 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자는 서열번호 1의 355번 뉴클레오티드 잔기인 G가 T로 변이되고 360번 뉴클레오티드 잔기인 T가 C로 변이된, 두 개의 돌연변이를 포함한다.

더구나, B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자는 유전자은행(GenBank) 기탁번호 L08471(서열번호 2) 및 Chen, N. et al., J. Biol . Chem . 1993, 268(13):9448-66)에 제시된 바와 같은, B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자의 유추된(deduced) 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로(예를 들어, 90%, 95%, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩할 수 있다. 단백질은 서열번호 2에서 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 비제한 일 실시예에서, 변종 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자는 서열번호 2의 119번 아미노산 잔기인 히스티딘이 티로신으로 치환된 돌연변이("H119Y 변종")를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩한다. B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자는 DDPS 활성을 갖는 단백질을 코딩할 수 있다.

본 발명은 또한 배양 배지에서 L-리신을 생산하는 야생형 또는 변종 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자를 포함하는 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아를 제공한다. 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아는 배양 배지에서 적어도 50 g/l로 L-리신을 생산할 수 있다. 비제한 일 실시예에서, L-리신을 생산하기 위하여 야생형 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자를 포함하는 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아가 제공된다. 또다른 비제한 실시예에서, L-리신을 생산하기 위하여 H119Y 변종 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자를 포함하는 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아가 제공된다.

또한 본 발명은 배양 배지에서 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아를 성장시키고 상기 배양 배지에서 L-리신을 수집함으로써 L-리신을 생산하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 박테리아는 야생형 또는 변종 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자를 포함한다. L-리신은 배양 배지로부터 수확되거나 수집되기 전에 축적되도록 둔다. L-리신이 적어도 25, 50, 75, 100, 125 또는 150 g/l, 바람직하게 적어도 50 g/l가 되었을 때, L-리신은 배양 배지로부터 수집될 수 있다. 비제한 일 실시예에서, 야생형 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자를 포함하는 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아는 배양 배지에서 성장하며, L-리신은 배양 배지로부터 수집된다. 또다른 비제한 일 실시예에서, H119Y 변종 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자를 포함하는 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아는 배양 배지에서 성장하며, L-리신은 배양 배지로부터 수집된다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 발효에 의해 L-리신을 생산하는 방법 및 발효에 의해 L-리신을 생산하기 위하여 에쉐리키아(Escherichia)의 속(genus)에 속하는 형질전환된 박테리아 및 재조합 DNA를 유리하게 제공한다. B. 서브틸리스(B. subtilis)의 야생형 또는 변종 dapA 유전자를 포함하는 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아에 의해 L-리신이 높은 수득률로 생산될 수 있는 것으로 현재 알려져 있다.

본 명세서를 더욱 명확히 하고, 본 발명을 제한하지 않는 방법에 의해서, 본 발명은 다음 서브섹션에서 자세히 설명된다:

(1) 재조합 DNA;

(2) 형질전환된 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아; 및

(3) L-리신을 생산하는 방법.

(1) 재조합 DNA

본 발명의 재조합 DNA는 B. 서브틸리스(B. subtilis) 균주의 야생형 또는 변종 dapA 유전자를 포함하며, 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아 균주에서 자발적으로 복제한다. 본 발명의 재조합 DNA는 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자를 포함하는 DNA 절편을 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아 균주의 복제가능한 발현 벡터에 삽입시킴으로써 수득될 수 있다.

B. 서브틸리스(B. subtilis) 균주에서, dapA 유전자가 발현되며 대응되는 DDPS는 L-리신에 의한 실질적인(예를 들면, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 또는 그 이상) 피드백 억제를 겪지 않는다. B. 서브틸리스(B. subtilis) 균주는 L-리신 생산자일 수 있거나, L-리신 생산자가 아닐 수 있다. 바람직한 B. 서브틸리스(B. subtilis) 균주는 W168이며, 이것은 리신 생산자가 아니다. 이러한 균주는 미국의 오하이오 주립대학교의 Bacillus genetic Stock Center로부터 구입가능하다.

야생형 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자("BsdapA gene")를 포함하는 DNA 절편은 야생형 B. 서브틸리스(B. subtilis) 균주의 염색체 DNA로부터 얻을 수 있다. 염색체 DNA는 업계에 알려진 표준 기술을 이용하여 B. 서브틸리스(B. subtilis) 균주로부터 준비될 수 있다. DNA 절편은 중합효소 연쇄 반응 방법(PCR)을 사용하여 염색체 DNA로부터 야생형 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자를 증폭시킴으로써 수득될 수 있다. 적당한 PCR 프라이머는 B. 서브틸리스(B. subtilis) 또는 다른 박테리아 균주(예를 들어, E. 콜라이(E. coli) 및 C. 글루타미쿰(C. glutamicum))의 이전에 공지된 dapA 유전자 서열에 기초하여 준비될 수 있다(Chen, N. et al., J. Biol . Chem . 1993, 268(13):9448-66). 예를 들어, 한 쌍의 단일 가닥 21-mer 프라이머, DapA-F(서열번호 3) 및 DapA-R(서열번호 4)이 이용될 수 있다.

서열번호 3 및 4의 핵산 서열은 하기와 같다:

서열번호 3 (DapA-F)	CGGCGATCGTTTCTGTTGGCA
서열번호 4 (DapA-R)	ATCTGGGCCATATCACGCGCT

변종 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자를 포함하는 DNA 절편은 생체내에서(in vivo) 돌연변이된 B. 서브틸리스(B. subtilis) 균주의 염색체 DNA로부터 유사하게 수득될 수 있다. 변종 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자는 부위 지정 돌연변이유발(site-directed mutagenesis) 및 PCR-매개 돌연변이유발(mutagenesis)과 같은, 업계에 알려진 표준 기술을 사용하여, 생체 밖에서(in vitro) 야생형 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자를 변형시킴으로써 또한 수득될 수 있다.

결과물 DNA 절편의 서열은 적당한 프라이머(예를 들어, DapA-F 및 DapA-R)를 이용한 통상적으로 알려진 방법에 의해 측정될 수 있다.

B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자는 유전자은행(GenBank) 기탁번호 L08471(서열번호 1) 및 Chen, N. et al., J. Biol . Chem . 1993, 268(13):9448-66)에 제시된 바와 같은 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자의 핵산 서열과 동일하거나 실질적으로(예를 들어, 90%, 95%, 또는 99%) 동일한 핵산 서열을 가질 수 있다. 야생형 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자는 서열번호 1과 동일한 핵산 서열을 가질 수 있다. 변종 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자는 서열번호 1의 하나 이상의 뉴클레오티드 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변종 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자는 서열번호 1의 355번 뉴클레오티드 잔기인 G가 T로 변이되고 360번 뉴클레오티드 잔기인 T가 C로 변이된, 두 개의 돌연변이를 포함할 수 있다. 서열의 백분율 동일성(percentage identity)은 BLAST 또는 FASTA과 같은 표준 소프트웨어에 의해 측정될 수 있다.

