KR20070116187A - 메틸로필루스 메틸로트로푸스로부터 유도된 신규한 효소 및이를 암호화하는 유전자 - Google Patents

메틸로필루스 메틸로트로푸스로부터 유도된 신규한 효소 및이를 암호화하는 유전자 Download PDF

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아지노모토 가부시키가이샤
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Abstract

신규한 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타제 및 프레페네이트 데하이드라타제/코리스메이트 뮤타제 및 메틸로필루스 메틸로트로푸스로부터 유도된 상기 효소를 암호화하는 DNA가 제공된다.
메틸로필루스 메틸로트로푸스(Methylophilus methylotrophus), 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타제, 프레페네이트 데하이드라타제, 코리스메이트 뮤타제, 방향족 아미노산

Description

메틸로필루스 메틸로트로푸스로부터 유도된 신규한 효소 및 이를 암호화하는 유전자{Novel enzymes and genes coding for the same derived from Methylophilus methylotrophus}
본 발명은 생명공학, 보다 구체적으로는 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타제, 프레페네이트 데하이드라타제 및 상기 효소를 암호화하는 유전자에 관한 것이다. 상기 유전자는 방향족 아미노산의 생산성 향상에 유용하다.
통상적으로, L-아미노산은 브레비박테리움(Brevibacterium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 바실러스(Bacillus), 에스케리키아(Escherichia), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 아트로박터(Arthrobactor), 세라티아(Serratia), 페니실리움(Penicillium) 및 칸디다(Candida) 속에 속하는 미생물을 사용하는 발효법으로 산업적으로 생산되었다. 이러한 미생물로서, 이러한 미생물의 천연 또는 돌연변이로부터 분리된 균주가 생산성을 향상시키기 위해 사용되 었다. 추가로, L-아미노산-생합성 경로에 연루된 효소적 활성을 증강시킴으로써 L-아미노산 생산성을 향상시키는 다양한 재조합 DNA 기술이 기재되어 있다.
L-아미노산의 생산성은 상기 언급된 미생물을 육종시키거나, 생산 방법을 개선시킴으로써 향상되었지만, 예상되는 L-아미노산의 현저히 증가되는 미래 수요에 부합하기 위한 보다 값싸고 효과적인 L-아미노산 생산 방법을 개발하는 것이 여전히 바람직하다.
통상적으로, 아크로모박터(Achromobactor) 및 슈도모나스(참조: 일본 공개 특허 공보 제45-25273호), 프로트아미노박터(Protaminobactor)(참조: 일본 공개 특허 공보 제49-125590호), 프로트아미노박터 및 메타노모나스(Methanomonas)(참조: 일본 공개 특허 공보 제50-25790호), 마이크로사이클러스(Microcyclus)(참조: 일본 공개 특허 공보 제52-18886호), 메틸로바실러스(Methylobacillus)(참조: 일본 공개 특허 공보 제4-91793호) 및 바실러스(참조: 일본 공개 특허 공보 제3-505284호) 속에 속하는 세균을 사용하여, 값싸고 대량으로 입수할 수 있는 가공하지 않은 물질로서 메탄올을 사용하는 발효에 의한 공지된 아미노산 생산 방법이 있다.
이외에도, L-페닐알라닌, L-티로신 및 L-트립토판과 같은 방향족 화합물의 생합성 경로에 중심 역할을 하는 수개의 효소가 있다. 중요한 효소는 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타제(약어 "DS"로서 후술됨)이다. L-페닐알라닌의 생합성에 있어서, 프레페네이트 데하이드라타제(약어 "PD"로서 후술됨)도 또한 중요한 효소이다.
그러나, 메틸로필루스(Methylophilus) 속에 속하는 세균의 DS 및 PD를 암호 화하는 어떠한 유전자도 공지되어 있지 않다.
본 발명의 목적은 메틸로트로푸스 속에 속하는 세균의 DS 및 PD를 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.
상기 언급된 목적을 이루기 위해서, 본 발명자들은 집중적으로 연구하였다. 결과로서, 본 발명자들은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 코리스메이트 뮤타제-프레페네이트 데하이드라타제 유전자(pheA)-결핍 균주를 사용하여 메틸로필루스 메틸로트로푸스(Methylophilus methylotrophus)로부터 DS 및 PD를 암호화하는 유전자를 분리하는데 성공하였고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명에 따라 제공되는 유전자는 방향족 아미노산의 생산성 향상에 유용하게 사용될 수 있다.
