CN114292903B - Lamp多维度可视化检测显色指示剂及rna/dna检测预混液 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了LAMP多维度可视化检测显色指示剂，其特征在于：包括酚红、铬黑T和Eva Green。还公开了LAMP多维度可视化RNA/DNA检测预混液。本发明采用酚红作为PH指示剂，采用铬黑T作为金属离子指示剂，采用Eva Green作为荧光指示剂，酚红、铬黑T和Eva Green在一定的浓度范围内相互配合，可以实现检出低拷贝数、降低假阳性率以及可完美解决在面对由于引物设计或模板浓度过低导致的弱阳性在进行拍照存留或目视分辨时出现的难以分辨的问题。本发明的显色指示剂具有分辨度高、灵敏度高、假阳性率低、多维度验证的特点，仅通过肉眼或365nm激发即可对样本阳性、阴性进行判读的效果。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种LAMP多维度可视化检测显色指示剂及RNA/DNA检测预混液。
背景技术
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，是一种核酸扩增技术。能够通过电泳、DNA嵌入荧光基团、焦磷酸镁的浊度和焦磷酸盐的转化等检测方法。然而这些方法均需要专业检测设备、长时间等待和存在开盖气溶胶污染的缺点。采用PH指示剂或镁离子螯合剂作为指示剂的检测方法在近年快速发展，相较于电泳、DNA嵌入荧光基团、焦磷酸镁的浊度和焦磷酸盐的转化等检测方法具有快速判断、低污染率等优点，在现场诊断中有较大优势，但由于弱阳性与阴性差别极其细微，导致无法对其结果快速的判读，降低了现场诊断的速度和准确性。
现场诊断需要快速、简单、准确的测试，在判读结果时应具有相互验证功能，同时无需复杂昂贵的专业设备。
发明内容
本发明提供了一种LAMP多维度可视化检测显色指示剂。
本发明采用的技术方案为：
一种LAMP多维度可视化检测显色指示剂，其特征在于：包括酚红、铬黑T和EvaGreen，其中酚红的浓度为0.1mM～1mM，铬黑T的浓度为10μM～1mM，Eva Green的浓度为0.1×～1×。0.1×～1×是指使用20X Eva Green原液进行稀释，稀释至0.1×～1×。本发明采用酚红作为PH指示剂，采用铬黑T作为金属离子指示剂，采用Eva Green作为荧光指示剂，酚红、铬黑T和Eva Green在一定的浓度范围内相互配合，可以实现检出低拷贝数、降低假阳性率以及可完美解决在面对由于引物设计或模板浓度过低导致的弱阳性在进行拍照存留或目视分辨时出现的难以分辨的问题，同时解决了由荧光指示剂带来的荧光本底过高需要借助中、大型仪器进行判读的问题。
优选的，酚红的浓度为0.2mM～0.5mM,铬黑T的浓度为50μM～500μM，Eva Green的浓度为0.3×～0.7×。
优选的，酚红的浓度为0.35mM,铬黑T的浓度为200μM，Eva Green的浓度为0.3×。
本发明还公开了一种LAMP多维度可视化RNA检测预混液，包括Tris-HCl、甜菜碱、dNTP、硫酸镁、氯化钠、硫酸铵、氢氧化钾、吐温-20、逆转录酶、Bst DNA聚合酶、FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物、LF引物、LB引物，还包括上述的LAMP多维度可视化检测显色指示剂。
优选的，所述Tris-HCl的浓度为1mM～30mM；
所述甜菜碱的浓度为0.25M～1M；
所述dNTP的浓度为1mM～1.8mM；
所述硫酸镁溶液的浓度为3.75mM～7.5mM；
所述氯化钠溶液的浓度为10mM～100mM；
所述硫酸铵溶液的浓度为5mM～15mM；
所述氢氧化钾的浓度为1mM～10mM；
所述吐温-20的浓度为0.01％～1％；
所述逆转录酶的浓度为0.5U/μL～1U/μL；
所述Bst DNA聚合酶的浓度为0.4U/μL～1.2U/μL；
所述FIP引物的浓度为0.8mM～3.2mM；
所述BIP引物的浓度为0.8mM～3.2mM；