또한, B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자는 유전자은행(GenBank) 기탁번호 L08471(서열번호 2) 및 Chen, N. et al., J. Biol . Chem . 1993, 268(13):9448-66)에 제시된 바와 같은 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자의 유추된 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로(예를 들어, 90%, 95%, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩할 수 있다. 야생형 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자는 서열번호 2과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩할 수 있다. B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자는 또한 서열번호 2에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩할 수 있다. 예를 들어, 변종 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자는 서열번호 2의 119번 아미노산 잔기인 히스티딘이 티로신으로 치환된 돌연변이("H119Y 변종")를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩할 수 있다.

아미노산 변형은 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 변형은 부위 지정 돌연변이유발(site-directed mutagenesis) 및 PCR-매개 돌연변이유발(mutagenesis)과 같은, 업계에 알려진 표준 기술에 의해 도입될 수 있다. 아미노산 치환은, 아미노산 잔기가, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 업계에서 정의되어 있다. 이러한 계열은 염기성 측쇄(예를 들면, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띄지 않는 극성 측쇄(예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-가지친 측쇄(예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향성 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 갖는 아미노산을 포함한다.

아미노산 치환은 또한 L-리신에 대응되는 DDPS를 탈감작(desensitize)시키기 는 것으로 알려진 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아의 야생형 dapA 유전자에서 아미노산 치환과 연관성이 있는 아미노산 치환을 포함한다.

B. 서브틸리스(B. subtilis)의 야생형 또는 변종 dapA 유전자를 포함하는 DNA 절편은 dapA 유전자를 포함하는 재조합 DNA를 생산하기 위한 적당한 발현 벡터와 나중에 연결될 수 있다. 적당한 DNA 발현 벡터는 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아 균주에서 자발적으로 복제되며, 선택가능한 유전자 마커를 포함한다. 선택가능한 유전자 마커는 항생제(예를 들어, 암피실린, 테트라시클린, 카나마이신 및 네오마이신), 색깔 변화 또는 형질전환되지 않은 호스트로부터 형질전환된 호스트를 구별할 수 있는 기타 특성에 대한 저항성을 감지할 수 있다. 적당한 벡터의 예는 pTrc99A, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 및 pSTV28과 같은 E. 콜라이(E. coli) 발현 벡터를 포함한다. dapA 유전자가 E. 콜라이(E. coli)의 강력한 프로모터의 조절하에 있는 것과 같은 방식으로 DNA 절편이 DNA 발현 벡터로 삽입되는 것이 바람직하다. 적당한 프로모터의 예는 trc, tac, lac 및 T7을 포함하며, 바람직하게 trc를 포함한다.

B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자는 DDPS 활성을 갖는 단백질을 코딩할 수 있다. B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자를 포함하는 재조합 DNA의 존재는 재조합 DNA로 형질전환된 박테리아 균주에서 높은 정도의 DDPS 활성에 의하거나 또는 재조합 DNA로 형질전환된 DDPS 결핍된 박테리아 균주(예를 들어, E. 콜라이(E. coli) JE7627 균주)에서 영양요구성(auxotrophy)의 회복에 의해 확인될 수 있다.

(2) 형질전환된 에쉐리키아 ( Escherichia ) 박테리아

에쉐리키아(Escherichia) 박테리아는 업계에 알려진 표준 기술을 이용하여 B. 서브틸리스(B. subtilis)의 야생형 또는 변종 dapA 유전자를 포함하는 재조합 DNA로 형질전환될 수 있다. 부모 (형질전환되지 않은) 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아는 야생형 또는 돌연변이 천연 dapA 유전자를 가질 수 있으며, 대응되는 야생형 또는 돌연변이 천연 DDPS를 발현할 수 있다. 천연 DDPS의 효소 활성은 L-리신에 의한 피드백 억제를 겪을 수 있다. 부모 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아는 L-리신 생산자일 수 있다. 리신 생합성에 관련된 다른 천연 효소의 활성이 증강될 수 있다. 예를 들어, L-리신에 의한 피드백 억제를 탈감작(desensitize)시키는 돌연변이를 갖는 천연 아스파르토키나아제 III를 코딩하는 DNA를 포함하는 E. 콜라이(E. coli) 균주(미국 특허등록 제6,040,160호)가 사용될 수 있다. 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아 균주가 E. 콜라이(E. coli)인 것이 바람직하다. 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아는 L-리신의 산업적 생산에 통상적으로 사용되는 E. 콜라이(E. coli) 균주인 것이 더욱 바람직하다.

형질전환된 후, 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아는 B. 서브틸리스(B. subtilis)의 야생형 또는 변종 dapA 유전자를 잠복시킨다. 형질전환된 박테리아의 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자의 존재는 업계에 알려진 표준 기술에 의해 측정될 수 있다. B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자는 플라즈미드에 존재할 수 있다. B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자는 또한 형질전환된 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아의 염색체로 통합될 수 있다. 형질전환된 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아는 L-리신을 높은 수율(예를 들어, 적어도 25, 50, 75, 100, 125 또는 150 g/l)로 생산한다.

일 실시예에서, E. 콜라이(E. coli) 균주 B-3996(유전학 및 산업 미생물 배양을 위한 연구소에서 등록번호 RIA 1867로 구입가능)는 형질전환된 박테리아 균주 B-399/pTrc99A-BsdapA를 제조하기 위하여 하나의 플라즈미드 pVIC40(미국 특허등록 제6,040,160호)를 제거한 후 야생형 dapA 유전자(예를 들어, pTrc99A-BsdapA)를 포함하는 재조합 DNA를 사용하여 형질전환된다. 대조군 균주 B-399/pTrc99A는 BsdapA(예를 들어, pTrc99A)없이 대응되는 재조합 DNA을 사용하여 형질전환됨으로써 유사하게 준비된다. 배양 배지는 멸균된 용액(pH 7.0에서 16 g/L (NH₄)₂SO₄, 1 g/L KH₂PO₄, 1 g/L MgSO₄·7H₂O, 0.01 g/L FeSO₄·7H₂O, 0.01 g/L MnSO₄·5H₂O, 2 g/L 이스트 추출물(Difco), 0.5 g/L L-메티오닌, 0.1 g/L L-트레오닌, 및 0.05 g/L L-이소류신을 포함함)을 멸균된 20% 글루코스와 4 대 1의 비율로 혼합함으로써 준비된다. 글루코스는 L-리신 생산을 개선하기 위하여 제공될 수 있다. 멸균된 약전 CaCO₃는 그 후에 상기 혼합물에 첨가되어 최종 농도 30 g/L가 되도록 용해된다. 적당한 항생제(예를 들어, 15 ㎍/ml 테트라시클린, 및 5 ㎍/ml 카나마이신) 또한 첨가될 수 있다. 두 개의 균주 모두 114 내지 116 rpm 및 37 ℃에서 48 시간 동안 교반하면서 배양된다. L-리신이 수확되고 배양 배지로부터 분석된다. 박테리아 균주 B-399/pTrc99A-BsdapA가 대조군 균주 B-399/pTrc99A보다 상당히 많을 것으로 예상되며, 적어도 10 g/l의 L-리신을 생산할 것으로 예상된다.

