CN115976096B

CN115976096B - MaGN12基因在调控香蕉果实生长上的应用

Info

Publication number: CN115976096B
Application number: CN202211571404.7A
Authority: CN
Inventors: 苗红霞; 金志强; 刘菊华; 徐碧玉; 孙佩光; 苗雨露
Original assignee: Sanya Research Institute Chinese Academy Of Tropical Agricultural Sciences; Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Sanya Research Institute Chinese Academy Of Tropical Agricultural Sciences; Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2022-12-08
Filing date: 2022-12-08
Publication date: 2023-08-11
Anticipated expiration: 2042-12-08
Also published as: CN115976096A

Abstract

本发明提供了一种糖原起始合成酶基因MaGN12在调控香蕉果实生长中的应用，过表达MaGN12能够显著增加果实大小，提高果实产量，例如将MaGN12基因导入香蕉中，获得35S启动子驱动的MaGN12转基因香蕉8个独立株系，过表达该基因提高了MaGN12表达量、果指长度、果指宽度、果穗轴长度、果实重量、总淀粉含量、支链淀粉含量、短链多糖链合成，且每个质体中淀粉颗粒数量也显著增加，<50μm淀粉颗粒数量明显增加，对增加果实体积、提高果实产量和培育高淀粉香蕉新品种具有重要意义。

Description

MaGN12基因在调控香蕉果实生长上的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及MaGN12基因在调控香蕉果实生长上的应用。

背景技术

糖原起始合成酶(Glycogenin,GN)是启动糖原合成的第一个限速酶。目前，大多数关于GN的研究主要集中在动物或人类(Bischof et al.,2013；Liu et al.,2021)。最早，GN被发现是位于糖原颗粒的核心蛋白，主要作为一种动物细胞能量储备形式(Cheng et al.,1995)。而植物通常以淀粉作为能量储备形式(Ball et a.,1996；Roach et al.,2012；Liuet al.,2021)。但最近有研究报道，GN可以影响红藻(Cyanidioschyzon merolae)细胞(Pancha et al.,2019)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶片(Chatterjee et al.,2005)等非贮藏器官淀粉的合成；而香蕉果实、谷物种子、马铃薯块茎和木薯块根等作为典型的贮藏器官，是人类饮食碳水化合物和食品加工原材料的主要来源，至今未见GN对植物贮藏器官发育或淀粉代谢影响的报道。

因此，开展香蕉MaGN12基因在植物贮藏器官中的应用研究是全新的，同时对增加果实体积、提高果实产量和培育高淀粉香蕉新品种具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供香蕉MaGN12基因在调控香蕉果实生长上的应用。

本发明的第一个方面是提供MaGN12基因在调控香蕉果实生长上的应用。

其中，过表达MaGN12基因增加了香蕉果指长度、果指宽度、果穗长度，提高了果实重量，提高了果实总淀粉含量，增加了支链淀粉含量，增加了果实<100DP短链多糖链链长分布，增加了果实质体中淀粉颗粒数量，增加了果实中淀粉颗粒数量，增加了果实中<50μm淀粉颗粒数量。

因此，本发明的第二个方面是提供香蕉MaGN12基因在增加果指长度、和/或增加果指宽度、和/或增加果穗长度、和/或提高果实重量、和/或提升果实总淀粉含量、和/或增加支链淀粉含量、和/或增加果实<100DP短链多糖链链长分布、和/或增加果实质体中淀粉颗粒数量、和/或增加果实中淀粉颗粒数量、和/或增加果实中<50μm淀粉颗粒数量中的应用。

本发明的第三个方面是提供含有香蕉MaGN12基因编码区的重组载体或宿主菌在调控果实生长上的应用。

其中，所述重组载体的原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采用pBI121载体质粒，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。

优选地，所述的果实为香蕉果实。

优选地，所述重组载体的原始载体为pBI121载体，香蕉MaGN12基因编码区序列位于pBI121载体的Xba I和Sac I两种限制性内切酶位点之间。

所述重组载体或宿主菌使过表达MaGN12基因增加了香蕉果指长度、果指宽度、果穗长度，提高了果实重量，提高了果实总淀粉含量，增加了支链淀粉含量，增加了果实<100DP短链多糖链链长分布，增加了果实质体中淀粉颗粒数量，增加了果实中淀粉颗粒数量，增加了果实中<50μm淀粉颗粒数量。