所述F3引物的浓度为0.1mM～0.4mM；
所述B3引物的浓度为0.1mM～0.4mM；
所述LF引物的浓度为0.2mM～0.8mM；
所述LB引物的浓度为0.2mM～0.8mM。
优选的，所述Tris-HCl的浓度为15mM；
所述甜菜碱的浓度为0.8M；
所述dNTP的浓度为1.4mM；
所述硫酸镁溶液的浓度为6.25mM；
所述氯化钠溶液的浓度为50mM；
所述硫酸铵溶液的浓度为10mM；
所述氢氧化钾的浓度为4mM；
所述吐温-20的浓度为0.1％；
所述逆转录酶的浓度为0.75U/μL；
所述Bst DNA聚合酶的浓度为0.8U/μL；
所述FIP引物的浓度为1.6mM；
所述BIP引物的浓度为1.6mM；
所述F3引物的浓度为0.2mM；
所述B3引物的浓度为0.2mM；
所述LF引物的浓度为0.4mM；
所述LB引物的浓度为0.4mM。
本发明还公开了一种LAMP多维度可视化DNA检测预混液，包括Tris-HCl、甜菜碱、dNTP、硫酸镁、氯化钠、硫酸铵、氢氧化钾、吐温-20、Bst DNA聚合酶、FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物、LF引物、LB引物，还包括上述的LAMP多维度可视化检测显色指示剂。
优选的，所述Tris-HCl的浓度为1mM～30mM；
所述甜菜碱的浓度为0.25M～1M；
所述dNTP的浓度为1mM～1.8mM；
所述硫酸镁溶液的浓度为3.75mM～7.5mM；
所述氯化钠溶液的浓度为10mM～100mM；
所述硫酸铵溶液的浓度为5mM～15mM；
所述氢氧化钾的浓度为1mM～10mM；
所述吐温-20的浓度为0.01％～1％；
所述Bst DNA聚合酶的浓度为0.4U/μL～1.2U/μL；
所述FIP引物的浓度为0.8mM～3.2mM；
所述BIP引物的浓度为0.8mM～3.2mM；
所述F3引物的浓度为0.1mM～0.4mM；
所述B3引物的浓度为0.1mM～0.4mM；
所述LF引物的浓度为0.2mM～0.8mM；
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优选的，所述Tris-HCl的浓度为15mM；
所述甜菜碱的浓度为0.8M；
所述dNTP的浓度为1.4mM；
所述硫酸镁溶液的浓度为6.25mM；
所述氯化钠溶液的浓度为50mM；
所述硫酸铵溶液的浓度为10mM；
所述氢氧化钾的浓度为4mM；
所述吐温-20的浓度为0.1％；
所述Bst DNA聚合酶的浓度为0.8U/μL；
所述FIP引物的浓度为1.6mM；
所述BIP引物的浓度为1.6mM；
所述F3引物的浓度为0.2mM；
所述B3引物的浓度为0.2mM；
所述LF引物的浓度为0.4mM；
所述LB引物的浓度为0.4mM。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
(1)本发明采用酚红作为PH指示剂，采用铬黑T作为金属离子指示剂，采用EvaGreen作为荧光指示剂，酚红、铬黑T和Eva Green在一定的浓度范围内相互配合，可以实现检出低拷贝数、降低假阳性率以及可完美解决在面对由于引物设计或模板浓度过低导致的弱阳性在进行拍照存留或目视分辨时出现的难以分辨的问题。本发明的显色指示剂可同时使用直接目视法和激发光目视法，解决了不同染料之间的缺点具有分辨度高、灵敏度高、假阳性率低、多维度验证的特点，实现了无需大型观测设备仅通过肉眼或365nm激发即可对样本阳性、阴性进行判读的效果，判读结果准确率高；并且在365nm激发光下无荧光本底干扰，可在365nm或蓝光灯下进行直接目视判读。对于PH指示剂在受到氧化后所带来的颜色变化以及荧光指示剂本底过高等缺点可以有效克服。
(2)本发明采用一管式预混液，无需额外添加酶，具有操作简便、控制污染的特点，实现了极短的操作时间、极低的气溶胶污染。
附图说明