또다른 실시예에서, Global Bio-Chem Technology Group Company Limited로부터 구입한 E. 콜라이(E. coli) 박테리아 균주 DC037는 B. 서브틸리스(B. subtilis)(DC051)의 야생형 dapA 유전자를 포함하는 재조합 E. 콜라이(E. coli), B. 서브틸리스(B. subtilis)(DC231)의 H119Y 변종 dapA 유전자를 포함하는 재조합 E. 콜라이(E. coli), 및 재조합 E. 콜라이(E. coli) 대조군(DC073)을 준비하기 위하여 사용되었고, 이들은 각각 150, 180 및 20 g/l로 L-리신을 생산하였다. 상기 재조합 E. 콜라이(E. coli) 균주의 준비 및 테스팅은 실시예 3 및 4에서 설명된다.

균주 DC051 및 DC231의 박테리아는 부다페스트 조약에 따른 중국일반미생물보존센터(China General Microbiological Culture Collection Center)(CGMCC)에 2009년 2월 26일에 기탁되었고, 각각 CGMCC 제2923호 및 CGMCC 제2924호의 기탁번호를 받았다.

형질전환된 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아에서 DDPS 활성은 L-리신에 의해 실질적인(예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 또는 그 이상) 피드백 억제를 겪지 않을 수 있다. 형질전환된 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아의 DDPS 활성은 10 mM L-리신의 존재하에서 겨우 50% 감소될 수 있다.

박테리아에서 DDPS의 활성은 Yugari, Y. and Gilvarg C. in J. Biol . Chem ., 1965, 240(12):4710-16에 제시된 방법, 또는 다른 적당한 방법에 따라 측정될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 추출물은 50 mM 이미다졸-HCl(pH 7.4), 20 mM L-아스파르트산 세미알데히드 및 20 mM 소듐 피루베이트를 포함하는 반응 용액에 첨가된 후, 10분 동안 37℃에서 배양된다. 소듐 피루베이트가 없는 반응 용액은 블랭크(blank)로 사용될 수 있다. DDPS 활성은 반응에 의해 생성된 디히드로디피콜리네이트의 양에 의해 측정되며, 270 nm의 파장에서 분광광도계에 의해 감지된다. L-리신의 다양한 양은 DDPS 활성의 리신 민감성을 평가하기 위하여 반응 혼합물에 첨가된다.

(3) L- 리신을 생산하는 방법

L-리신은 배양 배지에서 야생형 또는 변종 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자를 포함하는 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아를 성장시킴으로써 생산될 수 있다. 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아의 최적의 성장에 적당한 배지가 바람직하다(Anastassiadis, S., Recent Patents On Biotechnology 2007, 1(1):11-24). 항생제(예를 들어, 암피실린)은 형질전환된 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아의 선택성 및 안정성을 유지하는 배지에서 바람직하다.

예를 들어, 배양 배지는 멸균된 용액(pH 7.0에서 16 g/L (NH₄)₂SO₄, 1 g/L KH₂PO₄, 1 g/L MgSO₄·7H₂O, 0.01 g/L FeSO₄·7H₂O, 0.01 g/L MnSO₄·5H₂O, 2 g/L 이스트 추출물(Difco), 0.5 g/L L-메티오닌, 0.1 g/L L-트레오닌, 및 0.05 g/L L-이소류신을 포함함)을 멸균된 20% 글루코스와 4 대 1의 비율로 혼합시킴으로써 준비된다. 글루코스는 L-리신 생산을 개선하기 위하여 첨가될 수 있다. 멸균된 약전 CaCO₃은 그 후에 상기 혼합물에 첨가된 후 최종 농도 30 g/L가 되도록 용해된다. 적당한 항생제(예를 들어, 15 ㎍/ml 테트라시클린, 및 5 ㎍/ml 카나마이신)가 또한 첨가될 수 있다.

에쉐리키아(Escherichia) 박테리아에 대한 최적의 배양 상태가 바람직하다(Anastassiadis, S., Recent Patents On Biotechnology 2007, 1(1):11-24). 배양은 25℃ 내지 45℃ 사이의 온도 및 pH 5 내지 pH 8에서 호기성 상태에서 바람직하게 이루어진다. L-리신의 농도는 약 2 내지 10 일 동안 배양한 후에 최대에 도달한다. 박테리아 성장은 분광광도계에 의해 측정되는 배양 배지의 세포 농도에 기초하여 모니터될 수 있다.

L-리신은 본 발명에 따라 배양된 형질전환된 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아의 배양 배지에 축적된다. L-리신은 원심분리 및 배양 배지의 여과에 의한 세포 분리 전 또는 후에 L-리신-HCl을 생산하기 위하여 다양한 방법(예를 들어, 이온-교환 크로마토그래피 방법)에 의해 수확될 수 있거나; 또는 L-리신 브로스(broth)는 펠레타이징 공정(pelletizing process)에 의한 L-리신 설페이트를 생산하기 위하여 수확될 수 있다(Anastassiadis, S., Recent Patents On Biotechnology 2007, 1(1):11-24; 중국 특허등록 제200410050017.4호). L-리신이 대규모 발효 공정에서 적어도 5 내지 10 g/l, 또는 적어도 25, 50, 75, 100, 125 또는 150 g/l에 도달하거나, 바람직하게 적어도 50 g/l에 도달할 때 L-리신은 배양 배지로부터 수확되거나 수집될 수 있다. L-리신의 양은 업계에 알려진 다양한 분석 방법(예를 들어, HPLC)에 의해 측정될 수 있다.

본 발명의 재조합 DNA는 L-리신 생산을 증가시키기 위하여 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자를 에쉐리키아(Escherichia) 박테리아로 도입하는데 사용될 수 있다.

실시예

본 발명은 이제 일반적으로 설명될 것이며, 하기의 실시예를 참조함으로써 더욱 쉽게 이해될 것이며, 실시예는 본 발명의 일정한 관점 및 구체화를 보여주기 위한 목적으로만 포함된 것일 뿐, 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다.

