CN109897907A - 一种检测伯氏疏螺旋体的raa荧光引物、探针及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于分子生物学的快速检测莱姆病伯氏疏螺旋体的检测方法，以实现对莱姆病的快速诊断，从而弥补现有传统检测技术的不足。与PCR法相比，该荧光RAA引物和荧光探针及检测方法操作简单、快速，特异性强，灵敏度达10^‑3ng/μL，且对检测样品的处理简单方便，在39℃常温下15min内即可完成莱姆病伯氏疏螺旋体DNA的检测，适用于基层和现场的大规模筛查，为莱姆病的快速诊断、治疗和疫情监测提供科学的技术支撑。

Description

一种检测伯氏疏螺旋体的RAA荧光引物、探针及检测方法

技术领域

本发明属于重组酶介导等温扩增(Recombinase Aided Amplification，RAA)检测技术领域，具体涉及一种伯氏疏螺旋体的检测方法，包括检测过程中使用的引物对和探针。

背景技术

莱姆病(Lyme disease，LD)是由伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)感染而引起的一种自然疫源性人兽共患病，是常见的蜱传疾病之一。该病通过伯氏疏螺旋体在脊椎动物和蜱之间循环，其传染源就是储存宿主，主要包括哺乳动物、啮齿类动物和鸟类。莱姆病以慢性游走性红斑(Erythema ChronicumMigrans，ECM)为特征性表现，可累及心脏、神经、关节组织，严重者可致残甚至死亡，有“第二艾滋病”之称。莱姆病在全世界范围内流行，目前已有70多个国家发现本病，且疫区不断扩大，1992年被世界卫生组织(WHO)列入重点防治研究对象之一。迄今我国已约30个省(市、区)确定存在莱姆病自然疫源地，对人类的健康造成了一定的危害，也阻碍了畜牧业的发展。因此，加强莱姆病病原体检测技术研究，将为我国莱姆病预防体系的合理构架和防控提供科学依据。

莱姆病的病原体伯氏疏螺旋体属于原核生物界、螺旋体属、伯氏疏螺旋体，是一种单细胞疏松盘绕的左螺旋体，菌体长20-30μm，宽0.2-0.3μm。革兰氏染色呈阴性，姬姆萨染色呈蓝色。伯氏疏螺旋体与其他革兰氏阴性菌不同，它不含有脂多糖，主要由表层、外膜、鞭毛和原生质柱组成。其基因组由一个线状910kb染色体和20多个5～56kb的线状、环状质粒组成(约1.5Mb)。现阶段莱姆病实验室诊断技术主要包括病原学检测、血清学检测和分子生物学检测等。

伯氏疏螺旋体约12-18h生长复制一代，培养条件较苛刻，初次分离培养大约需20-30天，因此其体外培养周期长、培养基昂贵、因此传统的病原学和血清学检测方法受临床样本中螺旋体数目稀少、培养周期长、分离阳性率低、实验操作条件要求严格难以在临床中常规开展。国际上应用血清学和免疫学技术对莱姆病诊断一般分两步，第一步采用IFA法或ELISA检测抗体，第二步采用免疫印迹法对阳性标本进行验证，以此提高实验的准确性。但抗原的检测会产生一定的交叉反应，因此该血清学方法敏感度和特异性不高等缺陷而造成漏检。而PCR具有准确、敏感性和特异性高等优点，目前国内外已建立检测莱姆病伯氏疏螺旋体的实时荧光定量PCR法和简单操作的LAMP法。其中实时荧光定量PCR法需要使用复杂的仪器和装备精良的实验室，对待测样品DNA纯度要求较高。LAMP技术虽然不需要昂贵的PCR仪，但需设计多对引物且引物设计较复杂，易发生交叉污染，假阳性率较高，对靶基因序列要求很高，假阳性高，在基层和现场的检测应用受到一定限制。因此亟需一种便捷的快速检测伯氏疏螺旋体的方法，对于莱姆病的快速诊断及我国生物安全的应急监测与防控具有重要现实意义。

