CN104726565A - 一种快速检测表皮葡萄球菌的方法 - Google Patents

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刘有福
贾雄飞
宋玉竹
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Abstract

本发明公开了一种快速检测表皮葡萄球菌的方法，通过生物信息学手段获取用于鉴定表皮葡萄球菌的基因，并针对该基因，设计上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ ID NO：2所示，进行PCR扩增，扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳，获得检测结果，所述的鉴定表皮葡萄球菌的基因序列如SEQ ID NO：3所示。本发明方法针对特异基因设计特异引物，该引物可以快速、简便、准确的检测表皮葡萄球菌。

Description

一种快速检测表皮葡萄球菌的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种快速检测表皮葡萄球菌的方法，具体为一种表皮葡萄球菌的特异基因的发现及其应用于表皮葡萄球菌检测技术方法的建立。
背景技术
表皮葡萄球菌是存在于皮肤表面的条件致病菌，其引起败血症，慢性前列腺炎的趋势以日俱增。表皮葡萄球菌的耐药现象非常严重，临床上治疗表皮葡萄球菌所致疾病较为棘手。因此，快速检测出表皮葡萄球菌就显得尤为重要。
目前临床应用的表皮葡萄球菌的检测方法有常规涂片镜检法、培养法、免疫学测定、仪器自动分析鉴定系统等，但是这些方法都存在一定的缺陷，如常规涂片镜检是最基本的细菌学检查方法，但是敏感性低，特异性差；培养法是目前临床上发现传染源的主要途径和手段，但其非常耗时，不能实现快速的目的；免疫学测定方法对培养基的含盐量有很高的要求，若含盐量比较高，那么蛋白的合成会受到抑制，而出现假阴性；近年来，仪器自动化分析鉴定系统不断面市，但这些鉴定系统大多数应用面较窄，费用昂贵。
本发明利用生物信息学寻找出表皮葡萄球菌特异基因，并针对其设计引物，建立了表皮葡萄球菌的检测方法，实现了简便、快速、准确的检测出表皮葡萄球菌的目的。
发明内容
本发明针对现有技术对表皮葡萄球菌检测技术的缺陷，目的在于提供一种高特异高敏感检测的快速检测表皮葡萄球菌的方法，通过物信息学手段获取可用于鉴定表皮葡萄球菌的基因，并设计可以特异性检测表皮葡萄球菌的引物，利用聚合酶链式反应鉴定表皮葡萄球菌的方法。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种快速检测表皮葡萄球菌的方法，通过生物信息学手段获取用于鉴定表皮葡萄球菌的基因，并针对该基因，设计上游引物如SEQ IDNO：1所示，下游引物如SEQ ID NO：2所示，进行PCR扩增，扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳，获得检测结果。
本发明所述的鉴定表皮葡萄球菌的基因为DeoR familytranscriptional regulator，该基因Genbank登陆号为3240916，为表皮葡萄球菌特有，基因序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明所述的PCR反应体系为：25μL，Taq 0.125μL，10×聚合酶缓冲液2.5μL，dNTP 2μL，Mg2+1.6μL，模板1μL，上下游引物各1μL，加ddH2O补足25μL。
本发明所述的PCR反应程序为：1)预变性：95℃5min；2)30个循环：95℃30s，59℃30s，72℃20s；3)后扩增：72℃1min。
本发明快速检测表皮葡萄球菌的方法在Mg2+为1.6mM，退火温度为59℃条件下进行。
所述引物组合物与鉴定表皮葡萄球菌的基因的246位至705位的核苷酸序列或其互补链互补。
本发明还提供了一种用于应用聚合酶链式反应鉴定表皮葡萄球菌的引物组合物，所述的引物组合物为：上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ ID NO：2所示。
本发明还提供了基因DeoR family transcriptional regulator(Genbank登陆号为3240916)用于鉴定表皮葡萄球菌的用途。
本发明的有益效果为通过本地Blast比对和分析，获得表皮葡萄球菌的特异基因，针对特异基因设计特异引物，该引物可以快速、简便、准确的检测表皮葡萄球菌。
附图说明
图1是不同退火温度和Mg2+浓度下检测表皮葡萄球菌电泳图；A为退火温度49℃；B为退火温度51℃；C为退火温度53℃；D为退火温度55℃；E为退火温度57℃；F为退火温度59℃；M为2000bpmarker，1～5依次为0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mM；
图2是Mg2+为1.6mM、退火温度为59℃的条件下检测表皮葡萄球菌电泳图；M为2000bp marker，1至3为三株表皮葡萄球菌，4为肺炎克雷伯菌，5为弗劳地氏枸橼酸杆菌，6为伤寒杆菌，7为琼氏不动杆菌，8为大肠杆菌，9为粪肠球菌，10为溶血葡萄球菌，11为金黄色葡萄球菌，12为摩氏摩根菌；
图3是检测不同表皮葡萄球菌浓度的电泳图；M为2000bp marker，0至9分别为为100个/μL至109个/μL，C为阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1
一种快速检测表皮葡萄球菌的方法，具体通过以下步骤完成：
一、特异性靶基因筛选及引物设计
