CN115368450A - 一种人源α-乳清蛋白转基因表达载体、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人源α‑乳清蛋白转基因表达载体、其制备方法及其应用，能在玉米籽粒中表达人源α‑乳清蛋白的转基因材料。本发明将带有27‑kDγ‑zein信号肽和内质网滞留信号的人源α‑乳清蛋白CDS进行玉米密码子优化，与带有玉米27‑kDγ‑zein启动子/终止子的PTF102载体进行连接。该载体通过农杆菌介导的玉米幼胚转化实验进行玉米遗传转化，获得了人源α‑乳清蛋白转基因材料。对转基因事件的后代样本进行分析，发现人源α‑乳清蛋白可以在胚乳中稳定的表达，并且能够在成熟籽粒的胚乳中积累。胚乳中存在的人源α‑乳清蛋白提升了玉米籽粒中赖氨酸的含量，从而提高了玉米的营养品质。

Description

一种人源α-乳清蛋白转基因表达载体、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种能在胚乳中特异性表达积累人源α-乳清蛋白的转基因玉米材料的及应用。

技术背景

玉米(Zea mays)是世界上产量最高的禾本科作物之一。除了作为粮食外，玉米还是禽畜重要的饲料来源，也是重要的工业原料。提升并改良玉米的蛋白质品质对提高其营养价值，扩宽其使用范围有着重要意义。

醇溶蛋白是玉米籽粒中的主要储藏蛋白，占总蛋白的60％以上，然而其赖氨酸和色氨酸等必需氨基酸含量极低，导致传统的玉米籽粒中氨基酸组成不均衡。目前改良玉米籽粒氨基酸比例的方法主要分为三种：

一是利用通过玉米的o2突变体；

二是改变玉米籽粒中涉及赖氨酸的代谢途径，增加其合成量或阻断其下游通路；

三是导入外源基因让玉米在胚乳中表达一个氨基酸比例均衡的蛋白，能够显著地提高籽粒的蛋白质品质。

相较于前两种方法，方法三避开了o2突变体农艺性状不佳的缺陷和改变代谢通路可能造成的不良影响，更加简单易行。

人源α-乳清蛋白是一种氨基酸比例均衡的蛋白质，与世界卫生组织(WHO)提出的理想蛋白质的氨基酸比例相接近。来源于人体，无生物毒性、安全性好。

为使人源α-乳清蛋白能够成功表达并在成熟中积累，利用玉米27-kDγ醇溶蛋白启动子的胚乳特异性构建在胚乳中表达人源α-乳清蛋白的转化载体，通过农杆菌介导的玉米幼胚转化技术来获得转基因后代，进而分析一系列生理生化表现及细胞学变化，以期获得高赖氨酸的转基因玉米果穗。

发明内容

本发明的目的之一在于构建一种人源α-乳清蛋白转基因表达载体及其制备方法。

本发明的目的之二在于使用人源α-乳清蛋白转基因表达载体进行转化获得转基因玉米植株。

本发明的目的之三在于获得的人源α-乳清蛋白转基因玉米植株的籽粒相较野生型赖氨酸含量提高。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种人源α-乳清蛋白转基因表达载体，采用PTF102作为转基因载体，将经过改造的人源α-乳清蛋白CDS作为目的基因连入PTF102转基因载体中，获得所述人源α-乳清蛋白转基因表达载体；其中PTF102转基因载体是的经过改造得到，并以玉米27kD-γ-醇溶蛋白启动子和终止子表达目的基因。

优选地，所述人源α-乳清蛋白CDS为SEQ ID NO:1所示序列，SEQ ID NO:1的基因序列为:

ATGAGGGTGTTGCTCGTTGCCCTCGCTCTCCTGGCTCTCGCTGCGAGCGCCACCTCCAAGCAATTCACAAAATGTGAGCTGTCCCAGCTGCTGAAAGACATAGATGGTTATGGAGGCATCGCTTTGCCTGAATTGATCTGTACCATGTTTCACACCAGTGGTTATGACACACAAGCCATAGTTGAAAACAATGAAAGCACGGAATATGGACTCTTCCAGATCAGTAATAAGCTTTGGTGCAAGAGCAGCCAGGTCCCTCAGTCAAGGAACATCTGTGACATCTCCTGTGACAAGTTCCTGGATGATGACATTACTGATGACATAATGTGTGCCAAGAAGATCCTGGATATTAAAGGAATTGACTACTGGTTGGCCCATAAAGCCCTCTGCACTGAGAAGCTGGAACAGTGGCTTTGTGAGAAGTTGCATGACGAGCTGTGA。

