CN110268046B - 产生l-赖氨酸的棒杆菌属的微生物，以及使用其产生l-赖氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及产生L‑赖氨酸的微生物，以及使用其产生L‑赖氨酸的方法。
Description
技术领域
本公开涉及产生L-赖氨酸的棒杆菌属(genus Corynebacterium)的微生物，以及使用其产生L-赖氨酸的方法。
背景技术
L-赖氨酸被用于动物饲料以及用于人的药品和化妆品行业中，并且通常通过使用棒杆菌属的菌株或埃希氏菌属的菌株进行发酵来产生。为了产生L-赖氨酸，正在进行用于开发高效产生菌株和发酵工艺技术的各种研究。具体地，主要使用针对靶物质的特定路径的方法，如增加编码与L-赖氨酸生物合成相关的酶的基因的表达，或删除其生物合成不必要的基因(韩国专利号10-0838038)。
为了探索能够提高赖氨酸产量的有效特征，本发明人通过随机地导入棒杆菌属的微生物的内源基因已经发现了与高浓度赖氨酸产生相关的基因，并基于该发现，确认了当该基因在棒杆菌属的微生物中的表达增加时，可以提高L-赖氨酸的产量，从而完成本发明。
发明内容
[技术问题]
本公开的目的是提供产生L-赖氨酸的棒杆菌属的微生物，其包含具有相比于内源活性提高的活性的由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质。
本公开的另一个目的是提供使用该微生物产生L-赖氨酸的方法。
[技术方案]
为了实现上述目的，本公开的一个方面是一种产生L-赖氨酸的棒杆菌属的微生物，其包含具有相比于内源活性提高的活性的由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质。
在下文，将对本公开进行详细描述。同时，本文所公开的每个解释和示例性实施方式可应用于其他解释和示例性实施方式。也就是说，本文所公开的各种因素的所有组合都属于本公开的范围。此外，本公开的范围不应受到在下文提供的具体公开的限制。
在本公开中，术语“由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成(consisting of)的蛋白质”可与术语“HM1524蛋白质”互换使用。此外，它可以与术语“由HM1524基因编码的蛋白质”互换使用。另外，“基本上(essentially)由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质”或“由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成(composed of)的蛋白质”的表达可以互换使用。
此外，该蛋白质可包括与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、97％或99％的同源性的多肽。例如，显然，具有其中序列部分地被删除、修饰、取代或插入的氨基酸序列的蛋白质包含在本公开的范围内，只要它具有具有上述同源性的氨基酸序列并且显示出与由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质相应的效果。
此外，只要它具有与由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质的活性相应的活性，就不排除在SEQ ID NO：1的氨基酸序列的上游或下游添加无意义序列而发生的突变或其中自然发生的突变，或其中的沉默突变(silent mutation)，并且具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质也包括在本公开的范围内。
如在本公开中所使用的，术语“同源性(homology)”是指两个多核苷酸或多肽部分之间的同一性百分比，表示与给定氨基酸序列或核苷酸序列的一致程度，并且可以表示为百分比。在本说明书中，给定氨基酸序列或核苷酸序列的同源序列(具有与给定氨基酸序列或核苷酸序列相同或类似的活性)可以用“％同源性”表示。例如，可以使用用于计算诸如分数、同一性和相似性等参数的标准软件(具体地说，BLAST 2.0)来确认同源性，或者通过在定义的严格条件下通过southern杂交实验比较序列来确认同源性，并且定义的适当杂交条件在相关的技术范围内，并且可以通过本领域技术人员已知的方法来确定(例如，J.Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold SpringHarbor Laboratory press，Cold Spring Harbor，纽约，1989；F.M.Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.，纽约)。
尽管不限于此，但编码由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质的基因可以是包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列的多核苷酸，并且可以是与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少80％、90％、95％、97％或99％的同源性的多核苷酸。显然，由于密码子简并性，还可以包括可以被翻译成由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质或与其具有同源性的蛋白质的多核苷酸。或者，可从已知基因序列制备的探针可不受限制地包括例如任何序列，该任何序列在严格条件下与核苷酸序列的全部或部分互补的序列杂交以编码具有由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质活性的蛋白质的。术语“严格条件(stringent conditions)”是指允许多核苷酸间特异性杂交的条件。这些条件在文献(例如J.Sambrook等，下文)中具体描述。例如，严格的条件可包括以下条件：在此条件下，具有高同源性(80％以上、具体地90％以上、更具体地95％以上、非常具体地97％以上、特别具体地99％以上的同源性)的基因彼此杂交，而具有低于上述同源性的基因彼此不杂交；或者可以包括普通的Southern杂交洗涤条件，即，在对应于60℃、1×SSC和0.1％SDS；具体地60℃、0.1×SSC和0.1％SDS；更具体地68℃、0.1×SSC和0.1％SDS的盐浓度和温度下洗涤一次，具体地洗涤两次或三次。