因此，本发明的第四个方面是提供含有香蕉MaGN12基因编码区的重组载体或宿主菌在增加香蕉果指长度、和/或增加果指宽度、和/或增加果穗长度、和/或提高果实重量、和/或提升果实总淀粉含量、和/或增加支链淀粉含量、和/或增加果实<100DP短链多糖链链长分布、和/或增加果实质体中淀粉颗粒数量、和/或增加果实中淀粉颗粒数量、和/或增加果实中<50μm淀粉颗粒数量中的应用。

本发明提供了一种过表达糖原起始合成酶基因MaGN12在调控香蕉果实生长中的应用，过表达MaGN12能够显著增加香蕉果实大小，提高果实产量，例如将MaGN12基因导入香蕉中，获得35S启动子驱动的MaGN12转基因香蕉8个独立株系，过表达该基因提高了MaGN12表达量、果指长度、果指宽度、果穗轴长度、果实重量，总淀粉含量、支链淀粉含量、短链多糖链合成，每个质体中淀粉颗粒数量也显著增加，果实中<50μm淀粉颗粒数量明显增加，对增加果实体积、提高果实产量和培育高淀粉香蕉新品种具有重要意义。

附图说明

图1中(a)pBI121-MaGN12载体构建模式图；(b-c)pBI121-MaGN12质粒转化至EHA105农杆菌菌株，浸染未成熟雄花薄片的结果图；(d-f)香蕉中过表达MaGN12基因后不定芽和植株生长情况；(g)MaGN12转基因植株Southern blot分析图，M：Southern blot分析Marker，PC：阳性对照(pBI121载体质粒)，WT：野生型香蕉，L3、L8、L9、L10、L13、L14、L15和L25：MaGN12转基因香蕉植株；(h)MaGN12转基因香蕉植株的表达分析。

图2为实时荧光定量PCR仪(Mx3000P，Stratagene)中以MaActin为内参基因进行扩增检测的扩增反应运行程序。

图3为探针电泳检测。Lane M：DL2000 DNAMarker，Lane 1：dUTP标记的DNA探针HYG，Lane 2：对照的DNA片段HYG。

图4为基因组DNA的电泳检测结果。Lane M：DL2000 DNA Ladder，Lane 1：WT香蕉，Lane 2～9：MaGN12转基因香蕉1～8。

图5为基因组DNA酶切电泳检测结果。Lane M：DL5000 DNA Ladder，Lane 1：WT香蕉，Lane 2～9：MaGN12转基因香蕉1～8。

图6为香蕉中过表达糖原合成起始酶基因MaGN12导致果穗轴变长和果指变大的结果图。WT：野生型香蕉；L3、L8和L14：MaGN12转基因香蕉植株。

图7为香蕉中过表达MaGN12基因导致果指变长、变宽，果实重量增加和淀粉含量提升的结果图。(a)果指表型，标尺＝3厘米；(b)果实重量；(c)果指长度；(d)果指宽度；(e)淀粉含量；(f)直链淀粉含量；(g)支链淀粉含量；(h–k)MaGN12转基因香蕉果实淀粉中多糖链链长分布，WT：野生型玫瑰蕉，L3、L8和L14：MaGN12转基因香蕉植株，DP：多糖链链长。*和**代表与WT相比较，MaGN12转基因香蕉植株相关指标分别达到差异显著(*p<0.05)和差异极显著水平(**p<0.01)。

图8为香蕉中过表达MaGN12基因导致果实中淀粉颗粒数量增加的结果图。WT：野生型玫瑰蕉；L3、L8和L14：MaGN12转基因香蕉植株，标尺＝100μm。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

一、pBI121-MaGN12表达载体构建

将香蕉果实糖原起始合成酶基因MaGN12的核苷酸序列(1407bp)，其序列见已授权发明专利(ZL201910266092.0)；利用Xba I和Sac I两种限制性内切酶分别对目的片段及pBI121载体质粒双酶切，将酶切后的目的片段与植物表达载体pBI121片段进行回收、连接、转化及测序验证正确，即得香蕉果实糖原起始合成酶基因MaGN12的表达载体，pBI121-MaGN12载体构建模式图，详见图1a。

二、pBI121-MaGN12表达载体转化至香蕉未成熟雄花薄片诱导的多芽体

用上述的表达载体重组质粒通过农杆菌转化至香蕉未成熟雄花诱导的多芽体。农杆菌转化法具体实验步骤如下：

(1)pBI121-MaGN12载体的农杆菌转化：

取200μL冰浴上融化的根癌农杆菌EHA105感受态细胞，加入pBI121-MaGN12重组质粒5μg，轻轻混匀，在冰浴中放置30min；转入液氮中冷冻3min，迅速置37℃水浴中温育5min；加入800μL YEP液体培养基，28℃，250rpm预培养3～4h；吸取100μL菌液至含有50mg/L卡那霉素(Kan)和50mg/L利福平(Rif)的YEP固体选择培养基上，均匀涂布于整个平板；将平板置于28℃培养2～3天，挑选单菌落，验证检测，将转化正确的农杆菌菌液用于下一步实验。