실시예 1. 플라즈미드 pTrc99A-BsdapA의 구성

플라즈미드 pTrc99A-BsdapA는 야생형 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자를 포함하도록 구성되었다. 염색체 DNA는 통상적으로 알려진 방법을 이용하여 야생형 B. 서브틸리스(B. subtilis) 균주 W168(미국의 오하이오 주립대학교의 Bacillus Genetic Stock Center)로부터 준비되었다. 0.88 kb의 DNA 절편은 한 쌍의 프라이머들인, DapA-F(서열번호 3) 및 DapA-R(서열번호 4)를 이용하여 염색체 DNA에서 야생형 dapA 유전자를 증폭시킴으로써 수득되었으며, 상기 DapA-F(서열번호 3) 및 DapA-R(서열번호 4)는 각각, 서열번호 3 및 4에 나타난 핵산 서열을 갖는다. DNA 절편이 회복되고, 제한 효소 EcoRI 및 HindIII를 사용하여 소화되며 pTrc99A-BsdapA 플라즈미드를 생산하기 위하여, 동일한 제한 효소를 사용하여 이전에 소화된 pTrc99A 플라즈미드를 사용하여 연결되었다. 플라즈미드 pTrc99A-BsdapA는 서열번호 1의 핵산 서열을 포함하였다. 핵산 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩한다.

실시예 2. 플라즈미드 pTrc99A-BsdapAH119Y의 구성

플라즈미드 pTrc99A-BsdapAH119Y는 H119Y 변종 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자를 포함하도록 구성되었다. PCR 템플릿(template)으로서 pTrc99A-BsdapA 플라즈미드를 사용하여 돌연변이를 도입하였고 한 쌍의 프라이머 bsdapa119muts(서열번호 5) 및 bsdapa119mutas(서열번호 6)을 사용하여 돌연변이를 증폭시켰다. 서열번호 5 및 6의 핵산 서열은 하기와 같다:

서열번호 5 (bsdapa119muts)	TCAAGAAGGAATGTACCAG T ATTT C AAAGCAATTGCGGCAGAGAC
서열번호 6 (bsdapa119mutas)	GTCTCTGCCGCAATTGCTTT G AAAT A CTGGTACATTCCTTCTTGA

프라이머에서 돌연변이 부위는 볼드체의 이탤릭체로 나타냈다.

E. 콜라이 DH5α 수용성(competent) 세포는 DpnI에 의해 소화된 PCR 생성물의 부분 표본(aliquot)을 사용하여 형질변환되었다. 플라즈미드는 형질변환물로부터 추출되었고 바람직한 돌연변이 플라즈미드 pTrc99A-BsdapAH119Y를 확인하기 위하여 제한 효소 DraI로 소화되었으며, 상기 돌연변이 플라즈미드 pTrc99A-BsdapAH119Y는 서열번호 1의 355번 뉴클레오티드 잔기인 G가 T로 변이되고 360번 뉴클레오티드 잔기인 T가 C로 변이된, 두 개의 돌연변이를 포함하는 핵산 서열을 포함하였다. 핵산 서열은 서열번호 2의 119번 아미노산 잔기인 히스티딘이 티로신으로 치환된 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩한다.

실시예 3. 야생형 B. 서브틸리스 dapA 유전자를 포함하는 재조합 E. 콜라이

야생형 B. 서브틸리스 dapA 유전자(DC051)를 포함하는 재조합 E. 콜라이는 E. 콜라이(E. coli) 박테리아 균주 DC037로부터 준비되었으며, E. 콜라이(E. coli) 박테리아 균주 DC037는 Global Bio-Chem Technology Group Company Limited로부터 구입하였다. DC037는 두 개의 다른 플라즈미드를 포함하며, 각각의 플라즈미드는 E. 콜라이(E. coli)의 돌연변이 dapA 유전자 및 테트라시클린 또는 카나마이신 저항성 유전자를 포함한다. 상기 두 개의 플라즈미드가 제거되고 pDCtetBSdapA 및 pDCkanBSdapA로 대체되었으며, 각각의 플라즈미드는 하기에 제시된 바와 같은 BsdapA 유전자 및 테트라시클린 또는 카나마이신 저항성 유전자를 포함하였다.

BsdapA 유전자 및 테트라시클린 저항성 유전자를 포함하는 플라즈미드 pDCtetBSdapA가 구성되었다. BsdapA는 서열번호 7 및 8에서 하기에 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 갖는 한 쌍의 프라이머들인, ptrcBSdapA1-F 및 ptrcBSdapA1-R를 이용함으로써 pTrc99A-BsdapA로부터 수득되었다. 1.6 kb의 DNA 절편이 회복되고 제한 효소 Tth111I 및 SpeI로 소화된 후, 동일한 제한 효소로 이전에 소화된 플라즈미드 pDCtetdapA로 연결되어 플라즈미드 pDCtetBSdapA가 준비되었다.

BsdapA 유전자 및 카나마이신 저항성 유전자를 포함하는 플라즈미드 pDCkanBSdapA가 구성되었다. BsdapA는 한 쌍의 프라이머들인, ptrcBSdapA2-F 및 ptrcBSdapA2-R를 사용함으로써 pTrc99A-BsdapA로부터 수득되었으며, ptrcBSdapA2-F 및 ptrcBSdapA2-R는 각각 서열번호 9 및 10에서 하기에 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 갖는다. 1.6 kb의 DNA 절편이 회복되고 제한 효소 NotI 및 PshAI로 소화된 후, 동일한 제한 효소로 이전에 소화된 플라즈미드 pDCkandapA로 연결되어 플라즈미드 pDCkanBSdapA가 준비되었다.

DC045는 DC037로부터 준비되었다. DC037는 24시간 동안 800 ㎍/ml EB로 처리된 후, 순차적으로 5 ㎍/ml 테트라시클린과 50 ㎍/ml 카나마이신으로 각각 보호됨으로써 DC039가 준비되었으며, 상기 DC039에는 pDCkandapA가 제거되고 pDCtetdapA가 유지되어 있다.

2.8 kb 절편은 각각 서열번호 11 및 12에서 하기에 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 갖는, 한 쌍의 프라이머들인, LDCup 및 f1DN로 E. 콜라이(E. coli) W3110를 증폭시킴으로써 수득되었다. 상기 절편은 pMD18swtLDC을 얻기 위하여 pMD18simple T 벡터로 서브클론되었다.

