CN105203362B - 一种快速鉴别霍山石斛的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速鉴别霍山石斛的方法。操作步骤如下：（1）测量被测石斛每节的直径和长度，并与霍山石斛的特征比对；（2）对被测石斛的各节进行徒手切片，并置显微镜观察、拍照，数维管束个数，与霍山石斛的特征比对；（3）对被测石斛进行石蜡切片；（4）将石蜡切片置于显微镜下观察，看其维管束鞘类型、有无硅质块、有无针晶束及针晶束存在位置等，并与霍山石斛的特征比对；确定被测石斛是否属于霍山石斛。本发明采用性状和显微特征相结合的方法来快速鉴别霍山石斛，简便、快速、高效、实用、经济，可实现霍山石斛的及时鉴别，为临床准确用药及质量保证提供保障。

Description

一种快速鉴别霍山石斛的方法

技术领域

本发明属于中药种质来源的鉴别技术领域，具体涉及一种根据性状和显微特征来鉴别霍山石斛的方法。

背景技术

石斛属是兰科的一个大属，全世界共1100多个种。中国石斛属植物有74个种和2个变种，其中有40多种石斛属植物曾被用作传统或民间药物。石斛味甘、微寒。有益胃生津、滋阴退热的功效。临床应用于热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨微软等。其中，尤以霍山石斛质量为佳。

霍山石斛（Dendrobium huoshanenese Tang et Cheng）俗称米斛，仅发现于安徽省大别山区。始载于《神农本草经》，被列为上品。其最早的产地记载见于《范子计然》，“石斛，出六安”。而霍山石斛以单条目出现，则是在清代赵学敏的《本草纲目拾遗》中，被叫做“霍石斛”。《百草镜》:石斛近时有一种形短只寸许，细如灯心，色青黄，咀之味甘，微有滑涎，系出六安州及颍州府霍山县，名霍山石斛，最佳。

然而，作为一个珍稀濒危的中药，有限的支出和巨大的需求导致霍山石斛价格急剧上升，霍山石斛茎的加工品价格高达7-10万元/Kg。霍山产石斛除了霍山石斛外，还有铁皮石斛、细茎石斛和河南石斛，其价格相对霍山石斛都比较低，但它们形态和解剖学特征又比较相似。因此，市场上的一些混伪品因价格悬殊而激增。而石斛的商品大多加工成枫斗，为鉴别增加了难度。因此，为了安全有效和质量控制，有必要研究一种有效的和可靠的方法来鉴定和区分霍山石斛。

近年来很多学者对石斛类药材的真伪鉴别进行了研究，但大多集中在铁皮石斛的鉴别上，而对霍山石斛的研究相对较少。2010版药典只对市场上几个主流石斛（金钗石斛、鼓槌石斛、流苏石斛和铁皮石斛）提供了传统显微鉴别法或薄层鉴别法来判断其真伪，而对霍山石斛的鉴别没做记录。目前对霍山石斛的鉴别方法主要是通过叶绿体基因组或分子标记指纹图谱等分子生物学手段。张潇潇等利用特异性引物对霍山石斛及其形态学相似的9种石斛进行分子鉴别，当退火温度调至66℃时，只有霍山石斛的模板DNA能被扩增出来，进而达到有效区分霍山石斛与其形态学相似的常见混淆种的目的。胡甜等采用微型近红外光谱仪MicroNIR 1700实现对来自于三个不同种的五个不同商品等级的霍山石斛鉴别研究。随着现代分子生物学技术的不断成熟，又因其稳定性好、特异性强、所需样品量少等优点，分子鉴别已广泛应用于中药真伪品鉴别。但其操作技术较为复杂、成本偏高且缺乏专业技术人员，对霍山石斛的鉴别仍有局限性。

传统的性状与显微鉴别作为药材基源鉴定的重要手段，具有简捷、快速、准确、经济等优点。有关石斛属植物茎的显微结构已有相关报道，徐珞珊等对石斛属植物的显微结构曾做过系列研究；楚楚等采用普通光学显微镜与荧光显微镜相结合的方法来鉴别铁皮石斛及其混伪品的显微结构。然而霍山石斛、河南石斛等的显微结构的重要鉴别特征还仍未见报道。

