CN108034760A - 桑花叶型萎缩病相关病毒检测引物和质粒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桑花叶型萎缩病相关病毒检测引物和质粒及检测方法。所述引物包括上游引物MCP746f和下游引物MCP1148r，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，同时构建了用于检测的阳性质粒，以上游引物13MCP156f和下游引物13MCP1464r扩增获得1309bp大小的片段构建质粒13MCP‑pEASY‑Bblunt，质粒及引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。基于本发明检测引物可特异地检测桑花叶型萎缩病相关病毒，检测结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高。尤其是对于处于侵染早期（潜育期）的病叶的检测，具有重要的实际应用意义，同时其可对病株的叶、叶柄、芽、枝上存在的病原菌进行检测，对桑花叶型萎缩病相关病毒的防控有切实的指导意义。

Description

桑花叶型萎缩病相关病毒检测引物和质粒及检测方法

技术领域

本发明涉及病原分子检测技术领域。更具体地，涉及一种在桑花叶型萎缩病相关病毒分子检测中的应用。

背景技术

桑树作为我国重要经济作物，随着桑树资源的综合利用，桑树除作为蚕主要的食物外，其食药用价值、生态修复功能更多的被需求。随着桑产业的壮大，桑树病害将逐渐成为我们关注的焦点。

桑花叶型萎缩病作为最重要的桑树病毒病之一，在我国各蚕区发生较普遍且危害严重。该病对桑叶的产量影响非常大，杂交桑品种的推广导致抗病品种种植面积减少，最终导致该病的发生面积大大增加(邱长玉等,2011)。

桑花叶型萎缩病的症状主要是叶片边缘稍向叶面卷起，成皱缩状，叶片缺刻加深，叶背脉有时会呈现棘状突起，侧脉间叶肉褪色，呈现斑驳或花叶症状(张月季,1983)。发病初期，叶片侧脉间因褪绿出现黄绿色或淡绿色斑块。随着病情发展，叶缘稍向叶面卷起，叶背脉有瘤状突起。后期，病叶卷缩成空心，叶脉部满瘤状突起且明显变褐，病株逐渐衰亡。由于气温的变化，在同一枝条上的叶片有间歇出现病症的现象，当气温高达30℃时，病症隐蔽。花叶症状在气温较低时出现，簇生症状在气温较高时出现(王太兴,2009；张月季和林玉松,1964)。

2010年白锡川(白锡川等,2010)推断桑花叶型萎缩病通过花粉、果实传染，还可通过土壤传染。但笔者认为上述途径传播的可能性不大，病毒只有在接触寄主并且有很好的感染部位时，感染才能进行。首先花粉、果实、土壤这些传染范围小，其次病毒很难打破桑树的表皮防御。夏志松等(夏志松和卢全有,2004)研究发现，对于外观健康的枝条，在高温隐症状态下具有很强的传染性，越冬枝条在春季嫁接时传染率更高。

在桑病毒病病原的鉴定上，由于病毒小、难分离、不可培养等特点，使它在柯赫式法则验证上存在困难，以至于阻碍了桑病毒病的发展。桑病毒病的防控主要靠隔离病原，由于桑病毒病存在潜隐现象，在不适宜的条件不会产生病症，以至于难以辨别没有症状的桑叶是否携带病原，以至于很难隔离防控。

近年来，国内关于桑花叶型萎缩病的研究报道较多，且聚焦于该病病原的鉴定。其病原至今未完全确定，从将其病原鉴定为类病毒(卢全有和夏志松,2006；夏志松,2008)，到线型传多面体病毒(Lu,Wu,Xia,Xie,2015)，再到双生病毒(马宇欣，2015)。但这些只能说明这些病原与该病具有相关性，未能明确之间关系。但双生病毒与该病具有92.4％的相关性，只要存在这种病原基本上可以判定会发生着种病，将该病原作为检测对象具有很好的代表性。

至今桑病毒病都是通过发病后病症来判断，还没有一种分子检测的方法。随着分子生物学技术的发展，分子检测技术以其快速、灵敏等优势逐渐成为重要检测手段。NCBI已报道多种桑花叶型萎缩病相关病毒核酸序列，该核酸序列为病毒全基因组，其中存在5个基因，表达出5种蛋白，分别是V2蛋白、V3蛋白、coat蛋白、Rep蛋白及RepA蛋白。外壳蛋白作为病毒特殊部分，是病毒产生免疫的关键成分，具有很高的特异性。