1.5 kb 아프라마이신 저항성 유전자는 각각 서열번호 13 및 14에서 하기에 나타낸 바와 같은 핵산 서열을 갖는, 한 쌍의 프라이머들인, FRT5 및 HPA1FRT3로 pIJ773를 증폭시킴으로써 수득되었다. pMD18swtLDC는 벡터인 HpaI에 의해 소화되었고 pMD18swtLDC-apra를 얻기 위하여 1.5 kb 아프라마이신 저항성 유전자로 연결되었다. 4.5 kb 절편은 PvuII을 사용하여 pMD18swtLDC-apra을 소화시킴으로써 분리되었고, 4.5 kb 절편은 DC043를 얻기 위하여 DC039(pIJ790)를 형질전환하기 위한 재조합 절편으로 사용되었으며, 상기 DC043에는 야생형 LDC가 DC039의 게놈에서 길이가 짧아진 LDC로 대체되어 있다. 야생형 LDC 및 플라즈미드 pDCtetdapA를 포함하는 DC045는 플라즈미드 pCP20의 도움으로 DC043의 게놈으로부터 아프라마이신 저항성 유전자를 제거한 후에 수득되었다.

그 다음, pDCamBSdapA는 DC045에서 플라즈미드 pDCtetdapA를 격퇴하기 위하여 구성되었다.

플라즈미드 pIJ773는 추출되고 제한 효소 EcoRI 및 ClaI으로 소화되었다. 1.3 kb 절편이 분리되었다. 3.4 kb 절편은 제한 효소 PvuII를 사용하여 pDCtetBSdapA를 소화시키고, 뒤이어 플라즈미드 pMD18simple을 사용하여 연결시킴으로써 수득되었고, 상기 플라즈미드 pMD18simple는 pMD18s(BStet)를 구성하기 위하여 동일한 제한 효소 PvuII로 이전에 소화된 것이다. pMD18s(BStet)는 벡터로 사용되는 4.5 kb 절편을 얻기 위하여 제한 효소 EcoRI 및 ClaI로 소화되었다. pIJ773로부터 얻은 1.3 kb 절편은 4.5 kb 벡터 절편으로 연결되었다. 수용성(competent) DH5α 세포는 라이게이션(ligation) 혼합물을 사용하여 형질전환되었고 플레이트를 함유하는 암피실린/아프라마이신에서 성장되었다. 플라즈미드 DNA는 형질전환된 박테리아로부터 추출되었고 제한 효소 PvuII로 소화된 후, 3.5 kb의 절편이 장완부(long-arm) 재조합 절편으로 수득되었다.

pDCtetBSdapA를 사용하여 형질전환된 BW25113(pIJ790)는 장완부(long-arm) 재조합 절편을 사용하여 더욱 형질전환되었다. 재조합 플라즈미드 pDCamBSdapA는 형질전환된 박테리아로부터 추출되었고, DC045를 형질전환하기 위하여 사용되었다. 형질전환된 DC045는 두 개의 플라즈미드, pDCtetdapA 및 pDCamBSdapA를 포함하였다. 두 개의 복제 개시점의 반발(repulsion)에 기인하여 DC049-1가 수득되었으며, 상기 DC049-1에는 pDCtetdapA가 제거되었고 pDCamBSdapA가 유지되었다. pDCtetBSdapA 및 pDCkanBSdapA을 사용하여 DC049-1을 형질전환한 후에 DC051가 수득되었다.

균주 DC051의 박테리아는 2009년 2월 26일에 부다페스트 조약에 따라 중국일반미생물보존센터(China General Microbiological Culture Collection Center)(CGMCC)에 기탁되었고 기탁번호 CGMCC 제2923호를 받았다.

발현 벡터 pTrc99A를 갖는 DC073은 대조군과 유사하게 준비되었다. DC051과 달리, DC073은 pBsdapA를 포함하지 않는다.

서열번호 7 내지 14의 핵산 서열은 하기와 같다:

서열번호 7(ptrcBSdapA1-F)	GGACACTGTCTAATGTGAGTTAGCGCG
서열번호 8(ptrcBSdapA1-R)	CACTAGTATTGAAGCATTTATCAGGGT
서열번호 9	GCGGCCGCTGTGCAGGTC
서열번호 10	GACCACTGTCAGGGTTATTGTCTCAT
서열번호 11(LDCup)	atgaacatcattgccattatggg
서열번호 12(f1DN)	TTACTGCTCATACAGTTCCAACG
서열번호 13(FRT5)	attccggggatccgtcgacc
서열번호 14(HPA1FRT3)	AACAGCACGTTACTCGCCCGGAAGCCGCTCTGGCAAGTTATGTAGGCTGGAGCTGCTTC

DC051 및 DC073는 3일 동안 37℃에서 암피실린을 포함한 배양 배지에서 성장되었고 각각, 150 g/l 및 20 g/l로 배지에서 L-리신을 생산하였다.

실시예 4. H119Y 변종 B. 서브틸리스 dapA 유전자를 포함하는 재조합 E. 콜라이( E. coli )

B. 서브틸리스(DC231)의 H119Y 변종 dapA 유전자를 포함하는 재조합 E. 콜라이(E. coli)는, 플라즈미드 pTrc99A-BsdapAH119Y가 플라즈미드 pTrc99A-BsdapA를 대체하기 위하여 사용되었다는 점을 제외하고, 실시예 3에서 설명된 방법을 사용하여 준비되었다. pDCkanBSdapAH119Y 및 pDCtetBSdapAH119Y를 사용하여 DC049-1를 형질전환한 뒤에 DC231가 수득되었다.

균주 DC231의 박테리아는 2009년 2월 26일에 부다페스트 조약에 따라 중국일반미생물보존센터(China General Microbiological Culture Collection Center)(CGMCC)에 기탁되어 기탁번호 CGMCC 제2924호를 받았다.

DC231은 실시예 3에서 설명된 방법을 사용하여 배양 배지에서 성장되었다. L-리신은 180 g/l로 배지에서 생산되었다.

참조에 의한 통합

본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허는, 각각의 간행물 또는 특허가 특히 개별적으로 참조에 의해 통합되는 것으로 나타난 것처럼, 그 전체로서 인용에 의해 본 발명에 통합된다. 서로 충돌되는 경우에는, 본 명세서에서 언급된 정의를 포함하는 본 명세서에 조절한다.

본 발명의 특정한 구체화가 토의되는 반면, 상기 명세서는 본 발명은 실례가 되며(illustrative) 제한적이지 않다. 본 발명의 다양한 변형은 본 명세서 및 하기의 청구항의 관점에서 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 전체 범위는 균등물의 전체 범위를 포함한 청구항 및 다양한 변형을 포함하는 명세서를 참조하여 결정되어야 한다.