즉, 본 발명은,
(1) 하기 (A) 또는 (B)로 정의된 바와 같은 단백질:
(A) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 또는
(B) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열에서 하나 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타제 활성을 갖는 단백질,
(2) 하기 (A) 또는 (B)로 정의된 바와 같은 단백질을 암호화하는 DNA:
(A) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 또는
(B) 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열에서 하나 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타제 활성을 갖는 단백질,
(3) 하기 (A) 또는 (B)로 정의된 바와 같은 DNA인, 상기 (2)에 따르는 DNA:
(A) 서열번호 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA; 또는
(B) 서열번호 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 서열로부터 제조된 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화할 수 있고, 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA,
(4) 엄격한 조건이 60℃, 및 1 ×SSC 및 0.1% SDS에 상응하는 염 농도에서 세척을 수행하는 조건인, 상기 (3)에 따르는 DNA,
(5) 하기 (C) 또는 (D)에 정의된 바와 같은 단백질:
(C) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 또는
(D) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열에서 하나 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 프레페네이트 데하이드라타제 활성 또는 코리스메이트 뮤타제 활성중 하나 이상을 갖는 단백질,
(6) 하기 (C) 또는 (D)에 정의된 바와 같은 단백질을 암호화하는 DNA:
(C) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 또는
(D) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열에서 하나 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 프레페네이트 데하이드라타제 또는 코리스메이트 뮤타제 활성중 하나 이상을 갖는 단백질,
(7) 하기 (C) 또는 (D)에 정의된 바와 같은 DNA인, 상기 (6)에 따르는 DNA:
(C) 서열번호 3에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA; 또는
(D) 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 서열로부터 제조된 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화할 수 있고, 프레페네이트 데하이드라타제 또는 코리스메이트 뮤타제 활성중 하나 이상을 갖는 DNA,
(8) 엄격한 조건이 60℃, 및 1 ×SSC 및 0.1% SDS에 상응하는 염 농도에서 세척을 수행하는 조건인, 상기 (3)에 따르는 DNA를 제공한다.
본 발명에서, 용어 "3-데옥시-D-아라비노헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타제 활성"은 포스포에놀피루베이트 및 D-에리트로스 4-포스페이트로부터 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소네이트-7-포스페이트를 합성하는 반응을 촉매하는 활성을 의미한다. 용어 "프레페네이트 데하이드라타제 활성"은 프레펜산으로부터 페닐피루브산을 합성하는 반응을 촉매하는 활성을 의미하고, 용어 "코리스메이트 뮤타제"는 코리스민산으로부터 프레펜산을 합성하는 반응을 촉매하는 활성을 의미한다. 본 발명에 기재된 PD는 에스케리키아 콜라이와 같은 기타 미생물과 유사하게 코리스메이트 뮤타제 활성 및 프레페네이트 데하이드라타제 활성을 갖는 것으로 제시된다. 본 발명에서, 용어 "프레페네이트 데하이드라타제 또는 코리스메이트 뮤타제 활성중 하나 이상"은 PD가 함유하는 하나 또는 두가지 모든 특성을 의미한다. 하기, 본 발명에서 "프레페네이트 데하이드라타제 또는 코리스메이트 뮤타제 활성중 하나 이상"은 "PD 활성"으로서 언급될 수 있다.
본 발명은 하기 상세히 설명될 것이다.
본 발명의 DNA는 하기 기재되는 바와 같이, 엠. 메틸로트로푸스의 염색체 DNA로부터 수득될 수 있다.
엠. 메틸로트로푸스의 염색체 DNA, 예를 들면, 엠. 메틸로트로푸스 균주 AS-1이 제조된다. 염색체 DNA는 예를 들어, Saito and Miura 방법[참고문헌: Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)], 또는 K. S. Kirby 방법[참고문헌: Biochem. J., 64, 405 (1956)]에 의해 세포 펠렛으로부터 수득될 수 있다.
이어서, 수득된 염색체 DNA로부터 DS 또는 PD 유전자를 분리하기 위해서, 염색체 DNA 라이브러리를 제조한다. 우선, 염색체 DNA를 적절한 제한 효소로 부분적으로 분해하여 다양한 단편의 혼합물을 수득한다. 절단 정도가 절단 반응 시간 등에 의해 조절되는 경우 다양한 제한 효소가 사용될 수 있다. 예를 들면, Sau3AI 또는 BamHI는 염색체 DNA를 분해하기 위해서 다양한 시간 기간(1분 내지 2시간) 동안 1 내지 10단위/㎖의 효소 농도로 30℃ 이상, 바람직하게는 37℃의 온도로 염색체 DNA 상에서 반응시킨다.
그다음, 수득된 DNA 단편은 에스케리키아 속에 속하는 세균의 세포내에서 자가복제할 수 있는 벡터 DNA와 연결되어 재조합 DNA를 형성한다. 구체적으로는, 염 색체 DNA를 절단하는데 사용된 제한 효소 Sau3AI에 의해 생성되는 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 말단 뉴클레오타이드 서열을 생산하는 제한 효소, 예를 들어, BamHI는 30℃ 이상의 온도 및 1 내지 100단위/㎖의 효소 농도의 조건하에 1시간 이상, 바람직하게는 1 내지 3시간 동안 벡터 DNA상에서 작용하여 이를 완전하게 분해하고 절단 및 개열할 수 있다. 그다음, 상기 기재된 바와 같이 수득된 염색체 DNA 단편 혼합물은 개열되고 절단된 벡터 DNA와 혼합되고, DNA 리가제, 바람직하게는 T4 DNA 리가제가 상기 혼합물상에서 4 내지 16℃의 온도 및 1 내지 100단위/㎖의 효소 농도의 조건하에서 1시간 이상, 바람직하게는 4 내지 24시간 동안 작용하여 재조합 DNA를 수득할 수 있다.