发明内容

本发明提供一种检测伯氏疏螺旋体的RAA荧光引物、探针及检测方法。本发明提供的引物和探针组具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点，应用含上述引物和探针的试剂盒能在15min内检测出伯氏疏螺旋体DNA，具有应急快速检测的应用价值。

一种基于RAA荧光法检测伯氏疏螺旋体的引物对，所述上游引物的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.1所示，

5′-TCTTTCGACCTTCTTCATTCACGCAGTGTCGC-3′；

所述下游引物的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.2所示

5′-CTACCAAGGCGATGATAAGTAACCGGCCTG-3′；

所述探针的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.3，其采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰；所述荧光报告基团(FAM)修饰在探针序列离5'端碱基数31bp的T碱基位置上；所述荧光淬灭基团(BHQ1)修饰在探针序列离3'端碱基数16bp的T碱基位置上；所述荧光报告基团与淬灭基团之间间隔1个碱基A用四氢呋喃残基替换；3′端进行C3-spacer阻断修饰。

包括RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品和阳性质控品，还包括有权利要求1所述的引物对和权利要求2所述的探针。

一种基于RAA荧光法检测伯氏疏螺旋体的检测方法，所述的方法包括如下的步骤：

1)配制RAA反应体系

按体积份数计总体系50份，含有反应缓冲液25份，10pmol/μL LD16SF1和LD16SR1各2.1份，10pmol/μL LD16S探针0.6份，纯化H₂O 16.7份，将上述46.5份混合液加入荧光基础反应单元中，加入醋酸镁2.5份，待检测的样品DNA模板1份；

2)RAA反应体系扩增提取待检测样品的DNA作为模板进行RAA反应，将检测反应条件设置为：在39℃下恒温扩增15min；

3)结果判定质控标准:阴性对照无扩增曲线，且阳性对照出现扩增曲线，则实验数据有效，否则实验结果视为无效；

结果描述及判定:无扩增曲线，样品判为阴性；出现扩增曲线，样品判为阳性。

一种权利要求1所述引物对、权利要求2或权利要求3探针或所述试剂盒在检测伯氏疏螺旋体的应用。

本发明提供一种基于分子生物学的快速检测伯氏疏螺旋体的方法，以实现对伯氏疏螺旋体进行特异、灵敏、简单的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。与其它检测技术相比具有以下优点：①本发明提供的荧光RAA引物和荧光探针灵敏度高，与荧光实时定量PCR检测伯氏疏螺旋体相当，本实验中对全基因组的拷贝数检出限达100拷贝数/μL。

②一般PCR检测时间约2-4h,本发明中RAA荧光法摆脱了PCR仪器的束缚，操作简单，在恒温条件下39℃反应15min就可得到检测结果，大大缩短了反应时间，提高了检测效率。

③本发明可以实现单管现场、快速检测伯氏疏螺旋体活性，对检测材料质量要求较低，昆虫媒介物和组织样品破碎并煮沸8min取上清就可作为模板备用，且实验中3-5min就可监测实时荧光值，为莱姆病现场快速诊断、早治疗及防控提供了科学的技术支撑。

附图说明

图1：伯氏疏螺旋体的RAA优化的引物和探针设计示意图(GenBank No.NC018747)，其中引物由方框圈出，探针由斜体并加下划线表示；每个序列引物起始位点由箭头标示；

图2：本发明引物和探针的灵敏度检测结果图；

图3：本发明引物和探针的特异性检测结果图；

图4：临床样品的检测结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，(下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：

用于检测伯氏疏螺旋体的荧光RAA引物和探针的设计

根据伯氏疏螺旋体的16S ribosomal RNA(16SrRNA)序列进行引物设计。通过NCBI查找公开发表的伯氏疏螺旋体的16SrRNA序列，选取16SrRNA序列中特异保守区域为靶标区域。伯氏疏螺旋体16SrRNA序列全长为1524bp(GenBank No.NC018747)根据基因比对同源性分析其保守区域，以位于选取1112bp-1269bp的为目的片段(158bp)进行RAA引物和探针设计。