病原的早期检测也是控制病毒病的有效措施，将病疫扼杀在摇篮中。常规的检测手段包括生物学测定法(Biological assay)、电子显微(Electron microscopy)、血清学检测(Sero-logical detection)和分子生物学检测(Molecular biological detection)。随着现代科学的发展，病原检测技术将朝着简便、快速、准确、有效的检测方向发展，结合多种技术对病毒进行检测，将大大提高检测的速度和精确度。目前常用的单一技术有PCR、免疫捕获、巢式反应、环介导等温扩增(LAMP)、荧光定量等。

1985年，美国科学家Kary Mullis发明了PCR技术，PCR技术至今已非常成熟，作为分子层面最基本的检测技术，PCR以其灵敏度高、简便快速、对样本纯度要求低。PCR技术在在病毒的检测上应用非常广泛。虽然利用PCR技术对双生病毒进行检测(谢艳等，2002，叶青静等，2009)已有报道，但是桑花叶型萎缩病相关病毒为双生病毒的一个新种(马宇欣，2015)，其PCR检测技术还需进一步研究，利用PCR技术检测桑树病毒的研究至今还没有开展，。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有桑花叶型萎缩病相关病毒的预测监控技术的缺陷和不足，提供一种桑花叶型萎缩病相关病毒检测引物。基于所述引物可以成功建立检测桑花叶型萎缩病相关病毒的PCR技术。

本发明要解决的另一技术问题是提供检测桑花叶型萎缩病相关病毒的PCR技术中用于检测时的阳性对照质粒。

本发明还一要解决的技术问题是提供桑花叶型萎缩病相关病毒的PCR检测方法。

本发明在桑花叶型萎缩病相关病毒出现明显病症、病害大规模爆发前，检测叶片中病原菌的存在及其含量的技术，进而对桑园叶片等进行及时相应的处理。在桑花叶型萎缩病相关病毒基因组(NC_026771.1)的基础上，以外壳蛋白基因为靶基因，科学设计了桑花叶型萎缩病相关病毒的特异检测引物，可以以病叶以及桑树不同组织样本的总DNA为模板，并且检测结果可靠、易于操作、简单快速、特异性强、灵敏度高，可用于桑花叶型萎缩病相关病毒的快速检测，在桑花叶型萎缩病相关病毒的实际检测应用中具有广泛的应用价值和意义。

具体地，本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种桑花叶型萎缩病相关病毒检测用引物，分别为引物MCP746f和MCP1148r，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明同时提供所述引物MCP746f和MCP1148r在桑花叶型萎缩病相关病毒分子检测中的应用或在制备桑花叶型萎缩病相关病毒分子检测产品方面的应用。

本发明同时提供桑花叶型萎缩病相关病毒检测用试剂盒，包含有权利要求1所述桑花叶型萎缩病相关病毒特异性检测引物。还可以包括DNA提取所需试剂或PCR扩增反应所需试剂。

所述试剂盒的使用方法为：以待测样本DNA为模板，利用上游引物MCP746和下游引物MCP1148r进行PCR反应，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增DNA片段的大小判定结果；所述判定结果的标准为：琼脂糖凝胶上出现特异性地403bp的DNA片段产物，即样品中存在有桑花叶型萎缩病相关病毒。

本发明同时提供桑花叶型萎缩病相关病毒检测用阳性对照质粒，为质粒13MCP-pEASY-Bblunt，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明同时提供所述桑花叶型萎缩病相关病毒检测用阳性对照质粒在桑花叶型萎缩病相关病毒分子检测中的应用或在制备桑花叶型萎缩病相关病毒分子检测产品方面的应用。

本发明同时提供所述阳性对照质粒的构建用引物，分别为引物13MCP156f和13MCP1464r，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