(2)根癌农杆菌介导香蕉遗传转化：

将已经转化pBI121-MaGN12重组载体的根癌农杆菌EHA105菌液取20μL到10mL含有50mg/L Kan和50mg/L Rif的YEP液体培养基中过夜活化培养；吸取活化培养的菌液1mL到新的50mL含有50mg/L Kan和50mg/L Rif的YEP液体培养基中培养至OD600到0.5左右；将所需浓度的菌液于超净工作台上转移到50mL无菌离心管中，4℃，3000rpm离心5min，弃去上清液，加入等体积(离心前菌液体积)的MS液体培养基将菌体重新悬浮；将菌液转移到100mL无菌三角瓶中，加入0.1％(重悬菌液体积)乙酰丁香酮(AS)，充分混匀，备用。

在超净工作台上将香蕉未成熟雄花薄片诱导的多芽体切成厚度为3mm的薄片，转移至农杆菌菌液中浸泡15min，期间摇动菌液使外植体于菌液充分接触；将外植体取出置于无菌滤纸上，吸干外植体表面多余的菌液，然后将其转移到含有乙酰丁香酮的MS分化培养基上，25℃黑暗培养2天；将共培养的薄片转移到含有200mg/L特美汀的MS分化培养基上，于25℃，2000LUX光照强度，16h光照，8h黑暗条件下培养两周时间；薄片转移到含有200mg/L特美汀和15mg/L潮霉素的MS分化培养基上，于25℃，2000LUX光照强度，16h光照，8h黑暗条件下培养。每两周继代培养一次。待薄片愈伤组织长出不定芽到2cm左右时，切取并于含有200mg/L特美汀和20mg/L潮霉素的MS生根培养基(MS固体培养基+0.2mg/L IAA)上，于25℃，2000LUX光照强度，16h光照，8h黑暗条件下培养。培养两周待其分化出根之后，选择能够正常生长的香蕉幼苗进行炼苗，然后将其移栽种植。

MaGN12农杆菌菌株浸染香蕉未成熟雄花薄片后，愈伤、不定芽和生根苗的生长情况如图1b-1f所示，图1b显示MaGN12农杆菌菌株浸染香蕉未成熟雄花薄片后，经过暗培养2周，光照培养45天，能够观察到明显的白色愈伤；图1c显示，继续培养135天，能够观察到萌发的芽点，同时受潮霉素筛选影响，有些愈伤没有萌发芽点；图1d显示，继续分化培养基上培养30天，能够观察多个不定芽；图1e显示，切取2cm不定芽到生根培养基上，15天后能观察到明显的白色幼根；图1f显示，转MaGN12基因后生根苗生长情况，炼苗后可移栽。

三、转化株系的检测

(1)香蕉基因组DNA提取及阳性转化植株检测

使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，天根生化科技(北京)有限公司)提取DNA，其具体实验方法见说明书。

(2)转化香蕉株系Southern blot鉴定

为进一步检测外源基因MaGN12在香蕉基因组中的整合，以转化香蕉植株为材料，以非转化WT野生型香蕉植株为阴性对照，以转化使用的菌株质粒为阳性对照，对转化香蕉株系进行Southern blot鉴定，其具体实验方法步骤如下：

①探针制备：采用PCR制备探针，PCR反应体系和PCR反应程序分别如表1和表2所示。

表1 PCR反应体系

表2 PCR反应程序

②标记探针电泳分析：标记后PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图3所示，探针成功标记后分子量增加，电泳条带滞后。

③基因组DNA的提取酶切：将提取的样品基因组DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示。图4显示提取的基因组DNA有明亮的单一条带，说明提取的基因组DNA质量较好，能够满足Southern blot实验要求。

④对基因组进行酶切：酶切体系如表3所示。内切酶分两次加入，第一次加10μL，温和搅拌，37℃消化2h，再加入10μL，温和搅拌，37℃消化过夜(约16h)，次日再加入10μL，继续反应4h。各取5μL，进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示，采用EcoR I单酶切基因组DNA，电泳检测能够看到均匀的弥散带，能够满足Southern blot实验要求。酶切后的DNA用等体积酚：氯仿抽提，产物溶于50μL去离子水。

