CN101613757A - 检测蜱体内莱姆病病原的试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从蜱体内检测某种病原体的检测试剂盒及检测方法。本发明的检测蜱体内莱姆病病原的试剂盒内至少有：其上共价结合有莱姆病病原螺旋体通用探针和狭义螺旋体B.buredorferi sensu stricto、嘎氏螺旋体B.garinii、伽氏螺旋体B.afzelii和B.valaisiana螺旋体特异寡核苷酸探针的Biodyne C膜，以及在螺旋体5S－23SrRNA基因序列两端的保守区域设计的一对可扩增出的片段大小为225bp的引物，且其中的一条引物用生物素标记。
Description
技术领域
本发明涉及一种从蜱体内检测某种病原体的检测试剂盒及检测方法，确切讲是一种用于检测蜱体内莱姆病病原的RLB检测方法。
背景技术
莱姆病(Lyme disease)又称莱姆包柔体病或莱姆疏螺旋体病，是一种蜱传性的自然疫源性人兽共患螺旋体病，因首次在美国康涅狄格州的莱姆镇发现而得名。病原体为伯氏疏螺旋体，可分为10个基因型，我国已发现报道的莱姆病螺旋体有狭义伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi sensus stricto)、伽氏疏螺旋体(B.garinii)和嘎氏疏螺旋体(B.afzelii)三个基因型。目前已在全球30多个国家和地区报告有本病和自然疫源地存在，年发病人数在30万左右，仍有不断增多的趋势，在美国有“第二爱滋病”之称(Gratz N.Emerging and resurging vector-bornedisease.Ann Rev Entomol，1999，44：51)。1992年，世界卫生组织(WHO)将此病列为重点防治研究对象。我国于1986年首次在黑龙江省海林县林区发现了该病，到目前，我国29个省(区、市)均已发现有莱姆病分布，每年新发病例高达万余例，某些省份林区的发病率在1-40％。
人感染后的临床症状主要表现为慢性炎症性多系统损伤，除皮肤慢性游走性红斑、关节炎和慢性萎缩性肢皮炎外，常常会伴有心脏和神经系统的损伤，从而引起脑膜炎、路神经炎、运动及感觉神经根炎、神经丛炎、多发单神经炎小脑共济失调等等症状。严重影响人类健康。
由于本病是一类蜱传性疾病，所以探明媒介蜱的种类，为切断传播途径，控制本病的流行是十分重要的。现已发现，在北美主要的媒介蜱是肩突硬蜱、新节硬蜱和太平洋硬蜱，其中肩突硬蜱是主要的传播媒介，带菌率在12-100％；欧洲的传播媒介是篦子硬蜱和全沟硬蜱，篦子硬蜱的带菌率可达到40％；在我国，在全沟硬蜱、粒形硬蜱、锐跗硬蜱、长角血蜱、二棘血蜱、嗜群血蜱、台湾血蜱、微小牛蜱和森林革蜱等9种硬蜱体内分离到病原，其中全沟硬蜱、二棘血蜱和粒形硬蜱的带菌率最高，分别达到20-45％、16-40％和24％。研究证实在我国北方林区主要是全沟硬蜱，南方林区为二棘血蜱和粒形硬蜱传播本病。
目前，蜱体内莱姆病病原的检测方法目前主要有：聚合酶链反应(PCR)；组织镜检与体外培养。以PCR为主，但是PCR在检测本病原时常常表现为敏感性较低，而且难以满足进行本病原全面的大规模调查的需要，因此，到目前为止，莱姆病的实验室诊断没有得到有效的解决，全球仍然没有统一的参考标准。现有技术可参见：BarbourA G. Biology of Borrelia species[J].M icrobiological review，1986，50：381-4001，Chary V alckenaere I，Jaulhac B，Monteil H，et la.D iagnosis ofL yme disease[J].Current difficultiesand prospects.Rev-Rhum-Engl-Ed，1995，62(4)：271-280，Luger SW Krauss E Lyme disease，Interlaboratory variability[J]Arch-Intern-Med，1990，150(4)：761-763和Magnarelli LA Current status of laboratorydiagnosis for Lyme disease[J].Am-J-Med，1995，98(4A)：10-12
发明内容