尽管根据杂交的严格程度，核苷酸之间可能存在错配，但杂交需要两个核酸含有互补序列。术语“互补的(complementary)”用于描述可彼此杂交的核苷酸之间的关系。例如，关于DNA，腺苷与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本公开不仅可以包括实质上与其相似的核酸序列，还可以包括与整个序列互补的分离的核酸片段。
具体地，在上述条件下，可以使用包括Tm值为55℃的杂交步骤的杂交条件来检测具有同源性的多核苷酸。此外，Tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以根据其目的由本领域技术人员适当控制。
杂交多核苷酸的适当严格程度取决于多核苷酸的长度和互补程度，这些变量在本领域中是公知的。
杂交中使用的探针可以是与核苷酸序列互补的序列的一部分。这种探针可以通过使用基于已知序列制备的寡核苷酸作为引物和含有该核苷酸序列的基因片段作为模板的PCR来制备。所述基因片段例如可以是至少约50个核苷酸、60个核苷酸、70个核苷酸、80个核苷酸、90个核苷酸或至少100个核苷酸。此外，本领域技术人员可以按需要根据诸如探针的长度等因素调整温度和洗涤溶液的盐浓度。
如在本公开中所使用的，术语“内源活性”是指在微生物的性质由于自然或人工因素通过遗传修饰而改变的情况下，在其转化之前微生物的亲本菌株本来具有的蛋白质的特定活性。
如在本公开中所使用的，术语“相比于内源活性提高的活性”是指与其内源活性或其在修饰前的活性相比，微生物蛋白质活性的增强。活性的提高可包括导入外来HM1524和HM1524活性的内源性增强。
具体地，本公开中的活性的提高可以通过以下方法来执行：
1)增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数的方法，
2)修饰表达调控序列，使得多核苷酸的表达增加的方法，
3)修饰染色体上的多核苷酸序列，使得增强蛋白质的活性的方法，
4)导入修饰的多核苷酸的方法，其中外源多核苷酸的密码子或显示蛋白质活性的上述多核苷酸已被优化，或
5)通过组合上述方法等进行修饰以实现增强的方法；然而，活性的提高不限于此。
上述方法1)中多核苷酸拷贝数的增加可以通过与载体的可操作连接来实现，或可以通过插入宿主细胞中的染色体来实现，但不特别限于此。具体地，可以通过将编码本公开的蛋白质的多核苷酸与载体(其可与宿主细胞无关地复制和发挥作用)可操作地连接，并且将其导入宿主细胞来实现。或者，可以通过将多核苷酸可操作地连接到载体(其可以将多核苷酸插入宿主细胞中的染色体中)上，并将其导入宿主细胞中而增加宿主细胞中染色体中多核苷酸的拷贝数的方法来进行。
此外，在上述方法2)中，修饰表达调控序列，使得多核苷酸的表达增加，可以为了进一步增强表达调控序列的活性，通过核酸序列的删除、插入、或非保守或保守取代、或通过它们的组合在序列中诱导修饰来进行，或者通过用具有更强活性的核酸序列替代来进行，但不特别限于此。表达调控序列可以包括启动子、操纵基因、编码核糖体结合位点的序列、调节转录和翻译终止的序列等，但并不特别限于此。
强异源启动子可以代替原始启动子与多核苷酸的表达单元的上游区域连接；强启动子的实例是CJ7启动子(韩国专利号0620092和国际公开号WO2006/065095)、lysCP1启动子(国际公开号WO2009/096689)、EF-Tu启动子、groEL启动子、aceA或aceB启动子等，但强启动子不限于此。进一步，在上述方法3)中，染色体上的多核苷酸序列的修饰可以通过核酸序列的删除、插入、或非保守或保守取代、或通过它们的组合而诱导对表达调控序列的修饰，从而进一步增强多核苷酸序列的活性来进行，或者可以通过用修饰的多核苷酸序列来替代多核苷酸序列以具有更强活性来进行；然而，该修饰并不特别限于此。
另外，在上述方法4)中，外源多核苷酸序列的导入可以通过将编码显示与上述蛋白质相同或类似活性的蛋白质的外源多核苷酸、或其中外源多核苷酸的密码子已被优化的修饰的多核苷酸导入宿主细胞来进行。只要外源多核苷酸表现出与蛋白质相同或类似活性，就可以不受其来源或序列限制地使用。此外，为了外源多核苷酸在宿主细胞中优化的转录和翻译，可以在优化其密码子之后将其导入宿主细胞中。导入可以通过本领域技术人员选择本领域已知的合适的转化方法来进行，并且可通过在宿主细胞中表达导入的多核苷酸来产生蛋白质，从而提高其活性。
最后，方法5)(其涉及通过方法1)至4)的组合进行的效果增强的修饰)可以通过联合应用以下中的至少一种来进行：增加编码蛋白质的多核苷酸的拷贝数、修饰表达调控序列使得多核苷酸的表达增加、修饰染色体上的多核苷酸序列、以及修饰显示蛋白质活性的外源多核苷酸或其密码子优化的修饰的多核苷酸。
如本文中所用的，术语“载体(vector)”是指包括编码靶蛋白的多核苷酸序列的DNA构建体，所述编码靶蛋白的多核苷酸序列可操作地连接到合适的调控序列，使得靶蛋白可以在合适的宿主中表达。该调控序列包括能够启动转录的启动子、用于控制转录的任何操纵基因、编码适当mRNA核糖体结合域的序列以及控制转录和翻译终止的序列。在转化到合适的宿主细胞中之后，载体可以与宿主基因组无关地复制或发挥作用，并且所述载体可以整合到宿主基因组本身中。在一个实施方式中，染色体中编码靶蛋白的多核苷酸可以被通过用于染色体插入的载体修饰的多核苷酸代替。将多核苷酸插入染色体中可以通过本领域已知的任何方法(例如，同源重组)进行，但不限于此。