发明内容

为了实现对霍山石斛的快速鉴别，本发明提供一种快速鉴别霍山石斛的方法。

一种快速鉴别霍山石斛的操作步骤如下：

（1）测量被测石斛每节的直径和长度，与霍山石斛的直径和长度特征比较；保留符合条件的一测石斛；

（2）对一测石斛的各节进行徒手切片，显微镜观察、拍照，数维管束个数；与霍山石斛的维管束特征比较；保留符合条件的二测石斛；

（3）对二测石斛进行石蜡切片，得到中性树胶封片；

（4）对中性树胶封片进行显微镜观察，与霍山石斛的特征条件比较；符合条件的被测石斛属于霍山石斛，否则不属于霍山石斛。

一种快速鉴别霍山石斛的具体操作步骤如下：

（1）测量被测石斛每节的直径和长度，通过Excel和SPSS软件对所测数据进行分析，得到被测石斛各节直径和长度变化趋势图；

霍山石斛茎的每节直径和长度特征是：每节长度在2.5-22.6mm之间，从基部到茎尖的整体变化趋势是先增加后减小，在第2或第3节达到最大；霍山石斛每节直径在0.7-5.6mm之间，从基部到茎尖的整体变化趋势是逐渐减小，基部最粗，茎尖最细；

将被测石斛的各节直径和长度变化趋势图与霍山石斛的直径和长度特征比较；对于符合霍山石斛各节直径和长度特征的被测石斛确定为一测石斛，保留；不符合的被测石斛放弃；

（2）对一测石斛茎的各节进行徒手切片，将切片置于显微镜下观察并拍照，数维管束个数，得到霍山石斛各节维管束数目变化趋势图；

霍山石斛的维管束特征是：每节维管束个数在9-40个不等，从基部到茎尖的整体变化趋势是逐渐减小，基部维管束数目最多，茎尖维管束数目最少；

将一测石斛的各节维管束数目变化趋势图与霍山石斛的维管束特征比较；对于符合霍山石斛的维管束特征的一测石斛确定为二测石斛，保留；不符合条件的一测石斛放弃；

（3）对二测石斛进行石蜡切片，得到中性树胶封片；

（4）将中性树胶封片置于物镜下观察其显微特征，若观察到诸多大小相近的维管束，且数目在9-40个，基部茎节维管束数目最多，中部较次，顶部最少；维管束鞘呈双帽形，偶成环形；则该被测石斛属于霍山石斛，否则不属于霍山石斛。

本发明的有益技术效果体现在以下方面：

1.本发明采用性状和显微特征相结合的方法来快速鉴别霍山石斛，简便、快速、高效、实用、经济，可实现霍山石斛的及时鉴别，为临床准确用药及质量保证提供保障。

2.首次采用连续测量法测量霍山石斛茎各节直径、长度和维管束数目的整体变化规律。为石斛类药材的真伪鉴别提供一个新方法。

3.首先测量霍山石斛茎各节长度，得到其变化规律。该操作方便易行，不论是新鲜霍山石斛还是霍山枫斗，只要有尺子，随时随地都可测量。目前市场上多用其他石斛减短后冒充霍山石斛，但是石斛种质不同，茎各节长度不同，其变化规律也不同，这是无法模仿的，此时便可淘汰一部分混伪品。

4.接着测量霍山石斛茎各节直径，得到其变化规律。虽然市场上用其他石斛剪断后冒充霍山石斛，茎各节长度相同，但是霍山石斛茎各节直径变化规律特征明显，是其他石斛所不具备的，此时又可淘汰一部分伪品。

5.徒手切片测量霍山石斛各节维管束数目及其变化规律。石斛的黏性及嚼后渣的多少与石斛种类有关，准确来说是和石斛中维管束的多少有关。霍山石斛维管束数目较少，各节维管束数目变化规律明显，可区分其他伪品。徒手切片快速简单，方法容易掌握，即使是没有专业基础的人也很快就能上手。