本发明针对现有技术检测蜱体内莱姆病病原伯氏疏螺旋体时检测病原单一，不能同时检测出混合感染的发生，且敏感性低的缺点，提供一种能够直接，综合性，高特异性和敏感性的检测出目前已知所有的被检样品中的螺旋体感染的检测试剂盒，本发明同时提供使用这种试剂盒的检测方法。
本发明的检测蜱体内莱姆病病原的试剂盒内至少有：其上共价结合有莱姆病病原螺旋体通用探针和狭义螺旋体B.buredorferi sensu stricto、嘎氏螺旋体B.garinii、伽氏螺旋体B.afzelii和B.valaisiana螺旋体特异寡核苷酸探针的BiodyneC膜，以及在螺旋体5S-23SrRNA基因序列两端的保守区域设计的一对可扩增出的片段大小为225bp的引物，且其中的一条引物用生物素标记。
本发明的检测蜱体内莱姆病病原的试剂盒中所用的莱姆病病原螺旋体通用探针的序列为ctttgaccatatttttatcttcca；狭义螺旋体B.buredorferi sensu stricto的特异性寡核苷酸探针为aacaccaatatttaaaaaacataa；嘎氏螺旋体B.garinii的特异性寡核苷酸探针为aacatgaacatctaaaaacataaa；伽氏螺旋体B.afzelii的特异性寡核苷酸探针为aacatttaaaaaataaattcaagg；B.valaisiana的特异性寡核苷酸探针为cattaaaaaaatataaaaaataaatttaagg；一对引物的序列各为：
上游引物：23SN2(5′-accatagactcttattactttgacca-3′)，
下游引物：5SCB(5′-biotin-gagagtaggttattgccaggg-3)，其中下游引物用生物素标记。
本发明的试剂盒的使用方法是将捕捉的待检蜱用75％酒精浸泡20min，再用生理盐水漂洗，将其置于含有BSKII培养基的无菌研磨器中研磨碎后再进行菌体分离培养与提纯，得到DNA，以所得到的DNA为模板，以试剂盒内的引物进行PCR，扩增产物和固定在Biodyne C膜上的伯氏螺旋体的寡核苷酸进行杂交，再将Biodyne C膜放置在塑料布或者包装膜内，滴加A、B混合液在膜上含有寡核苷酸和PCR产物杂交的区域，用塑料层覆盖膜，塑料薄膜封闭器封闭薄膜，将封闭好的薄膜于曝光储片夹曝光处理，取出胶片进行显影定影处理后观察结果。
本发明的优点是：利用莱姆病伯氏疏螺旋体5S-23S间隔区序列设计的两对引物，第二对引物其中一条用生物素标记，PCR扩增伯氏疏螺旋体5S-23S间隔区，通过单链的种特异性寡核苷酸探针与扩增的PCR产物进行杂交反应，发现所有的菌种都只与其相对应的寡合苷酸进行反应出现杂交信号，而且没有观察到有交叉反应，杂交反应后发现，所有感染有伯氏疏螺旋体的样品均可看到一个或者多个种的杂交信号产生。同时，伯氏疏螺旋体通用的寡核苷酸探针可以表明，如果PCR产物与通用的探针发生杂交信号，而没有与种特异性的探针产生杂交信号，则可以判断为一个新种或新的基因型的发现。同时，设计的四个种特异性探针(Sl、Ss、Ga、Bv)更加详尽的诊断动物所感染的菌种类别或者菌株，本发明的相关实验表明，RLB能够检测出目前已存在的所有伯氏疏螺旋体菌种，同时有助于新菌种的发现。
附图说明
图1为本发明的伯氏疏螺旋体RLB标准阳性特异性试验中在感光胶片上显示的特异性杂交结果，其中：Sl为伯氏疏螺旋体通用探针；Ga为Borrelia.garinii特异性探针；Ss为Borrelia.burgdorferi sensus strict特异性探针；Af为Borrelia.afzelii特异性探针；Vs为Borrlia.valaisian特异性探针；支为支原体基因组；衣为衣原体基因组；牛为健康牛基因组；羊为健康羊基因组；水为空白对照。
具体实施方式
一、引物和探针的设计与合成
在螺旋体5S-23S rRNA基因序列两端的保守区域设计一对扩增出的片段大小为225bp的引物，其上游引物为：
23SN2(5′-ACCATAGACTCTTATTACTTTGACCA-3′)，
下游引物为：5SCB(5′-biotin-GAGAGTAGGTTATTGCCAGGG-3)。