图1实施例5在自然光下反应结果照片：泳道1、2、3、4、5、6为向LAMP扩增反应液中加入COVID-19-pseudovirus(YEASEN,11900ES10)，浓度依次为60copies、50copies、40copies、20copies、10copies、5copies；其中NTC管为：向LAMP扩增反应液中加入去核酸酶水。
图2实施例5在365nm激发光下反应结果照片：泳道1、2、3、4、5、6为向LAMP扩增反应液中加入COVID-19-pseudovirus(YEASEN,11900ES10)，浓度依次为60copies、50copies、40copies、20copies、10copies、5copies；其中NTC管为：向LAMP扩增反应液中加入去核酸酶水。
图3实施例6在自然光下反应结果照片：泳道1、2、3、4、5、6为向LAMP扩增反应液中加入人RNA，浓度依次为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg；其中NTC管为：向LAMP扩增反应液中加入去核酸酶水。
图4实施例6在365nm激发光下反应结果照片：泳道1、2、3、4、5、6为向LAMP扩增反应液中加入人RNA，浓度依次为10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg；其中NTC管为：向LAMP扩增反应液中加入去核酸酶水。
图5实施例7在自然光下反应结果照片：泳道1、2、3、4、5、6为向LAMP扩增反应液中加入Mycoplasma-DNA质粒模板，浓度依次为1×105copies、1×104copies、1×103copies、1×102copies、1×101copies、1×100copies；其中NTC管为：向LAMP扩增反应液中加入去核酸酶水。
图6实施例7在365nm激发光下反应结果照片：泳道1、2、3、4、5、6为向LAMP扩增反应液中加入Mycoplasma-DNA质粒模板，浓度依次为1×105copies、1×104copies、1×103copies、1×102copies、1×101copies、1×100copies；其中NTC管为：向LAMP扩增反应液中加入去核酸酶水。
图7实施例8在自然光下反应结果照片：泳道1、2、3、4、5、6为向LAMP扩增反应液中加入HBV-DNA质粒模板，浓度依次为1×105copies、1×104copies、1×103copies、1×102copies、1×101copies、1×100copies；其中NTC管为：向LAMP扩增反应液中加入去核酸酶水。
图8实施例8在365nm激发光下反应结果照片：泳道1、2、3、4、5、6为向LAMP扩增反应液中加入HBV-DNA质粒模板，浓度依次为1×105copies、1×104copies、1×103copies、1×102copies、1×101copies、1×100copies；其中NTC管为：向LAMP扩增反应液中加入去核酸酶水。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例对本发明作进一步地说明。支原体(Mycoplasma)与HBV是常见的DNA细菌、病毒,；新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease,COVID-19)是2020年起最常见的RNA病毒、ACTIN是实验室常用的内参，故分别以检测支原体、HBV作为DNA；COVID-19、ACTIN作为RNA检测为例。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例1COVID-19特征核酸序列的选择及对应的LAMP引物的设计与合成
根据COVID-19的Gene E Primer Set(NEB，SARS-CoC-2 LAMP Primer Sequencse)序列使用6条对应的LAMP引物(N2-F3、N2-B3、N2-FIP、N2-BIP、N2-LF、N2-LB)；所有的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司代为合成。引物序列如表1所示。
