CN113512605A - 莱姆病螺旋体的巢式荧光定量pcr检测方法 - Google Patents

莱姆病螺旋体的巢式荧光定量pcr检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113512605A
CN113512605A CN202110923779.4A CN202110923779A CN113512605A CN 113512605 A CN113512605 A CN 113512605A CN 202110923779 A CN202110923779 A CN 202110923779A CN 113512605 A CN113512605 A CN 113512605A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pcr
primer
nested
round
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110923779.4A
Other languages
English (en)
Inventor
郝琴
万康林
季绍有
范雪婷
侯学霞
张琳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Original Assignee
National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention filed Critical National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority to CN202110923779.4A priority Critical patent/CN113512605A/zh
Publication of CN113512605A publication Critical patent/CN113512605A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种莱姆病螺旋体的巢式荧光定量PCR检测方法。本发明以rrf‑rrl作为靶基因，设计用于检测莱姆病螺旋体的巢式PCR引物及探针，包括第一轮PCR引物和第二轮PCR引物，在第二轮PCR反应中，引入探针，以提高检测的灵敏度。本发明提供的莱姆病螺旋体的巢式荧光定量PCR检测方法，具有较好的特异性，灵敏度高，检测下限达0.01pg/μL。本方法还可以对阳性标本进行单位点分型，实现对Borrelia burgdorferi sensu stricto(B.b.s.s)、Borrelia garinii(B.g)、Borrelia afzelii(B.a)和Borrelia valaisiana(B.v)四种伯氏疏螺旋体的有效判别。

Description

莱姆病螺旋体的巢式荧光定量PCR检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学及微生物检测技术领域，具体地说，涉及一种莱姆病螺旋体的巢式荧光定量PCR检测方法。
背景技术
莱姆病(Lyme disease)是由伯氏疏螺旋体(Bolrelia burgdorferi)引起的一种慢性自然疫源性疾病。该病主要是通过节肢动物蜱的叮咬在宿主动物与宿主动物及人之间传播。莱姆病临床表现初期多有典型皮肤损害--慢性游走性红斑(ECM)，同时伴有头痛、发热、寒战、疲乏不适.局部淋巴结肿大等症状，后期表现为神经系统、循环系统、运动系统等呈间歇性、交替性出现的各种损害。具有分布广、病程长、病死率较高等特点。如能早期诊断、早期治疗常可痊愈，否则会出现严重并发症。因此开发莱姆病螺旋体的早期快速检测技术，对莱姆病早期诊断、早期治疗具有重要的意义。
目前莱姆病的主要诊断方法包括病原学检测和特异性抗体检测。病原学检测包括直接镜检法、病原分离培养、多聚酶链反应(PCR)和荧光定量PCR(real-time PCR)；常用的特异性抗体检测包括间接免疫荧光抗体法(IFA)、酶联免疫吸附实验(ELISA)和蛋白免疫印迹法(WB)。
莱姆病早期抗体效价较低，常达不到莱姆病诊断标准，在此“窗口期”常采用特异性核酸检测提供线索和依据。莱姆病患者菌血症期较短，并且血液、脑脊液等标本中菌的载量较低，所以需要采用敏感度和特异度较高的方法。目前常用的普通PCR和real-time PCR，选择的靶基因有fla、ospA、recA、hbb等。上述方法中，普通PCR方法敏感度较低，一般用于菌株鉴定，很少用于临床标本检测；针对recA、hbb等基因的real-time PCR的检测下限也只可达到101-102/mL，但这些靶基因并不能用于检测阳性标本感染菌株型别的判定。
发明内容
本发明的目的是提供一种莱姆病螺旋体的巢式荧光定量PCR检测方法。
本发明构思如下：巢式荧光定量PCR是将巢式PCR和特异性荧光定量PCR相结合，可以大大提高检测的灵敏度，从而减少临床病例漏诊的状况。本发明选择rrf-rrl为靶位点建立巢式荧光定量PCR方法，可以检测到血液、脑脊液等病人无菌体液中单个拷贝的莱姆病螺旋体DNA，大大提高了检测灵敏度。并且rrf-rrl位点为莱姆病螺旋体特有的基因，并且为常用的鉴定和分型位点，可以同时实现初步对莱姆病螺旋体进行分型，从而判断病人感染型别的目的。