本发明同时提供所述引物13MCP156f和13MCP1464r在桑花叶型萎缩病相关病毒分子检测中的应用或在制备桑花叶型萎缩病相关病毒分子检测产品方面的应用。

本发明同时提供桑花叶型萎缩病相关病毒的检测方法，包括以下步骤：

S1.提取待测样品的DNA；

S2.以步骤S1提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物，进行PCR扩增反应；

S3.步骤S2反应结束后，凝胶电泳检测扩增产物，以权利要求4所述阳性对照质粒作为对照，根据琼脂糖凝胶上是否出现特异性的403bp的DNA片段产物，判断样品中是否存在有桑花叶型萎缩病相关病毒。

优选地，步骤S2所述PCR扩增反应的反应体系为：

其中，2×反应缓冲液的组分为Taq DNA聚合酶，160mM Tris-HCl，40mM(NH₄)2SO₄，3.0mM MgCl₂，400μM dNTP。

优选地，步骤S2所述PCR扩增反应的程序为：94℃5min；94℃30s，62℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。

本发明涉及的桑花叶型萎缩病相关病毒DNA的外壳蛋白基因序列，序列如SEQ IDNO.6所示。

本发明具有以下有益效果：

本发明人对桑花叶型萎缩病相关病毒核酸序列进行分析总结，选择外壳蛋白基因序列作为检测的靶基因，科学设计出一组桑花叶型萎缩病相关病毒的特异检测引物，包括上游引物MCP746f和下游引物MCP1148r，引物灵敏、快速、特异性高，依据本引物可有效地检测在桑叶及病树组织中的桑花叶型萎缩病相关病毒，能够准确地判断样品中是否含有桑花叶型萎缩病相关病毒，对该病的预先检测并防范具有实际的指导意义，且可为桑叶的健康生产与资源利用提供保证。

另外，本发明引物及相关试剂可组装成试剂盒，使用方便，而且适用快速的PCR扩增。

重要的是，本发明的特异检测引物和试剂盒均能够在病原菌侵染早期就能够特异性的检测出来，为桑花叶型萎缩病相关病毒的早期检测提供了一种简单快速的方法，具有很好的实际推广应用前景。

附图说明

图1为引物MCP746F/MCP1148R的特异性以及灵敏性实验。其中，M：TaKaRa DL1000Marker；泳道1-12为特异性测试，泳道13-20为灵敏性测试；各泳道DNA模板为：1为华南农业大学桑园随机采样的病桑样品总DNA(仅为说明本发明思想使用，并不因此限定本发明范围)。2-5为本实验室保存的真菌病原DNA(本领域技术人员可以采用其他常规渠道获得的病原)，其中2为桑里白粉病病原-桑球针壳(Phyllactinia moricola)；3为桑菌核病病原菌-肉阜状杯盘菌(Ciboria carunculoides)；4为白僵菌(Beauveria bassiana)；5为疣孢青霉(Penicillium verruculosum)；6为桑青枯病病原菌-茄科劳尔式菌(Ralstoniasolanacearum)；7为假单胞菌(Pseudomonadaceae)；8为阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)；9为家蚕微孢子(Nosema bombycis)；10为健康桑叶；11为带有目的片段的13mcp-pEASY-Bblunt质粒(阳性对照)；12为水(空白对照)；泳道13-19为梯度稀释的13mcp-pEASY-Bblunt质粒，核酸浓度分别为13为1×10^-2ng/uL；14为1×10-³ng/uL；15为1×10^-4ng/uL；16为1×10^-5ng/uL；17为1×10^-6ng/uL；18为1×10^-7ng/uL；19为1×10^-2ng/uL；20为水(空白对照)。

图2为引物MCP746F/MCP1148R对不同地区桑花叶型萎缩型病病叶的检测。其中，M：TaKaRa DL1000 Marker；泳道1为华农桑园随机采样的病叶样品总DNA；泳道2为广东省翁源县农户桑地随机采样的病桑叶总DNA；泳道3为广东省英德市农户桑地随机采样的病桑叶总DNA；泳道4为广西省柳城县凤山镇示范区随机采样的桑病叶总DNA；泳道5为广西省宾阳县农户随机采样的桑病叶总DNA；泳道6为广西省柳城县冲脉镇随机采样的桑病叶总DNA；泳道7为华南农业大学亚太地区蚕桑培训中心随机采样的健康桑叶总DNA(阴性对照)；泳道8为水(空白对照)。