实施例2Mycoplasma特征核酸序列的选择及对应的LAMP引物的设计与合成
根据Mycoplasma的特征核酸序列使用6条对应的LAMP引物(M-F3、M-B3、M-FIP、M-BIP、M-LF、M-LB)；所有的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司代为合成。引物序列如表2所示。
实施例3HBV特征核酸序列的选择及对应的LAMP引物的设计与合成
根据HBV的特征核酸序列使用6条对应的LAMP引物(HBV-F3、HBV-B3、HBV-FIP、HBV-BIP、HBV-LF、HBV-LB)；所有的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司代为合成。引物序列如表3所示。
实施例4ACTIN特征核酸序列的选择及对应的LAMP引物的设计与合成
根据HBV的特征核酸序列使用6条对应的LAMP引物(ACT-F3、ACT-B3、ACT-FIP、ACT-BIP、ACT-LF、ACT-LB)；所有的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司代为合成。引物序列如表4所示。
实施例5多维度可视化指示剂、单一铬黑T染料、单一酚红染料、单一Eva Green在以RNA为模板(COVID-19)的LAMP检测中的可视化效果比较
1、多维度可视化指示剂、单一铬黑T染料、单一酚红染料、单一Eva Green预混液配置
多维度可视化指示剂预混液：酚红0.35mM、铬黑T 200μM、Eva Green 0.3×(指20XEva Green原液稀释成0.3×，以下同)、Tris-HCl 15mM、甜菜碱0.8M、dNTP 1.4mM、硫酸镁溶液6.25mM、氯化钠溶液50mM、硫酸铵溶液10mM、氢氧化钾溶液4mM、吐温-20 0.1％、逆转录酶(Yeasen,11112ES92)1U/μL、Bst DNA聚合酶(Yeasen,12908ES97)0.8U/μL、N-FIP引物1.6mM、N-BIP引物1.6mM、N-F3引物0.2mM、N-B3引物0.2mM、N-LF引物0.4mM、N-LB引物0.4mM。
单一铬黑T染料预混液配置：铬黑T 200μM、Tris-HCl 15mM、甜菜碱0.8M、dNTP1.4mM、硫酸镁溶液6.25mM、氯化钠溶液50mM、硫酸铵溶液10mM、氢氧化钾溶液4mM、吐温-200.1％、逆转录酶(Yeasen,11112ES92)1U/μL、Bst DNA聚合酶(Yeasen,12908ES97)0.8U/μL、N-FIP引物1.6mM、N-BIP引物1.6mM、N-F3引物0.2mM、N-B3引物0.2mM、N-LF引物0.4mM、N-LB引物0.4mM。
单一酚红染料预混液配置：酚红0.35mM、Tris-HCl 15mM、甜菜碱0.8M、dNTP1.4mM、硫酸镁溶液6.25mM、氯化钠溶液50mM、硫酸铵溶液10mM、氢氧化钾溶液4mM、吐温-200.1％、逆转录酶(Yeasen,11112ES92)1U/μL、Bst DNA聚合酶(Yeasen,12908ES97)0.8U/μL、N-FIP引物1.6mM、N-BIP引物1.6mM、N-F3引物0.2mM、N-B3引物0.2mM、N-LF引物0.4mM、N-LB引物0.4mM。
单一Eva Green预混液配置：Eva Green 0.3×、Tris-HCl 15mM、甜菜碱0.8M、dNTP1.4mM、硫酸镁溶液6.25mM、氯化钠溶液50mM、硫酸铵溶液10mM、氢氧化钾溶液4mM、吐温-200.1％、逆转录酶(Yeasen,11112ES92)1U/μL、Bst DNA聚合酶(Yeasen,12908ES97)0.8U/μL、N-FIP引物1.6mM、N-BIP引物1.6mM、N-F3引物0.2mM、N-B3引物0.2mM、N-LF引物0.4mM、N-LB引物0.4mM。
2、LAMP反应