附图说明

图1是霍山石斛茎各节长度图；

图2是4种石斛茎各节长度图；

图3是霍山石斛茎各节直径图；

图4是4种石斛茎各节直径图；

图5是霍山石斛茎各节维管束数目图；

图6是4种石斛茎各节维管束数目图；

图7是4种石斛茎横切片的显微特征图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。

实施例1 : 已确定霍山石斛的性状及显微特征鉴别

1.材料与试剂

于2014年10月从霍山购得霍山石斛新鲜的茎，经过安徽中医药大学彭华胜教授鉴定，均为兰科植物霍山石斛Dendrobium huoshanense的新鲜茎条。

FAA溶液，酒精（70%、80%、85%、90%、95%、100%），二甲苯，石蜡，中性树胶，番红-固绿染液；

2.仪器与软件

1-150mm量程的游标卡尺（上海量具刃具厂，中国上海）；

Leica DM6000 B显微镜(Leica, Benshein, Germany)；

Olympus BH-2显微镜；

Leica RM2265旋转切片机；

LAS软件 (Leica Applications Suite V4.1)；

Photoshop CS6；Excel；SPSS17.0；AI CS6

3.实验步骤

（1）取10根待测样品，待测样品新鲜茎条置于实验台上，用刀片把每节割断并编号，从茎的基部开始编号，编号从1开始，然后依次增加；用1-150mm量程的游标卡尺分别对其各节的长度和直径进行测量并记录；所测直径部位为各节节间中部；然后把所得数据输入Excel表格，作折线图；把数据再次生成SPSS数据，用SPSS17.0做箱式图。

将被测石斛的各节直径和长度变化趋势图与霍山石斛的直径和长度特征比较；若符合霍山石斛各节直径和长度特征，则被测石斛确定为一测石斛，保留；若被测石斛不符合霍山石斛特征，则放弃；

（2）对一测石斛茎的各节进行徒手切片；取10根待测样品，用自来水冲洗干净，分别在各节的节间中部进行徒手切片，厚度为500um内；首先用左手的拇指、食指和中指固定材料，右手持刀，手臂用力，使刀口从左前方缓慢向右后方下滑，刀面不断加水润滑；切片置成水装片；把水装片放在普通光学显微镜下观察并拍照；把所得图片用PS合成处理后，数维管束数目并记录；编号方法同步骤1。

将一测石斛的各节维管束数目变化趋势图与霍山石斛的维管束特征比较；若符合霍山石斛的维管束特征的一测石斛确定为二测石斛，保留；若不符合条件，则一测石斛放弃。

（3）对二测石斛进行石蜡切片法；在二测石斛的新鲜茎的上、中、下三部分节间取样，厚度为0.3-0.5cm，FAA溶液固定，抽气，24h后转移至浓度70%的酒精中；再经不同浓度酒精梯度脱水后浸蜡、换蜡、包埋、修块， LEICA RM2265 石蜡切片机切片，厚度为10～15μm，粘片，烘片24h以上；番红-固绿对染后，得到中性树胶封片。

（4）将中性树胶封片置于Leica DM6000 B显微镜的载物台上；开启电源，调节光亮度；选择普通光源；调节焦距，先在低倍镜下观察，再调到高倍镜下观察。找到合适清晰的视野，拍照，关闭显微镜。把所拍碎片经PS合成处理。

将所观察到的中性树胶封片特征与霍山石斛特征对比；若特征相同，则该待测样品为霍山石斛，若特征不同，则不属于霍山石斛。

4.结果与分析

霍山石斛的性状特征：由图1可知，霍山石斛每节长度在2.5-22.6mm之间，从基部到茎尖的整体变化趋势是先增加后减小，在第2或第3节长度达到最大。由图3可知，霍山石斛每节直径在0.7-6.0mm之间，从基部到茎尖的整体变化趋势是逐渐减小，基部最粗(3.8-6.0mm)，茎尖最细(0.7-1.6mm)。

霍山石斛的显微特征：

（1）霍山石斛茎各节维管束数目变化趋势：由图5可知，霍山石斛每节维管束个数在9-40个不等，从基部到茎尖的整体变化趋势是逐渐减小，基部维管束数目最多，茎尖维管束数目最少；