수득된 재조합 DNA는 에스케리키아 속에 속하는 미생물, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이 B-7078(pheA::Tn10(KmR))을 형질전환하는데 사용된다. 이어서, 형질전환체는 페닐알라닌이 없는 아가 플레이트상에 플레이팅되고 생성된 콜로니는 액체 배지에 접종되어 배양된다. 플라스미드가 상기 세포로부터 회수되어 PD 유전자를 함유하는 DNA 단편이 수득된다.
상기 기재된 바와 같이 수득된 DNA 단편이 실질적으로 PD 유전자를 함유하는지는 상기 단편을 서열화하고, 결정된 서열이 서열번호 3에 제시된 서열을 함유하는지 확인함으로써 확인된다.
하기 기재된 실시예에서 수득된 PD 유전자를 함유하는 클로닝된 단편이 또한 DS 유전자를 함유하는지는, 상기 단편이 DS-결핍 균주인 AB3257 균주(aroG365-, aroH367-, aroF363-, thi-1, ilvC7, argE3, his-4, proA2, xyl-5, galK2, lacY1, mtl-1, strA712, tfr3, tsx-358, supE44, hsdR2, zjj-202::Tn10)의 방향족 영양요구성을 보충한다는 사실과 상기 단편을 서열화함으로써 증명되었다.
BamHI가 메틸로필루스 메틸로트로푸스 AS-1 균주의 염색체 DNA를 분해하는데 사용되는 경우, 상기 DS 및 PD 유전자는 약 10Kb의 BamHI-단편으로서 클로닝된다.
메틸로트로푸스 속에 속하는 기타 세균의 DS 및 PD 유전자는 상기 기재된 바와 같은 동일한 방법으로 분리될 수 있다. 추가로, 본 발명의 DNA의 뉴클레오타이드 서열이 밝혀졌으므로, 상기 DNA는, 프라이머로서 결정된 서열을 근거로 합성된 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 PCR(폴리머라제 연쇄 반응) 또는 프로브로서 상기 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 하이브리드화에 의해 메틸로필루스 속에 속하는 세균의 염색체 DNA 또는 게놈 라이브러리로부터 수득될 수 있다.
게놈 DNA의 제조, 게놈 DNA 라이브러리의 제조, 하이브리드화, PCR, 플라스미드 DNA의 제조, DNA의 분해 및 연결, 및 형질전환을 수행하기 위해 당해 분야 숙련가에게 공지된 통상의 방법이 사용될 수 있다. 이는 문헌[참고문헌: Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)]에 기재되어 있다.
상기 기재된 바와 같이 수득된 DS 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록에서 서열번호 1에 예시된다. 추가로, 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있는 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2에 예시된다.
상기 기재된 바와 같이 수득된 PD 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록에서 서열번호 3에 예시된다. 추가로, 상기 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있는 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 4에 예시된다.
본 발명의 DNA는 하나 또는 다수의 위치에서 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가, 또는 역위를 포함하는 DS 또는 PD를 암호화할 수 있고, 단, 이로 인하여 암호화된 DS 또는 PD의 활성은 변질되지 않는다. "수개의" 아미노산의 수는 단백질의 3차원 구조에서 아미노산 잔기의 위치 또는 유형에 따라 상이하다. 이는 하기 이유 때문이다. 즉, 이소루신 및 발린과 같은 수개의 아미노산은 서로 높은 상동성을 갖는 아미노산들이다. 이러한 아미노산에서의 차이는 단백질의 3차원 구조에 크게 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명의 DNA에 의해 암호화되는 단백질은 DS 또는 PD를 구성하는 전체 아미노산 잔기에 대해서 35 내지 50% 이상, 바람직하게는 50 내지 70% 이상의 상동성을 갖고, DS 및 PD 활성을 갖는 것일 수 있다. 보다 적절하게는, "수개의" 아미노산의 수는 2 내지 30개, 바람직하게는 2 내지 20개, 및 보다 바람직하게는 2 내지 10개이다.
상기 기재된 바와 같이 DS 또는 PD와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열의 변형, 예를 들어, 부위특이적 돌연변이 유발법에 의해서 하나 이상의 아미노산 잔기가 특정 부위에 치환, 결실, 삽입, 부가, 또는 역위를 포함하도록 하여 수득될 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 변형된 DNA는 통상적으로 공지된 돌연변이 처리에 의해 수득될 수 있다. 상기 돌연변 이 처리는 시험관내에서 DS 및 PD를 암호화하는 DNA를 예를 들어, 하이드록실아민으로 처리하는 방법, 및 DS 및 PD를 암호화하는 DNA를 보유하는 미생물, 예를 들어, 에스케리키아 속에 속하는 세균을 자외선 조사 또는 통상적으로 돌연변이 처리에 사용되는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 및 아질산과 같은 돌연변이 제제로 처리하는 방법을 포함한다.
상기 기재된 바와 같은 뉴클레오타이드의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위는 또한 예를 들어, 개체 상이성 또는 DS 및 PD를 보유하는 미생물 종 또는 속에서 의 차이를 근거로 한, 천연적으로 발생하는 돌연변이(돌연변이체 또는 변이체)를 포함한다.