根据已确定的莱姆病伯氏疏螺旋体5S-23S rRNA基因序列的变异区域设计针对①狭义螺旋体B.buredorferi sensu stricto，②嘎氏螺旋体B.garinii，③伽氏螺旋体B.afzelii和④螺旋体B.valaisiana的四个特异性寡核苷酸探针，即：SS，BG，BA和BV，另外，针对所有螺旋体的通用探针SL也被设计合成。所有的寡核苷酸探针均用N-(trifluoroacetamidohexyl-cyanoethyl，N，N-diisopropylphosphoramidite[TFA])-C6氨基团连接修饰，将合成的探针0-800pmol/150ul500mM NaHCO3(pH 8.4)，寻找最佳浓度用于杂交。各寡核苷酸探针序列和其最佳浓度见表1。
表1.泰勒虫和巴贝斯虫寡核苷酸探针序列和最佳浓度
二、含有螺旋体种特异寡核苷酸Biodyne C膜的制备：
螺旋体种的特异性寡核苷酸序列根据每个菌种的5S-23S rRNA基因序列设计。所有的寡核苷酸5′端被氨基团修饰后合成。它们能够共价结合到带有负电荷的Biodyne C薄膜上。按照Gubbels等1999描述的方法改进后进行操作[28]，基本过程如下：
(1)用149ul 500mM NaHCO3.pH 8，4(每次都要精确校对pH值)稀释螺旋体种的特异性寡核苷酸到已经确定的最佳浓度。
(2)将Biodyne C膜剪成14.5cmX14.5cm大小，用记号笔标记薄膜以便能在以后的操作中辨别方向。用去离子水配制新鲜的16％(w/v)1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide(EDAC)，加10ml孵育10分钟活化Biodyne C膜，室温下旋转培养瓶。
(3)将薄膜放在塑料容器中用去离子水摇洗两分钟，然后放入洁净的印迹仪中。旋紧手柄。
(4)通过抽吸除去孔里残留的液体。将150ul稀释的寡核苷酸溶液加入印迹仪的孔槽，第一个和最后一个孔不加寡核苷酸。
(5)将墨水用2xSSPE缓冲液按1∶100的比例稀释，加入第一个孔和最后一个孔。
(6)所有的样品都加入以后，室温下孵育2分钟。
(7)通过抽吸除去每个孔槽内的寡核苷酸溶液及第一和最后一个孔槽的墨水稀释液。
(8)用镊子从印迹仪中除去膜，然后用250ml新鲜配制的100mM NaOH(最大量)在塑料容器中孵育10分钟，不断摇动容器使膜钝化。
(9)用去离子水漂洗薄膜。
(10)在塑料容器中用250ml 2x SSPE/0.1％SDS 60℃漂洗5分钟，漂洗期间轻微摇动溶液瓶。
(11)用100ml 20mM EDTA pH 8，0在塑料容器中漂洗薄膜，室温下轻轻摇动15分钟。
(12)4℃保存薄膜直到使用(用塑料制品密封或者用包装膜包装避免薄膜脱水)。
三、检测实例
(一)伯氏疏螺旋体的分离
采集的活蜱鉴定蜱种后，未吸血的活蜱20只一组，吸血活蜱6～10只一组，先用75％酒精浸泡20min后，用无菌滤纸吸干，再用生理盐水，漂洗3次，用无菌滤纸吸干蜱体表水份后，置于含有BSK II培养基的无菌研磨器中研磨。研磨碎后，置于离心管中，1000rpm离心10min，吸取上清液约0.1～0.2ml接种于1.5ml培养基中，于33℃培养箱中培养，待菌液变色后用暗视野显微镜观察。伯氏疏螺旋体的培养和传代将通过分离获得的莱姆病菌株培养液取1ml分别接种于1ml BSK II培养基培养基进行传代。
(二)菌体的分离与提纯：
(1)取细菌培养液1-5ml，10,000rpm离心1分钟，尽量吸净上清。
(2)向菌液沉淀中加入200ul缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。
(3)向管中加入20ul蛋白酶K溶液，混匀。
(4)加入220ul缓冲液GB，振荡15秒，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(5)加220ul无水乙醇，充分振荡混匀10秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(7)向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(8)向吸附柱CB3中加入700ul漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。
(9)向吸附柱CB3中加500μl漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(10)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3开盖置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(三)PCR扩增