表3基因组DNA酶切体系

⑤质粒酶切：采用如表4所示酶切体系对pBI121质粒进行酶切，37℃消化2h。

表4质粒酶切体系

⑥电泳：将制备好的样品进行0.7％的琼脂糖凝胶电泳，25V恒压、4℃、过夜。

⑦转膜：将胶置于平皿、用蒸馏水冲洗一次后，加入3倍体积变性液室温振荡45min。用蒸馏水冲洗2次。加入中和液室温振荡2×15min。用蒸馏水冲洗2次。加入2×SSC以平衡凝胶和带正电荷的尼龙膜5min。向上毛细管法进行转膜20h。取下膜作好标记，在2×SSC中漂洗一次，80℃烘烤固定2h。

⑧杂交-预杂交：取10.0mL Hyb-100，加入杂交管中，37℃预杂交2h。探针变性：探针在PCR仪中100℃变性10min，立即放冰水浴冷却5min。杂交：排尽预杂交液，在10mL Hyb-100中加入20μL新变性好的探针，混匀。37℃杂交过夜。

⑨洗膜、信号检测：杂交后室温下，20mL 2×SSC/0.1％ SDS洗膜2×5min。65℃，20mL1×SSC/0.1％SDS洗涤2×15min。再将膜置于20mL洗涤缓冲液中平衡2-5min。将膜在10mL封闭液中封闭30min(在摇床上轻轻摇动)。Anti-Dig-AP在10000r/min下离心5min。离心后将Anti-Dig-AP用封闭液稀释(1∶5000)，2.0μL Anti-Dig-AP加入10mL封闭液混匀。封闭完成后倒出封闭液，加入稀释好的10mL抗体溶液，浸膜至少30min。去除抗体溶液，用20mL洗涤缓冲液缓慢洗膜2次，每次15min。在膜的正面(核酸面)滴加1mL CSPD，隔绝空气15-25℃反应5min，去除多余的液体，37℃孵育10min。机器曝光并记录实验结果。

结果如图1g所示，阳性质粒有条带，野生型WT没有条带，而转MaGN12基因株系L3、L8、L9、L10、L13、L14、L15和L25能够清楚地分辨出单一条带或多个条带，证明MaGN12基因已成功转化至香蕉基因组，且不同株系含有不同的拷贝数。

(3)香蕉果实MaGN12表达水平分析

以转基因株系采收期果实cDNA为模板，对MaGN12基因在香蕉不同转基因株系的表达进行分析，其反应体系及具体实验方法如下：

在200μL的PCR管中加入以下个组分，其反应体系如下：

吸打混匀，瞬时离心数秒，然后于实时荧光定量PCR仪(Mx3000P，Stratagene)中以MaActin为内参基因进行扩增检测，每个样品重复三次，扩增反应运行程序如图2所示。

结果如图1h所示，与野生型玫瑰蕉相比较，MaGN12基因在香蕉转基因株系L3、L8和L14中的相对表达量增加了约58～99倍。

(4)香蕉果穗长度检测

以转化MaGN12基因的香蕉株系，野生型WT香蕉株系的采收期果穗为材料，拍照；卷尺测量果穗长度。

结果如图6所示，野生型香蕉株系采收期果穗长度为34cm，转基因株系L3、L8和L14在采收期果穗长度分别为68cm、78cm和72cm，与野生型相比较，转基因株系L3、L8和L14在采收期果穗长度分别增加了34cm、44cm和38cm，约1～2倍。

(5)香蕉果实重量、果指长度和果指宽度检测

以转化MaGN12基因的香蕉株系，野生型WT香蕉株系的采收期果实为材料，拍照；台秤称取果实重量；游标卡尺测量果指长度和果指宽度。

结果如图7a-7d所示，与野生型相比较，转基因株系L3、L8和L14在采收期果实重量、果指长度和果指宽度分别增加了约368.30～1292.70g、1.47～3.07cm和0.38～0.55cm，均具有显著性差异。

(6)香蕉果实总淀粉含量测定

以转化MaGN12基因的香蕉株系，野生型WT香蕉株系的采收期果实为材料，取香蕉果肉在1.5％的NaHSO3中护色10min，于40℃恒温箱中烘干24h，磨成香蕉粉。取100mg香蕉粉于15mL离心管中，加入5mL的80％乙醇，充分振荡混匀。4000rpm离心5min后弃上清，沉淀用5mL蒸馏水悬浮洗涤一次，再次离心后沉淀用5mL的80％Ca(NO₃)₂悬浮，沸水浴中放置10min，4000rpm离心5min后将上清液转入20mL容量瓶中。取淀粉液1mL，用80％Ca(NO₃)₂补充至2mL，加入100μL的0.01N I₂-KI溶液，混匀后于620nm波长下测定吸光度值，代入标准曲线即可计算出样品淀粉含量。