DS 및 PD와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는 상기 기재된 바와 같은 돌연변이를 갖는 DNA를 적절한 세포에서 발현시키고, 발현된 생성물의 DS 및 PD 활성을 조사함으로써 수득된다. 실질적으로 DS 및 PD와 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는 또한, 예를 들어, 서열목록에서 서열번호 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건하에서 하이브리드화할 수 있고 DS 및 PD 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를, 돌연변이를 갖는 DS 및 PD를 암호화하는 DNA 또는 이를 보유하는 세포로부터 분리함으로써 수득된다. 본원에 언급된 "엄격한 조건"은 소위 특이적 하이브리드가 형성되고, 비특이적 하이브리드가 형성되지 않는 조건이다. 임의의 수치를 사용하여 이러한 조건을 명확하게 표현하기는 곤란하다. 그러나, 예를 들면, 엄격한 조건은 상당한 상동성을 갖는 DNA, 예를 들어, 50% 이상의 상동성을 갖는 DNA가 서로 하이브리드화되고, 상기 미만의 상동성을 갖는 DNA 는 서로 하이브리드화되지 않는 조건을 포함한다. 대안으로, 엄격한 조건은 DNA가 서던 하이브리드화(Southern hybridization)에서 세척의 통상적인 조건에 상응하는 염 농도, 즉, 60℃, 1 ×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는 0.1 ×SSC, 0.1% SDS에서 서로 하이브리드화되는 조건으로 예시된다.
상기 기재된 조건하에서 하이브리드화할 수 있는 유전자는 유전자의 암호화 영역내 생성된 종결 코돈을 갖는 것과 활성 중심의 돌연변이로 인해 어떠한 활성도 갖지 않는 것을 포함한다. 그러나, 이러한 돌연변이체는 유전자를 시판중인 활성 발현 벡터와 연결하고, 상기 기재된 방법에 따라 DS 및 PD 활성을 측정함으로써 용이하게 제거될 수 있다.
DS 또는 PD 유전자가 발현되는 숙주는 예를 들어, 에스케리키아 콜라이와 같은 에스케리키아 속에 속하는 세균, 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibacterium lactofermentum)과 같은 코리네형 세균, 메틸로필루스 메틸로트로푸스와 같은 메틸로필루스 속에 속하는 세균, 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 기타 다양한 진핵세포, 동물 세포 및 식물 세포, 바람직하게는 원핵생물, 특히, 이. 콜라이, 코리네형 세균 및 엠. 메틸로트로푸스로 예시된다.
이. 콜라이내 DS 또는 PD 유전자를 도입시키는 벡터는 예를 들어, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219 및 pMW218을 포함한다. 파지 DNA 벡터가 또한 사용될 수 있다.
코리네형 세균내 DS 또는 PD 유전자 도입에 사용되는 벡터는 예를 들어, pAM330(참조: 일본 공개 특허 공보 제58-67699호), pHM1519(참조: 일본 공개 특허 공보 제58-77895호), pAJ655, pAJ611 및 pAJ1844(참조: 일본 공개 특허 공보 제58-192900호), pCG1(참조: 일본 공개 특허 공보 제57-134500호), pCG2(참조: 일본 공개 특허 공보 제58-35197호), pCG4 및 pCG11(참조: 일본 공개 특허 공보 제57-183799호), pHK4(참조: 일본 공개 특허 공보 제5-7491호)를 포함한다.
DS 및 PD 유전자의 도입은 DS 또는 PD 유전자를 상기 기재된 바와 같은 벡터와 연결함으로써 수득된 재조합 벡터로 상기 기재된 바와 같은 숙주를 형질전환시킴으로써 수행될 수 있다. 상기 DS 또는 PD 유전자는 형질도입, 트랜스포존[참고문헌: Berg, D. E. and Berg, C. M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)], 뮤(Mu) 파지[참고문헌: 일본 공개 특허 공보 제2-109985호], 또는 상동 재조합[참고문헌: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. (1972)]의 사용을 근거로 한 방법에 따라 숙주의 게놈내로 삽입될 수 있다.
DS 및 PD는 상기 기재된 바와 같은 방법에 따라 DS 또는 PD 유전자가 도입된 세포를 배양하고, 배지내에서 DS 또는 PD를 생산 및 축적시켜, 배양물로부터 수집함으로써 생산될 수 있다. 배양에 사용된 배지는 본원에 사용된 숙주에 따라 적절하게 선택될 수 있다.
경우에 따라서, 상기 기재된 바와 같은 방법으로 생산된 DS 또는 PD는 이온 교환 크로마토그래피법, 겔 여과 크로마토그래피법, 흡착 크로마토그래피법, 용매 침전법 등과 같은 효소의 통상적인 정제 방법으로 세포 추출물 또는 배지로부터 정제될 수 있다.
야생형의 활성보다 큰 DS 또는 PD의 활성을 갖는 미생물은 본 발명의 DNA를 사용함으로써 작제될 수 있다. 이는 미생물을 발현가능한 형태로서 DS 또는 PD 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환시킴으로써 수행될 수 있다.
본 발명을 위해 사용되는 세균은 예를 들어, 메틸로필루스 메틸로트로푸스 AS1(NCIMB10515) 등을 포함한다. 메틸로필루스 메틸로트로푸스 AS1(NCIMB10515)은 기탁기관 NCIMB(National Collections of Industrial and Marine Bacteria, NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom]로부터 수득할 수 있다.