本公开中使用的载体没有特别限制，并且可以使用本领域已知的任何载体。常规使用的载体的实例可包括天然或重组质粒、黏粒、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体(phage vector)或黏粒载体，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21A等，作为质粒载体，可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL、pET等的那些。具体地，可以使用载体pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BAC等。
如在本文所用的，术语“转化(transformation)”是指将包括编码靶蛋白的多核苷酸的载体导入宿主细胞中，从而使得由多核苷酸编码的蛋白质能够在宿主细胞中表达的过程。只要转化的多核苷酸能够在宿主细胞中表达，其是否插入宿主细胞的染色体中并位于其中或位于染色体外并不重要，并且这两种情况都可以包括在内。此外，多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。多核苷酸可以以任何形式导入，只要其可导入到宿主细胞中并在其中表达。例如，所述多核苷酸可以表达盒的形式导入宿主细胞中，所述表达盒是包括自我表达(self-expression)所需的所有元件的基因构建体(gene construction)。表达盒通常可包括可操作地连接到多核苷酸的启动子、终止子、核糖体结合位点和终止密码子。所述表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。此外，多核苷酸可按原样被导入宿主细胞并可操作地连接到对其在宿主细胞中表达所必要的序列，但不限于此。
另外，如上所述，术语“可操作地连接”是指上述基因序列和启动子序列之间的功能连接，该启动子序列启动并介导编码本公开的靶蛋白的多核苷酸的转录。
用于转化本公开的载体的方法包括任何将核酸导入细胞中的方法，并且可以通过根据宿主细胞选择本领域已知的合适的标准技术来进行。该方法的实例包括电穿孔、磷酸钙(CaHPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、微注射、聚乙二醇(PEG)技术、DEAE-葡聚糖技术、阳离子脂质体技术、乙酸锂-DMSO技术等，但是，该方法不限于此。
作为宿主细胞，优选使用具有高DNA导入效率和导入的DNA的高表达效率的宿主；例如，宿主细胞可以是棒杆菌属的微生物。
如本文所使用的，术语“L-赖氨酸”是指作为必需氨基酸在体内不能合成的碱性α-氨基酸，并且是具有化学式NH2(CH2)4CH(NH2)COOH的L-氨基酸。另外，即使在盐形式的情况下，L-赖氨酸也可以包括在本公开的范围内。
如本文所用的，术语“产生L-赖氨酸的微生物”是指考虑到本公开的目的，可以产生L-赖氨酸的微生物菌株，具体指通过经由根据本公开的操作可以以高浓度产生L-赖氨酸的菌株。因此，只要微生物能够产生L-赖氨酸，其亲本菌株的类型就没有特别限制。也就是说，在本公开中，亲本菌株可以包括具有L-赖氨酸生产能力(productivity)的菌株和那些不具有L-赖氨酸生产能力的菌株。L-赖氨酸的生产能力可以包括自然发生的或人工改造的(artificially engineered)。具有人工改造的L-赖氨酸生产能力的微生物可以通过突变诱导物质(如亚硝基胍(NTG)等)被修饰以具有L-赖氨酸生产能力，或者可以控制特定目的蛋白质的表达水平或活性以获得L-赖氨酸生产能力，但是微生物不限于此。具体地，所述特定目的蛋白质可包括沿着L-赖氨酸生物合成途径直接/间接起作用的所有蛋白质，并且通过增加或降低其表达水平或活性，微生物可被修饰以具有L-赖氨酸的生产能力；此外，还可以在这种蛋白质的氨基酸序列或核苷酸序列中诱导修饰以获得L-赖氨酸生产能力。包括控制特定目的蛋白质的表达和使用上述NTG等诱导随机突变的微生物的人工改造(artificial engineering)可以由本领域技术人员经由已知技术适当地进行。
该微生物可以具体地是棒杆菌属的微生物。例如，可以使用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)、嗜热产氨棒杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)、黄短杆菌(Brevibacterium flavum)或发酵短杆菌(Brevibacterium fermentum)等，但微生物不限于此。例如，谷氨酸棒杆菌可用作棒杆菌属的微生物。然而，微生物不限于这些实例，可以使用其他已知的具有L-赖氨酸生产能力的棒杆菌属微生物。
已知的具有L-赖氨酸生产能力的棒杆菌属的微生物的实例是在韩国专利号10-0397322(或美国专利公开号2003-0124688)、韩国专利号10-0924065(或美国专利公开号2010-0143984)、韩国专利号10-0073610、和/或Binder等，Genome Biology 2012，13∶R40中描述的微生物，并且这些的内容通过引用整体并入本文。
作为另一个方面，本公开提供一种产生L-赖氨酸的方法，包括：在培养基中培养产生L-赖氨酸的棒杆菌属的微生物，其包含具有相比于内源活性提高的活性的由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质；以及从培养的微生物或其培养基中回收L-赖氨酸。
产生L-赖氨酸的棒杆菌属的微生物如上所述。
如本文所用的，术语“培养”意指使微生物在适当控制的环境条件下生长。本公开的培养方法可以根据本领域已知的合适的培养基(culture media)和培养条件进行。这种培养方法可根据待选择的菌株由本领域技术人员容易地调节以使用。在上述方法中，微生物的培养可以通过已知的分批培养法、连续培养法、补料分批培养法等进行，但不限于此。特别地，关于培养条件，可以使用碱性化合物(例如氢氧化钠、氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如磷酸或硫酸)将培养物的pH调节到合适的pH(例如pH5至pH9，具体地pH6至pH8，最具体地pH6.8)。另外，在培养期间，可以添加消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯，以防止泡沫产生；进一步，为了维持其好氧状态，可以将氧或含氧气体注入培养物中，或者为了维持培养物的厌氧或微好氧状态，可以注入氮气、氢气或二氧化碳气体，或者可以在不注入气体的情况下进行培养。可以将培养温度维持在20℃至45℃，具体地在25℃至40℃，并且可以继续培养直到获得所期望的生成有用物质的量，具体是大约10至160小时。然而，培养物不限于上述。通过培养产生的L-赖氨酸可以分泌到培养基中或可以保留在细胞中。