将上述含有多维度可视化指示剂、单一铬黑T染料、单一酚红染料、单一Eva Green的预混液分别加入不同浓度的COVID-19-pseudovirus(YEASEN,11900ES10)使其混合成LAMP反应液，反应体积为20L，将反应液置于63℃条件下，反应30min。
3、读取结果
在自然光下，肉眼观察反应液颜色变化。结果如图1～图2所示，含有多维度可视化指示剂在自然光下的阳性反应液呈绿色，阴性呈深红色，在365nm激发光下的阳性具有绿色荧光，阴性无绿色荧光；含有单一铬黑T染料在自然光下的阳性反应呈深蓝色，阴性呈紫色，在365nm激发光下的阳性与阴性均无绿色荧光；含有单一酚红染料在自然光下的阳性反应呈黄色，阴性呈橘黄色，在365nM激发光下的阳性与阴性均无绿色荧光；含有单一Eva Green在自然光下的阳性呈浊状液体，阴性呈透明状液体，在365nm激发光下的阳性具有强烈绿色荧光，阴性有绿色荧光。依据肉眼判断，可清楚看出含有多维度可视化指示剂预混液的阴、阳结果间差异最为明显，最易于可视化的结果判读。
实施例6多维度可视化指示剂、单一铬黑T染料、单一酚红染料、单一Eva Green在以RNA为模板(ACTIN)的LAMP检测中的可视化效果比较
1、多维度可视化指示剂、单一铬黑T染料、单一酚红染料、单一Eva Green预混液配置
多维度可视化指示剂预混液：酚红0.35mM、铬黑T 200μM、Eva Green 0.3×、Tris-HCl15mM、甜菜碱0.8M、dNTP 1.4mM、硫酸镁溶液6.25mM、氯化钠溶液50mM、硫酸铵溶液10mM、氢氧化钾溶液4mM、吐温-20 0.1％、逆转录酶(Yeasen,11112ES92)1U/μL、Bst DNA聚合酶(Yeasen,12908ES97)0.8U/μL、N-FIP引物1.6mM、N-BIP引物1.6mM、N-F3引物0.2mM、N-B3引物0.2mM、N-LF引物0.4mM、N-LB引物0.4mM。
单一铬黑T染料预混液配置：铬黑T 200M、Tris-HCl 15mM、甜菜碱0.8M、dNTP1.4mM、硫酸镁溶液6.25mM、氯化钠溶液50mM、硫酸铵溶液10mM、氢氧化钾溶液4mM、吐温-200.1％、逆转录酶(Yeasen,11112ES92)1U/μL、Bst DNA聚合酶(Yeasen,12908ES97)0.8U/μL、N-FIP引物1.6mM、N-BIP引物1.6mM、N-F3引物0.2mM、N-B3引物0.2mM、N-LF引物0.4mM、N-LB引物0.4mM。
单一酚红染料预混液配置：酚红0.35mM、Tris-HCl 15mM、甜菜碱0.8M、dNTP1.4mM、硫酸镁溶液6.25mM、氯化钠溶液50mM、硫酸铵溶液10mM、氢氧化钾溶液4mM、吐温-200.1％、逆转录酶(Yeasen,11112ES92)1U/μL、Bst DNA聚合酶(Yeasen,12908ES97)0.8U/μL、N-FIP引物1.6mM、N-BIP引物1.6mM、N-F3引物0.2mM、N-B3引物0.2mM、N-LF引物0.4mM、N-LB引物0.4mM。
单一Eva Green预混液配置：Eva Green 0.3×、Tris-HCl 15mM、甜菜碱0.8M、dNTP1.4mM、硫酸镁溶液6.25mM、氯化钠溶液50mM、硫酸铵溶液10mM、氢氧化钾溶液4mM、吐温-200.1％、逆转录酶(Yeasen,11112ES92)1U/μL、Bst DNA聚合酶(Yeasen,12908ES97)0.8U/μL、N-FIP引物1.6mM、N-BIP引物1.6mM、N-F3引物0.2mM、N-B3引物0.2mM、N-LF引物0.4mM、N-LB引物0.4mM。
2、LAMP反应
将上述含有多维度可视化指示剂、单一铬黑T染料、单一酚红染料、单一Eva Green的预混液分别加入不同浓度的Hunman Total RNA使其混合成LAMP反应液，反应体积为20L，将反应液置于63℃条件下，反应30min。
3、读取结果