优选地，所述玉米的人源α-乳清蛋白转基因表达载体，以玉米27kD-γ-醇溶蛋白启动子和终止子表达目的基因，采用SEQ ID NO:2基因序列，SEQ ID NO:2基因序列为：

27kD-γ-醇溶蛋白启动子：

CGTCCCGCGTCAATATTATTAAAAAACTCCTACATTTCTTTATAATCAACCCGCACTCTTATAATCTCTTCTCTACTACTATAATAAGAGAGTTTATGTACAAAATAAGGTGAAATTATGTATAAGTGTTCTGGATATTGGTTGTTGGCTCCATATTCACACAACCTAATCAATAGAAAACATATGTTTTATTAAAACAAAATTTATCATATATCATATATATATATATATATATATAAACCGTAGCAATGCACGGGCATATAACTAGTGCAACTTAATACATGTGTGTATTAAGATGAATAAGAGGGTATCCAAATAAAAAACTTGTTCGCTTACGTCTGGATCGAAAGGGGTTGGAAACGATTAAATCTCTTCCTAGTCAAAATTGAATAGAAGGAGATTTAATCTCTCCCAATCCCTTTCGATCATCCAGGTGCAACCGTATAAGTCCTAAAGTGGTGAGGAACACGAAACAACCATGCATTGGCATGTAAAGCTCCAAGAATTTGTTGTATCCTTAACAACTCACAGAACATCAACCAAAATTGCACGTCAAGGGTATTGGGTAAGAAACAATCAAACAAATCCTCTCTGTGTGCAAAGAAACACGGTGAGTCATGCCGAGATCATACTCATCTGATATACATGCTTACAGCTCACAAGACATTACAAACAACTCATATTGCATTACAAAGATCGTTTCATGAAAAATAAAATAGGCCGGACAGGACAAAAATCCTTGACGTGTAAAGTAAATTTACAACAAAAAAAAGCCATATGTCAAGCTAAATCTAATTCGTTTTACGTAGATCAACAACCTGTAGAAGGCAACAAAACTGAGCCACGCAGAAGTACAGAATGATTCCAGATGAACCATCGACGTGCTACGTAAAGAGAGTGACGAGTCATATACATTTGGCAAGAAACCATGAAGCTGCCTACAGCCGTCTCGGTGGCATAAGAACACAAGAAATTGTGTTAATTAATCAAAGCTATAAATAACGCTCGCATGCCTGTGCACTTCTCCATCACCACCACTGGGTCTTCAGACCATTAGCTTTATCTACTCCAGAGCGCAGAAGAACCCGATCGACACC

27kD-γ-醇溶蛋白终止子：

AGAAACTATGTGCTGTAGTATAGCCGCTGGCTAGCTAGCTAGTTGAGTCATTTAGCGGCGATGATTGAGTAATAATGTGTCACGCATCACCATGGGTGGCAGTGTCAGTGTGAGCAATGACCTGAATGAACAATTGAAATGAAAAGAAAAAAGTATTTTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAA。