此外，作为待使用的培养基的碳源、糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油和脂肪(例如，大豆油、葵花油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如甘油和乙醇)、有机酸(例如乙酸)等可以单独或组合使用，但碳源不限于此。作为氮源，含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉汁(meat gravy)、麦芽汁、玉米浆、大豆粉和尿素)或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)等可以单独或组合使用，但氮源不限于此。作为磷源，磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、相应的含钠盐等可以单独或组合使用，但磷源不限于此。此外，在培养基中可包含必需的促生长物质如其它金属盐(例如硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸、维生素等。
在本公开用于回收在培养中产生的L-赖氨酸的方法中，可以根据培养方法使用本领域已知的适当方法从培养液(culture broth)中收集目标氨基酸。例如，可以使用离心、过滤、阴离子交换色谱、结晶、HPLC等，并且可以使用本领域已知的适当方法从培养基或微生物中回收目标L-赖氨酸。此外，回收步骤可以包括纯化工艺。
[本发明的有利效果]
使用本公开的具有L-赖氨酸生产能力的微生物，可以高效地产生L-赖氨酸。
具体实施方式
在下文中，将通过示例性实施方式详细描述本公开。然而，这些示例性实施方式仅为了说明的目的而提供，并且本公开的范围不限于这些示例性实施方式。
实施例1：棒杆菌属微生物的野生型文库的制备
在从谷氨酸棒杆菌ATCC13032中提取基因组DNA后，用Sau3AI限制酶处理基因组DNA，通过在琼脂糖凝胶上进行电泳按大小分离DNA片段，从而选择性地获得3kb至4kb的DNA片段。将具有BamHI限制位点的pECCG117载体(韩国专利号10-0057684)与片段连接，并导入到大肠杆菌DH5α中后，然后将所得产物涂布(plated)在含有卡那霉素(25mg/L)的固体LB培养基上，因而得到转化菌落。使用SEQ ID NO：3和4的引物对100个随机菌落进行PCR，从而发现含有插入约3kb至4kb的靶DNA片段的载体的菌落比率为90％以上。所有获得的菌落在含卡那霉素(25mg/L)的液体LB培养基中接种后共培养；然后使用公知的质粒提取方法提取质粒，从而完成谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA文库。
SEQ ID NO：3：5′-ACGACGGGATCAGTACCGA-3′
SEQ ID NO：4：5′-AGCTATCTGTCGCAGCGCC-3′
实施例2：导入野生型文库的产生赖氨酸的微生物的制备和评价
使用电脉冲法(electric pulse method)，将实施例1中制备的基因组DNA文库导入产生赖氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌KCCM11016P中(最初被指定为KFCC10881，根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)将微生物重新保藏在国际保藏机构中，并指定保藏号为KCCM11016P；韩国专利号10-0159812)，并涂布在含有卡那霉素(25mg/L)的复合平板培养基上，在30℃下培养24小时后，获得大约2000个菌落。
<复合平板培养基>
20g葡萄糖、50g(NH4)2SO4、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、5g KH2PO4、10gK2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、100μg生物素、1000μg硫胺素HCl、2000μg泛酸钙、2000μg烟酰胺、20g琼脂、25mg卡那霉素(每1L蒸馏水)
将200μL复合液体培养基分配到96孔细胞培养板的每个孔中，在将获得的每个菌落接种后，在30℃和1200rpm的条件下进行振荡培养(shake-culturing)24小时。通过离心培养液分离细胞体和上清液，将50μL上清液与含有赖氨酸氧化酶的反应溶液混合。
<复合液体培养基>
20g葡萄糖、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH2PO4、8g K2HPO4、0.5gMgSO4·7H2O、100μg生物素、1000μg硫胺素HCl、2000μg泛酸钙、2000μg烟酰胺、25mg卡那霉素(每1L蒸馏水)
<反应溶液>
0.02单位赖氨酸氧化酶(Sigma-Aldrich)、0.2单位过氧化物酶(Sigma-Aldrich)、2mg ABTS(每1mL磷酸钾缓冲液)
此后，分析OD405处的吸光度30分钟，并且选择比对照组(KCCM11016P/pECCG117)显示更高吸光度的15种实验组。为了确认每种转化体的赖氨酸生产能力，将每种菌株接种在包含25mL含有卡那霉素(25mg/L)的种子培养基(seed medium)的250mL角挡板烧瓶(corner-baffle flask)中，并在30℃和200rpm的条件下振荡培养20小时。在包含24mL含有卡那霉素(25mg/L)的生产培养基(production medium)的250mL角挡板烧瓶中接种1mL种子培养液，并在37℃和200rpm下振荡培养96小时。培养结束后，使用HPLC分析L-赖氨酸浓度(表1)。