图3为引物MCP746F/MCP1148R对华南农业大学桑园中随机采样的具有桑花叶型萎缩型病症的病株39号不同组织部位总DNA的检测。其中：M TaKaRaDL2000 Marker；泳道1为顶嫩芽总DNA；泳道2为顶端叶片总DNA；泳道3为病叶叶柄总DNA；泳道4为侧腋芽总DNA；泳道5为枝韧皮组织总DNA；泳道6为枝木质部总DNA；泳道7为健康桑叶(阴性对照)；泳道8为水(空白对照)。

图4为不同地区病叶照，a为华农桑园病叶；b为广东省翁源县农户桑病叶；c为广东省英德市农户桑病叶；d为广西省柳城县凤山镇示范区桑病叶；e为广西省宾阳县农户桑病叶；f为广西省柳城县冲脉镇桑病叶，均为随机采样。

图5为相同病株不同组织部位的照片，1为顶嫩芽；2为顶端叶片；3为病叶叶柄；4为侧腋芽(未发芽)；5为枝韧皮组织；泳道6为枝木质部。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1检测引物设计及PCR扩增方法的建立

1、引物设计

在获得桑花叶型萎缩病相关病毒全基因组的基础上，设计了多对引物，确定优选的本发明所述两对引物。并通过大量的特异性和灵敏性检测证明了2对引物具有优异的特异性和灵敏性，引物序列如下：

(1)MCP746f/MCP1148r引物组：

上游引物MCP746f(SEQ ID NO.1)：

5’-CGAGTTTGGCAAGAAGGAAGAG-3’

下游引物MCP1148r(SEQ ID NO.2)：

5’-TTGGCTCCCACTAAATGAAAGG-3’。

(2)13MCP156f/13MCP1464r引物组：

上游引物13MCP156f(SEQ ID NO.4)：5’-TAAAGCAGATTCGCCGACAG-3’

下游引物13MCP1464r(SEQ ID NO.5)：5’-GGGACTCCCATCCAGAGGTA-3’

2、PCR扩增方法的建立

提取病叶的总DNA为模板，用前述2对引物组分别进行PCR扩增。

(1)MCP746f/MCP1148r引物组的反应体系及条件：

所述PCR反应体系(总体积20μL)：

其中，2×Taq Master Mix(反应缓冲液)的组分为Taq DNA聚合酶，160mM Tris-HCl，40mM(NH₄)₂SO₄，3.0mM MgCl₂，400μM dNTP。

PCR反应的程序为：94℃5min；94℃30s，62℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。

(2)13MCP156f/13MCP1464r引物组的体系及条件：

所述PCR反应体系(总体积20μL)

其中，2×Taq Master Mix(反应缓冲液)的组分为Taq DNA聚合酶，160mM Tris-HCl，40mM(NH₄)₂SO₄，3.0mM MgCl₂，400μM dNTP。

PCR反应的程序为：94℃5min；94℃30s，62℃30s，72℃1min，35个循环；72℃10min。

3、结果判断

第一对引物13MCP156f/13MCP1464r，PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据是否扩增到1309bp的DNA片段，将PCR结果送上海生工生物工程有限公司测序，对比结果与桑花叶型萎缩病相关病毒99％相似，判断为相同病毒。因此根据扩增到1309bp的DNA片段，判定样品中是否含有桑花叶型萎缩病相关病毒存在。

第二对引物MCP746f/MCP1148r：PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，根据是否扩增到403bp的DNA片段判定样品中是否含有桑花叶型萎缩病相关病毒的存在。

实施例2阳性对照质粒13MCP-pEASY-Bblunt的构建

桑花叶型萎缩病相关病毒DNA的外壳蛋白基因序列，序列如SEQ ID NO.6所示。本发明人对桑花叶型萎缩病相关病毒核酸序列进行分析总结，设计扩增选择包含外壳蛋白基因序列(SEQ ID NO.7所示)的13MCP片段的引物，包括上游引物13MCP156f和下游引物13MCP1464r，扩增条件如实施例1中13MCP156f/13MCP1464r引物组的体系及条件。利用13MCP按照全式金生物公司pEASY-Blunt Cloning Kit试剂盒构建13MCP-pEASY-Bblunt阳性质粒，用于检测时的阳性对照，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