방향족 아미노산, 특히 L-페닐알라닌의 생산성을 향상시키기 위해서, DS 및 PD 효소를 암호화하는 유전자의 증폭이 유용하다.
본 발명을 수행하기 위한 최선의 방법
엠. 메틸로트로푸스 프레페네이트 데하이드라타제 및 DAHP-신타제 유전자를 함유하는 10kbp의 BamHI DNA 단편을 쇼트건(shotgun) 실험에서 보충을 통해 저 복제 벡터 pMW119(ApR)상에 클로닝하였다(도 1). 이러한 실험에서, 엠. 메틸로트로푸스 AS-1의 염색체 DNA를 BamHI로 분해하였고, 수득한 DNA 단편을 T4 DNA 리가제를 사용하여 플라스미드 pMW119의 BamHI 분해 생성물과 연결하였다. 연결 생성물을 이. 콜라이 B-7078 균주(pheA::Tn10(KmR))를 형질전환시키는데 사용하였다. 암피실린 내성의 클론 중에서, 페닐알라닌 영양요구성이 사라진 균주를 선택하였고, 재조합 플라스미드를 선택된 균주로부터 회수하였다. 수득된 플라스미드중 하나를 pPD1이라 명명하였다. 클로닝된 단편의 배향이 pPD1의 배향과 반대되는 플라스미드를 pPD2라 명명하였다.
플라스미드 pPD1 및 pPD2는 이. 콜라이 B-7078 균주의 pheA- 돌연변이 뿐만 아니라 DS-마이너스 이. 콜라이 AB3257 균주(aroG-, aroH-, aroF-)의 원영양성을 보충하였다. 따라서, 플라스미드 pPD1 및 pPD2 모두 동일한 클로닝된 DNA 단편에서 PD 효소 및 DS 효소를 암호화하는 유전자를 갖고 있는 것으로 제시되었다.
pPD1 및 pPD2의 결실 유도체를 작제하였다(도 2). 시험관내에서 플라스미드 DNA를 상이한 제한 효소로 분해하고, 수득한 DNA 단편을 연결함으로써 결실을 수행하였다. 연결 혼합물을 PD-마이너스 균주 이. 콜라이 B-7078(pheA::Tn10(kan))을 Phe+ 원영양성으로 형질전환시키는데 사용하였다. 분리된 플라스미드를 지도화하고, DS-마이너스 돌연변이체 이. 콜라이 AB3257(aroG-, aroH-, aroF-)을 Aro+ 원영양성으로 보충하는 능력을 시험하였다. 작제된 결실 유도체는 구조 및 보충 능력에서 다양하였다. PD 효소를 암호화하는 오직 하나의 유전자를 함유하는 결실 유도체를 발견하였다. 이러한 결실 유도체는 DS-마이너스 돌연변이체 이. 콜라이 AB3257(aroG-, aroH-, aroF-)을 원영양성으로 보충화할 수 있는 능력이 없다. 따라서, pPD1 또는 pPD2내 클로닝된 엠. 메틸로트로푸스 DNA 단편은 각각 DS 및 PD 효소를 암호화하는 2개의 상이한 유전자를 갖는 것으로 제안되었다.
DS 및 PD 효소를 암호화하는 엠. 메틸로트로푸스의 2개의 유전자의 뉴클레오 타이드 서열을 결정하였다. DS 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 상기 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 서열번호 1에 나타낸다. PD 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 상기 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 서열번호 3에 나타낸다.
DS 및 PD를 암호화하는 엠. 메틸로트로푸스 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 컴퓨터 프로그램을 사용하여 분석하고 특징지웠다. 해독후 DS 및 PD 유전자 서열은 다수의 다른 미생물의 동일한 작용 단백질과 현저히 유사한 아미노산 서열을 나타냈다(표 1, 2)
본 발명은 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소네이트-7-포스페이트 신타제, 프레페네이트 데하이드라타제 및 상기 효소를 암호화하는 유전자를 제공한다. 상기 유전자는 방향족 아미노산의 생산성 향상에 유용하다.