<种子培养基>
20g葡萄糖、5g(NH4)2SO4、10g蛋白胨、5g酵母提取物、1.5g尿素、4g KH2PO4、8gK2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、100μg生物素、1000μg硫胺素HCl、2000μg泛酸钙、2000μg烟酰胺(每1L蒸馏水)
<生产培养基(pH 7.0)>
100g葡萄糖、40g(NH4)2SO4、2.5g大豆蛋白、5g固体玉米浆(corn steep solids)、3g尿素、1g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、100μg生物素、1000μg硫胺素HCl、2000μg泛酸钙、3000μg烟酰胺、30g CaCO3(每1L蒸馏水)
[表1]
从上述结果，选择了显示出与对照组相比赖氨酸生产能力提高的效果的KCCM11016P/H15和KCCM11016P/M24，并且使用通常已知的质粒提取方法提取了质粒。源自KCCM11016P/H15的质粒命名为pEC-H15，源自KCCM11016P/M24的质粒命名为pEC-M24。此后，使用SEQ ID NO：3和4的引物进行核苷酸序列分析。结果，发现pEC-H15和pEC-M24质粒分别含有SEQ ID NO：15和16的核苷酸序列。因此，发现上述两种质粒都含有SEQ ID NO：2的核苷酸序列，其编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列。因此，编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列的基因被命名为HM1524，在下文中称为HM1524。
实施例3：HM1524基因过表达载体的制备
为了确认在实施例2中发现的HM1524的效果，制备了用于过表达相应基因的载体。
基于所报告的核苷酸序列，为了获得包含从HM1524起始密码子上游约200bp到其终止密码子下游约50bp的区域的DNA片段，合成了设计成允许在5'和3'端插入XhoI限制位点的引物(分别为SEQ ID NO：5和6)，并且使用谷氨酸棒杆菌的基因组DNA作为模板进行PCR。PCR通过在94℃下初始变性5分钟；由在94℃下变性30秒、在56℃下退火30秒、和在72℃下聚合90秒组成的30个循环；和在72℃下最后聚合7分钟进行。
SEQ ID NO：5：5′-TCACTCGAGTGATGGCCAGGTTGTTGTC-3′
SEQ ID NO：6：5′-TCACTCGAGTTAGTCATAGGTACTAGTTT-3′
用XhoI限制酶处理上述PCR扩增产物后，用XhoI处理pECCG117载体，与所得DNA片段连接，以及转化到大肠杆菌DH5α中，并将所得产物涂布在含有卡那霉素(25mg/L)的固体LB培养基上。在PCR筛选用其中插入靶基因的载体转化的菌落(使用SEQ ID NO：3和4)后，使用通常已知的质粒提取方法获得质粒，并将该质粒命名为pECCG-HM1524。
实施例4：导入有HM1524基因过表达载体的菌株的赖氨酸生产能力分析
在使用电脉冲法将在实施例3中制备的pECCG-HM1524载体导入谷氨酸棒杆菌KCCM11016P(即产生赖氨酸的菌株)中后，将所得产物涂布在含卡那霉素(25mg/L)的复合平板培养基上，并在30℃下培养24小时后获得菌落。将获得的菌株命名为KCCM11016P/pECCG-HM1524，并且根据实施例2的烧瓶培养方法在培养三批次后分析培养液的L-赖氨酸浓度。
[表2]
结果，发现HM1524基因过表达的菌株KCCM11016P/pECCG-HM1524的赖氨酸生产能力相比于亲本菌株KCCM11016P提高了6％。
实施例5：用于HM1524基因的进一步染色体插入的载体的制备
为了确认在实施例4中发现的HM1524基因的效果，制备了用于进一步将该基因插入到棒杆菌(Corynebacterium)的染色体上的载体。为了扩增源自产氨棒杆菌的Pcj7启动子(韩国专利号10-0620092)，合成了引物，其设计成允许在Pcj7启动子的5'端插入EcoRI限制位点和3'端插入NdeI限制位点(分别为SEQ ID NO：7和8)，以及允许在Pcj7启动子的5'端插入SpeI限制位点和3'端插入SalI限制位点(分别为SEQ ID NO：9和10)。作为以产氨棒杆菌的基因组DNA为模板使用合成的引物(SEQ ID NO：7和8，以及SEQ ID NO：9和10)进行PCR的结果，获得了分别在5'和3'端含有EcoRI和NdeI限制位点的Pcj7启动子DNA片段，以及获得了分别在5'和3'端含有SpeI和SalI限制位点的Pcj7启动子DNA片段。PCR通过在94℃下初始变性5分钟；由在94℃下变性30秒、在56℃下退火30秒、和在72℃下聚合30秒组成的30个循环；和在72℃下最后聚合7分钟进行。
基于所报告的核苷酸序列，为了扩增HM1524基因的ORF，合成了设计成允许在起始密码子位置插入NdeI限制位点和终止密码子下游插入SpeI限制位点(分别为SEQ ID NO：11和12)的引物。作为以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组DNA为模板使用SEQ ID NO：11和12的引物进行PCR的结果，获得了分别在起始密码子位置和在终止密码子下游含有NdeI和SpeI限制位点的HM1524基因DNA片段。PCR通过在94℃下初始变性5分钟；由在94℃下变性30秒、在56℃下退火30秒、和在72℃下聚合90秒组成的30个循环；和在72℃下最后聚合7分钟进行。
SEQ ID NO：7：5′-TCAGAATTCTTCCTTCAGGCTAATCTTTT-3′
SEQ ID NO：8：5′-TCACATATGTGTTTCCTTTCGTTGGGTAC-3′
SEQ ID NO：9：5′-TCAACTAGTCTTCCTTCAGGCTAATCTTT-3′
SEQ ID NO：10：5′-TCAGTCGACTGTTTCCTTTCGTTGGGTAC-3′