实施例3引物MCP746f/MCP1148r的特异性检测

1、分别以从桑叶中分离的真菌和细菌，以及同为桑树病原真菌的桑里白粉病病原菌(Phyllactinia moricola)、桑菌核病病原菌(Ciboria carunculoides)、为白僵菌(Beauveria bassiana)、桑青枯病病原菌-茄科劳尔式菌(Ralstonia solanacearum)作为对照组，利用引物MCP746f/MCP1148r，以实施例1的方法进行PCR扩增，扩增结束后琼脂糖凝胶电泳检测结果。

2、引物的扩增结果分别如附图1所示。结果显示，只有桑花叶型萎缩病相关病毒DNA在目标位置(403bp)有条带。表明该引物组可以特异性地检测桑花叶型萎缩病相关病毒。

实施例4引物MCP746f/MCP1148r的灵敏性检测

1、获得的质粒浓度为30ng/uL。

将上述质粒DNA用1×TE进行稀释，分别以10的倍数稀释。以浓度梯度为1×10^-2ng/ul、1×10-³ng/ul、1×10^-4ng/ul、1×10^-5ng/ul、1×10^-6ng/ul、1×10^-7ng/ul、1×10^-8ng/ul为实验的DNA浓度。

2、以上述各浓度的DNA为模板，以引物MCP746f/MCP1148r，以实施例1的方法进行PCR扩增，扩增结束后琼脂糖凝胶电泳检测结果。

3、结果如图1所示，引物MCP746f/MCP1148r能检测到1×10^-6ng/μL浓度的阳性质粒DNA，具有很好的检测灵敏性。

因此，综上所述，从特异性和灵敏性的角度考虑，只有引物MCP746f/MCP1148r既能够特异性的检测桑花叶型萎缩病相关病毒，又具有很好的检测灵敏性。

实施例5对不同地区的桑病叶进行桑花叶型萎缩病相关病毒检测

以下实验进一步对引物MCP746f/MCP1148r的检测适用性和灵敏性进行测试。

材料选定：选择(随机选取)的实验材料包括华农桑园病叶、广东省翁源县农户桑病叶、广东省英德市农户桑病叶、广西省柳城县凤山镇示范区桑病叶、广西省宾阳县农户桑病叶、广西省柳城县冲脉镇桑病叶，如图4所示。

S1.各种病叶总DNA的提取

使用CTAB法进行DNA的提取，步骤如下：

选取含植物组织材料，使用液氮充分研磨至粉末；1.5mL离心管中加入800μL的2％的CTAB溶液，并添加β-巯基乙醇至终浓度0.1％；加入液氮研磨后的粉末样品，65℃恒温金属浴4小时或过夜；先使用500μL酚/氯仿振荡混匀5分钟，后12000r/min离心5分钟，取上清；加入500μL氯仿/异戊醇，振荡混匀5分钟，后12000r/min离心5分钟，取上清；将上清吸入新的1.5mL离心管中离心5分钟，取上清；上清中加入同体积的异丙醇，放置于-20℃1小时，取出后12000r/min离心5分钟，倒上清，加入1mL的70％的乙醇溶液洗涤，混匀后，12000r/min离心5分钟；去上清，倒置风干，除去异丙醇及乙醇。加入50μLTEBuffer，4℃放置1小时，即可获得总DNA。

S2.PCR检测

以步骤2得到的各材料提取DNA为模板，用特异性引物MCP746f/MCP1148r进行PCR反应。反应体系和条件参照实施例1。

S3.步骤S2反应结束后，凝胶电泳检测扩增产物，琼脂糖凝胶上出现特异性的403bp的DNA片段产物，即样品中存在有桑花叶型萎缩病相关病毒

反应结果如附图2所示，各地区病桑叶中均检测到DNA存在(泳道1-6)，而作为没有健康的桑叶(泳道7)未检测到病原，并对各地的PCR结果进行测序，获得的序列在ncbi中对比，仅与桑花叶型萎缩病相关病毒相似，相似度高达99％。说明该引物对各地区的桑花叶型萎缩病相关病毒具有特异的检测效果。

实施例6具有桑花叶型萎缩病症状的病桑树不同组织部位的桑花叶型萎缩病相关病毒检测

材料的选定：选择(随机选择)的实验材料，华南农业大学桑园中病株的顶嫩芽、桑叶、叶柄、枝侧芽(未发芽)、桑枝韧皮组织、桑枝木质部，如图5。

S1.实验材料总DNA的提取

参照实施例5中总DNA提取的方法提取不同材料中总DNA。

S2.PCR检测

以步骤S1得到的各材料提取DNA为模板，用特异性引物MCP746f/MCP1148r进行PCR反应，反应体系和条件参照实施例1。

S3.步骤S2反应结束后，凝胶电泳检测扩增产物.