（2）霍山石斛茎横切面结构：茎横切面圆形。最外面偶可见一圈残留的叶鞘，有薄壁细胞和维管束组成。表皮由一列扁平的细胞组成，细胞壁稍木质化，外面覆盖一层黄色或橘黄色的角质层。维管束散在在薄壁细胞中，有限外韧型，大小相似，9-40个不等，基部茎节维管束数目最多，中部较次，顶部最少。维管束鞘纤维群呈双帽状，外侧纤维群偶与木质部内侧的纤维群相连成环形，有1-2列纤维，外侧纤维直径普遍比内侧纤维要小。薄壁细胞大小相似，近维管束处薄壁细胞较小，偶可见硅质块分布。草酸钙针晶束分布于近表皮处薄壁细胞及维管束旁薄壁细胞中。薄壁细胞中有淀粉粒存在。

总结霍山石斛性状和显微鉴别点在于：

（1）茎各节长度：霍山石斛茎各节长度从基部到茎尖的整体变化趋势是先增加后减小，在第2或第3节长度达到最大。每节长度在2.5-22.6mm之间。（图1）

（2）茎各节直径：霍山石斛每节直径在0.7-6.0mm之间，从基部到茎尖的整体变化趋势是逐渐减小，基部最粗(3.8-6.0mm)，茎尖最细(0.7-1.6mm)。（图3）

（3）茎各节维管束数目：霍山石斛每节维管束个数在9-40个不等，从基部到茎尖的整体变化趋势是逐渐减小，基部维管束数目最多（23-40个），茎尖维管束数目最少（9-18个）。（图5）

（4）维管束散在在薄壁细胞中，有限外韧型，大小相似，9-40个不等。维管束鞘纤维群呈双帽状，外侧纤维群偶与木质部内侧的纤维群相连成环形，有1-2列纤维，外侧纤维直径普遍比内侧纤维要小。（图7）

（5）薄壁细胞大小相近，近维管束处薄壁细胞较小，偶可见硅质块分布。有淀粉粒存在。（图7）

（6）草酸钙针晶束分布于近表皮处薄壁细胞及维管束旁薄壁细胞中。成束或散在。（图7）

5.霍山石斛品种的确证

将所测样品的相应标本按照《中国植物志》进行鉴定。

鉴别标准与具体方法如下：将待测样品的标本平铺于桌面，观察、测量其根、茎、叶特征，并用放大镜对其花进行解剖：待测样品原植物茎直立，肉质，长3-9厘米，从基部上方向上逐渐变细，基部上方粗3-18毫米，不分枝，具3-7节，节间长3-8毫米，淡黄绿色，有时带淡紫红色斑点，干后淡黄色。叶革质，2-3枚互生于茎的上部，斜出，舌状长圆形，长9-21厘米，宽5-7毫米，先端钝并且微凹，基部具抱茎的鞘；叶鞘膜质，宿存。总状花序1-3个，从落了叶的老茎上部发出，具1-2朵花；花序柄长2-3毫米，基部被1-2枚鞘；鞘纸质，卵状披针形，长3-4毫米，先端锐尖；花苞片浅白色带栗色，卵形，长3-4毫米，先端锐尖；花梗和子房浅黄绿色，长2-2.7厘米；花淡黄绿色，开展；中萼片卵状披针形，长12-14毫米，宽4-5毫米，先端钝，具5条脉；侧萼片镰状披针形，长12-14毫米，宽5-7毫米，先端钝，基部歪斜；萼囊近矩形，长5-7毫米，末端近圆形。花瓣卵状长圆形，通常长12-15毫米，宽6-7毫米，先端钝，具5条脉；唇瓣近菱形，长和宽约相等，1-1.5厘米、基部楔形并且具1个胼胝体，上部稍3裂，两侧裂片之间密生短毛，近基部处密生长白毛；中裂片半圆状三角形，先端近钝尖，基部密生长白毛并且具1个黄色横椭圆形的斑块；蕊柱淡绿色，长约4毫米，具长7毫米的蕊柱足；蕊柱足基部黄色，密生长白毛，两侧偶然具齿突；药帽绿白色，近半球形，长1.5毫米，顶端微凹。花期5月。

结果表明，待测样品的原植物标本符合《中国植物志》中对霍山石斛原植物的记载。说明待测样品为霍山石斛Dendrobium huoshanense。

实施例2 : 未知霍山石斛的性状及显微特征鉴别

1.材料与试剂

从安徽霍山购得十批石斛样品。

试剂同实施例1.