SEQ ID NO：11：5′-TCACATATGCGCGTAGCTATGATTTC-3′
SEQ ID NO：12：5′-TCAACTAGTTTAGCCGTGATGCGTTTCAC-3′
用对应于每端限制位点的限制酶处理上述三种PCR扩增产物中的每一种后，将pDZ载体(韩国专利号10-0924065)连接到用EcoR和SalI限制酶处理后获得的DNA片段上，从而制备pDZ-Pcj7-HM1524载体。
实施例6：HM1524基因的进一步染色体插入的菌株的赖氨酸生产能力分析
使用电脉冲法将在实施例5中制备的pDZ-Pcj7-HM1524载体导入到谷氨酸棒杆菌KCCM11016P中，在通过同源重组转化的菌落中，选择其中在染色体上的HM1524基因终止密码子的下游插入HM1524基因的菌落。为了通过PCR筛选菌落使用了SEQ ID NO：13和14的引物。选择的菌株命名为KCCM11016P::Pcj7-HM1524，并且根据实施例2的烧瓶培养方法培养后，分析了培养液的L-赖氨酸浓度(表3)。
SEQ ID NO：13：5′-GTCGAACACGCCAGAACATT-3′
SEQ ID NO：14：5′-TACTCTCACGATCTCACCCT-3′
[表3]
结果，发现进一步插入HM1524基因的KCCM11016P::Pcj7-HM1524菌株的赖氨酸生产能力比亲本菌株KCCM11016P提高约6％。KCCM11016P::Pcj7-HM1524菌株命名为CA01-2297，并于2016年8月2日在根据布达佩斯条约的国际保藏机构韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms)(KCCM)保藏，被指定保藏号为KCCM11876P。
实施例7：使用其中进一步插入HM1524基因的源自KCCM10770P的微生物的赖氨酸
的产生
将在实施例5中制备的pDZ-Pcj7-HM1524载体转化到谷氨酸棒杆菌KCCM10770P(产生赖氨酸的菌株)中(韩国专利号10-0924065)。上述谷氨酸棒杆菌KCCM10770P的特征在于在其染色体上插入7种与L-赖氨酸生物合成途径相关的基因。通过PCR选择性地分离菌落，导入有HM1524基因的菌株命名为谷氨酸棒杆菌KCCM10770P::Pcj7-HM1524。此后，根据实施例2的烧瓶培养方法培养后，分析了培养液的L-赖氨酸浓度(表4)。
[表4]
结果，发现谷氨酸棒杆菌KCCM10770P::Pcj7-HM1524菌株的赖氨酸生产能力相比于亲本菌株提高了约5％。
实施例8：使用其中进一步插入HM1524基因的源自CJ3P的微生物的赖氨酸的产生
将在实施例5中制备的pDZ-Pcj7-HM1524载体转化到谷氨酸棒杆菌CJ3P(产生赖氨酸的菌株)中(Binder等，Genome Biology 2012，13:R40)。谷氨酸棒杆菌CJ3P的特征在于在其染色体上插入3种与增强L-赖氨酸生产能力相关的基因。通过PCR选择性地分离菌落，并且导入有HM1524基因的菌株命名为谷氨酸棒杆菌CJ3P::Pcj7-HM1524。根据实施例2的烧瓶培养方法培养后，分析了培养液的L-赖氨酸浓度(表5)。
[表5]
结果，发现谷氨酸棒杆菌CJ3P::Pcj7-HM1524菌株的赖氨酸生产能力相比于亲本菌株提高了约38％。
实施例9：使用其中进一步插入HM1524基因的源自KCCM11347P的微生物的赖氨酸
的产生
将在实施例5中制备的pDZ-Pcj7-HM1524载体转化到谷氨酸棒杆菌KCCM11347P(产生赖氨酸的菌株)中(最初指定为KFCC10750，根据布达佩斯条约将微生物重新保藏在国际保藏机构中，并指定保藏号为KCCM11347P；韩国专利号10-0073610)。谷氨酸棒杆菌KCCM11347P的特征在于，在其染色体上插入3种与增强L-赖氨酸生产能力相关的基因。通过PCR选择性地分离菌落，并且导入有HM1524基因的菌株命名为谷氨酸棒杆菌KCCM11347P::Pcj7-HM1524。根据实施例2的烧瓶培养方法培养后，分析了培养液的L-赖氨酸浓度(表6)。
[表6]
结果，发现谷氨酸棒杆菌KCCM11347::Pcj7-HM1524菌株的赖氨酸生产能力相比于亲本菌株提高了约10％。
综上所述，上述结果表明，对于HM1524基因的活性相比于其内源活性提高的菌株，赖氨酸生产能力提高了，并且进一步暗示通过提高微生物中由上述基因编码的蛋白质的活性可以大量产生赖氨酸。
根据前述内容，本公开所属领域的技术人员将能够理解，本公开可以在不改变本公开的技术概念或必要特征的情况下以其它具体形式呈现。在这方面，本文所公开的示例性实施方式仅用于说明性目的，不应被解释为限制本公开的范围。相反，本公开意在不仅含盖示例性实施方式，而且含盖可包括在由所附权利要求所限定的本公开的精神和范围内的各种替代、修饰、等同物和其他实施方式。
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 产生L-赖氨酸的棒杆菌属的微生物，以及使用其产生L-赖氨酸的方法
<130> OPA17196
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<151> 2016-11-15
<160> 16
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 418
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HM1524氨基酸
<400> 1
Met Arg Val Ala Met Ile Ser Met His Thr Ser Pro Leu Gln Gln Pro
1 5 10 15
Gly Thr Gly Asp Ser Gly Gly Met Asn Val Tyr Ile Leu Ser Thr Ala
20 25 30
Thr Glu Leu Ala Lys Gln Gly Ile Glu Val Asp Ile Tyr Thr Arg Ala
35 40 45
Thr Arg Pro Ser Gln Gly Glu Ile Val Arg Val Ala Glu Asn Leu Arg