중국일반미생물보존센터 (China General Microbiological Culture Collection Center)

CGMCC02923

20090226

CGMCC02924

20090226

SEQUENCE LISTING <110> Global Bio-Chem Technology Group Company Limited. Yang, Sheng Huang, He Wang, Dehui <120> RECOMBINANT MICROORGANISM AND METHOD FOR PRODUCING L-LYSINE <130> CP1090198P <150> US 61/033,099 <151> 2008-03-03 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7016 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> gene <222> (5665)..(6537) <223> dapA gene <400> 1 atcggcacag gttcgagaca tgaaacgccg gagataaacg gaatttctca ctttttagag 60 cacatgttct ttaaagggac gagcacaaaa tctgcacgcg agatagcaga atcttttgat 120 cgtattggcg gccaggtcaa tgcgtttact tcaaaggaat atacctgcta ctatgcaaag 180 gtgcttgacg agcatgcgaa ttacgcgctg gacgtattag cagatatgtt ctttcattca 240 acgtttgatg aaaacgagct gaaaaaagag aaaaatgtag tatatgaaga aattaaaatg 300 tatgaagatg cgccggacga cattgtacat gatttattga gcaaagccac ttacggcaat 360 cattctttag gctacccaat tttaggaacg gaagaaacgc ttgcttcctt taacggtgac 420 tctctcagac aatacatgca tgattattat acgccggacc gagtggtgat ttcggtagcg 480 ggcaatatat ctgacagttt tatcaaagat gtagaaaaat ggttcgggtc atacgaggcg 540 aaaggcaaag cgacaggcct tgagaagcct gagttccaca cggaaaaact gacgagaaaa 600 aaagaaacag agcaggctca tttgtgcctt ggatttaaag gcttagaggt tggccatgaa 660 cgtatttatg atttaatcgt cctcaacaat gtgctcggag gcagcatgag cagccggctg 720 ttggaagatg tgcgtgaaga taaaggactt gcttattctg tttacagcta tcacagctca 780 tatgaggaca gcggaatgct aacgatttac ggcggaacgg gtgcaaatca gcttcagcag 840 ctgtcggaaa caattcaaga aaccctggcc acattaaaac gtgacggcat tacctcgaaa 900 gaactggaaa acagcaaaga gcaaatgaag ggaagcttaa tgctgagctt agaaagcaca 960 aacagcaaaa tgagccgaaa cggaaaaaat caactgctgc tcggcaaaca taaaacatta 1020 gatgaaatta tcaatgaatt aaacgccgtg aacttagagc gtgttaatgg ccttgccaga 1080 caattgttta ccgaagacta tgcattagca cttatcagcc cttccggcaa tatgccgtct 1140 taaaaaggaa agcctgcccc ataatggagc aggcattttt taatcccttt catcatacat 1200 agtacaaggg ggtgacagac atgcggctca gtgaattatc gggaaaggaa attgtagaca 1260 tcaaaagagc tgaacggctc ggagtgctcg gccagaccga tttggaaatc aatgaacagg 1320 atggacagat tacagcactc ctcattccca cagttaagtg gtttggtttg agaaagcaag 1380 gtcatgacat tcgtgtccca tggcaccata ttcaaaagat cggttcagat atgattatat 1440 tagatgtacc tgaggaaatg cctcctcgac aagagtaaat agcccaattg actgtgaagc 1500 gggctctaaa gaaaacatct gaaacatcgg ctgccggagc cgatgttttt ttatatggaa 1560 aaagcgcatc ttttatattc accggtattt ccttttgatc ataagatgaa ggggagctta 1620 acaactagag atccagtata tacaaagaag gtgaacgttt agaatgttaa ccggattgaa 1680 aattgcagtt atcggcggtg acgcaagaca gctcgaaatt ataagaaagc tcactgaaca 1740 gcaggctgac atctatcttg tcggttttga ccaattggat cacggtttta ccggggcagt 1800 aaaatgcaat attgatgaaa ttccttttca gcaaatagac agcatcattc ttccagtatc 1860 cgcgacaaca ggagaaggtg tcgtatcgac tgtattttcg aatgaagaag ttgtgttaaa 1920 acaggaccat cttgacagaa cgcctgcaca ttgtgtcatt ttctcaggaa tttctaacgc 1980 ctatttagaa aacattgcag ctcaggcaaa aagaaaactt gttaagctgt ttgagcggga 2040 tgacattgcg atatacaact ctattccgac agtagaagga acgatcatgc tggctattca 2100 gcacacggat tatacgatac acggatcaca ggtggccgtt ctcggtctgg ggcgcaccgg 2160 gatgacgatt gcccgtacat ttgccgcgct cggggcgaat gtaaaagtgg gggcaagaag 2220 ttcagcgcat ctggcacgta tcactgaaat ggggctcgtt ccttttcata ccgatgagct 2280 gaaagagcat gtaaaagata tagatatttg cattaatacc ataccgagta tgattttaaa 2340 tcaaacggta ctttctagca tgacaccaaa aaccttaata ttggatctgg cctcacgtcc 2400 cgggggaacg gattttaaat atgccgagaa acaagggatt aaagcacttc ttgctcccgg 2460 gcttccaggg attgtcgctc ctaaaacagc tgggcaaatc cttgcaaacg tcttgagcaa 2520 gcttttggct gaaatacaag ctgaggaggg gaaataagga tgtcgtcatt aaaaggaaaa 2580 agaatcgggt ttgggctgac cgggtcgcat tgcacatatg aagcggtttt cccgcaaatt 2640 gaggagttgg tcaacgaagg agctgaagtc cgtccggttg tcacatttaa tgtaaaatct 2700 acaaataccc gatttggaga gggcgcagaa tgggttaaaa aaattgaaga cctgactgga 2760 tatgaggcca ttgattcgat tgtaaaggca gaacctcttg ggccgaagct gccccttgac 2820 tgcatggtca ttgcgccttt aacaggcaat tcaatgagca agctggcaaa tgccatgacg 2880 gacagcccgg tgctgatggc ggcaaaagcg acaatccgga acaatcggcc tgtcgttctg 2940 ggtatctcga caaatgatgc tcttggttta aacggaacaa atttaatgag gctcatgtca 3000 acaaaaaata tcttttttat tccattcggg caagatgatc catttaaaaa accgaattca 3060 atggtagcca aaatggatct gcttccgcaa acgattgaaa aggcactcat gcaccagcag 3120 cttcagccga ttctagttga gaattatcag ggaaatgact aaatttacag aaaatctttc 3180 ccaaactaaa aaattcggtc atcacccgca tattctatgg taaaataaaa cgtaaaatca 3240 tagtcaaatc aattcaatga agctgattgg cggaaggagt tttacagatg ggaagaggtt 3300 tacacgtagc tgttgtcgga gcgacagggg ctgtgggaca acaaatgctt aaaacacttg 3360 aagacagaaa ctttgaaatg gacacactta cattgctatc ttcaaaacgc tctgcgggga 3420 caaaagtcac gtttaaaggc caagagctga ctgttcagga agcttctcct gagagctttg 3480 aaggggtaaa tattgctttg ttcagcgccg gcggaagcgt atcacaagca ttggcaccag 3540 aagctgtaaa acgcggcgct attgttatag ataatacgag tgcgttccgc atggatgaaa 3600 atacaccgct tgttgtgcca gaagtgaatg aggcagactt gcatgaacac aacggcatta 3660 ttgccaatcc aaactgctct acaatccaaa tggttgcggc acttgaaccg atccgcaaag 3720 catatggctt aaacaaggtc atcgtatcaa cttaccaggc agtatcagga gcgggtaatg 3780 aagctgtaaa agagctttac agccaaacac aggcgatttt aaataaagaa gaaatagagc 3840 ctgagatcat gcctgtaaaa ggtgacaaaa aacactatca aatcgccttc aacgcgattc 3900 cgcaaatcga taaattccaa gataacggct atacgtttga ggaaatgaaa atgataaatg 3960 aaacgaaaaa aatcatgcac atgcctgacc ttcaagtagc ggctacatgt gtgagactgc 4020 caatccaaac tgggcactca gagtccgtct acatcgaaat agaccgtgat gacgctacag 4080 ttgaagatat taaaaatcta ttgaaagaag ctccgggcgt gacacttcag gatgatccaa 4140 gccagcagct ttatccgatg cctgctgatg ctgtcggcaa aaacgatgtg tttgtaggcc 4200 gcatccgcaa agacttggac agagcaaacg gttttcattt atgggttgtt tctgataacc 4260 tattaaaagg cgcggcatgg aactctgttc aaattgcaga aagcctgaaa aaactaaacc 4320 tcgtataaaa gagagaattt tctaaagacg aatagaagag agtaaggcgc tatcagcctg 4380 ctctcttctg ttacgtccga ataatttgga gtgaaaacag tgaagataat tgttcaaaag 4440 ttcggcggaa catcagtaaa agatgataaa ggccgcaaac tggctttagg gcatattaaa 4500 gaagcaatca gtgaaggata taaggttgtc gttgtcgttt cagcgatggg ccgaaaaggg 4560 gacccgtatg caacagattc tttgctcggg ctgctttacg gcgatcagtc agcgatttct 4620 cctagggagc aggatttgct tttatcttgc ggagagacta tttcctctgt