本发明构建一种用于玉米转基因转化的表达载体pTF102-p27::LALBA，该载体含有能表达人源α-乳清蛋白的基因，包括如下步骤：

①构建pTF102-p27载体：

采用植物转化载体PTF102为蓝本，将其中的CaMV 35S启动子替换为玉米27-kDγ醇溶蛋白启动子，NOS终止子替换为玉米27-kDγ醇溶蛋白终止子；

②获取表达人源α-乳清蛋白的LALBA基因：

对人源α-乳清蛋白的CDS进行最适玉米的密码子优化，然后在N端添加玉米27-kDγ醇溶蛋白信号肽，C端添加内质网滞留信号；

③获得人源α-乳清蛋白转基因表达载体：

将LALBA基因片段α-LA与载体pTF102-p27相连，得到含有LALBA基因的表达载体pTF102-p27::LALBA。

本发明人源α-乳清蛋白转基因玉米及其应用涉及的基因序列：

TCTAGAATGAGGGTCCTTCTCGTGGCCCTCGCGCTGCTCGCCCTTGCCGCGTCCGCCACCTCTAAGCAGTTCACCAAGTGCGAGCTGTCTCAGCTTTTAAAAGACATCGACGGCTACGGCGGCATCGCGCTCCCGGAGCTTATCTGCACCATGTTCCACACCAGCGGCTACGACACCCAGGCGATCGTGGAGAACAACGAGTCTACCGAGTACGGCCTTTTCCAGATCAGCAACAAGTTGTGGTGCAAGTCTAGCCAGGTCCCGCAGAGCCGGAACATCTGCGACATCTCTTGCGACAAGTTCCTGGACGACGACATCACCGACGACATCATGTGCGCGAAGAAGATCCTTGACATCAAGGGCATCGACTACTGGCTGGCGCACAAGGCCCTGTGCACCGAGAAGTTGGAGCAGTGGCTCTGCGAGAAGCTCCACGACGAGCTGTGAAGAAACTATGTGCTGTAGTATAGCCGCTGGCTAGCTAGCTAGTTGAGTCATTTAGCGGCGATGATTGAGTAATAATGTGTCACGCATCACCATGGGTGGCAGTGTCAGTGTGAGCAATGACCTGAATGAACAATTGAAATGAAAAGAAAAAAGTATTTTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAGCTC

1-6bp:XbaI；

433-444bp:内质网滞留信号；

64-432bp:人源α-乳清蛋白ORF；

10-63bp:27kDγ-醇溶蛋白信号肽；

448-626bp:27kDγ-醇溶蛋白终止子；

627-632bp:SacI。

一种利用本发明所述玉米的人源α-乳清蛋白转基因表达载体构建人源α-乳清蛋白的转基因植株的基因材料的应用，采用玉米杂交品种PB×PA，利用玉米遗传转化法，得到所述人源α-乳清蛋白的转基因植株的基因材料。

优选地，本发明获取人源α-乳清蛋白转基因玉米植株的基因材料，使用农杆菌介导的玉米转化法，获得人源α-乳清蛋白转基因玉米植株的基因材料。优选地，在玉米籽粒胚乳中α-乳清蛋白的平均含量为0.028-0.062g/100g胚乳组织。本发明通过PPCR/Southern-blot鉴定得到的人源α-乳清蛋白转基因玉米确为阳性转基因事件且彼此之间相互独立。

一种本发明所述玉米的人源α-乳清蛋白转基因表达载体在玉米育种中的应用，在玉米育种时，在玉米胚乳中表达人源α-乳清蛋白，调控玉米胚乳中赖氨酸含量。本发明人源α-乳清蛋白转基因玉米植株的籽粒相较野生型赖氨酸含量提高。

本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：

1.本发明通过SDS-PAGE、Western blot、ELISA实验，明确了人源α-乳清蛋白在玉米成熟籽粒中积累，且拥有一定的积累量；

2.本发明通过对部分转基因事件的氨基酸含量测定证明了赖氨酸与色氨酸含量相较野生型有所提升；转基因玉米成功的表达并积累了人源α-乳清蛋白，从而使籽粒的赖氨酸含量上升；

3.本发明利用人源α-乳清蛋白可以在胚乳中稳定的表达，并且能够在玉米成熟籽粒的胚乳中积累，胚乳中存在的人源α-乳清蛋白提升了玉米籽粒中赖氨酸的含量，从而提高了玉米的营养品质。

附图说明

图1是本发明制备的含有LALBA基因的pTF102-p27::LALBA载体示意图。

图2是本发明转基因阳性事件PCR检测结果和Southern blot拷贝数检测分析结果图。

图3是本发明玉米成熟籽粒的胚乳总蛋白、醇溶蛋白的SDS-PAGE分析图。

图4是本发明玉米成熟籽粒胚乳总蛋白、醇溶蛋白中人源α-乳清蛋白Westernblot检测结构图。

图5是本发明的ELISA法测定成熟籽粒胚乳总蛋白中人源α-乳清蛋白的含量对比图。

图6是本发明玉米成熟籽粒的胚乳中氨基酸含量检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.)或植物分子生物学－实验手册(Plant Molecular Biology－A Laboratory Manual,Melody S.Clark编，Springer-verlag Berlin Heidelberg,1997)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一