在自然光下，肉眼观察反应液颜色变化。结果如图3～图4所示，含有多维度可视化指示剂在自然光下的阳性反应液呈绿色，阴性呈深红色，在365nm激发光下的阳性具有绿色荧光，阴性无绿色荧光；含有单一铬黑T染料在自然光下的阳性反应呈深蓝色，阴性呈紫色，在365nm激发光下的阳性与阴性均无绿色荧光；含有单一酚红染料在自然光下的阳性反应呈黄色，阴性呈橘黄色，在365nM激发光下的阳性与阴性均无绿色荧光；含有单一Eva Green在自然光下的阳性呈浊状液体，阴性呈透明状液体，在365nm激发光下的阳性具有强烈绿色荧光，阴性有绿色荧光。依据肉眼判断，可清楚看出含有多维度可视化指示剂预混液的阴、阳结果间差异最为明显，最易于可视化的结果判读。
实施例7多维度可视化指示剂、单一铬黑T染料、单一酚红染料、单一Eva Green在以DNA(Mycoplasma)为模板的LAMP检测中的可视化效果比较
1、多维度可视化指示剂、单一铬黑T染料、单一酚红染料、单一Eva Green预混液配置
多维度可视化指示剂预混液：酚红0.35mM、铬黑T 200μM、Eva Green 0.3×、Tris-HCl15mM、甜菜碱0.8M、dNTP 1.4mM、硫酸镁溶液6.25mM、氯化钠溶液50mM、硫酸铵溶液10mM、氢氧化钾溶液4mM、吐温-20 0.1％、Bst DNA聚合酶(Yeasen,12908ES97)0.8U/μL、N-FIP引物1.6mM、N-BIP引物1.6mM、N-F3引物0.2mM、N-B3引物0.2mM、N-LF引物0.4mM、N-LB引物0.4mM。
单一铬黑T染料预混液配置：铬黑T 200 M、Tris-HCl 15mM、甜菜碱0.8M、dNTP1.4mM、硫酸镁溶液6.25mM、氯化钠溶液50mM、硫酸铵溶液10mM、氢氧化钾溶液4mM、吐温-200.1％、Bst DNA聚合酶(Yeasen,12908ES97)0.8U/μL、N-FIP引物1.6mM、N-BIP引物1.6mM、N-F3引物0.2mM、N-B3引物0.2mM、N-LF引物0.4mM、N-LB引物0.4mM。
单一酚红染料预混液配置：酚红0.35mM、Tris-HCl 15mM、甜菜碱0.8M、dNTP1.4mM、硫酸镁溶液6.25mM、氯化钠溶液50mM、硫酸铵溶液10mM、氢氧化钾溶液4mM、吐温-200.1％、Bst DNA聚合酶(Yeasen,12908ES97)0.8U/μL、N-FIP引物1.6mM、N-BIP引物1.6mM、N-F3引物0.2mM、N-B3引物0.2mM、N-LF引物0.4mM、N-LB引物0.4mM。
单一Eva Green预混液配置：Eva Green 0.3×、Tris-HCl 15mM、甜菜碱0.8M、dNTP1.4mM、硫酸镁溶液6.25mM、氯化钠溶液50mM、硫酸铵溶液10mM、氢氧化钾溶液4mM、吐温-200.1％、Bst DNA聚合酶(Yeasen,12908ES97)0.8U/μL、N-FIP引物1.6mM、N-BIP引物1.6mM、N-F3引物0.2mM、N-B3引物0.2mM、N-LF引物0.4mM、N-LB引物0.4mM。
2、LAMP反应
将上述含有多维度可视化指示剂、单一铬黑T染料、单一酚红染料、单一Eva Green的预混液分别加入不同浓度的Mycoplasma-DNA质粒模板使其混合成LAMP反应液，反应体积为20L，将反应液置于63℃条件下，反应30min。
3、读取结果
在自然光下，肉眼观察反应液颜色变化。结果如图5～图6所示，含有多维度可视化指示剂在自然光下的阳性反应液呈绿色，阴性呈深红色，在365nm激发光下的阳性具有绿色荧光，阴性无绿色荧光；含有单一铬黑T染料在自然光下的阳性反应呈深蓝色，阴性呈紫色，在365nm激发光下的阳性与阴性均无绿色荧光；含有单一酚红染料在自然光下的阳性反应呈黄色，阴性呈橘黄色，在365nM激发光下的阳性与阴性均无绿色荧光；含有单一Eva Green在自然光下的阳性呈浊状液体，阴性呈透明状液体，在365nm激发光下的阳性具有强烈绿色荧光，阴性有绿色荧光。依据肉眼判断，可清楚看出含有多维度可视化指示剂预混液的阴、阳结果间差异最为明显，最易于可视化的结果判读。
实施例8多维度可视化指示剂、单一铬黑T染料、单一酚红染料、单一Eva Green在以DNA(HBV)为模板的LAMP检测中的可视化效果比较