cgtctttaca 4680 agcatgctgc ttgataacgg tgtgaaagca gctgcgctga caggggctca ggctggcttt 4740 ttaacgaatg atcagcatac taatgcgaaa atcattgaaa tgaaaccgga gcgtttattc 4800 agtgtgctcg ccaatcatga tgcggtagtc gtcgcaggct tccagggcgc aactgaaaag 4860 ggtgatacaa caacaatcgg cagagggggc agcgatacgt ctgcagccgc actcggagca 4920 gctgttgatg cggaatacat cgatattttc accgatgtag aaggcgtgat gactgctgac 4980 ccaagagtgg tagaaaatgc aaaaccgctt cctgttgtga cgtatacgga aatctgcaac 5040 ctggcgtatc agggggccaa ggtcatttct ccgcgtgctg tggaaatcgc aatgcaggcc 5100 aaggttccga tccgcgtccg ttcgacttat tcgaatgata aaggcacatt ggtgacatca 5160 catcactctt ccaaggtcgg cagtgatgtt tttgaaaggc tgattacggg aatcgcccat 5220 gtcaaagatg tcacgcagtt caaagtgcct gcgaaaatcg gccagtataa cgttcagact 5280 gaagtgttca aggctatggc aaacgctgga atcagtgtcg atttctttaa cattacacct 5340 agtgaaatcg tctatacggt agccggaaat aaaacagaaa cagctcagcg tattttaatg 5400 gatatgggct atgatccaat ggtgacgaga aactgcgcga aggtatcggc ggtcggcgcg 5460 ggcattatgg gtgttcccgg tgttacgtcc aaaattgtat cggctctttc agaaaaagaa 5520 attccgatcc ttcagtcggc tgacagccat acgacgatat gggtgctcgt ccatgaagcg 5580 gatatggttc ctgctgtaaa cgctttgcat gaagtgtttg aactttcgaa gtaaatgtga 5640 ttgaatcatg atgaggtgaa taaaatgaat ttcggaaatg tgtctacagc gatgattaca 5700 ccctttgaca ataaagggaa cgtagacttt caaaaactgt ctacactgat tgattacttg 5760 ttgaaaaacg gaacggattc tttagtagta gcgggaacaa ctggagaatc tccgaccctt 5820 tcaactgaag aaaaaattgc gctttttgaa tatacggtaa aagaagtaaa cggacgggtg 5880 cccgttatcg ctggtactgg gagcaacaac acgaaagatt ccattaagct gacaaaaaaa 5940 gctgaggaag cgggcgtgga cgctgttatg cttgttaccc cgtattacaa taaaccttct 6000 caagaaggaa tgtaccagca ttttaaagca attgcggcag agacatctct tccggttatg 6060 ctctataatg ttcctggccg tacggttgct tctcttgctc ctgaaacgac gatccgtttg 6120 gcggcagaca ttccgaatgt ggttgcgatt aaagaagcga gcggagacct cgaagcgatt 6180 acaaaaatta ttgctgaaac acctgaagac ttctatgtct attcagggga tgatgctcta 6240 acgcttccaa ttctttcagt tggaggtaga ggagttgtgt cagtggcgag ccatattgca 6300 ggcactgata tgcagcaaat gatcaaaaat tatacgaatg ggcaaacagc taatgcggca 6360 ctgattcatc agaaactgct gccgattatg aaggaactgt ttaaagcgcc taatcctgct 6420 ccagtcaaaa cagcgcttca gctgagaggt cttgatgtcg gttctgtgcg tctgcctcta 6480 gtcccattaa ctgaggatga acgtctgagc ttaagcagca cgatcagcga actgtaagaa 6540 aatttcatac agtgaaacaa acgcggtcat tctcacattc agctgagttt gaccgtttct 6600 tttacatatt ggttttccct aaaccttctg ctttatcttg ttttctaaat ttactttcag 6660 ttataatagg aacaagtgat gatggacggg tatgagacta ggaggatata gattttgaaa 6720 aagaaaaata cagaaaacgt tagaattatc gcccttggcg gtgtcggaga gatcgggaat 6780 taccattttt ggacagctgt cttttcagca gcagccatta tgctcggggg ctttctcgct 6840 gactttttca cagtgcaaat gattttttat gcaagctcta ttctatattt tttgagtgga 6900 ttgatgatga tgaaaacagg ctgacgcggt cagcctgttt ttttatgcgg ctgaaatgcg 6960 gcaccgcatc aacgtttttg tgctggagtc gtgctgattt tttttgagcg gaattc 7016 <210> 2 <211> 290 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 2 Met Asn Phe Gly Asn Val Ser Thr Ala Met Ile Thr Pro Phe Asp Asn 1 5 10 15 Lys Gly Asn Val Asp Phe Gln Lys Leu Ser Thr Leu Ile Asp Tyr Leu 20 25 30 Leu Lys Asn Gly Thr Asp Ser Leu Val Val Ala Gly Thr Thr Gly Glu 35 40 45 Ser Pro Thr Leu Ser Thr Glu Glu Lys Ile Ala Leu Phe Glu Tyr Thr 50 55 60 Val Lys Glu Val Asn Gly Arg Val Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ser 65 70 75 80 Asn Asn Thr Lys Asp Ser Ile Lys Leu Thr Lys Lys Ala Glu Glu Ala 85 90 95 Gly Val Asp Ala Val Met Leu Val Thr Pro Tyr Tyr Asn Lys Pro Ser 100 105 110 Gln Glu Gly Met Tyr Gln His Phe Lys Ala Ile Ala Ala Glu Thr Ser 115 120 125 Leu Pro Val Met Leu Tyr Asn Val Pro Gly Arg Thr Val Ala Ser Leu 130 135 140 Ala Pro Glu Thr Thr Ile Arg Leu Ala Ala Asp Ile Pro Asn Val Val 145 150 155 160 Ala Ile Lys Glu Ala Ser Gly Asp Leu Glu Ala Ile Thr Lys Ile Ile 165 170 175 Ala Glu Thr Pro Glu Asp Phe Tyr Val Tyr Ser Gly Asp Asp Ala Leu 180 185 190 Thr Leu Pro Ile Leu Ser Val Gly Gly Arg Gly Val Val Ser Val Ala 195 200 205 Ser His Ile Ala Gly Thr Asp Met Gln Gln Met Ile Lys Asn Tyr Thr 210 215 220 Asn Gly Gln Thr Ala Asn Ala Ala Leu Ile His Gln Lys Leu Leu Pro 225 230 235 240 Ile Met Lys Glu Leu Phe Lys Ala Pro Asn Pro Ala Pro Val Lys Thr 245 250 255 Ala Leu Gln Leu Arg Gly Leu Asp Val Gly Ser Val Arg Leu Pro Leu 260 265 270 Val Pro Leu Thr Glu Asp Glu Arg Leu Ser Leu Ser Ser Thr Ile Ser 275 280 285 Glu Leu 290 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> Unsure <222> (1)..(21) <223> DapA-F primer <400> 3 cggcgatcgt ttctgttggc a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> Unsure <222> (1)..(21) <223> DapA-R primer <400> 4 atctgggcca tatcacgcgc t 21 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> Unsure <222> (1)..(45) <223> bsdapa119muts primer <400> 5 tcaagaagga atgtaccagt atttcaaagc aattgcggca gagac 45 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> Unsure <222> (1)..(45) <223> bsdapa119mutas primer <400> 6 gtctctgccg caattgcttt gaaatactgg tacattcctt cttga 45 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> Unsure <222> (1)..(27) <223> ptrcBSdapA1-F primer <400> 7 ggacactgtc taatgtgagt tagcgcg 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> Unsure <222> (1)..(27) <223> ptrcBSdapA1-R primer <400> 8 cactagtatt gaagcattta tcagggt 27 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> Unsure <222> (1)..(18) <223> ptrcBSdapA2-F primer <400> 9 gcggccgctg tgcaggtc 18 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> Unsure <222> (1)..(26) <223> ptrcBSdapA2-R primer <400> 10 gaccactgtc agggttattg tctcat 26 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> Unsure <222> (1)..(23) <223> LDCup primer <400> 11 atgaacatca ttgccattat ggg 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> Unsure <222> (1)..(23) <223> f1DN primer <400> 12 ttactgctca tacagttcca acg 23 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> Unsure <222> (1)..(20) <223> FRT5 primer <400> 13 attccgggga tccgtcgacc 20 <210> 14 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> Unsure <222> (1)..(59) <223> HPA1FRT3 primer <400> 14 aacagcacgt tactcgcccg gaagccgctc tggcaagtta tgtaggctgg agctgcttc 59