엠. 메틸로트로푸스 DS 효소 단백질 서열과 기타 미생물의 유사한 서열과의 배열
미생물 서열 수탁번호 유전자 효소 엠.메틸로트로푸스 DS 단백질과의 상동성(%)
에스케리키아 콜라이 P00886 aroG 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소네이트 7-포스페이트 신타제 60%
헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae) P44303 aroG 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소 네이트 7-포스페이트 신타제 56%
에스케리키아 콜라이 P00887 aroH 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소 네이트 7-포스페이트 신타제 54%
쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) Q09755 aroF 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소 네이트 7-포스페이트 신타제 52%
에르위니아 헤르비콜라 (Erwinia herbicola) O54459 aroH 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소 네이트 7-포스페이트 신타제 52%
사카로마이세스 세레비시에 P32449 aroG 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소 네이트 7-포스페이트 신타제 54%
에스케리키아 콜라이 P00888 aroF 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소 네이트 7-포스페이트 신타제 49%
칸디다 알비칸스 (Candida albicans) P79023 aroG 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소 네이트 7-포스페이트 신타제 51%
살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) P21307 aroF 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소 네이트 7-포스페이트 신타제 49%
부크네라 아피디콜라 (Buchnera aphidicola) P46245 aroH 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소 네이트 7-포스페이트 신타제 47%
사카로마이세스 세레비시에 P14843 aroF 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소 네이트 7-포스페이트 신타제 49%
코리네박테리움 글루타미쿰 P35170 aroG 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소 네이트 7-포스페이트 신타제 48%
칸디다 알비칸스 P34725 aroF 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소 네이트 7-포스페이트 신타제 50%
에르위니아 헤르비콜라 Q02285 aroF 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소 네이트 7-포스페이트 신타제 53%
아미콜라토프시스 메타놀리카 (Amycolatopsis methanolica) Q44093 aroG 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소 네이트 7-포스페이트 신타제 52%
엠. 메틸로트로푸스 PD 효소 단백질 서열과 기타 미생물의 유사한 서열과의 배열
미생물 서열 수탁번호 유전자 효소 엠.메틸로트로푸스 PD 단백질과의 상동성(%)
니세리아 고노르호에 (Neisseria gonorrhoeae) Q9ZHY3 pheA 코리스메이트 뮤타제;프레페네이트 데하이드라타제 54%
슈도모나스 스투트제리 (Pseudomonas stutzeri) P27603 pheA 코리스메이트 뮤타제;프레페네이트 데하이드라타제 47%
아퀴펙스 아에올리쿠스 (Aquifex aeolicus) O67085 pheA 코리스메이트 뮤타제;프레페네이트 데하이드라타제 47%
에르위니아 헤르비콜라 Q02286 pheA 코리스메이트 뮤타제;프레페네이트 데하이드라타제 37%
에스케리키아 콜라이 P07022 pheA 코리스메이트 뮤타제;프레페네이트 데하이드라타베 36%
헤모필루스 인플루엔자 P43900 pheA 코리스메이트 뮤타제;프레페네이트 데하이드라타제 34%
도 1은 DS 및 PD 유전자를 갖는 플라스미드 pPD1 및 pPD2의 작제를 나타내고,
도 2는 PD 및 DS 단편을 함유하는 엠. 메틸로트로푸스 DNA 단편의 결실후 수득된 플라스미드의 보충 분석을 나타낸다.
<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Novel Enzymes and Genes Coding for the Same Derived from Methylophilus methylotrophus <130> B886MSOP1086 <150> RU 2000128122 <151> 2000-11-13 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1083 <212> DNA <213> Methylophilus methylotrophus <220> <221> CDS <222> (1)..(1080) <400> 1 atg act gca tac gaa aaa tta gcc acc gat gat gtg cgc gtg ctt gaa 48 Met Thr Ala Tyr Glu Lys Leu Ala Thr Asp Asp Val Arg Val Leu Glu 1 5 10 15 atc aag ccg ctg gta aag ccc gcg gag cta ttg tct cgc ctg cag gaa 96 Ile Lys Pro Leu Val Lys Pro Ala Glu Leu Leu Ser Arg Leu Gln Glu 20 25 30 agt aca gtc agt acc caa aac atc ctt aaa acg cgg tca gcg att cat 144 Ser Thr Val Ser Thr Gln Asn Ile Leu Lys Thr Arg Ser Ala Ile His 35 40 45 cat att ctc cat cag ggc gac gac cgg ttg ctg gtg att gtt ggc cct 192 His Ile Leu His Gln Gly Asp Asp Arg Leu Leu Val Ile Val Gly Pro 50 55 60 tgt tcc atc cat gac acg gaa gct ggc atg gag tac gcg cga cgc ctg 240 Cys Ser Ile His Asp Thr Glu Ala Gly Met Glu Tyr Ala Arg Arg Leu 65 70 75 80 ctc gat gtg cgt cag cga ctg ggt ggc gaa ttg ctc att gtc atg cgc 288 Leu Asp Val Arg Gln Arg Leu Gly Gly Glu Leu Leu Ile Val Met Arg 85 90 95 gtc tat ttt gag aaa ccc cgt acc acg gta ggg