在本实施例中，构建pTF102-p27::LALBA转基因载体，并用于转基因，其步骤如下：

①构建pTF102-p27载体：

以商用的植物转化载体PTF102为蓝本，将其中的CaMV 35S启动子替换为玉米27-kDγ醇溶蛋白启动子，NOS终止子替换为玉米27-kDγ醇溶蛋白终止子；

②获取表达人源α-乳清蛋白的LALBA基因：

对人源α-乳清蛋白的CDS进行最适玉米的密码子优化，之后在N端添加玉米27-kDγ醇溶蛋白信号肽，C端添加内质网滞留信号；

③将基因片段LACT与载体pTF102-p27相连，得到含有该基因的表达载体pTF102-p27::LALBA，如图1。

进行电击转化EHA105菌株。选取PBPA玉米品系授粉8-12天的幼胚，大小约1.5mm左右作为受体材料，进行幼胚转化，具体流程：

1.农杆菌侵染10min共培养20℃3天；

2.恢复培养28℃7天-筛选培养(双丙氨磷浓度为1.5mg/L)28℃14天；

3.筛选培养(双丙氨磷浓度为3mg/L)28℃14天3-5轮；

4.获得抗性愈伤组织-暗再生培养28℃14-21天；

5.光再生培养28℃14-21天-获得阳性苗；

6.移入盆中，授粉并获得后代。

结果：选取1000个幼胚作为受体材料，经过转化筛选后获得5个转基因阳性事件。获得后对各个事件进行鉴定，通过TPS法抽提各事件植株的基因组，设计跨越27-kDγ醇溶蛋白启动子和LACT基因的PCR引物用于鉴定，阳性事件在400bp处相较于阴性对照有明亮条带，如图2所示。

实施例二

在本实施例中，人源α-乳清蛋白转基因阳性事件的叶片基因组大量抽提，其方法如下：

1.首先向50mL离心管中加入10mL基因组大量抽提液，并在离心管盖和离心管壁上做相应的标记；

2.取1-3g整片的新鲜嫩叶，去除叶脉，放进-80℃冰箱进行备用；或者，放入液氮中进行速冻，研磨成泛白的粉末，直接进行实验；将粉末放进相应编号的50mL离心管中(含有DNA大抽提取液)，并加入20uL的浓度为10mg/mL的RNA酶母液，上下颠倒，混合均匀，室温静置10min；

3.每管加入与提取液等量的酚：氯仿：异戊醇(体积比为25：24：1)，剧烈震荡，充分混匀，4℃，12000rpm离心10min；

4.吸取全部上清到新的50mL离心管中，写上编号，向其中加入总体积0.7倍的异丙醇，上下轻轻颠倒，出现絮状沉淀，立即进行下一步；也可放置于-20℃，30min，使基因组DNA充分沉淀；

5.将絮状沉淀挑出，移到2mL EP管中，用70％乙醇洗3次；

6.吸尽乙醇，将沉淀放在65℃条件下烘干，加入1mL 1×TE溶液溶解沉淀，再加入20uL的10mg/mL RNAase，37℃，1h，消化RNA；

7.电泳检测：取1uL的样品加3uL的染色液进行琼脂糖凝胶电泳，判断RNA是否被完全消化；

8.确定样品中RNA降解完全后，向其中加入与溶液等体积的酚：氯仿：异戊醇(体积比为25：24：1)，充分混匀，4℃，12000rpm，离心10min；

9.将上清转移到另一个新的2mL EP管中(注意不要吸到下层杂质)，加入7/10体积的异丙醇和1/10体积的醋酸钠(PH＝5.2)，轻柔混匀，待出现絮状沉淀；

10.将沉淀转移至新的2mL EP管中，用70％乙醇洗3遍，除尽乙醇，将沉淀在37℃条件下烘干，加入100μL的1×TE溶解沉淀，用于做Southern blot实验。

实施例三

在本实施例中，人源α-乳清蛋白转基因阳性事件的Southernblot拷贝数分析。

为了研究转基因玉米中转化拷贝数的情况，本实施例对部分转基因阳性植株用EcoRⅠ和HindⅢ两种酶进行酶切，并进行Southern blot分析。本实验选取了人源α-乳清蛋白转基因阳性事件1#/2#/3#/4#/5#，5个事件进行了Southern blot实验分析拷贝数。步骤如下：

1.酶切体系50μL：1-2μL的限制性内切酶(内切酶体积应小于酶切体系的1/10)、5μL 10×Buffer、适量的基因组DNA(10μg-15μg)，加ddH2O定容至50μL；37℃水浴，酶切8h；

2.配制低浓度的大孔琼脂糖凝胶(无EB)，向酶切完全的体系中加入8μL染色液，在恒定低温条件下，25-36V，电泳13-18h；

3.准备转膜装置，在装置方槽中加入400mL的ddH2O和20μL的EB染料，混合均匀后将电泳好的凝胶浸泡其中，10min后拍照显影，用ddH2O冲洗2遍；

4.在装置的另一个方槽中加入500mL的0.2M盐酸，将凝胶轻轻放入其中，浸泡10min；

5.倒掉盐酸溶液，再加入500mL的变性液，浸泡15min，重复一次；变性期间剪取一张尼龙膜(11×12)和滤纸(12×12)，并将尼龙膜放在碱转液中浸泡5-10min；