反应结果如附5所示，具有桑花叶型萎缩病病症的桑树顶嫩芽、桑叶、叶柄、枝侧芽(未发芽)、桑枝韧皮组织、桑枝木质部上检测到病原菌DNA存在(泳道1-6)，而用作对照的新鲜桑叶(泳道7)则未检测出病原存在，证明具有桑花叶型萎缩病症状的病株的顶嫩芽、桑叶、叶柄、枝侧芽(未发芽)、桑枝韧皮组织、桑枝木质部上存在有病原菌。虽然病原没有病叶密集但存在，因此可以猜测病原在桑叶中大量繁殖，也可以通过木质部及韧皮部的输导组织运送到树的各个组织，幼嫩的叶片中病原还未繁殖，在较老的病叶中病原含量较多。虽然在这些部位病原菌数量较少，但仍能检测到病原菌存在，说明该引物可用于病害诊断。由图5结果可知，在桑树病害防控时，应考虑桑树枝条嫁接在病原菌传播中的作用，在桑园管理时，应做好桑枝条的处理工作。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 桑花叶型萎缩病相关病毒检测引物和质粒及检测方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物MCP746f人工序列(primer)

<400> 1

cgagtttggc aagaaggaag ag 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物MCP1148r人工序列(primer)

<400> 2

ttggctccca ctaaatgaaa gg 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物13MCP159f人工序列(primer)

<400> 3

taaagcagat tcgccgacag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物13MCP1464r人工序列(primer)

<400> 4

gggactccca tccagaggta 20

<210> 5

<211> 5238

<212> DNA

<213> 阳性质粒13MCP-pEASY-Bblunt人工序列(Positive plasmid)