tgg aaa ggc ctg atc 336 Val Tyr Phe Glu Lys Pro Arg Thr Thr Val Gly Trp Lys Gly Leu Ile 100 105 110 aac gac ccg cat ctg gat ggg act tat gat atc aat ctt gga ttg gag 384 Asn Asp Pro His Leu Asp Gly Thr Tyr Asp Ile Asn Leu Gly Leu Glu 115 120 125 aag gcc cgc cgt ttc ctg ctg gat gtg aat gaa att ggc atg cct gca 432 Lys Ala Arg Arg Phe Leu Leu Asp Val Asn Glu Ile Gly Met Pro Ala 130 135 140 gcc aca gaa ttc ctc gat gtg gtc tcc ccg caa tat act gct gac ctg 480 Ala Thr Glu Phe Leu Asp Val Val Ser Pro Gln Tyr Thr Ala Asp Leu 145 150 155 160 gtc agc tgg gga gct att ggc gct cgg acg aca gag tct cag att cac 528 Val Ser Trp Gly Ala Ile Gly Ala Arg Thr Thr Glu Ser Gln Ile His 165 170 175 cgc gaa ttg gcc tct ggc ctg tct tgt ccg gtt ggc ttt aaa aat ggg 576 Arg Glu Leu Ala Ser Gly Leu Ser Cys Pro Val Gly Phe Lys Asn Gly 180 185 190 acc gat ggc ggc gtc aaa gtt gcc att gat gcg att aag gca gca gcc 624 Thr Asp Gly Gly Val Lys Val Ala Ile Asp Ala Ile Lys Ala Ala Ala 195 200 205 agt ccg cat cac ttt ttg tcc gtg acc aaa gaa ggc gaa tcc gct att 672 Ser Pro His His Phe Leu Ser Val Thr Lys Glu Gly Glu Ser Ala Ile 210 215 220 ttt gcc acc aag ggt aat gaa gac tgc cat gtg att tta cgt ggc ggt 720 Phe Ala Thr Lys Gly Asn Glu Asp Cys His Val Ile Leu Arg Gly Gly 225 230 235 240 aaa gcg ccg aac ttt gat gcg cct agt gtg gca gca gta tgc gac caa 768 Lys Ala Pro Asn Phe Asp Ala Pro Ser Val Ala Ala Val Cys Asp Gln 245 250 255 ttg gca gac gct ggc ctg gca ccg gta ttg atg gtg gat tgc agt cat 816 Leu Ala Asp Ala Gly Leu Ala Pro Val Leu Met Val Asp Cys Ser His 260 265 270 ggc aat agc cag aag caa tat aaa aac caa att tcg gtg gtg aat gat 864 Gly Asn Ser Gln Lys Gln Tyr Lys Asn Gln Ile Ser Val Val Asn Asp 275 280 285 gtg gct agc caa ata gcg ggt gga gat gct cgc ata atc ggg atc atg 912 Val Ala Ser Gln Ile Ala Gly Gly Asp Ala Arg Ile Ile Gly Ile Met 290 295 300 cta gag tcg cat ttg aac gaa ggg cga cag gat cat tcg cca ggc tgc 960 Leu Glu Ser His Leu Asn Glu Gly Arg Gln Asp His Ser Pro Gly Cys 305 310 315 320 agc ctt aat tat ggg caa tcc atc acc gat gcc tgt ttg gga tgg gag 1008 Ser Leu Asn Tyr Gly Gln Ser Ile Thr Asp Ala Cys Leu Gly Trp Glu 325 330 335 gac tca gtg gct gtg ctg gaa acg ctg gct gct gca gtc aag gcc cgc 1056 Asp Ser Val Ala Val Leu Glu Thr Leu Ala Ala Ala Val Lys Ala Arg 340 345 350 cgt gac aag cat gcc gct gct gaa taa 1083 Arg Asp Lys His Ala Ala Ala Glu 355 <210> 2 <211> 360 <212> PRT <213> Methylophilus methylotrophus <400> 2 Met Thr Ala Tyr Glu Lys Leu Ala Thr Asp Asp Val Arg Val Leu Glu 1 5 10 15 Ile Lys Pro Leu Val Lys Pro Ala Glu Leu Leu Ser Arg Leu Gln Glu 20 25 30 Ser Thr Val Ser Thr Gln Asn Ile Leu Lys Thr Arg Ser Ala Ile His 35 40 45 His Ile Leu His Gln Gly Asp Asp Arg Leu Leu Val Ile Val Gly Pro 50 55 60 Cys Ser Ile His Asp Thr Glu Ala Gly Met Glu Tyr Ala Arg Arg Leu 65 70 75 80 Leu Asp Val Arg Gln Arg Leu Gly Gly Glu Leu Leu Ile Val Met Arg 85 90 95 Val Tyr Phe Glu Lys Pro Arg Thr Thr Val Gly Trp Lys Gly Leu Ile 100 105 110 Asn Asp Pro His Leu Asp Gly Thr Tyr Asp Ile Asn Leu Gly Leu Glu 115 120 125 Lys Ala Arg Arg Phe Leu Leu Asp Val Asn Glu Ile Gly Met Pro Ala 130 135 140 Ala Thr Glu Phe Leu Asp Val Val Ser Pro Gln Tyr Thr Ala Asp Leu 145 150 155 160 Val Ser Trp Gly Ala Ile Gly Ala Arg Thr Thr Glu Ser Gln Ile His 165 170 175 Arg Glu Leu Ala Ser Gly Leu Ser Cys Pro Val Gly Phe Lys Asn Gly 180 185 190 Thr Asp Gly Gly Val Lys Val Ala Ile Asp Ala Ile Lys Ala Ala Ala 195 200 205 Ser Pro His His Phe Leu Ser Val Thr Lys Glu Gly Glu Ser Ala Ile 210 215 220 Phe Ala Thr Lys Gly Asn Glu Asp Cys His Val Ile Leu Arg Gly Gly 225 230 235 240 Lys Ala Pro Asn Phe Asp Ala Pro Ser Val Ala Ala Val Cys Asp Gln 245 250 