本发明的PCR扩增，采用前述的引物，以所得到的DNA为模板，其具体的做法如下：
基因片段PCR扩增的反应体系及程序：
H2O 56.0μl
10x buffer* 7.2μl
10mM dNTP 1.6μl
100uM上游引物(RLB F) 3.6μl
100uM下游引物(RLB R) 3.6μl
Genomic DNA 1ul
Taq酶 0.36μl
*(200mM Tris-HCl(pH 8.55)，160mM(NH4)2SO4和20mM MgCl2)所有的样品混合后12000rpm离心10秒，置于PCR扩增仪中按照如下循环进行扩增：
94℃ 3min
4℃ 保存
取PCR产物1.5ul在1.0％的琼脂糖凝胶(含0.5％ug/ml溴化乙锭)，在75伏的电压下进行电泳分析，观察扩增结果。
(四)检测蜱体内伯氏螺旋体RLB方法的建立：
将生物素标记的PCR产物和固定在Biodyne C膜上的伯氏螺旋体的寡核苷酸进行杂交。如果存在螺旋体，则和寡核苷酸特异性作用后用streptavidin-peroxidase和ECL-detection(增强化学发光)孵育后在黑色的方格里面的胶片上可以看到显影，操作步骤如下：
(1)准备下面的缓冲液，用无离子水稀释，所有的缓冲液使用前要预热。(按一张膜的量)：
250ml 2xSSPE/0.1％SDS，60℃，
500ml 2xSSPE/0.5％SDS，60℃，
500ml 2xSSPE/0.5％SDS，42℃.
500ml 2xSSPE，室温.
(2)加20μl的PCR产物到130μl 2xSSPE/0.1％SDS中。
(3)稀释后的PCR产物99℃热激10分钟然后立即在冰中冷却。
(4)用250ml2xSSPE/0.1％SDS 60℃漂洗膜5分钟。
(5)在印迹仪中按照与寡核苷酸成垂直的方向放入薄膜和支持气垫。
(6)通过抽吸的方法除去印迹仪中残留的液体。
(7)用稀释后的PCR产物填充孔槽，在水平面上60℃杂交10分钟。
(8)通过抽吸除掉印迹仪中的样品，然后用镊子将膜取出。
(9)用250ml 2xSSPE/0.5％SDS 60℃，10分钟，漂洗膜两次。
(10)放置膜在旋转瓶中使其冷却，以免下一步因过氧化物酶作用而失活。
(11)加入2.5ul链霉菌抗生物素蛋白一过氧化物酶(500U/ml)结合到10ml2xSSPE/0.5％SDS中，将此溶液加入旋转瓶中42℃孵化薄膜45-60分钟。
(12)用250ml的2xSSPE/0.5％SDS溶液42℃10分钟漂洗两次。
(13)用250ml的2xSSPE在室温下5分钟漂洗膜两次。
(14)加1ml免疫印迹发光氨试剂A于一个5ml试管中，随后加入1ml的试剂B，混合均匀。
(15)将薄膜放置在塑料布或者包装膜内，滴加A、B混合液在膜上含有寡核苷酸和PCR产物杂交的区域，用塑料层覆盖膜，塑料薄膜封闭器封闭薄膜。
(16)放置封闭好的薄膜于曝光储片夹内，放一张X光胶片在薄膜上(在胶片的左侧角打折为了以后辨认方向)，曝光30分钟。
(17)取出X光胶片放入显影液中显影5分钟，然后用无离子水漂洗2分钟，随后转入定影液中定影5分钟，再用无离子水漂洗，充分洗去定影液后观察结果。
(18)如果胶片上的信号太弱或太强，可延长或缩短曝光时间将薄膜直接曝光于另一张胶片。杂交过的PCR产物可以从膜上除去。一张膜可以重复利用大约15次。
需说明的在实际的试剂盒中也可将以上所使用的试剂、酶、缓冲液，以及显影、定影剂等均放入试剂盒内，这样可以使检测更为方便、快捷。
(五)结果判定：
1、特异性检测结果