2.仪器与软件

同实施例1

3.实验步骤

（1）将被测石斛每批各选取20根样品茎条置于实验台上，用刀片把每节割断并编号，从茎的基部开始编号，编号从1开始，然后依次增加；用1-150mm量程的游标卡尺分别对其各节的长度和直径进行测量并记录；所测直径部位为各节节间中部。然后把所得数据输入Excel表格，作折线图；把数据再次生成SPSS数据，用SPSS17.0做箱式图。

将被测石斛的各节直径和长度变化趋势图与霍山石斛的直径和长度特征比较；对于符合霍山石斛各节直径和长度特征的被测石斛确定为一测石斛，保留；不符合的被测石斛放弃；

（2）将一测石斛样品每批各取20根样品进行徒手切片，用自来水冲洗干净，分别在各节的节间中部进行徒手切片，厚度为500um内；首先用左手的拇指、食指和中指固定材料，右手持刀，手臂用力，使刀口从左前方缓慢向右后方下滑，刀面不断加水润滑；切片置成水装片；把水装片放在普通光学显微镜下观察并拍照；把所得图片用PS合成处理后，数维管束数目并记录；编号方法同步骤1。

将一测石斛的各节维管束数目变化趋势图与霍山石斛的维管束特征比较；对于符合霍山石斛的维管束特征的一测石斛确定为二测石斛，保留；不符合的一测石斛放弃；

（3）对二测石斛进行石蜡切片；将二测石斛新鲜茎的上、中、下三部分节间取样，厚度为0.3-0.5cm，FAA溶液固定，抽气，24h后转移至浓度70%的酒精中；再经不同浓度酒精梯度脱水后浸蜡、换蜡、包埋、修块， LEICA RM2265 石蜡切片机切片，厚度为10～15μm，粘片，烘片24h以上；番红-固绿对染后，得到中性树胶封片。

（4）将中性树胶封片置于Leica DM6000 B显微镜的载物台上；开启电源，调节光亮度；选择普通光源；调节焦距，先在低倍镜下观察，再调到高倍镜下观察。找到合适清晰的视野，拍照，关闭显微镜。把所拍碎片经PS合成处理。

将所得图像与霍山石斛显微特征对比。若特征相同，则该待测样品为霍山石斛，若特征不同，则不属于霍山石斛。

4.结果与分析

（1）第1批、第2批、第8批和第9批石斛样品每节长度均在2.5-22.6mm之间，从基部到茎尖的整体变化趋势是先增加后减小，在第2或第3节长度达到最大；每节直径在0.7-6.0mm之间，从基部到茎尖的整体变化趋势是逐渐减小，基部最粗(3.8-6.0mm)，茎尖最细(0.7-1.6mm)；符合霍山石斛茎各节长度与直径特征，定为一测石斛，进入下一步验证；第3批、第4批、第6批和第7批石斛样品每节长度在4.0-35.3mm之间，不符合霍山石斛茎长度特征，予以淘汰。第5批和第10批石斛样品每节直径在1.1-4.5mm之间，从基部到茎尖的整体变化趋势是先增加后减小，在第2节达到最粗(3.0-4.5mm)，茎尖最细(1.1-2.0mm)。不符合霍山石斛茎直径特征，予以淘汰。

（2）第1批和第9批石斛茎各节维管束数目变化趋势为：每节维管束个数在9-40个不等，从基部到茎尖的整体变化趋势是逐渐减小，基部维管束数目最多，茎尖维管束数目最少；符合霍山石斛茎各节维管束数目特征，定位二测石斛，进入下一步验证；第2批石斛每节维管束个数在22-106个不等，从基部到茎尖的整体变化趋势是先增加后减少，在3-5节数目达到最大；第8批石斛每节维管束个数在20-36个不等，从基部到茎尖的整体变化趋势是不明显；第2批和第8批石斛茎各节维管束数目均不符合霍山石斛茎特征，予以淘汰。