255 Leu Ala Asp Ala Gly Leu Ala Pro Val Leu Met Val Asp Cys Ser His 260 265 270 Gly Asn Ser Gln Lys Gln Tyr Lys Asn Gln Ile Ser Val Val Asn Asp 275 280 285 Val Ala Ser Gln Ile Ala Gly Gly Asp Ala Arg Ile Ile Gly Ile Met 290 295 300 Leu Glu Ser His Leu Asn Glu Gly Arg Gln Asp His Ser Pro Gly Cys 305 310 315 320 Ser Leu Asn Tyr Gly Gln Ser Ile Thr Asp Ala Cys Leu Gly Trp Glu 325 330 335 Asp Ser Val Ala Val Leu Glu Thr Leu Ala Ala Ala Val Lys Ala Arg 340 345 350 Arg Asp Lys His Ala Ala Ala Glu 355 <210> 3 <211> 1083 <212> DNA <213> Methylophilus methylotrophus <220> <221> CDS <222> (1)..(1080) <400> 3 atg tct gat tta tta aaa caa ttt aga gat aag att gac gcg att gat 48 Met Ser Asp Leu Leu Lys Gln Phe Arg Asp Lys Ile Asp Ala Ile Asp 1 5 10 15 gcg cag att cta gcg ctc gtc aat gag cgt gcc aag ctg gca cgt gaa 96 Ala Gln Ile Leu Ala Leu Val Asn Glu Arg Ala Lys Leu Ala Arg Glu 20 25 30 atc ggc cat tta aag gat gat ggt gtg att tac cgt cct gag cgt gaa 144 Ile Gly His Leu Lys Asp Asp Gly Val Ile Tyr Arg Pro Glu Arg Glu 35 40 45 gcg caa att atc cgt cgc ttg caa gca gaa aat gaa ggg ccg ctg tca 192 Ala Gln Ile Ile Arg Arg Leu Gln Ala Glu Asn Glu Gly Pro Leu Ser 50 55 60 ccg 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Ala Glu Asn Glu Gly Pro Leu Ser 50 55 60 Pro Glu Ala Val Ser His Ile Phe Arg Ala Val Met Ser Asn Cys Arg 65 70 75 80 Ala Leu Glu Lys Glu Leu Ala Ile Ala Phe Leu Gly Pro Leu Gly Thr 85 90 95 Tyr Ser Glu Glu Ala Ala Leu Lys Gln Phe Gly Glu Gly Arg Gln Ala 100 105 110 Val Val Cys Gly Ser Ile Asp Glu Val Phe Arg Thr Val Glu Ala Gly 115 120 125 Gln Ala Asp Tyr Gly Val Val Pro Val Glu Asn Ser Thr Glu Gly Ala 130 135 140 Val Gly Ile Thr Leu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Ala Leu Gln Val Val 145 150 155 160 Gly Glu Val Thr Leu Pro Val His His Cys Leu Leu Ser Ala Gln Gln 165 170 175 Asp Leu Gln Gln Ile Thr His Val Phe Ser His Ala Gln Ser Leu Ser 180 185 190 Gln Cys His Glu Trp Leu Asn Lys Val Leu Pro Ser Ala Gln Arg Glu 195 200 205 Ala Val Thr Ser Asn Ala Arg Ala Ala Gln Met Ile His Glu Leu Val 210 215 220 Ala Thr Gln Gly Thr Phe Ala Ala Ala Ile Ala Ser Lys Arg Ala Ala 225 230 235 240 Glu Leu Phe Asp Leu Asn Ile Leu Ala Glu Asn Ile Glu Asp Asp Pro 245 250 255 Lys Asn Thr Thr Arg Phe Leu Val Leu Gly Asn His Gly Val Ala Pro 260 265 270 Ser Gly Gln Asp Lys Thr Ser Leu Val Met Ser Ala His Asn Lys Pro 275 280 285 Gly Ala Val Leu Gln Leu Leu Glu Pro Leu Ser Arg His Gly Val Ser 290 295 300 Met Thr Lys Leu Glu Ser Arg Pro Ser Arg Gln Asn Leu Trp Asn Tyr 305 310 315 320 Val Phe Phe Val Asp Ile Glu Gly His Gln Gln Gln Pro Ser Val Gln 325 330 335 Ala Ala Leu Lys Glu Leu Ala Glu Arg Ala Thr Phe Leu Lys Val Leu 340 345 350 Gly Ser Tyr Pro Thr Ala Ile Ile 355 23

Claims (4)

  1. (C) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 또는
    (D) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열에서 하나 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 프레페네이트 데하이드라타제 활성 또는 코리스메이트 뮤타제 활성중 하나 이상을 갖는 단백질로 정의된 단백질.
  2. (C) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 또는
    (D) 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열에서 하나 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하고, 프레페네이트 데하이드라타제 또는 코리스메이트 뮤타제 활성중 하나 이상을 갖는 단백질로 정의된 단백질을 암호화하는 DNA.
  3. 제2항에 있어서,
    (C) 서열번호 3에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA; 또는
    (D) 서열번호 3에 제시된 뉴클레오타이드 서열 또는 상기 서열로부터 제조된 프로브와 엄격한 조건하에 하이브리드화할 수 있고, 프레페네이트 데하이드라타제 또는 코리스메이트 뮤타제 활성중 하나 이상을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA로 정의된 DNA.
  4. 제3항에 있어서, 엄격한 조건이 60℃, 및 1 ×SSC 및 0.1% SDS에 상응하는 염 농도에서 세척이 수행되는 조건인 DNA.
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