1、多维度可视化指示剂、单一铬黑T染料、单一酚红染料、单一Eva Green预混液配置
多维度可视化指示剂预混液：酚红0.35mM、铬黑T 200μM、Eva Green 0.3×、Tris-HCl15mM、甜菜碱0.8M、dNTP 1.4mM、硫酸镁溶液6.25mM、氯化钠溶液50mM、硫酸铵溶液10mM、氢氧化钾溶液4mM、吐温-20 0.1％、Bst DNA聚合酶(Yeasen,12908ES97)0.8U/μL、N-FIP引物1.6mM、N-BIP引物1.6mM、N-F3引物0.2mM、N-B3引物0.2mM、N-LF引物0.4mM、N-LB引物0.4mM。
单一铬黑T染料预混液配置：铬黑T 200 M、Tris-HCl 15mM、甜菜碱0.8M、dNTP1.4mM、硫酸镁溶液6.25mM、氯化钠溶液50mM、硫酸铵溶液10mM、氢氧化钾溶液4mM、吐温-200.1％、Bst DNA聚合酶(Yeasen,12908ES97)0.8U/μL、N-FIP引物1.6mM、N-BIP引物1.6mM、N-F3引物0.2mM、N-B3引物0.2mM、N-LF引物0.4mM、N-LB引物0.4mM。
单一酚红染料预混液配置：酚红0.35mM、Tris-HCl 15mM、甜菜碱0.8M、dNTP1.4mM、硫酸镁溶液6.25mM、氯化钠溶液50mM、硫酸铵溶液10mM、氢氧化钾溶液4mM、吐温-200.1％、Bst DNA聚合酶(Yeasen,12908ES97)0.8U/μL、N-FIP引物1.6mM、N-BIP引物1.6mM、N-F3引物0.2mM、N-B3引物0.2mM、N-LF引物0.4mM、N-LB引物0.4mM。
单一Eva Green预混液配置：Eva Green 0.3×、Tris-HCl 15mM、甜菜碱0.8M、dNTP1.4mM、硫酸镁溶液6.25mM、氯化钠溶液50mM、硫酸铵溶液10mM、氢氧化钾溶液4mM、吐温-200.1％、Bst DNA聚合酶(Yeasen,12908ES97)0.8U/μL、N-FIP引物1.6mM、N-BIP引物1.6mM、N-F3引物0.2mM、N-B3引物0.2mM、N-LF引物0.4mM、N-LB引物0.4mM。
2、LAMP反应
将上述含有多维度可视化指示剂、单一铬黑T染料、单一酚红染料、单一Eva Green的预混液分别加入不同浓度的HBV-DNA质粒模板使其混合成LAMP反应液，反应体积为20L，将反应液置于63℃条件下，反应30min。
3、读取结果
在自然光下，肉眼观察反应液颜色变化。结果如图7～图8所示，含有多维度可视化指示剂在自然光下的阳性反应液呈绿色，阴性呈深红色，在365nm激发光下的阳性具有绿色荧光，阴性无绿色荧光；含有单一铬黑T染料在自然光下的阳性反应呈深蓝色，阴性呈紫色，在365nm激发光下的阳性与阴性均无绿色荧光；含有单一甲酚红染料在自然光下的阳性反应呈黄色，阴性呈橘黄色，在365nM激发光下的阳性与阴性均无绿色荧光；含有单一EvaGreen在自然光下的阳性呈浊状液体，阴性呈透明状液体，在365nm激发光下的阳性具有强烈绿色荧光，阴性有绿色荧光。依据肉眼判断，可清楚看出含有多维度可视化指示剂预混液的阴、阳结果间差异最为明显，最易于可视化的结果判读。
Claims (7)
1.一种LAMP多维度可视化检测显色指示剂，其特征在于：包括酚红、铬黑T和EvaGreen，其中酚红的浓度为0.35mM,铬黑T的浓度为200μM，Eva Green的浓度为0.3×。
2.一种LAMP多维度可视化RNA检测预混液，包括Tris-HCl、甜菜碱、dNTP、硫酸镁、 氯化钠、硫酸铵、氢氧化钾、吐温-20、逆转录酶、Bst DNA聚合酶、FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物、LF引物、LB引物，其特征在于：还包括权利要求1所述的LAMP多维度可视化检测显色指示剂。
3.根据权利要求2所述的LAMP多维度可视化RNA检测预混液，其特征在于：
所述Tris-HCl的浓度为1mM~30mM；