本发明中，引物、探针设计基于参考株Borrelia burgdorferi 297(GenBank:JX564636.1)。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于检测莱姆病螺旋体的巢式PCR引物，包括第一轮PCR引物和第二轮PCR引物；
第一轮PCR引物包括上游引物F1：5’-CGACCTTCTTCGCCTTAAAGC-3’和下游引物R1：5’-TAAGCTGACTAATACTAATTACCC-3’；
第二轮PCR引物包括上游引物F2：5’-CTGCGAGTTCGCGGGAGAG-3’和下游引物R2：5’-AAGCTCCTAGGCATTCACCATA-3’。
第二方面，本发明提供与所述巢式PCR引物配合使用的探针，探针P的序列为5’-TGACCATATTTTTATCTTCC-3’；
其中，探针P的5’端带有荧光基团(如FAM)，3’带有荧光淬灭基团(如MGB)。
第三方面，本发明提供含有所述巢式PCR引物和所述探针的检测试剂或试剂盒。
第四方面，本发明提供莱姆病螺旋体的巢式荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
1)提取样本中的DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用第一轮PCR引物进行PCR扩增反应；
3)以步骤2)的扩增产物为模板，利用第二轮PCR引物和探针进行PCR扩增反应；
4)分析PCR产物。
所述方法含非疾病诊断目的。
优选地，步骤2)中，PCR反应体系为：反应混合液10μL，10μM上、下游引物各0.5μL，DNA模板4μL，去离子水5μL。
PCR反应程序为：94℃2min，55℃1min，72℃2min，1个循环；94℃45s，55℃45s，72℃45s，33个循环；94℃45s，55℃45s，72℃2min，1个循环。
优选地，步骤3)中，PCR反应体系为：反应混合液10μL，10μM上、下游引物各0.4μL，10μM探针0.4μL，步骤2)的扩增产物2μL，水6.8μL。
PCR反应程序为：94℃2min；94℃10s，60℃30s，40个循环。
可选地，反应混合液为2×Premix Ex Taq(TaKaRa DRR390)。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明提供的莱姆病螺旋体的巢式荧光定量PCR检测方法，具有较好的特异性，能够将莱姆病螺旋体与大肠杆菌、立克次体、巴尔通体、钩体等病原体进行有效区分。
(二)在巢式PCR的第二轮反应中，添加探针，引入特异性荧光定量PCR，从而大大提高检测的灵敏度。检测下限达0.01pg/μL。
(三)将rrf-rrl作为靶基因，可同时对阳性标本进行单位点分型，实现对Borreliaburgdorferi sensu stricto(B.b.s.s)、Borrelia garinii(B.g)、Borrelia afzelii(B.a)和Borrelia valaisiana(B.v)四种伯氏疏螺旋体的有效判别。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中巢式荧光定量PCR特异性检测实验结果。
图2为本发明较佳实施例中巢式荧光定量PCR敏感度实验结果。
图3为本发明较佳实施例中普通荧光定量PCR敏感度实验结果。
图4为本发明较佳实施例中普通荧光定量PCR检测临床模拟样本结果。
图5为本发明较佳实施例中巢式荧光定量PCR检测临床模拟样本结果。
图6～图11为本发明较佳实施例中对第二轮PCR反应体系及反应条件进行优化的实验结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1巢式荧光定量PCR引物的设计及优化
莱姆病螺旋体有独特的rRNA基因结构，即有两个拷贝的23S rRNA(rrf)和5S rRNA(rrl)基因,呈前后重复排列:-rrf-rrl-rrf-rrl-，中间形成rrf-rrl基因间隔区，这种结构对莱姆病螺旋体是特异的。
选取可以进行单位点分型鉴定的莱姆病螺旋体的rrf-rrl位点作为靶基因。第一轮采用巢式PCR的外轮引物，富集标本中的莱姆病螺旋体DNA；第二轮采用特异的荧光定量PCR进行莱姆病螺旋体的特异检测。
第一轮：普通PCR
引物如下(SEQ ID NO:1-2)：
上游引物F1：5’-CGACCTTCTTCGCCTTAAAGC-3’
下游引物R1：5’-TAAGCTGACTAATACTAATTACCC-3’
第二轮：荧光定量PCR
引物及探针如下(SEQ ID NO:3-5)：
上游引物F2：5’-CTGCGAGTTCGCGGGAGAG-3’
下游引物R2：5’-AAGCTCCTAGGCATTCACCATA-3’
探针：5’-FTGACCATATTTTTATCTTCCP-3’(F为荧光基团，P为荧光淬灭基团)