（3）第9批石斛茎横切面结构：茎横切面圆形；最外面偶可见一圈残留的叶鞘，有薄壁细胞和维管束组成；表皮由一列扁平的细胞组成，细胞壁稍木质化，外面覆盖一层黄色或橘黄色的角质层；维管束散在在薄壁细胞中，有限外韧型，大小相似，9-40个不等，基部茎节维管束数目最多，中部较次，顶部最少；维管束鞘纤维群呈双帽状，外侧纤维群偶与木质部内侧的纤维群相连成环形，有1-2列纤维，外侧纤维直径普遍比内侧纤维要小；薄壁细胞大小相似，近维管束处薄壁细胞较小，偶可见硅质块分布；草酸钙针晶束分布于近表皮处薄壁细胞及维管束旁薄壁细胞中；薄壁细胞中有淀粉粒存在；符合霍山石斛茎横切面显微特征，为正品霍山石斛。

第1批石斛样品茎横切面草酸钙针晶束分布于薄壁细胞中，无明显规律；与霍山石斛茎显微特征不符，不是正品霍山石斛。

实施例3：市场易混淆品河南石斛的鉴别

1、材料与试剂

于2014年10月从霍山购得河南石斛新鲜的茎，经过安徽中医药大学彭华胜教授鉴定，均为兰科植物河南石斛Dendrobium henanense的新鲜茎条。

FAA溶液，酒精（70%、80%、85%、90%、95%、100%），二甲苯，石蜡，中性树胶，番红-固绿染液；

2.仪器与软件

同实施例1.

3.实验步骤

同实施例1.

4.结果与分析

河南石斛的性状特征：由图2可知，河南石斛每节长度在3.2-20.1mm之间，从基部到茎尖的整体变化趋势是先增加后减小，在第2或第3节长度达到最大；由图4可知，河南石斛每节直径在1.0-3.1mm之间，从基部到茎尖的整体变化趋势是先增加后减小，在第2节达到最粗(2.4-3.1mm)，茎尖最细(1.0-1.7mm)。

河南石斛的显微特征：

（1）河南石斛茎各节维管束数目变化趋势：由图6可知，河南石斛每节维管束个数在20-36个不等，从基部到茎尖的整体变化趋势是不明显。

（2）河南石斛茎横切面结构：茎横切面圆形；最外面偶可见一圈残留的叶鞘，有薄壁细胞和维管束组成；表皮由一列扁平的细胞组成，细胞壁稍木质化，外面覆盖一层黄色或橘黄色的角质层；维管束散在在薄壁细胞中，有限外韧型，大小相似，20-36个不等，茎上、中、下三部分维管束数目变化不大，无明显规律；维管束鞘纤维群多呈双帽状，偶成单帽形，有1-2列纤维；薄壁细胞大小相似，近维管束处薄壁细胞较小，偶可见硅质块分布；草酸钙针晶束分布于薄壁细胞中，无明显规律；薄壁细胞中有淀粉粒存在。

河南石斛的性状特征与霍山石斛极为相似；进一步观察其性状特征可发现河南石斛茎各节直径的变化趋势及直径大小与霍山石斛不同（图4）；其显微特征中茎各节维管束数目变化趋势与霍山石斛不同，维管束数目最多不超过40个（图7）；草酸钙针晶束分布于薄壁细胞中，无明显规律；从而可鉴定其非霍山石斛品种。

实施例4：市场易混淆品铁皮石斛的鉴别

1、材料与试剂

于2014年10月从霍山购得铁皮石斛新鲜的茎，经过安徽中医药大学彭华胜教授鉴定，均为兰科植物铁皮石斛Dendrobium officinale的新鲜茎条。

FAA溶液，酒精（70%、80%、85%、90%、95%、100%），二甲苯，石蜡，中性树胶，番红-固绿染液；

2.仪器与软件

同实施例1.

3.实验步骤

同实施例1.