引物序列如下：

上游引物(LD16SF1)：

5′-TCTTTCGACCTTCTTCATTCACGCAGTGTCGC-3′；(32bp)

下游引物(LD16SR1)：

5′-CTACCAAGGCGATGATAAGTAACCGGCCTG-3′；(30bp)

探针LD16S：

5′-

AGCTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTATCTCAGTTCCAGTGTG-3′；(48bp)

其中探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰。探针序列自5′端第31位碱基T上标记荧光报告基团(FAM)；第32位碱基A用四氢呋喃残基替换，第33位碱基T上标记BHQ1淬灭基团，3′端进行C3-spacer阻断修饰。探针修饰后序列为

5′-AGCTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCG/i6FAMdT//idSp//iBHQ1dT/CTCAGTTCCAGTGTG[3′C3Spacer]-3′。

本发明提供一种检测临床样品中伯氏疏螺旋体的检测方法，该方法包括如下的步骤：

1)RAA反应体系

采用实施例1设计的上游引物、下游引物和探针，以及RAA反应试剂盒(本实施例具体采用了江苏奇天基因生物科技有限公司的RAA基础试剂盒)，以伯氏疏螺旋体美国B31株(ATCC35210)基因组DNA为阳性对照，以钩端螺旋体基因组(DSM-21536)DNA为阴性对照进行扩增反应，其中反应体系(50μL)如下：25μl RAA反应缓冲液(江苏奇天基因生物科技有限公司RAA基础试剂盒提供)；上游引物10pmol/μL LD16SF1和下游引物LD16SR1各2.1μL，10pmol/μL LD16S探针0.6μL，纯化H₂O 16.7μL，将上述46.5μL混合液加入到有干粉(江苏奇天基因生物科技有限公司RAA基础试剂盒提供)的反应管中，再次混匀。各管加入2.5μL280mM醋酸镁溶液，加入从蜱中分离的伯氏疏螺旋体培养物的DNA模板1μL；

2)RAA反应体系扩增

将上述反应管放置于RAAF-6100荧光基因检测仪(江苏奇天基因生物科技有限公司)，在39℃反应15min，进行荧光检测。将检测反应条件设置为：在39℃下恒温扩增15min；

3)结果判定

本次实验同时满足以下两个条件：①质控标准中阴性对照(H₂O)在FAM通道无扩增曲线，且无Tt值；②阳性对照在FAM通道有扩增曲线，Tt值均≤8min，则本次实验有效，可对实验结果进行判定；反之，本次实验需要重新进行实验。

样品检测结果判定：当质控标准正常时，检测的样品FAM通道均有扩增曲线，可判定伯氏疏螺旋体阳性；当所检测的样品FAM通道无扩增曲线，且Tt值显示为Undet或No Tt，可判定伯氏疏螺旋体阴性。

实施例2：

引物探针灵敏度和特异性的检测实验

灵敏度实验：

设置6组不同浓度的伯氏疏螺旋体DNA模板，在最适条件下进行RAA的核酸扩增。以美国伯氏疏螺旋体标准株B31(ATCC35210)为阳性对照，参照DNA提取试剂盒说明书提取伯氏疏螺旋体B31培养物的DNA，测定提取的DNA模板浓度，以1ng/μL浓度的伯氏疏螺旋体B31的DNA模板为检测限的参比品，按照10倍梯度稀释成10^-1ng/μL，10^-2ng/μL，10^-3ng/μL，10^{- 4}ng/μL，10^-5ng/μL，分别取1μL作为反应模板，按照前述加样方法进行RAA核酸扩增。通过该实验表明该检测方法的检测限达到10^-3ng，按照以下公式计算，本发明中RAA荧光法检测伯氏疏螺旋体基因组DNA的拷贝数为100copies/μL。