50 55 60
Val Ile Asn Ile Ala Ala Gly Pro Tyr Glu Gly Leu Ser Lys Glu Glu
65 70 75 80
Leu Pro Thr Gln Leu Ala Ala Phe Thr Gly Gly Met Leu Ser Phe Thr
85 90 95
Arg Arg Glu Lys Val Thr Tyr Asp Leu Ile His Ser His Tyr Trp Leu
100 105 110
Ser Gly Gln Val Gly Trp Leu Leu Arg Asp Leu Trp Arg Ile Pro Leu
115 120 125
Ile His Thr Ala His Thr Leu Ala Ala Val Lys Asn Ser Tyr Arg Asp
130 135 140
Asp Ser Asp Thr Pro Glu Ser Glu Ala Arg Arg Ile Cys Glu Gln Gln
145 150 155 160
Leu Val Asp Asn Ala Asp Val Leu Ala Val Asn Thr Gln Glu Glu Met
165 170 175
Gln Asp Leu Met His His Tyr Asp Ala Asp Pro Asp Arg Ile Ser Val
180 185 190
Val Ser Pro Gly Ala Asp Val Glu Leu Tyr Ser Pro Gly Asn Asp Arg
195 200 205
Ala Thr Glu Arg Ser Arg Arg Glu Leu Gly Ile Pro Leu His Thr Lys
210 215 220
Val Val Ala Phe Val Gly Arg Leu Gln Pro Phe Lys Gly Pro Gln Val
225 230 235 240
Leu Ile Lys Ala Val Ala Ala Leu Phe Asp Arg Asp Pro Asp Arg Asn
245 250 255
Leu Arg Val Ile Ile Cys Gly Gly Pro Ser Gly Pro Asn Ala Thr Pro
260 265 270
Asp Thr Tyr Arg His Met Ala Glu Glu Leu Gly Val Glu Lys Arg Ile
275 280 285
Arg Phe Leu Asp Pro Arg Pro Pro Ser Glu Leu Val Ala Val Tyr Arg
290 295 300
Ala Ala Asp Ile Val Ala Val Pro Ser Phe Asn Glu Ser Phe Gly Leu
305 310 315 320
Val Ala Met Glu Ala Gln Ala Ser Gly Thr Pro Val Ile Ala Ala Arg
325 330 335
Val Gly Gly Leu Pro Ile Ala Val Ala Glu Gly Glu Thr Gly Leu Leu
340 345 350
Val Asp Gly His Ser Pro His Ala Trp Ala Asp Ala Leu Ala Thr Leu
355 360 365
Leu Asp Asp Asp Glu Thr Arg Ile Arg Met Gly Glu Asp Ala Val Glu
370 375 380
His Ala Arg Thr Phe Ser Trp Ala Ala Thr Ala Ala Gln Leu Ser Ser
385 390 395 400
Leu Tyr Asn Asp Ala Ile Ala Asn Glu Asn Val Asp Gly Glu Thr His
405 410 415
His Gly
<210> 2
<211> 1257
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HM1524核苷酸
<400> 2
atgcgcgtag ctatgatttc catgcacacc tctccattgc agcagcccgg aactggtgat 60
tcaggcggca tgaacgtcta cattctttcg accgcgactg agctagcgaa acagggtatc 120
gaggtcgata tttacactcg tgccacgagg ccttctcagg gtgagatcgt gagagtagct 180
gagaatttgc gggtcattaa tatcgctgcg gggccgtatg aggggctttc caaagaggag 240
cttcctactc agttggcggc gtttaccggc ggaatgttgt cgtttacgcg ccgggagaag 300
gttacttatg atctgatcca ttctcactat tggctgtctg gtcaggtggg gtggttgctg 360
cgcgatttgt ggcggattcc ccttattcat acggcacaca ctttggcggc ggtgaagaat 420
tcttatcggg atgattcgga cactccggag tcggaggcgc gtcgcatttg tgagcagcag 480
ctggtggata acgctgacgt gttggcggtg aacactcagg aggagatgca ggatttgatg 540
catcactacg atgcggatcc ggatcggatt tctgtggtgt caccgggtgc ggacgtggaa 600
ctttatagcc ctggaaatga tcgcgcgacg gaacgttccc gtcgtgagct gggcattccg 660
ctgcacacaa aggtagtggc ttttgtgggt cggttgcagc cgtttaaggg cccgcaggtg 720