6.组装转膜装置：先在转膜台上倒少许的碱转液，铺1层滤纸，再在滤纸中间铺上尼龙膜，然后用黑皮垫子压住尼龙膜，最后在中间放置凝胶(每铺一层都要用玻璃棒赶气泡，确保形成转膜的封闭环境)；

7.启动真空泵进行真空抽提，加入少量碱转液，100mbar，预抽5min，然后向转膜装置中加入适量的碱转液，注意不要漫过凝胶，75min；

8.转膜结束后，关闭电源；用镊子将尼龙膜取出，放在适量的中和液中浸泡10min，然后将尼龙膜放置在滤纸上约25-35min左右，晾干，紫外交联固定；

9.将尼龙膜放到杂交管中(与凝胶接触的那一面朝里)，加入10mL的预杂液，42℃的杂交炉，杂交2h；

10.取250ng制备好的探针，加1×TE溶液补足至40μL，封口膜封口，沸水浴，10min，反应结束后立刻冰浴5min，瞬离，待用；

11.将变性的探针加到预热的10mL杂交液中，轻轻吹打混匀；将混匀的杂交液用玻璃棒导流入杂交管中，50℃杂交炉，低转速孵育16-20小时，(18-19小时最佳)；

12.杂交后加入10mL的洗膜液I(25℃度预热)，25℃杂交炉，15min，重复一遍；

13.加入10mL洗膜液II(65℃预热)，65℃杂交炉，30min，重复一遍；

14.配制洗膜液20mL，25℃，每次10mL，5-10min，共洗两次；

15.加10mL封闭液(用马来酸将试剂盒中10×Blocking Solution稀释至1×)，25℃，30-40min；

16.加10mL抗体溶液，避光，25℃，30-60min；

17.加20mL洗膜液，每次10mL，25℃，10min；

18.加10mL检测液，25℃，5-10min；

19.将保鲜膜平铺在水平实验台上，最好不要有褶皱，把CSPD显色液均匀滴在保鲜膜上，将尼龙膜的内侧一面与其接触，显影保存。

结果显示杂交背景低，样本的拷贝数清晰，如图2所示。经过统计发现3#、4#、5#有三个拷贝，而2#事件只有一个拷贝，这种转化低拷贝数可能为后代筛选培育带来便利。

实施例四

在本实施例中，人源α-乳清蛋白转基因阳性事件醇溶蛋白的SDS-PAGE检测，包括如下步骤：

1.将籽粒去皮去胚，剩下胚乳待用；

2.使用液氮研磨胚乳达到粉末级；

3.取研磨后的籽粒胚乳粉末装入EP管中，放入冷冻干燥机中，冷冻抽干；

4.取50mg冷冻抽干的籽粒胚乳粉末装入EP管中，加入1mL石油醚，涡旋混匀后，摇床室温孵育1小时；

5.采用转入为12,000rpm，离心15分钟，弃上清；

6.再加入1mL石油醚，斡旋混匀后，12,000rpm，离心15分钟，弃上清；

7.得到的沉淀放入冷冻干燥机中，冷冻抽干；

8.加入1mL硼酸钠缓冲液，20μL巯基乙醇；斡旋混匀后，置于37度恒温摇床中，孵育过夜(12小时)；

9.采用转速为12,000rpm，离心15分钟，移取上清大约900μL至新管中，上清液则为总蛋白；

10.取300μL总蛋白溶液，加入700μL无水乙醇，斡旋混匀，摇床室温孵育2小时；

11.进行12,000rpm，离心15分钟，吸取全部上清至新管中，上清液则为醇溶蛋白，沉淀为非醇溶蛋白；

12.用70％的乙醇洗沉淀两次，12,000rpm，离心5分钟；风干至边缘透明且管中没有乙醇味后，加入200μL IPG溶液后，弹匀溶解；

13.上清液放入冷冻干燥机中，冷冻抽干，加入200μL IPG溶液后，弹匀溶解；

14.取300μL总蛋白溶液，放入冷冻干燥机中，冷冻抽干，加入200μL IPG溶液后，弹匀溶解；

15.各取4μL的溶解的总蛋白、醇溶蛋白和非醇溶蛋白，加入1μL混有1M DTT的5×SDS蛋白上样缓冲液，99℃变性10分钟后，立即将蛋白样品插在冰上；

16.SDS-PAGE电泳验证，堆积胶为5％，80V电泳半小时后，分离胶为12.5％，电泳时间约为2小时；

17.取下蛋白胶，放入考马斯亮蓝中摇床室温染色4小时，使用脱色液脱色，至背景透明，使用Bio-Rad电泳成像仪拍胶。