通过PCR扩增现有所有菌株的5S-23S rRNA基因变异区域，产生的DNA片段和固定在薄膜上的寡核苷酸探针进行核酸杂交，寡核苷酸探针经光学发光作用，在胶片上产生一定强度的信号，检测结果见附图1。图1中：Sl为伯氏疏螺旋体通用探针；Ga为Borrelia.garinii特异性探针；Ss为Borrelia.burgdorferisensus strict特异性探针；Af为Borrelia.afzelii特异性探针；Vs为Borrlia.valaisian特异性探针；；PKo为Borrelia.afzelii的代表菌株，PKa为Borrelia.burgdorferi sensus strict的代表菌株，PBi、T25、PBr、20047、IP90、TN为Borrelia.garinii的代表菌株，VS116为Borrlia.valaisian的代表菌株。支为支原体基因组；衣为衣原体基因组；牛为健康牛基因组；羊为健康羊基因组；水为空白水对照。由图1可见，所有的探针仅与它们各自的靶序列进行结合，不同的种之间没有交叉反应，很清楚的与相应的菌种产生杂交信号。每个菌种可以分别被四个核苷酸探针识别：①B.buredorferi sensu stricto，②B.garinii，③B.afzelii，④B.valaisiana四个特异性寡核苷酸探针，即：SS，BG，BA和BV，所有的菌株都可被通用探针SL识别。
2、野外试样的检测结果见表2
研究表明，根据已报道的螺旋体5S-23S rRNA基因序列设计伯氏螺旋体的通用性引物对和伯氏螺旋体通用探针和种特异性寡核苷酸探针固定于BiodyneC薄膜上，将PCR方法和RLB方法相结合建立了一种特异，敏感的诊断方法，可以识别相应的螺旋体种。通过对13个地区的野外样品用RLB检测后得出：13个地区样品的RLB检测阳性样品数量及检测率分别为：9(36％)、8(57％)、8(17％)、73(77％)、5(100％)、41(98％)、10(21％)、2(50％)、8(42％)、7(88％)、5(100％)、9(82％)、44(90％)，参见表2。而总的阳性样品数量是231，阳性率是62％，被检样品多数为混合感染四种伯氏疏螺旋体的两种或以上，少数仅仅感染一种病原，不论是华南地区还是黑龙江地区Borrelia.afzelii的感染率都很高，说明Borrelia.afzelii在我国的华南地区和东北地区是优势种。Borrlia.valaisian的感染率在华南地区很低，但在东北部分地区有发现。
由以上内容可知，本发明可以检测出螺旋体的种类和混合感染的情况，为莱姆病的检测、菌种鉴定和流行病学调查提供了有利的工具。
表2.部分野外样品检测结果：
Claims (3)
1、检测蜱体内莱姆病病原的试剂盒，其特征在于试剂盒内至少有：其上共价结合有莱母病病原螺旋体通用探针和狭义螺旋体B.buredorferi sensu stricto、嘎氏螺旋体B.garinii，、伽氏螺旋体B.afzelii和B.valaisiana螺旋体特异寡核苷酸探针的Biodyne C膜，以及在螺旋体5S-23SrRNA基因序列两端的保守区域设计的一对可扩增出的片段大小为225bp的引物，且其中的一条引物用生物素标记。
2、根据权利要求1所述的检测蜱体内莱姆病病原的试剂盒，其特征是莱母病病原螺旋体通用探针的序列为ctttgaccatatttttatcttcca；B.buredorferi sensu stricto特异性寡核苷酸探针为aacaccaatatttaaaaaacataa；B.garinii特异性寡核苷酸探针为aacatgaacatctaaaaacataaa；B.afzelii特异性寡核苷酸探针为aacatttaaaaaataaattcaagg；B.valaisiana 特异性寡核苷酸探针为cattaaaaaaatataaaaaataaatttaagg；一对引物的序列各为：
上游引物：23SN2(5′-accatagactcttattactttgacca-3′)，
下游引物：5SCB(5′-biotin-gagagtaggttattgccaggg-3)。
3、权利要求1或2所述的试剂盒的使用方法，其特征是将捕捉的待检蜱用75％酒精浸泡20min，再用生理盐水漂洗，将其置于含有BSK II培养基的无菌研磨器中研磨碎后再进行菌体分离与·提纯，得到DNA，以所得到的DNA为模板，以试剂盒内的引物进行PCR，扩增产物和固定在Biodyne C膜上的伯氏螺旋体的寡核苷酸进行杂交，再将Biodyne C膜放置在塑料布或者包装膜内，滴加A、B混合液在膜上含有寡核苷酸和PCR产物杂交的区域，用塑料层覆盖膜，塑料薄膜封闭器封闭薄膜，将封闭好的薄膜于曝光储片夹曝光处理，取出胶片进行显影定影处理后观察结果。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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