具体实验结果如图2所示。图2中横坐标表示反应时间，纵坐标毫伏表示荧光值。

特异性实验

该实验选择与伯氏疏螺旋体为同一属的钩端螺旋体DSM-21536和常见的病原体(布鲁氏菌CVCC70202、金黄色葡萄球菌ATCC29213及大肠杆菌CVCC1531)作为特异性实验的参考品。应用DNA提取试剂盒提取以上样本中的DNA作为模板，根据前述反应体系添加各组分，其中RAA荧光反应过程、反应体系(除模板DNA种类不同外，其它均相同)均与本实施例1相同。特异性实验结果如图3所示。图3中横坐标表示反应时间，纵坐标毫伏表示荧光值。图3所示结果表明，4种特异性参考品均未有扩增曲线，只有伯氏疏螺旋体检测出相应的特异性扩增曲线，与其他4种特异性参考品无交叉反应，说明该检测方法的特异性良好。

实施例3：

临床样品的检测应用

选择新疆畜牧科学院兽医研究所细菌室的3例临床伯氏疏螺旋体阳性样本对该方法进行检测、验证。样品为2组蜱(每组5只蜱)研磨液、1只老鼠肾脏研磨组织液，将研磨组织液适量煮沸8min，沉淀后取上清3μL作为模板，RAA荧光反应过程、反应体系(除模板DNA不同外，其它均相同)均与本实施例1步骤相同。具体实验结果如图4所示。图4中横坐标表示反应时间，纵坐标毫伏(mV)表示荧光值。图4实验数据表明该检测方法均能检出3例临床阳性样本，扩增效果优异。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 新疆畜牧科学院兽医研究所

<120> 一种检测伯氏疏螺旋体的RAA荧光引物、探针及检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tctttcgacc ttcttcattc acgcagtgtc gc 32

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctaccaaggc gatgataagt aaccggcctg 30

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agctgctgcc tcccgtagga gtctggaccg tatctcagtt ccagtgtg 48

Claims (5)

1.一种基于RAA荧光法检测伯氏疏螺旋体的引物对，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.1所示，5′-TCTTTCGACCTTCTTCATTCACGCAGTGTCGC-3′；所述下游引物的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.2所示5′-CTACCAAGGCGATGATAAGTAACCGGCCTG-3′。

2.如权利要求1所述基于RAA荧光法检测伯氏疏螺旋体的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.3，其采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰；所述荧光报告基团(FAM)修饰在探针序列离5'端碱基数31bp的T碱基位置上；所述荧光淬灭基团(BHQ1)修饰在探针序列离3'端碱基数16bp的T碱基位置上；所述荧光报告基团与淬灭基团之间间隔1个碱基A用四氢呋喃残基替换；3′端进行C3-spacer阻断修饰。

3.一种基于RAA荧光法检测伯氏疏螺旋体的试剂盒，其特征在于，包括RAA基础荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品和阳性质控品，还包括有权利要求1所述的引物对和权利要求2所述的探针。

4.一种基于RAA荧光法检测伯氏疏螺旋体的检测方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)配制RAA反应体系

按体积份数计总体系50份，含有反应缓冲液25份，10pmol/μL LD16SF1和LD16SR1各2.1份，10pmol/μL LD16S探针0.6份，纯化H₂O 16.7份，将上述46.5份混合液加入荧光基础反应单元中，加入醋酸镁2.5份，待检测的样品DNA模板1份；

2)RAA反应体系扩增提取待检测样品的DNA作为模板进行RAA反应，将检测反应条件设置为：在39℃下恒温扩增15min；

3)结果判定质控标准:阴性对照无扩增曲线，且阳性对照出现扩增曲线，则实验数据有效，否则实验结果视为无效。

结果描述及判定:无扩增曲线，样品判为阴性；出现扩增曲线，样品判为阳性。

5.一种权利要求1所述引物对、权利要求2或权利要求3探针或所述试剂盒在检测伯氏疏螺旋体的应用。