结果显示转基因阳性籽粒抽提的总蛋白/醇溶蛋白/非醇溶蛋白中相较于野生型(W22)在10kD-15kD处有新增条带，如图3所示。

实施例五

在本实施例中，人源α-乳清蛋白转基因材料醇溶蛋白的Western blot检测，使用实施例三的方法抽提人源α-乳清蛋白转基因材料醇溶蛋白，步骤如下：

1.将7个事件分别各取4μL的蛋白，加入1μL混有1M DTT的5×SDS蛋白上样缓冲液，99℃变性10分钟后，立即将蛋白样品插在冰上；

2.进行SDS-PAGE电泳，堆积胶为5％，80V电泳半小时后，分离胶为12.5％，电泳时间约为2小时；

3.将200mA转膜1h；用TBST配置5％牛奶室温封闭1h；

4.分别用人源α-乳清蛋白抗体和Tubulin抗体(Sigma)以1/5000比例稀释在5％牛奶中；室温杂交1h；

5.进行TBST洗膜3次，每次5min；

6.用相应二抗室温杂交1h；

7.进行TBST洗膜3次，每次5min；

8.加入显色底物，用TANON化学发光成像仪现象。

结果显示用作总蛋白内参的actin在6个材料中都存在，用作醇溶蛋白内参的22kDα-在醇溶蛋白在6个材料中也都存在。人源α-乳清蛋白在5个转基因材料中也均有表达。如图4所示。

实施例六

在本实施例中，ELISA检测转基因材料总蛋白的人源α-乳清蛋白含量。

为了进一步说明人源α-乳清蛋白在玉米胚乳中存在足量的积累，需要更进一步测定其在胚乳中的含量。

使用实施例三的方法抽提人源α-乳清蛋白转基因材料醇溶蛋白。步骤如下：

1.向冻干的标准品中加入1mL样本稀释液R1，轻轻混匀至少15min，使冻干品完全溶解至浓度为50ng/mL；按照以下浓度进行稀释：50,25,12.5,6.25,3.12,1.56,0.78,0ng/mL；

2.向微孔板条中每孔加入1×洗涤缓冲液350μL，静置40秒后弃去液体，该步骤共洗涤三次；

3.在孔中加入100μL的不同浓度的标准品和待测样品，用封板膜封闭板孔，37°孵育2小时；

4.弃去液体，重复步骤二的洗涤步骤；

5.每孔中加入100μL的生物素化抗体工作液，用封板膜封闭板孔，37°孵育1小时；

6.弃去液体，重复步骤二的洗涤步骤；

7.每孔中加入100μL的链霉素亲和素-HRP工作液，用封板膜封闭板孔，37°孵育30分钟；

8.预热酶标仪，弃去液体，重复步骤二的洗涤步骤；

9.每孔中加入100μL的TMB底物，用封板膜封闭板孔，37°避光孵育15-20分钟；

10.每孔加入终止液50μL，并立即放入酶标仪，在5min内测定每个孔450nm的OD值；选择570nm为校正波长；

11.使用测得的标准样品OD值拟合标准曲线；

12.将测得的样品OD值代入标准曲线计算出相应的浓度。

如图5中所示，结果表明F2籽粒胚乳中α-乳清蛋白的平均含量为0.028-0.062g/100g胚乳组织。作为比较，某些玉米醇溶蛋白亚基的含量为1g/100g胚乳组织。

实施例七

在本实施例中，人源α-乳清蛋白转基因材料成熟籽粒的胚乳氨基酸检测。

为了检测所获得的转基因玉米是否达到了促进赖氨酸的显著升高，提高玉米的蛋白品质的目标，对人源α-乳清蛋白转基因材料的1#/2#事件进行氨基酸含量的测定；

1.每个事件分别取30mg成熟籽粒粉末，同时做3个生物学重复；

2.每个样品中加入5mL的浓度为6mol/L HCI和20uL苯酚；

3.氮气吹5min；

4.在110℃下，进行高温处理22h；

5.将样品漩涡后取1mL离心，4℃12000rpm 20min；

6.取200uL上清于试管，用氮气吹干液体，温度设置在60℃；

7.加入200ul 0.02mol/L HCI完全溶解样品；

8.取完全溶解后样品于1.5mL EP管离心，4℃12000rpm 20min；

9.取上清于上样柱中，上机测定。

结果可以看出2个事件的赖氨酸含量都有显著升高，参见图6。在1#/4#阳性籽粒胚乳中赖氨酸含量占总氨基酸含量的增幅为WT的46.6％和45.2％。赖氨酸含量占总氨基酸的比例分别提高了0.682％和0.932％。