Claims

B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자를 포함하며, 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) 박테리아에서 자발적으로 복제되는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA.
제 1항에 있어서, 상기 dapA 유전자는 서열번호 1과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA.
제 2항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호 1과 동일한 핵산 서열인 것을 특징으로 하는 재조합 DNA.
제 2항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호 1의 355번 뉴클레오티드 잔기인 G가 T로 변이 및 360번 뉴클레오티드 잔기인 T가 C로 변이된 두 개의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA.
제 1항에 있어서, 상기 dapA 유전자는 서열번호 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA.
제 5항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 2와 동일한 것을 특징으로 하는 재조합 DNA.
제 5항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 2의 119번 아미노산 잔기인 히스티딘이 티로신으로 치환된 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA.
B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자를 포함하며, L-리신을 생산하는 것을 특징으로 하는 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) 박테리아.
제 8항에 있어서, 상기 dapA 유전자는 서열번호 1과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 박테리아.
제 8항에 있어서, 상기 dapA 유전자는 서열번호 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 박테리아.
제 10항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 2와 동일한 것을 특징으로 하는 박테리아.
제 8항에 있어서, 상기 박테리아는 중국일반미생물보존센터(China General Microbiological Culture Collection Center)에 기탁된 기탁번호 CGMCC 제2923호를 갖는 박테리아인 것을 특징으로 하는 박테리아.
제 10항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 2의 119번 아미노산 잔기인 히스티딘이 티로신으로 치환된 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아.
제 8항에 있어서, 상기 박테리아는 중국일반미생물보존센터(China General Microbiological Culture Collection Center)에 기탁되어 기탁번호 CGMCC 제2924호를 갖는 것을 특징으로 하는 박테리아.
제 8항에 있어서, 상기 박테리아는 배양 배지에서 적어도 50 g/l로 L-리신을 생산하는 것을 특징으로 하는 박테리아.
배양 배지에서 B. 서브틸리스(B. subtilis) dapA 유전자를 포함하는 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) 박테리아를 성장시키고, 배양 배지로부터 L-리신을 수집하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 L-리신을 생산하는 방법.
제 16항에 있어서, 상기 dapA 유전자는 서열번호 1과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 상기 dapA 유전자는 서열번호 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
제 18항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 2와 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
제 18항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 2의 119번 아미노산 잔기인 히스티딘이 티로신으로 치환된 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.