<400> 5

agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60

acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120

tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180

ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcttg 240

gtaccgagct cggatccact agtaacggcc gccagtgtgc tggaattgcc cttgaaagca 300

gattcgccga cagatattaa aagtgggtcc caggaataat tattaaagag gttgcttgcg 360

cagcaagtaa ccgacgagtt ataaataccc ccctggtcct ataattttta aaatgtctga 420

gtattgcgaa cttgccgaag acagtaagta ctgtacaacg attttaattg ttcaatttat 480

tgttattgcc ctagccattc tcagttatgt ctttgtggag taccaaatta ggagagttgc 540

ctcagagctt gcaaggctgc gtaattatgt tggcctgcaa gcaattaatg tcaatggaag 600

accaaatctt gagccagaaa atagacatga gaaccgagac cggattcgag acttcagtgg 660

accacttggt ccaccttact cagtgccgta gacttctgag actgataaga cgtttttcca 720

gggtaaagga tcgtgctgca gtaaatggcg attaccagga gctctgctct gagatcaagg 780

cggggatgga accccggaac gataccacgc aggcccagaa ctgctcgagc cacgcgggtt 840

gcaagtgtta tgcgaacccc gtggagaaga agaggcccaa ggtcgagttt ggccagaagg 900

aagagacggc ccataaacgc gttgggtcca gtgaaacgtg gcacatttgg aattaaatta 960

gccagtataa atcatactgg tggtaatggg taccatttga cccattttga ccatggggat 1020

gacacaaacc aaagaactgg aaggaaaata aaaattaatg gaattaacat taggggtaaa 1080

ctgtacctaa ataatcctag gactaattct tatcatattg ttaggttgtg gataatcagg 1140

gataccagac cgggctcgga accggtgtcg ttcagctcgt tcatggacat gcacgacaac 1200

gagccaatga cagcgatggt gaagaaggac tggggagaac ggtttcaagt tctcaaggat 1260

ctgacctttc atttagtggg agccaatggt ttatctttca acgaagacgt ggtcgaggag 1320

tattttaaat ttaagggata tgttttgtat aatcacgagg attctggatc cttggcaaat 1380

gtacttgaga atggcatttt tttgtacgca gcaacctcac atccttctga gaatgtgact 1440

ttgactgcta attgtcgtgt ttatttttat gacgcagaat aattaataaa gttataattt 1500

ttttttacag actaagttga atgttttcaa ggagaaaaaa agagaaaaag gatgccggag 1560

tctcccgacg attggacgat catacctctg gatgggagtc ccaagggcaa ttctgcagat 1620

atccatcaca ctggcggccg ctcgagcatg catctagagg gcccaattcg ccctatagtg 1680

agtcgtatta caattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg 1740

ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag 1800

aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggacgcgcc 1860

ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact 1920

tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc 1980

cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt 2040

acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc 2100

ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt 2160

gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat 2220

tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa 2280

ttttaacaaa attcagggcg caagggctgc taaaggaagc ggaacacgta gaaagccagt 2340

ccgcagaaac ggtgctgacc ccggatgaat gtcagctact gggctatctg gacaagggaa 2400

aacgcaagcg caaagagaaa gcaggtagct tgcagtgggc ttacatggcg atagctagac 2460

tgggcggttt tatggacagc aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag 2520

gttgggaagc cctgcaaagt aaactggatg gctttcttgc cgccaaggat ctgatggcgc 2580

aggggatcaa gatctgatca agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat 2640

ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca 2700

caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg 2760

gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga cgaggcagcg 2820

cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact 2880

gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatcc 2940

caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg 3000

cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt 3060

actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc 3120

gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga ggatctcgtc 3180

gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga 3240

ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc 3300

cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt 3360

atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga 3420

attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 3480

cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 3540

aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc 3600

ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat 3660

gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact 3720

attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca 3780

tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact 3840

tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg 3900

atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg 3960

agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg 4020

aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg 4080

caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag 4140

ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc 4200

gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 4260

tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat 4320

atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 4380

tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 4440

accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 4500

gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 4560

caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc 4620

tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 4680

ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 4740

tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 4800

gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 4860

tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 4920

gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 4980

gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 5040

ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 5100

ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta 5160

ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag 5220

tgagcgagga agcggaag 5238

<210> 6

<211> 1309

<212> DNA

<213> 阳性质粒导入序列13MCP(Positive plasmid)