从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)中下载的表皮葡萄球菌全基因组序列，对本地的核酸数据库进行本地BLAST检索，获取得到表皮葡萄球菌各序列片段与数据库比对结果。
使用在线BLAST功能，使用2种策略确认其菌种特异性和表皮葡萄球菌鉴定可用性。一种策略为BLAST时排除表皮葡萄球菌，结果显示无任何相似序列者为表皮葡萄球菌特异基因；第二种策略为BLAST时选择在表皮葡萄球菌内进行检索，结果返回大量相似序列者是不同表皮葡萄球菌菌株共有序列。结合两种策略，最终得出DeoRfamily transcriptional regulator符合两种策略标准，基因Genbank登陆号为3240916，基因序列如SEQ ID NO：3所示。
针对表皮葡萄球菌DeoR family transcriptional regulator基因，设计特异引物：上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ ID NO：2所示。表皮葡萄球菌特异引物通过在线设计特异性寡核苷酸引物工具Primer-BLAST设计完成。设计步骤和注意事项参照Primer-BLAST使用说明书进行。
二、检测方法的建立
DNA的提取，用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的细菌基因组DNA小量提取试剂盒进行抽提回收，步骤如下：
1)取细菌培养液5mL，12,000rpm离心1分钟，尽量吸净上清。
2)向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL细胞悬浮液，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀，37℃温浴30分钟。每隔10分钟颠倒混匀数次。12,000rpm离心2分钟，尽量吸净上清。
3)向菌体沉淀中加入225μL缓冲液A，振荡至菌体彻底悬浮。
4)向管中加入6μL RNaseA溶液，振荡15秒，室温放置5分钟。
5)向管中加入10μL蛋白酶K溶液，颠倒混匀。
6)加入25μL裂解缓冲液S，颠倒混匀。
7)加入250μL缓冲液B，振荡10秒，70℃放置10分钟。12,000rpm离心1分钟，取上清放入一新管中，弃去沉淀。
8)加入250μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离心以去除管盖内壁的水珠。
9)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。
10)向吸附柱中加入500μL缓冲液C，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。
11)向吸附柱中加入700μL漂洗液W2，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。
12)向吸附柱中加入500μL漂洗液W2，12,000rpm离30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。然后12,000rpm离心2分钟。将吸附柱置于一个新的1.5mL离心管中，室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
13)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
三、PCR条件优化：
1)对退火温度和Mg2+同时进行优化。退火温度为6个梯度，49、51、53、55、57、59℃。Mg2+浓度为5个梯度，0.8、1.6、2.4、3.2和4.0mM。所述通过聚合酶链式反应检测表皮葡萄球菌条件优化扩增体系为25μL。具体反应体系为：TaqDNA聚合酶0.125μL,10×聚合酶缓冲液2.5μL,dNTP 2μL，Mg2+分别为0.8、1.6、2.4、3.2和4.0mM，模板1μL，上下游引物各1μL，加ddH2O补足25μL。
2)在PCR仪中按以下程序扩增：
预变性：
95℃                       5分钟
30个循环：
95℃                       30秒钟
49、51、53、55、57、59℃  30秒钟
72℃                     20秒钟
后扩增：
72℃                     1分钟
最终确立Mg2+为1.6mM，退火温度为59℃条件为检测的最优化条件。结果如图1所示。
四、特异性检测
收集表皮葡萄球菌临床分离株3株，非表皮葡萄球菌9株。将这些菌株用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的细菌基因组DNA小量提取试剂盒提取基因组，步骤如下：
1)取细菌培养液5mL，12,000rpm离心1分钟，尽量吸净上清。
2)向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL细胞悬浮液，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀，37℃温浴30分钟。每隔10分钟颠倒混匀数次。12,000rpm离心2分钟，尽量吸净上清。
3)向菌体沉淀中加入225μL缓冲液A，振荡至菌体彻底悬浮。
4)向管中加入6μL RNaseA溶液，振荡15秒，室温放置5分钟。
5)向管中加入10μL蛋白酶K溶液，颠倒混匀。
6)加入25μL裂解缓冲液S，颠倒混匀。
7)加入250μL缓冲液B，振荡10秒，70℃放置10分钟。12,000rpm离心1分钟，取上清放入一新管中，弃去沉淀。
8)加入250μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离心以去除管盖内壁的水珠。