ctgatcaagg cggttgcggc gttgtttgat cgcgatccgg accgaaatct gcgcgtcatt 780
atttgtggcg gcccttctgg tccgaatgcg acaccggata cctataggca tatggcagag 840
gaactgggcg tcgaaaagcg aattcgcttt ttggacccgc gcccgccgag cgagctagtg 900
gccgtgtatc gggcggcgga catcgtggcc gtgccaagtt ttaatgagtc cttcggactc 960
gtcgccatgg aggcgcaagc cagcggcaca ccggtcattg cggcccgggt tggcggcctg 1020
cccatcgcag tcgcggaagg ggagacggga ttgcttgtcg acggccactc cccgcatgcc 1080
tgggccgacg ccttagccac actcttggac gatgacgaaa cgcgcatcag aatgggtgaa 1140
gacgccgtcg aacacgccag aacattctcc tgggcggcca ccgccgcaca gctatcgtcg 1200
ctgtacaacg acgctattgc caacgaaaat gtcgacggtg aaacgcatca cggctaa 1257
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WT基因组DNA文库引物-1
<400> 3
acgacgggat cagtaccga 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> WT基因组DNA文库引物-2
<400> 4
agctatctgt cgcagcgcc 19
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5' XhoI引物
<400> 5
tcactcgagt gatggccagg ttgttgtc 28
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' XhoI引物
<400> 6
tcactcgagt tagtcatagg tactagttt 29
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5' EcoRI引物
<400> 7
tcagaattct tccttcaggc taatctttt 29
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' NdeI引物
<400> 8
tcacatatgt gtttcctttc gttgggtac 29
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5' SpeI引物
<400> 9
tcaactagtc ttccttcagg ctaatcttt 29
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' SalI引物
<400> 10
tcagtcgact gtttcctttc gttgggtac 29
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> s-NdeI引物
<400> 11
tcacatatgc gcgtagctat gatttc 26
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> t-SpeI引物
<400> 12
tcaactagtt tagccgtgat gcgtttcac 29
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HM1524选择引物-1
<400> 13
gtcgaacacg ccagaacatt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HM1524选择引物-2
<400> 14
tactctcacg atctcaccct 20
<210> 15
<211> 4102
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pEC-H15
<400> 15
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ctccttgctg cgtcgcgcga tc 4102
<210> 16
<211> 3181
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pEC-M24
<400> 16
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acgccaacat cgaaatcatt cgcggcgacc gcaccggcgt ttgggtagaa gccgatcgat 3180
c 3181
Claims (4)
1.棒杆菌属的微生物用于产生L-赖氨酸的用途，所述微生物包含具有相比于内源活性提高的活性的由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌。
3.产生L-赖氨酸的方法，其包括：在培养基中培养产生L-赖氨酸的棒杆菌属的微生物，其包含具有相比于内源活性提高的活性的由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的蛋白质；以及从所述培养的微生物或其培养基中回收L-赖氨酸。
4.根据权利要求3所述的产生L-赖氨酸的方法，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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