参考株Borrelia burgdorferi 297(GenBank:JX564636.1)rrf-rrl位点序列如下：
taagctgactaatactaattacccgtatctttggccatatttttgtcttccttgtaaaaaccctggtggttaaagaaaagaggaaacacctgttatcattccgaacacagaagttaagctcttattcgctgatggtactgcgagttcgcgggagagtaggttattgccagggtttttatttttatactttaaactttgattttatttttatgttttttaaatattggtgtttttgaatgggttgtttaaataacataaaaaataaaatatatattgacatgcattaaacaaagatatatattattttatgttgtataaataaattggcaaaatagagatggaagataaaaatatggtcaaagtaataagagtctatggtgaatgcctaggagctttaaggcgaagaaggtcg
实施例2莱姆病螺旋体的巢式荧光定量PCR检测方法的建立
本发明提供的莱姆病螺旋体的巢式荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
1、提取样本中的DNA；
2、以步骤1中提取的DNA为模板，利用第一轮PCR引物(SEQ ID NO:1-2)进行PCR扩增反应；
3、以步骤2的扩增产物为模板，利用第二轮PCR引物和探针(SEQ ID NO:3-5)进行PCR扩增反应；
4、分析PCR产物。
步骤2中，PCR反应体系为：反应混合液10μL，10μM上、下游引物各0.5μL，DNA模板4μL，去离子水5μL。
PCR反应程序为：94℃2min，55℃1min，72℃2min，1个循环；94℃45s，55℃45s，72℃45s，33个循环；94℃45s，55℃45s，72℃2min，1个循环。
步骤3中，PCR反应体系为：反应混合液2×Premix Ex Taq(TaKaRa DRR390)10μL，10μM上、下游引物各0.4μL，10μM探针0.4μL，步骤2的扩增产物2μL(加样量可调)，水7.2μL。
PCR反应程序为：94℃2min；94℃10s，60℃30s，40个循环。
实施例3巢式荧光定量PCR检测方法的特异性考察
所用菌株包括大肠杆菌(1株)、立克次体(5株)、巴尔通体(1株)、钩体(10株)以及伯氏疏螺旋体(5株)共22个样本。采用实施例2的巢式荧光定量PCR法进行检测。检测结果表明，除伯氏疏螺旋体外，其他菌均未检测到，说明该方法具有较好的特异性(图1)。
实施例4巢式荧光定量PCR检测方法的敏感度分析
将B.b.s.s、B.g、B.a和B.v四种伯氏疏螺旋体菌株进行滴度稀释。先进行一轮普通PCR，然后取普通PCR的扩增产物作为荧光定量的模板；结果表明巢式荧光定量PCR的检测最低浓度为0.01pg/μL(图2)。
实施例5巢式荧光定量PCR与普通荧光定量PCR的比较
将上述稀释后的四种莱姆病螺旋体DNA作为模板进行普通荧光定量PCR，比较两种荧光定量方法的灵敏度。结果表明，普通荧光定量PCR检测下限为1pg/μL，是巢式荧光定量PCR的100倍。说明巢式荧光定量PCR具有更高的灵敏度(图3)。
普通荧光定量PCR：
引物和探针：
上游引物F2：5’-CTGCGAGTTCGCGGGAGAG-3’
下游引物R2：5’-AAGCTCCTAGGCATTCACCATA-3’
探针：5’-FTGACCATATTTTTATCTTCCP-3’(F为荧光基团，P为荧光淬灭基团)
反应体系为：反应混合液2×Premix Ex Taq(TaKaRa DRR390)10μL，10μM上、下游引物各0.4μL，10μM探针0.4μL，DNA模板2-4μL(加样量可调)，水7.2-5.2μL。
反应程序为：94℃2min；94℃10s，60℃30s，40个循环。
实施例6临床模拟样本检测
将菌体用生理盐水重悬混匀后利用麦氏比浊法测定浓度，测得该样本浓度为1.5×109个/mL。将样本分别稀释至30个健康人血清中，编号以及血清中细菌含量如下：
1-3：1.5×108个；4-6：1.5×107个；7-9：1.5×106个；
10-12：1.5×105个；13-15：1.5×104个；16-18：1.5×103个；
19-21：1.5×102个；22-24：1.5×101个；25-28：1.5个；
29-30：无。
利用QIAGEN试剂盒提取样本核酸，分别进行普通荧光定量PCR和巢式荧光定量PCR。
1、普通荧光定量PCR
结果如图4所示，当血清中含菌量低至1.5个时，检测结果为阴性。即普通荧光定量PCR的灵敏度最高为1.5×101。
2、巢式荧光定量PCR
结果如图5所示，当血清样本中含菌量低至1.5个时仍可以检测到，阳性检出率为100％。
对临床样本的批内重复和批间实验数据表明本检测方法具有较好的重复性。
实施例7对第二轮PCR反应体系及反应条件的优化实验
以B.b.s.s、B.g、B.a和B.v四种伯氏疏螺旋体菌株DNA为模板进行如下实验：
方案I：
反应体系设为20μL，逐一对引物、探针浓度及退火温度、时间进行优化：