9)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。
10)向吸附柱中加入500μL缓冲液C，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。
11)向吸附柱中加入700μL漂洗液W2，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。
12)向吸附柱中加入500μL漂洗液W2，12,000rpm离30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。然后12,000rpm离心2分钟。将吸附柱置于一个新的1.5mL离心管中，室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
13)将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
PCR反应体系：把每个菌株的基因组分别用作模板进行聚合酶链式反应。反应体系为25μL，Taq 0.125μL,10×聚合酶缓冲液2.5μL,dNTP 2μL，Mg2+1.6μL，模板1μL，上下游引物各1μL，加ddH2O补足25μL。
在PCR仪中按以下程序扩增：1)预变性：95℃5min；2)30个循环：95℃30s，59℃30s；72℃20s；(3)后扩增：72℃1min。
在Mg2+为1.6mM，退火温度为59℃的条件下，该检测方法可以特异性的检测出表皮葡萄球菌，而不受其他菌种影响，如图2所示。
实施例2灵敏度检测
一、阳性质粒载体构建
1)以表皮葡萄球菌基因组为模板，用上述特异引物进行PCR扩增，反应体系为100μL，Taq 0.5μL,10×聚合酶缓冲液10μL,dNTP 8μL，Mg2+6.4μL，模板4μL，上下游引物各4μL，加ddH2O补足100μL。
2)在PCR仪中按以下程序扩增：
预变性：
95℃            5分钟
30个循环：
95℃            30秒钟
59℃            30秒钟
72℃            20秒钟
后扩增：
72℃            1分钟
3)循环结束后，将PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳，并用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行抽提回收，步骤如下：
①将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中，称取重量。
②向胶块中加入2倍体积溶胶液，55℃水浴10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
③将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
④向吸附柱中加入700μL漂洗液W2，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
⑤向吸附柱中加入50μL漂洗液W2，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
⑥将吸附柱放入收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。
⑦将吸附柱放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μL的洗脱缓冲液TE，室温放置2分钟。12,000rpm离心2分钟，收集DNA溶液。
4)大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：
①挑取单个DH5α菌落，接种于3mL不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50mLLB培养基中，37℃振荡2小时。当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。
②将细菌转移到一个50mL预冷的无菌聚丙烯管中，冰上放置10分钟，使培养物冷却。
③于4℃下4100rpm离心10分钟，吸出培养液，并将管倒置l分钟以使残留的培养基流尽。
④每50mL初始培养液且30mL预冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶(80mmol/L MgCl2,20mmol/L CaCl2)重悬细胞沉淀。
⑤于4℃下4100rpm离心10分钟，吸出上清液，并将管倒置l分钟以使残留的液体流尽。
⑥每50mL初始培养物用2mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬细胞沉淀，分装后备用。
5)连接及连接产物的转化：
①在微量离心管中加入1μL Takara pMD19-T simple载体、4μLDeoR family transcriptional regulator基因PCR产物及5μL的连接酶缓冲混合物。
②16℃反应3小时。
③全量(10μL)加入至100μl DH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。
④42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。
⑤加入37℃温浴过的LB培养基890μL，37℃缓慢振荡培养60分钟。
⑥取200μL涂布于含有氨苄青霉素的LB培养基上，37℃培养16h以形成单菌落。