<400> 6

gaaagcagat tcgccgacag atattaaaag tgggtcccag gaataattat taaagaggtt 60

gcttgcgcag caagtaaccg acgagttata aatacccccc tggtcctata atttttaaaa 120

tgtctgagta ttgcgaactt gccgaagaca gtaagtactg tacaacgatt ttaattgttc 180

aatttattgt tattgcccta gccattctca gttatgtctt tgtggagtac caaattagga 240

gagttgcctc agagcttgca aggctgcgta attatgttgg cctgcaagca attaatgtca 300

atggaagacc aaatcttgag ccagaaaata gacatgagaa ccgagaccgg attcgagact 360

tcagtggacc acttggtcca ccttactcag tgccgtagac ttctgagact gataagacgt 420

ttttccaggg taaaggatcg tgctgcagta aatggcgatt accaggagct ctgctctgag 480

atcaaggcgg ggatggaacc ccggaacgat accacgcagg cccagaactg ctcgagccac 540

gcgggttgca agtgttatgc gaaccccgtg gagaagaaga ggcccaaggt cgagtttggc 600

cagaaggaag agacggccca taaacgcgtt gggtccagtg aaacgtggca catttggaat 660

taaattagcc agtataaatc atactggtgg taatgggtac catttgaccc attttgacca 720

tggggatgac acaaaccaaa gaactggaag gaaaataaaa attaatggaa ttaacattag 780

gggtaaactg tacctaaata atcctaggac taattcttat catattgtta ggttgtggat 840

aatcagggat accagaccgg gctcggaacc ggtgtcgttc agctcgttca tggacatgca 900

cgacaacgag ccaatgacag cgatggtgaa gaaggactgg ggagaacggt ttcaagttct 960

caaggatctg acctttcatt tagtgggagc caatggttta tctttcaacg aagacgtggt 1020

cgaggagtat tttaaattta agggatatgt tttgtataat cacgaggatt ctggatcctt 1080

ggcaaatgta cttgagaatg gcattttttt gtacgcagca acctcacatc cttctgagaa 1140

tgtgactttg actgctaatt gtcgtgttta tttttatgac gcagaataat taataaagtt 1200

ataatttttt tttacagact aagttgaatg ttttcaagga gaaaaaaaga gaaaaaggat 1260

gccggagtct cccgacgatt ggacgatcat acctctggat gggagtccc 1309

<210> 7

<211> 738

<212> DNA

<213> 外壳蛋白基因序列(coat protein gene)

<400> 7

atggcgatta ccaggagctc tgctctgaga tcaaggcggg gatggaaccc cggaacgata 60

ccacgcaggc ccagaactgc tcgagccacg cgggttgcaa gtgttatgcg aaccccgtgg 120

agaagaagag gcccaaggtc gagtttggcc agaaggaaga gacggcccat aaacgcgttg 180

ggtccagtga aacgtggcac atttggaatt aaattagcca gtataaatca tactggtggt 240

aatgggtacc atttgaccca ttttgaccat ggggatgaca caaaccaaag aactggaagg 300

aaaataaaaa ttaatggaat taacattagg ggtaaactgt acctaaataa tcctaggact 360

aattcttatc atattgttag gttgtggata atcagggata ccagaccggg ctcggaaccg 420

gtgtcgttca gctcgttcat ggacatgcac gacaacgagc caatgacagc gatggtgaag 480

aaggactggg gagaacggtt tcaagttctc aaggatctga cctttcattt agtgggagcc 540

aatggtttat ctttcaacga agacgtggtc gaggagtatt ttaaatttaa gggatatgtt 600

ttgtataatc acgaggattc tggatccttg gcaaatgtac ttgagaatgg catttttttg 660

tacgcagcaa cctcacatcc ttctgagaat gtgactttga ctgctaattg tcgtgtttat 720

ttttatgacg cagaataa 738

Claims (10)

1.一种桑花叶型萎缩病相关病毒检测用引物，其特征在于，分别为引物MCP746f和MCP1148r，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述桑花叶型萎缩病相关病毒检测用引物在桑花叶型萎缩病相关病毒分子检测中的应用或在制备桑花叶型萎缩病相关病毒分子检测产品方面的应用。

3.一种桑花叶型萎缩病相关病毒检测用试剂盒，其特征在于，包含有权利要求1所述桑花叶型萎缩病相关病毒特异性检测引物。

4.一种桑花叶型萎缩病相关病毒检测用阳性对照质粒，其特征在于，为质粒13MCP-pEASY-Bblunt，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.权利要求4所述桑花叶型萎缩病相关病毒检测用阳性对照质粒在桑花叶型萎缩病相关病毒分子检测中的应用或在制备桑花叶型萎缩病相关病毒分子检测产品方面的应用。

6.一种权利要求4所述阳性对照质粒的构建用引物，其特征在于，分别为引物13MCP156f和13MCP1464r，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

7.权利要求6所述引物在桑花叶型萎缩病相关病毒分子检测中的应用或在制备桑花叶型萎缩病相关病毒分子检测产品方面的应用。

8.一种桑花叶型萎缩病相关病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.提取待测样品的DNA；

S2.以步骤S1提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物，进行PCR扩增反应；

S3.步骤S2反应结束后，凝胶电泳检测扩增产物，以权利要求4所述阳性对照质粒作为对照，根据琼脂糖凝胶上是否出现特异性的403bp的DNA片段产物，判断样品中是否存在有桑花叶型萎缩病相关病毒。

9.根据权利要求8所述桑花叶型萎缩病相关病毒的检测方法，其特征在于，步骤S2所述PCR扩增反应的反应体系为：

其中，2×反应缓冲液的组分为Taq DNA聚合酶，160mM Tris-HCl，40mM(NH₄)2SO₄，3.0mMMgCl₂，400μM dNTP。

10.根据权利要求8所述桑花叶型萎缩病相关病毒的检测方法，其特征在于，步骤S2所述PCR扩增反应的程序为：94℃ 5min；94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃10min。