4.结果与分析

铁皮石斛的性状特征：由图2可知，铁皮石斛每节长度在1.2-20.6mm之间，从基部到茎尖的整体变化趋势是先增加后减小，在2至4节长度达到最大；由图4可知，铁皮石斛每节直径在1.0-4.9mm之间，从基部到茎尖的整体变化趋势是先增加后减小，在第3节达到最粗(2.4-4.9mm)，茎尖最细(1.0-1.9mm)。

铁皮石斛的显微特征：

（1）铁皮石斛茎各节维管束数目变化趋势：由图6可知，铁皮石斛每节维管束个数在22-106个不等，从基部到茎尖的整体变化趋势是先增加后减少，在3-5节数目达到最大。

（2）铁皮石斛茎横切面结构：茎横切面圆形；最外面偶可见一圈残留的叶鞘，有薄壁细胞和维管束组成；表皮由一列小而扁平的细胞组成，横向细胞壁稍木质化，外面覆盖一层黄色或橘黄色的角质层；维管束散在在薄壁细胞中，有限外韧型，大小相似，22-106个不等，基部茎节维管束数目较多，中部较次，顶部最少；维管束外侧有纤维群，通常呈双帽状，偶呈单帽状或环列；薄壁细胞大小相似，近维管束处薄壁细胞较小，偶可见硅质块分布；近表皮处薄壁细胞中可见草酸钙针晶束；薄壁细胞中有淀粉粒存在。

铁皮石斛的性状特征与霍山石斛较相似，但铁皮石斛茎各节直径的变化趋势与霍山石斛不同（图4）；进一步观察显微特征可发现到，铁皮石斛茎各节维管束数目明显高于霍山石斛（图6），草酸钙针晶仅分布在近表皮处薄壁细胞中（图7）；以上表明该样品非霍山石斛品种。

实施例5：市场易混淆品铜皮石斛的鉴别

1、材料与试剂

于2014年10月从霍山购得铜皮石斛新鲜的茎，经过安徽中医药大学彭华胜教授鉴定，均为兰科植物铜皮石斛Dendrobium moniliforme的新鲜茎条。

FAA溶液，酒精（70%、80%、85%、90%、95%、100%），二甲苯，石蜡，中性树胶，番红-固绿染液；

2.仪器与软件

同实施例1.

3.实验步骤

同实施例1.

4.结果与分析

铜皮石斛的性状特征：由图2可知，铜皮石斛每节长度在4.0-35.3mm之间，从基部到茎尖的整体变化趋势是先增加后减小，在第2节长度达到最大；由图4可知，铜皮石斛每节直径在1.1-4.5mm之间，从基部到茎尖的整体变化趋势是先增加后减小，在第2节达到最粗(3.0-4.5mm)，茎尖最细(1.1-2.0mm)。

铜皮石斛的显微特征：

（1）铜皮石斛茎各节维管束数目变化趋势：由图6可知，铜皮石斛每节维管束个数在8-57个不等，从基部到茎尖的整体变化趋势是逐渐减少，基部维管束数目最多。

（2）铜皮石斛茎横切面结构：茎横切面圆形；最外侧偶可见一圈残留的叶鞘，有薄壁细胞和维管束组成；表皮由一列多角形细胞组成，壁加厚，外面覆盖一层黄色或黄绿色的角质层；维管束散在在薄壁细胞中，有限外韧型，大小相似，8-57个不等，基部茎节维管束数目较多，中部较次，顶部最少；维管束鞘纤维群呈双帽状，偶成环，由1-4列纤维组成，纤维多角形；薄壁细胞大小相似，近维管束处薄壁细胞较小，无硅质块分布；表皮下及维管束旁薄壁细胞中可见草酸钙针晶束；薄壁细胞中有淀粉粒存在。

铜皮石斛的性状特征与霍山石斛较相似，但铜皮石斛茎各节长度明显高于霍山石斛（图2），其茎各节直径的变化趋势与霍山石斛不同（图4）；进一步观察显微特征可发现到，铜皮石斛茎各节维管束数目高于霍山石斛（图6），维管束鞘中纤维数目较霍山石斛高；薄壁细胞中无硅质块（图7）；以上表明该样品非霍山石斛品种；因而验证了本发明的结论。

Claims (5)