6)DeoR family transcriptional regulator基因pcr产物筛选及鉴定
挑取上述单菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃缓慢振荡培养4h，进行PCR扩增。扩增引物及扩增条件同前述最优反应条件。将经PCR确证的阳性克隆进行质粒提取后，以美国AppliedBiosystems3730A全自动核苷酸序列测定仪进行核苷酸序列的测定。测序引物为BcaBESTTMSequencingPrimer ML3-47，如SEQ ID NO：4所示，目的片段测序结果自5’端至3’端序列如SEQ ID NO：5所示。
7)阳性质粒提取：
①取5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12,000rpm离心1分钟，尽量吸除上清。
②向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
③向离心管中加入250μL溶液2，温和地上下翻转6－8次使菌体充分裂解。
④向离心管中加入350μL溶液3，立即温和地上下翻转6–8次，充分混匀，即出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀。将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱中，12,000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
⑤向吸附柱中加入700μL漂洗液W2，12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
⑥向吸附柱中加入500μL漂洗液W2，12,000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
⑦将吸附柱放入收集管中，12,000rpm离心2分钟，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
⑧将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加60μL洗脱
缓冲液TE，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟将质粒溶液收集到离心管中。
二、表皮葡萄球菌灵敏度
1)质粒数目换算
用紫外分光光度计测得质粒浓度为：188ng/μL。
质粒数目换算公式：(注：X为质粒浓度；Y为质粒碱基对数；NA为阿伏伽德罗常数；2692为载体碱基对数；660为碱基平均分子量)得到DeoR family transcriptional regulator的浓度为9.04×109个/μL。
2)取1μL DeoR family transcriptional regulator阳性质粒稀释到1.0×109个/μL，取2μL稀释好的阳性质粒进行10倍梯度稀释，稀释成1.0×108至1.0×1009个梯度。分别取每个梯度稀释液2μL为模板。反应体系为25μL，Taq 0.125μL,10×聚合酶缓冲液2.5μL,dNTP 2μL，Mg2+1.6μL，模板2μL，上下游引物各1μL，加ddH2O补足25μL。
3)在PCR仪中按以下程序扩增：
预变性：
95℃             5分钟
30个循环：
95℃             30秒钟
59℃             30秒钟
72℃             20秒钟
后扩增：
72℃             1分钟
在Mg2+为1.6mM，退火温度为59℃的条件下，该检测方法可以检测到表皮葡萄球菌的最低浓度为1个/μL，如图3所示。

Claims (8)

1.一种快速检测表皮葡萄球菌的方法，其特征在于：通过生物信息学手段获取用于鉴定表皮葡萄球菌的基因，并针对该基因，设计上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ ID NO：2所示，进行PCR扩增，扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳，获得检测结果。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测表皮葡萄球菌的方法，其特征在于：所述的鉴定表皮葡萄球菌的基因序列如SEQ ID NO：3所示。
3.根据权利要求1所述的一种快速检测表皮葡萄球菌的方法，其特征在于：所述的PCR反应体系为：25μL，Taq 0.125μL，10×聚合酶缓冲液2.5μL，dNTP 2μL，Mg2+1.6μL，模板1μL，上下游引物各1μL，加ddH2O补足25μL。
4.根据权利要求1所述的一种快速检测表皮葡萄球菌的方法，其特征在于：所述的PCR反应程序为：1)预变性：95℃5min；2)30个循环：95℃30s，59℃30s，72℃20s；3)后扩增：72℃1min。
5.根据权利要求1所述的一种快速检测表皮葡萄球菌的方法，其特征在于：在Mg2+为1.6mM，退火温度为59℃条件下进行。
6.一种聚合酶链式反应鉴定表皮葡萄球菌的引物组合物，其特征在于：所述的引物组合物为：上游引物如SEQ ID NO：1所示，下游引物如SEQ ID NO：2所示。
7.权利要求1或2所述的鉴定表皮葡萄球菌的基因用于鉴定表皮葡萄球菌的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的鉴定表皮葡萄球菌的基因序列如SEQ ID NO：3所示。
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