反应总体积20μL：Mix10μL，primerF 0.4μL，primerR 0.4μL，probe 0.2μL，DNA 2μL，水7μL。
反应条件：预变性94℃，2分钟；变性94℃，10秒，退火及延伸60℃，30秒；40个循环。
结果见图6。
方案II：
反应总体积20μL：Mix 10μL，primerF 0.4μL，primerR 0.4μL，probe 0.2μL，DNA 2μL，水7μL。
反应条件：预变性94℃，2分钟；变性94℃，10秒，退火及延伸58℃，30秒；40个循环。
结果见图7。
方案III：
反应总体积20μL：Mix 10μL，primerF 0.4μL，primerR 0.4μL，probe 0.2μL，DNA 2μL，水7μL。
反应条件：预变性94℃，2分钟；变性94℃，10秒，退火及延伸56℃，30秒；40个循环。
结果见图8。
方案IV：
反应总体积20μL：Mix 10μL，primerF 0.4μL，primerR 0.4μL，probe 0.2μL，DNA 2μL，水7μL。
反应条件：预变性94℃，2分钟；变性94℃，10秒，退火及延伸54℃，30秒；40个循环。
结果见图9。
方案V：
反应总体积20μL：Mix 10μL，primerF 0.4μL，primerR 0.4μL，probe 0.4μL，DNA 2μL，水6.8μL。
反应条件：预变性94℃，2分钟；变性94℃，5秒，退火及延伸60℃，30秒，40个循环。
结果见图10。
方案VI：
反应总体积20μL：Mix 10μL，primerF 0.4μL，primerR 0.4μL，probe 0.4μL，DNA 2μL，水6.8μL。
反应条件：预变性94℃，2分钟；变性94℃，5秒；退火及延伸58℃，30秒，40个循环。
结果见图11。
根据以上实验结果，确定rrf-rrl荧光定量PCR的第二轮PCR反应中优化的反应条件为：预变性94℃，2分钟；变性94℃，10秒，退火58-60℃，30秒，40个循环。优选地，引物、探针浓度为10μM，每20μL反应体系加入量为0.4μL。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
<120>莱姆病螺旋体的巢式荧光定量PCR检测方法
<130> KHP211117520.0
<160>5
<170>SIPOSequenceListing1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgaccttctt cgccttaaag c 21
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taagctgact aatactaatt accc 24
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgcgagttc gcgggagag 19
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aagctcctag gcattcacca ta 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgaccatatt tttatcttcc 20

Claims (6)

1.用于检测莱姆病螺旋体的巢式PCR引物，其特征在于，包括第一轮PCR引物和第二轮PCR引物；
第一轮PCR引物包括上游引物F1：5’-CGACCTTCTTCGCCTTAAAGC-3’和下游引物R1：5’-TAAGCTGACTAATACTAATTACCC-3’；
第二轮PCR引物包括上游引物F2：5’-CTGCGAGTTCGCGGGAGAG-3’和下游引物R2：5’-AAGCTCCTAGGCATTCACCATA-3’。
2.与权利要求1所述巢式PCR引物配合使用的探针，其特征在于，探针P的序列为5’-TGACCATATTTTTATCTTCC-3’；
其中，探针P的5’端带有荧光基团，3’带有荧光淬灭基团。
3.含有权利要求1所述巢式PCR引物和权利要求2所述探针的检测试剂或试剂盒。
4.莱姆病螺旋体的巢式荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取样本中的DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用第一轮PCR引物进行PCR扩增反应；
3)以步骤2)的扩增产物为模板，利用第二轮PCR引物和探针进行PCR扩增反应；
4)分析PCR产物；
所述第一轮PCR引物、第二轮PCR引物来自权利要求1所述的巢式PCR引物；所述探针同权利要求2所述的探针；
所述方法为非疾病诊断目的。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中，PCR反应体系为：反应混合液10μL，10μM上、下游引物各0.5μL，DNA模板4μL，去离子水5μL；