1.一种快速鉴别霍山石斛的方法，其特征在于操作步骤如下：

（1）测量被测石斛每节的直径和长度，与霍山石斛的直径和长度特征比较；保留符合条件的一测石斛；具体操作工步如下：

通过Excel和SPSS软件对所测数据进行分析，得到被测石斛各节直径和长度变化趋势图；

霍山石斛茎的每节直径和长度特征是：每节长度在2.5-22.6mm之间，从基部到茎尖的整体变化趋势是先增加后减小，在第2或第3节达到最大；霍山石斛每节直径在0.7-5.6mm之间，从基部到茎尖的整体变化趋势是逐渐减小，基部最粗，茎尖最细；

将被测石斛的各节直径和长度变化趋势图与霍山石斛的直径和长度特征比较；对于符合霍山石斛各节直径和长度特征的被测石斛确定为一测石斛，保留；不符合的被测石斛放弃；

（2）对一测石斛的各节进行徒手切片，显微镜观察、拍照，数维管束个数；与霍山石斛的维管束特征比较；保留符合条件的二测石斛；具体操作工步如下：

对一测石斛茎的各节进行徒手切片，将切片置于显微镜下观察并拍照，数维管束个数，得到霍山石斛各节维管束数目变化趋势图；

霍山石斛的维管束特征是：每节维管束个数在9-40个不等，从基部到茎尖的整体变化趋势是逐渐减小，基部维管束数目最多，茎尖维管束数目最少；

将一测石斛的各节维管束数目变化趋势图与霍山石斛的维管束特征比较；对于符合霍山石斛的维管束特征的一测石斛确定为二测石斛，保留；不符合条件的一测石斛放弃；

徒手切片具体步骤为：取一测石斛新鲜茎，用自来水冲洗干净，分别在各节的节间中部进行徒手切片，厚度为500um内；切片制 成水装片；数维管束的具体操作如下：把水装片放在普通光学显微镜下观察并拍照；把所拍图片用PS合成处理，数维管束数目并记录；

（3）对二测石斛进行石蜡切片，得到中性树胶封片

具体操作方法为：在二测石斛的新鲜茎的上、中、下三部分节间取样，厚度为0.3-0.5cm，用FAA溶液固定，抽气，24h后转移至浓度70%的酒精中；再经不同浓度酒精梯度脱水、浸蜡、换蜡、包埋、修块， LEICA RM2265 石蜡切片机切片，厚度为10～15μm，粘片，烘片24h以上；番红-固绿对染，得到中性树胶封片；

（4）对中性树胶封片进行显微镜观察，与霍山石斛的特征条件比较；具体操作如下：

将中性树胶封片置于物镜下观察其显微特征，若观察到诸多大小相近的维管束，且数目在9-40个，基部茎节维管束数目最多，中部较次，顶部最少；维管束鞘呈双帽形，偶成环形；则该被测石斛属于霍山石斛，否则不属于霍山石斛；中性树胶封片的显微特征还包括：表皮由1列扁平的细胞组成，细胞壁微木质化，表皮外有一层黄色或橘黄色角质层，纤维群由1-2层细胞组成，草酸钙针晶存在于近表皮处薄壁细胞及维管束旁薄壁细胞内，成束或散在。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）的具体步骤为：将待测样品编号，从茎的基部开始编号，编号从1开始，然后依次增加；用1-150mm量程的游标卡尺分别对其各节的长度和直径进行测量并记录；所测直径部位为各节节间中部；使用Excel和SPSS软件对所测数据进行分析和做折线图与箱式图。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）的徒手切片具体操作为：首先用左手的拇指、食指和中指固定材料，右手持刀，手臂用力，使刀口从左前方缓慢向右后方下滑，刀面不断加水润滑；切片置成水装片。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，FAA溶液为浓度70%的酒精：甲醛：乙酸=90:5:5的混合液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）的具体操作方法如下：将中性树胶封片置于Leica DM6000 B显微镜的载物台上；开启电源，调节光亮度；选择普通光源；调节焦距，先在低倍镜下观察，再调到高倍镜下观察；找到合适清晰的视野，拍照，关闭显微镜；把所拍碎片经PS合成处理。