上述实施例能在玉米籽粒中表达人源α-乳清蛋白的转基因材料及其应用，将带有27-kDγ-zein信号肽和内质网滞留信号的人源α-乳清蛋白CDS进行玉米密码子优化，与带有玉米27-kDγ-zein启动子/终止子的PTF102载体进行连接。该载体通过农杆菌介导的玉米幼胚转化实验进行玉米遗传转化，获得了人源α-乳清蛋白转基因材料。对转基因事件的后代样本进行分析，发现人源α-乳清蛋白可以在胚乳中稳定的表达，并且能够在成熟籽粒的胚乳中积累。胚乳中存在的人源α-乳清蛋白提升了玉米籽粒中赖氨酸的含量，从而提高了玉米的营养品质。

上面对本发明实施例结合附图进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海大学

<120> 一种人源α-乳清蛋白转基因表达载体、其制备方法及其应用

<141> 2022-05-09

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 基因序列：()

<220>

<223> TCTAGAATGAGGGTCCTTCTCGTGGCCCTCGCGCTGCTCGCCCTTGCCGCGTCCGCCACCTCTAAGCAGTTCACCAAGTGCGAGCTGTCTCAGCTTTTAAAAGACATCGACGGCTACGGCGGCATCGCGCTCCCGGAGCTTATCTGCACCATGTTCCACACCAGCGGCTACGACACCCAGGCGATCGTGGAGAACAACGAGTCTACCGAGTACGGCCTTTTCCAGATCAGCAACAAGTTGTGGTGCAAGTCTAGCCAGGTCCCGCAGAGCCGGAACATCTGCGACATCTCTTGCGACAAGTTCCTGGACGACGACATCACCGACGACATCATGTGCGCGAAGAAGATCCTTGACATCAAGGGCATCGACTACTGGCTGGCGCACAAGGCCCTGTGCACCGAGAAGTTGGAGCAGTGGCTCTGCGAGAAGCTCCACGACGAGCTGTGAAGAAACTATGTGCTGTAGTATAGCCGCTGGCTAGCTAGCTAGTTGAGTCATTTAGCGGCGATGATTGAGTAATAATGTGTCACGCATCACCATGGGTGGCAGTGTCAGTGTGAGCAATGACCTGAATGAACAATTGAAATGAAAAGAAAAAAGTATTTTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAGCTC

<400> 1

<210> 2

<211> 3

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

Claims (7)

1.一种人源α-乳清蛋白转基因表达载体，其特征在于，采用PTF102作为转基因载体，将经过改造的人源α-乳清蛋白CDS作为目的基因连入PTF102转基因载体中，获得所述人源α-乳清蛋白转基因表达载体；其中PTF102转基因载体是的经过改造得到，并以玉米27kD-γ-醇溶蛋白启动子和终止子表达目的基因。

2.根据权利要求1所述玉米的人源α-乳清蛋白转基因表达载体，其特征在于：所述人源α-乳清蛋白CDS为SEQ ID NO:1所示序列，SEQ ID NO:1的基因序列为：

ATGAGGGTGTTGCTCGTTGCCCTCGCTCTCCTGGCTCTCGCTGCGAGCGCCACCTCCAAGCAATTCACAAAATGTGAGCTGTCCCAGCTGCTGAAAGACATAGATGGTTATGGAGGCATCGCTTTGCCTGAATTGATCTGTACCATGTTTCACACCAGTGGTTATGACACACAAGCCATAGTTGAAAACAATGAAAGCACGGAATATGGACTCTTCCAGATCAGTAATAAGCTTTGGTGCAAGAGCAGCCAGGTCCCTCAGTCAAGGAACATCTGTGACATCTCCTGTGACAAGTTCCTGGATGATGACATTACTGATGACATAATGTGTGCCAAGAAGATCCTGGATATTAAAGGAATTGACTACTGGTTGGCCCATAAAGCCCTCTGCACTGAGAAGCTGGAACAGTGGCTTTGTGAGAAGTTGCATGACGAGCTGTGA。