PCR反应程序为：94℃2min，52-55℃1min，72℃2min，1个循环；94℃45s，55℃45s，72℃45s，33个循环；94℃45s，52-55℃45s，72℃2min，1个循环。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)中，PCR反应体系为：反应混合液10μL，10μM上、下游引物各0.4μL，10μM探针0.4μL，步骤2)的扩增产物2μL，水6.8μL；
PCR反应程序为：94℃2min；94℃10s，58-60℃30s，40个循环。
CN202110923779.4A 2021-08-12 2021-08-12 莱姆病螺旋体的巢式荧光定量pcr检测方法 Pending CN113512605A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110923779.4A CN113512605A (zh) 2021-08-12 2021-08-12 莱姆病螺旋体的巢式荧光定量pcr检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110923779.4A CN113512605A (zh) 2021-08-12 2021-08-12 莱姆病螺旋体的巢式荧光定量pcr检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113512605A true CN113512605A (zh) 2021-10-19

Family

ID=78068127

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110923779.4A Pending CN113512605A (zh) 2021-08-12 2021-08-12 莱姆病螺旋体的巢式荧光定量pcr检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113512605A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109897907A (zh) * 2019-04-15 2019-06-18 新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心） 一种检测伯氏疏螺旋体的raa荧光引物、探针及检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1434872A (zh) * 1999-09-24 2003-08-06 生物技术检测股份有限公司 用于检测细菌群和细菌种系发育中单位的核酸分子
CN101613757A (zh) * 2009-07-09 2009-12-30 中国农业科学院兰州兽医研究所 检测蜱体内莱姆病病原的试剂盒及检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1434872A (zh) * 1999-09-24 2003-08-06 生物技术检测股份有限公司 用于检测细菌群和细菌种系发育中单位的核酸分子
CN101613757A (zh) * 2009-07-09 2009-12-30 中国农业科学院兰州兽医研究所 检测蜱体内莱姆病病原的试剂盒及检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAROLIN RAUTER等: "Critical Evaluation of Urine-Based PCR Assay for Diagnosis of Lyme BorrCritical Evaluation of Urine-Based PCR Assay for Diagnosis of Lyme Borreliosiseliosis", AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, vol. 12, no. 8, 31 August 2005 (2005-08-31), pages 910 - 917 *
张刘丽;侯学霞;耿震;霍秋波;郝琴;万康林;楼永良;: "巢式PCR用于疑似莱姆病患者血清标本检测的研究", 中国媒介生物学及控制杂志, no. 01, 20 February 2013 (2013-02-20), pages 8 - 10 *
张琳;苗广青;侯学霞;李博;郝琴;: "巢式PCR和实时荧光定量PCR在莱姆病宿主动物监测中的应用评价", 中国媒介生物学及控制杂志, no. 05, 3 August 2018 (2018-08-03), pages 425 - 427 *
褚宸一: "媒介和宿主中伯氏疏螺旋体感染调查及基因分型研究", 中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑, no. 09, 15 September 2009 (2009-09-15), pages 1 - 1 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109897907A (zh) * 2019-04-15 2019-06-18 新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心） 一种检测伯氏疏螺旋体的raa荧光引物、探针及检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108410957B (zh) 用于检测生殖支原体的荧光pcr引物、探针及检测试剂盒