所述甜菜碱的浓度为0.25M~1M；
所述dNTP的浓度为1mM~1.8mM;
所述硫酸镁溶液的浓度为3.75mM~7.5mM；
所述氯化钠溶液的浓度为10mM~100mM;
所述硫酸铵溶液的浓度为5mM~15mM;
所述氢氧化钾的浓度为1mM~10mM；
所述吐温-20的浓度为0.01%~1%；
所述逆转录酶的浓度为0.5U/μL~1U/μL；
所述Bst DNA聚合酶的浓度为0.4U/μL~1.2U/μL；
所述FIP引物的浓度为0.8mM~3.2mM；
所述BIP引物的浓度为0.8mM~3.2mM；
所述F3引物的浓度为0.1 mM~0.4mM；
所述B3引物的浓度为0.1 mM~0.4mM；
所述LF引物的浓度为0.2 mM~0.8mM；
所述LB引物的浓度为0.2 mM~0.8mM。
4.如权利要求3所述的LAMP多维度可视化RNA检测预混液，其特征在于：
所述Tris-HCl的浓度为15mM；
所述甜菜碱的浓度为0.8M；
所述dNTP的浓度为1.4mM;
所述硫酸镁溶液的浓度为6.25mM；
所述氯化钠溶液的浓度为50mM;
所述硫酸铵溶液的浓度为10mM;
所述氢氧化钾的浓度为4mM；
所述吐温-20的浓度为0.1%；
所述逆转录酶的浓度为0.75U/μL；
所述Bst DNA聚合酶的浓度为0.8U/μL；
所述FIP引物的浓度为1.6mM；
所述BIP引物的浓度为1.6mM；
所述F3引物的浓度为0.2mM；
所述B3引物的浓度为0.2mM；
所述LF引物的浓度为0.4mM；
所述LB引物的浓度为0.4mM。
5.一种LAMP多维度可视化DNA检测预混液，包括Tris-HCl、甜菜碱、dNTP、硫酸镁、 氯化钠、硫酸铵、氢氧化钾、吐温-20、Bst DNA聚合酶、FIP引物、BIP引物、F3引物、B3引物、LF引物、LB引物，其特征在于：还包括权利要求1所述的LAMP多维度可视化检测显色指示剂。
6.根据权利要求5所述的LAMP多维度可视化DNA检测预混液，其特征在于：
所述Tris-HCl的浓度为1mM~30mM；
所述甜菜碱的浓度为0.25M~1M；
所述dNTP的浓度为1mM~1.8mM;
所述硫酸镁溶液的浓度为3.75mM~7.5mM；
所述氯化钠溶液的浓度为10mM~100mM;
所述硫酸铵溶液的浓度为5mM~15mM;
所述氢氧化钾的浓度为1mM~10mM；
所述吐温-20的浓度为0.01%~1%；
所述Bst DNA聚合酶的浓度为0.4U/μL~1.2U/μL；
所述FIP引物的浓度为0.8mM~3.2mM；
所述BIP引物的浓度为0.8mM~3.2mM；
所述F3引物的浓度为0.1 mM~0.4mM；
所述B3引物的浓度为0.1 mM~0.4mM；
所述LF引物的浓度为0.2 mM~0.8mM；
所述LB引物的浓度为0.2 mM~0.8mM。
7.如权利要求6所述的LAMP多维度可视化DNA检测预混液，其特征在于：
所述Tris-HCl的浓度为15mM；
所述甜菜碱的浓度为0.8M；
所述dNTP的浓度为1.4mM;
所述硫酸镁溶液的浓度为6.25mM；
所述氯化钠溶液的浓度为50mM;
所述硫酸铵溶液的浓度为10mM;
所述氢氧化钾的浓度为4mM；
所述吐温-20的浓度为0.1%；
所述Bst DNA聚合酶的浓度为0.8U/μL；
所述FIP引物的浓度为1.6mM；
所述BIP引物的浓度为1.6mM；
所述F3引物的浓度为0.2mM；
所述B3引物的浓度为0.2mM；
所述LF引物的浓度为0.4mM；
所述LB引物的浓度为0.4mM。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 基于环介导等温扩增的微流控芯片检测技术研究进展;李林岳;中国生物工程杂志;第1-15页 * |
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| Publication number | Publication date |
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