3.根据权利要求1所述玉米的人源α-乳清蛋白转基因表达载体，其特征在于：以玉米27kD-γ-醇溶蛋白启动子和终止子表达目的基因，采用SEQ ID NO:2基因序列，SEQ ID NO:2基因序列为：

27kD-γ-醇溶蛋白启动子：

CGTCCCGCGTCAATATTATTAAAAAACTCCTACATTTCTTTATAATCAACCCGCACTCTTATAATCTCTTCTCTACTACTATAATAAGAGAGTTTATGTACAAAATAAGGTGAAATTATGTATAAGTGTTCTGGATATTGGTTGTTGGCTCCATATTCACACAACCTAATCAATAGAAAACATATGTTTTATTAAAACAAAATTTATCATATATCATATATATATATATATATATATAAACCGTAGCAATGCACGGGCATATAACTAGTGCAACTTAATACATGTGTGTATTAAGATGAATAAGAGGGTATCCAAATAAAAAACTTGTTCGCTTACGTCTGGATCGAAAGGGGTTGGAAACGATTAAATCTCTTCCTAGTCAAAATTGAATAGAAGGAGATTTAATCTCTCCCAATCCCTTTCGATCATCCAGGTGCAACCGTATAAGTCCTAAAGTGGTGAGGAACACGAAACAACCATGCATTGGCATGTAAAGCTCCAAGAATTTGTTGTATCCTTAACAACTCACAGAACATCAACCAAAATTGCACGTCAAGGGTATTGGGTAAGAAACAATCAAACAAATCCTCTCTGTGTGCAAAGAAACACGGTGAGTCATGCCGAGATCATACTCATCTGATATACATGCTTACAGCTCACAAGACATTACAAACAACTCATATTGCATTACAAAGATCGTTTCATGAAAAATAAAATAGGCCGGACAGGACAAAAATCCTTGACGTGTAAAGTAAATTTACAACAAAAAAAAGCCATATGTCAAGCTAAATCTAATTCGTTTTACGTAGATCAACAACCTGTAGAAGGCAACAAAACTGAGCCACGCAGAAGTACAGAATGATTCCAGATGAACCATCGACGTGCTACGTAAAGAGAGTGACGAGTCATATACATTTGGCAAGAAACCATGAAGCTGCCTACAGCCGTCTCGGTGGCATAAGAACACAAGAAATTGTGTTAATTAATCAAAGCTATAAATAACGCTCGCATGCCTGTGCACTTCTCCATCACCACCACTGGGTCTTCAGACCATTAGCTTTATCTACTCCAGAGCGCAGAAGAACCCGATCGACACC

27kD-γ-醇溶蛋白终止子：

AGAAACTATGTGCTGTAGTATAGCCGCTGGCTAGCTAGCTAGTTGAGTCATTTAGCGGCGATGATTGAGTAATAATGTGTCACGCATCACCATGGGTGGCAGTGTCAGTGTGAGCAATGACCTGAATGAACAATTGAAATGAAAAGAAAAAAGTATTTTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAA。

4.一种权利要求1所述玉米的人源α-乳清蛋白转基因表达载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

①构建pTF102-p27载体：

采用植物转化载体PTF102为蓝本，将其中的CaMV 35S启动子替换为玉米27-kDγ醇溶蛋白启动子，NOS终止子替换为玉米27-kDγ醇溶蛋白终止子；

②获取表达人源α-乳清蛋白的LALBA基因：

对人源α-乳清蛋白的CDS进行最适玉米的密码子优化，然后在N端添加玉米27-kDγ醇溶蛋白信号肽，C端添加内质网滞留信号；

③获得人源α-乳清蛋白转基因表达载体：

将LALBA基因片段α-LA与载体pTF102-p27相连，得到含有LALBA基因的表达载体pTF102-p27::LALBA。

5.一种利用权利要求1所述玉米的人源α-乳清蛋白转基因表达载体构建人源α-乳清蛋白的转基因植株的基因材料的应用，其特征在于：采用玉米杂交品种PB×PA，利用玉米遗传转化法，得到所述人源α-乳清蛋白的转基因植株的基因材料。

6.根据权利要求1所述应用，其特征在于：在玉米籽粒胚乳中α-乳清蛋白的平均含量为0.028-0.062g/100g胚乳组织。

7.一种权利要求1所述玉米的人源α-乳清蛋白转基因表达载体在玉米育种中的应用，其特征在于：在玉米育种时，在玉米胚乳中表达人源α-乳清蛋白，调控玉米胚乳中赖氨酸含量。

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