结果如图7e所示，与野生型相比较，转基因株系L3、L8和L14在采收期果实中淀粉含量分别增加了约14.45％、21.56％和15.19％，具有显著性差异。

(7)香蕉果实直链淀粉和支链淀粉含量测定

称取100mg的香蕉粉与50ml离心管中，加入1mL的95％乙醇和9mL的1mol/L的NaOH，40℃恒温箱内放置24h。将溶液移入100mL容量瓶中并用蒸馏水定容，混匀后取5mL移入新的100mL容量瓶中，加入1mL的1mol/L醋酸和2mL的I₂-KI溶液后定容至100mL。在30℃恒温箱中静置20min，在620nm波长下测定吸光度值，代入标准曲线，计算样品直链淀粉、支链淀粉含量。

结果如图7f和7g所示，与野生型相比较，转基因株系L3、L8和L14在采收期果实中直链淀粉含量分别增加了约0.85％、2.19％和1.79％，支链淀粉含量分别增加了约13.94％、19.37％和13.40％，具有显著性差异。

(8)淀粉中多糖链链长的测定方法

通过Agilent 1100series size-exclusion chromatography(SEC)系统(AgilentTechnologies,德国)和Shimadzu RID-10A refractive index detector(ShimadzuCrop.,日本)测定了淀粉中多糖链链长，具体方法参考Castro等(2005)和Sullivan等(2010)的报道。

结果如图7h-7k所示，与野生型WT相比较，转基因株系L3、L8和L14在采收期果实淀粉中显著增加了<100DP多糖链链长的分布；图7h显示野生型WT多糖链链长的分布，在1-100DP之间有明显的峰值；图7i显示转基因株系L3多糖链链长分布，与野生型相比，在1-100DP之间多糖链链长分布的峰面积约是WT的1.5倍；图7j显示转基因株系L8多糖链链长分布，与野生型相比，在1-100DP之间多糖链链长分布的峰面积约是WT的2.1倍；图7k显示转基因株系L14多糖链链长分布，与野生型相比，在1-100DP之间多糖链链长分布的峰面积约是WT的2.0倍；说明香蕉转基因株系L3、L8和L14<100DP多糖链链长分布显著高于WT。

(9)石蜡切片方法

香蕉果肉石蜡切片用1％番红溶液染色1～2小时，然后用50％、70％和80％梯度乙醇脱色1分钟；然后0.5％固绿溶液中染色30～60秒，无水乙醇脱色1分钟。60℃干燥后，二甲苯使切片透明5分钟，中性树胶封片。尼康Eclipse E100显微镜观察图像，拍照。

结果如图8所示，转基因株系L3、L8和L14果实每个质体中淀粉颗粒数量为3-6个，而野生型果实每个质体中淀粉颗粒数量为1-2个，转MaGN12显著增加了香蕉果实每个质体中淀粉颗粒数量。

(10)扫描电镜

香蕉果肉样品被固定根据Miao等(2017b)的报道。样品被观察拍照在FEI Quanta600FEG扫描电镜(FEI Company,Hillsboro,OR,USA)。

结果如图8所示，与野生型相比较，转基因株系L3、L8和L14果实淀粉颗粒数量显著增多，特别是<50μm淀粉颗粒显著增多。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.过表达香蕉MaGN12 基因在增加香蕉果指长度、和/或增加果指宽度、和/或增加果穗长度、和/或提高果实重量、和提升果实总淀粉含量、和增加支链淀粉含量、和/或增加< 100DP短链多糖链链长分布、和增加质体中淀粉颗粒数量、和增加果实中淀粉颗粒数量、和/或增加果实中< 50 μm淀粉颗粒数量中的应用。

2.含有香蕉MaGN12基因编码区的重组载体或宿主菌在增加香蕉果指长度、和/或增加果指宽度、和/或增加果穗长度、和/或提高果实重量、和提升果实总淀粉含量、和增加支链淀粉含量、和/或增加香蕉果实< 100 DP短链多糖链链长分布、和增加果实质体中淀粉颗粒数量、和增加果实中淀粉颗粒数量、和/或增加果实中 < 50 μm淀粉颗粒数量中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述重组载体的原始载体为pBI121载体，香蕉MaGN12基因编码区序列位于pBI121载体质粒的Xba I和Sac I两种限制性内切酶位点之间。