WO2023109032A1 (zh) 一种多重核酸检测系统及其制备方法与应用
RU2625006C1 (ru) Способ таргетной амплификации геномов возбудителей инфекций органов репродукции человека с целью одновременной идентификации возбудителей с набором праймеров
JP2023504258A (ja) 臨床的状況及び非臨床的状況において微小生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）を同定する方法
CN117363767B (zh) 一种用于靶基因实时荧光pcr检测的探针组合、引物组、试剂盒及其应用
US7989170B2 (en) Method for the detection of bacterial species of the genera anaplasma/ehrlichia and bartonella
US20110287965A1 (en) Methods and compositions to detect clostridium difficile
Wang et al. Development of a recombinase polymerase amplification assay with lateral flow dipstick for rapid detection of feline parvovirus
EP2753629B1 (en) Methods for detecting lyme disease
CN113512605A (zh) 莱姆病螺旋体的巢式荧光定量pcr检测方法
ZA200607878B (en) Neisseria gonorrhoeae detection
CN114410799A (zh) 一种基于PCR-CRISPR/Cas13a的梅毒螺旋体检测方法
Ciervo et al. Rapid detection and differentiation of Bartonella spp. by a single-run real-time PCR
CN105349526B (zh) 一种采用多重内引物进行恒温扩增核酸的方法及应用
Liu et al. A rapid and sensitive loop-mediated isothermal amplification procedure (LAMP) for Mycoplasma hyopneumoniae detection based on the p36 gene
KR102326566B1 (ko) 성매개 감염 진단용 프라이머 세트, 진단용 조성물, 및 이를 이용한 성매개 감염 진단 방법
CN111172306A (zh) 一种用于检测结核分枝杆菌和/或布鲁氏菌的组合物、试剂盒及其应用
CN107110864B (zh) 用于检测高毒力艰难梭菌菌株的存在的方法
CN108004337B (zh) 检测新型隐球菌的成套试剂
RU2289627C2 (ru) СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК БАКТЕРИИ ЗАБОЛЕВАНИЯ ЛАЙМСКОГО БОРРЕЛИОЗА-Borrelia burgdorferi
Reischl et al. Rapid and specific detection of Helicobacter pylori by LightCycler PCR
JP3141976B2 (ja) 赤痢菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法
WO2021011850A2 (en) Amplification assay for the detection of anaplasma phagocytophilum
Beck et al. Rapid and Specific Detection of Helicobacter pylori by LightCycler PCR Udo Reischl*, BIRGIT Leppmeier, Markus Heep
WO2021094601A1 (en) Method of determining the presence of a hyper-virulent clostridioides difficile strain of the b1/nap1/027 group in a sample

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination