CN106755310A - 鉴定海龙的成套试剂与方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了鉴定海龙的成套试剂与方法。本发明公开的鉴定海龙的成套试剂包括名称分别为HLN‑P、HLD‑P和HLJ‑P的引物对；HLN‑P由序列表中序列1和序列2所示的单链DNA组成；HLD‑P由序列表中序列3和序列4所示的单链DNA组成；HLJ‑P由序列表中序列5和序列6所示的单链DNA组成；SH‑P由序列表中序列7和序列8所示的单链DNA组成。实验证明，利用本发明的鉴定或辅助鉴定海龙的成套试剂和方法可以成功鉴定海龙的正伪品，还可以区分正品海龙中的拟海龙、刁海龙和尖海龙。利用本发明的鉴定或辅助鉴定海龙的成套试剂鉴定海龙的特异性高、稳定性好，准确率达100％。

Description

鉴定海龙的成套试剂与方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，鉴定海龙的成套试剂与方法。
背景技术
中药海龙为海龙科动物刁海龙Solenognathus hardwickii(Gray)、拟海龙Syngnathoides biaculeatus(Bloch)或尖海龙Syngnathus acus Linnaeus的干燥体。具有温肾壮阳，散结消肿的功效，主要用于肾阳不足，阳痿遗精，癥瘕积聚，瘰疬痰核，跌扑损伤，外治痈肿疔疮。现代药理实验证明其具有抗疲劳、抗肿瘤以及性激素样作用。
清·赵学敏《本草纲目拾遗》中《赤嵌集》记载：“海龙产于澎湖澳……功倍于海马，益房箔，催生捷效，握之即可产”，其认为海龙功效大于海马，2015版《中国药典》一部中记载海马功效为温肾壮阳，散结消肿，主要用于阳痿，遗尿，肾虚作喘，癥瘕积聚，跌扑损伤；外治痈肿疔疮。与海龙功效主治、性味归经都非常相似，但是由于海马药材资源相对较少，价格昂贵，而海龙药材资源相对来说较为丰富，价格亦较海马便宜。经研究，海龙药材具有多种化学成分，如甾体化合物，脂肪酸，磷脂，蛋白质及氨基酸，核苷酸类成分以及大量Sr、Zn和Se等人体必需微量元素等。所以海龙药材的应用非常广泛，如中成药的深海龙胶囊、海龙蛤蚧口服液、海龙胶以及北海凯鸿海洋保健品有限公司的“仙元春”酒等。
虽然海龙资源丰富，但是其亦为珍贵海洋药物资源，不同规格海龙价格亦不相同，一直以来，常有用价格便宜的伪品海龙冒充药典正品海龙使用，导致了药材市场海龙药材的情况混乱。所以亟需创建一个能快速、准确鉴别海龙正、伪品的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何鉴定海龙。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了鉴定或辅助鉴定海龙的成套试剂。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定海龙的成套试剂，包括名称分别为HLN-P、HLD-P和HLJ-P的引物对中的三种、任两种或任一种；
所述HLN-P由名称分别为HLN-S和HLN-A的单链DNA组成；所述HLN-S是如下a1)至a4)中的任一种单链DNA：
a1)序列表中序列1所示的单链DNA；
a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
a3)与a1)或a2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述HLN-A是如下b1)至b4)中的任一种单链DNA：
b1)序列表中序列2所示的单链DNA；
b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
b3)与b1)或b2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述HLD-P由名称分别为HLD-S和HLD-A的单链DNA组成；所述HLD-S是如下c1)至c4)中的任一种单链DNA：
c1)序列表中序列3所示的单链DNA；
c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
c3)与c1)或c2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述HLD-A是如下d1)至d4)中的任一种单链DNA：
d1)序列表中序列4所示的单链DNA；
d2)在d1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
d3)与d1)或d2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述HLJ-P由名称分别为HLJ-S和HLJ-A的单链DNA组成；所述HLJ-S是如下e1)至e4)中的任一种单链DNA：
e1)序列表中序列5所示的单链DNA；
e2)在e1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
e3)与e1)或e2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
e4)在严格条件下与e1)或e2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述HLJ-A是如下f1)至f4)中的任一种单链DNA：
f1)序列表中序列6所示的单链DNA；
f2)在f1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
f3)与f1)或f2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
f4)在严格条件下与f1)或f2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。
上述成套试剂中，a2)所述单链DNA可为在序列1所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。b2)所述单链DNA可为在序列2所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。c2)所述单链DNA可为在序列3所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。d2)所述单链DNA可为在序列4所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。e2)所述单链DNA可为在序列5所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。f2)所述单链DNA可为在序列6所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5或序列6所示的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述成套试剂还可包括名称为SH-P的引物对，所述SH-P由名称分别为SH-S和SH-A的单链DNA组成；所述SH-S是如下g1)至g4)中的任一种单链DNA：
g1)序列表中序列7所示的单链DNA；
g2)在g1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
g3)与g1)或g2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
g4)在严格条件下与g1)或g2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述SH-A是如下h1)至h4)中的任一种单链DNA：
h1)序列表中序列8所示的单链DNA；
h2)在h1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
h3)与h1)或h2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
h4)在严格条件下与h1)或h2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。
上述成套试剂中，g2)所述单链DNA可为在序列7所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。h2)所述单链DNA可为在序列8所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列7或序列8所示的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述成套试剂中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述85％以上同一性，可为85％、90％或95％以上的同一性。
上述成套试剂中的各引物对可独立包装，也可将各引物对中的两条单链DNA独立包装。上述成套试剂中的各引物对间的摩尔比可根据具体需要确定，每个引物对中的两条单链DNA的摩尔比均可为1:1。
所述成套试剂可由所述HLN-P、所述HLD-P和所述HLJ-P中的至少一种与所述SH-P组成，也可仅为所述HLN-P、所述HLD-P和所述HLJ-P中的三种、任两种或任一种。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定海龙的系统。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定海龙的系统，由所述成套试剂和M1组成；所述M1为进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器。
上述系统中，所述进行PCR扩增所需的试剂可包括DNA聚合酶；和/或，所述进行PCR扩增所需的仪器包括PCR仪。
上述系统中，所述DNA聚合酶可为Taq DNA聚合酶，也可为将所述DNA聚合酶与进行PCR反应所需的其他试剂混合在一起得到的混合试剂。所述Taq DNA聚合酶具体可为北京全式金生物技术有限公司的TRANFast Taq DNA Polymerase。所述混合试剂具体可为北京全式金生物技术有限公司的2×EasyTaq PCR SuperMix。
所述PCR仪具体可为Applied Biosystems，Veriti 96-Well Thermal Cycler；或Eppendorf AG，22331Hamburg；或BIO-RAD，T100TM Thermal Cycler。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定海龙的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定海龙的方法，包括：以待测样品的基因组DNA为模板，利用所述HLN-P、所述HLD-P和所述HLJ-P进行PCR扩增，得到PCR产物；按照如下方法确定所述待测样品是否为海龙或所述待测样品的海龙物种：
H11、检测所述PCR产物的大小，如所述PCR产物仅含有大小为209bp的DNA片段，所述待测样品为或候选为拟海龙；所述PCR产物仅含有大小为318bp的DNA片段，所述待测样品为或候选为刁海龙；所述PCR产物仅含有大小为139bp的DNA片段，所述待测样品为或候选为尖海龙；如所述PCR产物不含有大小为209bp的DNA片段、大小为318bp的DNA片段和大小为139bp的DNA片段中的任一种，所述待测样品不为或候选不为海龙。
上述方法中，所述利用所述HLN-P、所述HLD-P和所述HLJ-P进行PCR扩增的退火温度为43-55℃。
可利用DNA聚合酶进行所述PCR扩增。所述DNA聚合酶可为Taq DNA聚合酶，也可为将所述DNA聚合酶与进行PCR反应所需的其他试剂混合在一起得到的混合试剂。所述TaqDNA聚合酶具体可为北京全式金生物技术有限公司的TRANFast Taq DNA Polymerase。所述混合试剂具体可为北京全式金生物技术有限公司的2×EasyTaq PCR SuperMix。
可利用PCR仪进行所述PCR扩增。所述PCR仪具体可为Applied Biosystems，Veriti96-Well Thermal Cycler；或Eppendorf AG，22331Hamburg；或BIO-RAD，T100TM ThermalCycler。
利用所述HLN-P、所述HLD-P和所述HLJ-P进行PCR扩增可在一个反应体系中进行，也可在不同的反应体系中进行。
所述以待测样品的基因组DNA为模板，利用所述HLN-P、所述HLD-P和所述HLJ-P进行PCR扩增，还可包括：利用所述SH-P对所述待测样本的基因组DNA进行PCR扩增，得到SH-PPCR产物；利用所述HLN-P、所述HLD-P和所述HLJ-P以所述SH-P PCR产物为模板进行PCR扩增。
上述方法中，所述PCR扩增在一个反应体系中进行时，可在名称为反应体系1中进行。所述反应体系1可由以下物质组成：所述DNA聚合酶，包括四种dNTP的dNTP混合物，所述HLN-S、所述HLN-A、所述HLD-S、所述HLD-A、所述HLJ-S和所述HLJ-A，DNA模板，水。所述反应体系1中各物质的量可根据具体需要进行调整。所述反应体系1中的所述HLN-S、所述HLN-A、所述HLD-S、所述HLD-A、所述HLJ-S和所述HLJ-A的浓度为0.15μM、0.15μM、0.25μM、0.25μM、0.4μM和0.4μM。所述反应体系1中的DNA模板量可为5-100ng。所述反应体系1中的DNA模板量进一步可为15-60ng，如30ng。
上述方法中，进行所述PCR扩增时的退火温度可为43℃-55℃。进行所述PCR扩增时的退火温度进一步可为45℃-51℃。进行所述PCR扩增时的退火温度更进一步可为47℃-49℃。进行所述PCR扩增时的反应条件可为：94℃5min，35个循环(94℃30s，相应的退火温度30s，72℃15s)，72℃7min，4℃∞。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述M1、M2或M3的鉴定或辅助鉴定海龙的方法：
M1、鉴定或辅助鉴定拟海龙的方法，包括：以待测样品的基因组DNA为模板，利用权利要求1中所述HLN-P进行PCR扩增，得到PCR产物；检测所述PCR产物的大小，如所述PCR产物含有大小为209bp的DNA片段，所述待测样品为或候选为拟海龙；如所述PCR产物不含有大小为209bp的DNA片段，所述待测样品不为或候选不为拟海龙；
M2、鉴定或辅助鉴定刁海龙的方法，包括：以待测样品的基因组DNA为模板，利用权利要求1中所述HLD-P进行PCR扩增，得到PCR产物；检测所述PCR产物的大小，如所述PCR产物含有大小为318bp的DNA片段，所述待测样品为或候选为刁海龙；如所述PCR产物不含有大小为318bp的DNA片段，所述待测样品不为或候选不为刁海龙；
M3、鉴定或辅助鉴定尖海龙的方法，包括：以待测样品的基因组DNA为模板，利用权利要求1中所述HLJ-P进行PCR扩增，得到PCR产物；检测所述PCR产物的大小，如所述PCR产物含有大小为139bp的DNA片段，所述待测样品为或候选为尖海龙；如所述PCR产物不含有大小为139bp的DNA片段，所述待测样品不为或候选不为尖海龙。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述成套试剂在鉴定或辅助鉴定海龙中的应用或在制备鉴定或辅助鉴定海龙产品中的应用。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述系统在鉴定或辅助鉴定海龙中的应用或在制备鉴定或辅助鉴定海龙产品中的应用。
本发明中，所述海龙可为拟海龙、刁海龙和/或尖海龙。
实验证明，利用本发明的鉴定或辅助鉴定海龙的成套试剂和方法可以成功鉴定海龙的正伪品，还可以区分正品海龙中的拟海龙、刁海龙和尖海龙。利用本发明的鉴定或辅助鉴定海龙的成套试剂鉴定海龙的特异性高、稳定性好，准确率达100％。表明，可以利用本发明的鉴定或辅助鉴定海龙的成套试剂和方法鉴定多来源的药典海龙与其伪品及区分正品海龙中的拟海龙、刁海龙和尖海龙。
附图说明
图1为各种海龙样品的SH-P PCR产物电泳检测结果。其中，M为DNA分子量标准。
图2为最佳DNA模板用量的确定。
图3为最佳退火温度的确定。
图4为最佳DNA聚合酶的确定。其中，Easy Taq表示2×EasyTaq PCR SuperMix，TRAN Fast表示TRANFast Taq DNA Polymerase。
图5为最佳PCR仪的确定。其中，ABS表示Applied Biosystems，Veriti 96-WellThermal Cycler；Eppendorf表示Eppendorf AG，22331Hamburg；BIO-RAD表示BIO-RAD，T100TM Thermal Cycler。
图6为部分海龙样品的鉴定结果。
图2-图6中，A为拟海龙，B为刁海龙，C为尖海龙，D为宝珈海龙，E为粗吻海龙，F为棘刀海龙，M为DNA分子量标准。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的TRANFast Taq DNA Polymerase为北京全式金生物技术有限公司产品，2×EasyTaq PCR SuperMix为北京全式金生物技术有限公司产品。
实施例1、鉴定或辅助鉴定海龙的成套试剂的制备
本发明提供了鉴定或辅助鉴定海龙的成套试剂，由名称分别为HLN-P、HLD-P与HLJ-P的引物对组成；
HLN-P由名称分别为HLN-S和HLN-A的单链DNA组成；HLN-S为序列表中序列1所示的单链DNA，HLN-A为序列表中序列2所示的单链DNA；
HLD-P由名称分别为HLD-S和HLD-A的单链DNA组成；HLD-S为序列表中序列3所示的单链DNA；HLD-A为序列表中序列4所示的单链DNA；
HLJ-P由名称分别为HLJ-S和HLJ-A的单链DNA组成；HLJ-S为序列表中序列5所示的单链DNA；HLJ-A为序列表中序列6所示的单链DNA。
该成套试剂中，各引物对中的两条单链DNA的摩尔比分别为1:1，HLN-P、HLD-P与HLJ-P的摩尔比为3:5:8，各单链DNA均独立包装。
实施例2、利用实施例1的鉴定或辅助鉴定海龙的成套试剂鉴定海龙
一、样品
选择24份海龙样品，包括正品3种和伪品3种，3种正品：拟海龙5份、刁海龙4份、尖海龙6份；3种伪品：宝珈海龙3份、粗吻海龙5份以及1份棘刀海龙。这24份海龙样品经李军德研究员鉴定，凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心，实验材料详见表1。
表1、实验材料
分别提取以上各样品的基因组DNA，然后利用引物对SH-P进行PCR扩增，分别得到各样品的SH-P PCR产物，SH-P由名称分别为SH-S(正向引物)和SH-A(反向引物)的单链DNA组成；SH-S为序列表中序列7所示的单链DNA；SH-A为序列表中序列8所示的单链DNA。反应体系为：高保真酶2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix 12.5μL，正反向引物各0.75μl，SH-S在反应体系中的浓度为0.3μM，SH-A在反应体系中的浓度为0.3μM，基因组DNA 50ng，无菌水补至25μL。PCR扩增程序为：95℃3min，35个循环(98℃20s，60℃15s，72℃15s)，72℃1min，4℃∞。电泳检测结果如图1所示，6种海龙均得到了扩增高质量的条带。
二、鉴定海龙最佳条件的确定
利用上述各样品的SH-P PCR产物确定鉴定海龙的最佳条件：
1、DNA模板用量的确定
除棘刀海龙外，每种海龙随机选取两个样品的SH-P PCR产物，棘刀海龙只有一个样品的SH-P PCR产物，棘刀海龙的样品设置两个重复，确定最佳DNA模板用量，设置DNA模板用量分别为100ng、60ng、30ng、15ng、5ng和1ng，按照如下体系确定最佳DNA模板用量：2×EasyTaq PCR Super Mix 10μL，成套试剂中HLN-P、HLD-P和HLJ-P的两条引物的量分别为0.3μL、0.5μL、0.8μL，HLN-S和HLN-A在反应体系中的浓度分别为0.15μM，HLD-S和HLD-A在反应体系中的浓度分别为0.25μM，HLJ-S和HLJ-A在反应体系中的浓度分别为0.4μM，DNA模板，无菌水补至20μl。
PCR扩增程序为：94℃5min，35个循环(94℃30s，47℃30s，72℃15s)，72℃7min，4℃∞，所用PCR仪为Applied Biosystems，Veriti 96-Well Thermal Cycler。
电泳检测PCR产物，结果如图2所示，结果显示，DNA模板用量在5-100ng之间海龙正品均扩增出清晰、单一条带，而海龙伪品扩增结果为阴性。而在DNA用量为1ng时，正品已不能全部扩增出清晰条带，因此DNA模板最佳用量为5-100ng。
2、退火温度的确定
除棘刀海龙外，每种海龙随机选取两个样品的SH-P PCR产物，棘刀海龙只有一个样品的SH-P PCR产物，棘刀海龙的样品设置两个重复，确定最佳DNA模板用量，设置退火温度分别为43℃、45℃、47℃、49℃、51℃和55℃，按照如下体系确定最佳退火温度：2×EasyTaq PCR Super Mix 10μL，成套试剂中HLN-P、HLD-P和HLJ-P的两条引物的量分别为0.3μL、0.5μL、0.8μL，HLN-S和HLN-A在反应体系中的浓度分别为0.15μM，HLD-S和HLD-A在反应体系中的浓度分别为0.25μM，HLJ-S和HLJ-A在反应体系中的浓度分别为0.4μM，DNA模板30ng，无菌水补至20μl。
PCR扩增程序为：94℃5min，35个循环(94℃30s，相应的退火温度30s，72℃15s)，72℃7min，4℃∞，所用PCR仪为Applied Biosystems，Veriti 96-Well Thermal Cycler。
电泳检测PCR产物，结果如图3所示，结果显示，退火温度在43℃-55℃均出现清晰、单一条带，而伪品扩增结果为阴性。
3、DNA聚合酶的确定
除棘刀海龙外，每种海龙随机选取两个样品的SH-P PCR产物，棘刀海龙只有一个样品的SH-P PCR产物，棘刀海龙的样品设置两个重复，确定最佳DNA聚合酶，所用DNA聚合酶为TRANFast Taq DNA Polymerase、2×EasyTaq PCR SuperMix。
DNA聚合酶为TRANFast Taq DNA Polymerase时的反应体系为：TRANFast Taq DNAPolymerase0.4μL，四种dNTPs的混合物1.6μL，成套试剂中HLN-P、HLD-P和HLJ-P的两条引物的量分别为0.3μL、0.5μL、0.8μL，HLN-S和HLN-A在反应体系中的浓度分别为0.15μM，HLD-S和HLD-A在反应体系中的浓度分别为0.25μM，HLJ-S和HLJ-A在反应体系中的浓度分别为0.4μM，DNA模板30ng，无菌水补至20μl。
DNA聚合酶为2×EasyTaq PCR SuperMix时的反应体系为：2×EasyTaq PCR SuperMix 10μL，成套试剂中HLN-P、HLD-P和HLJ-P的两条引物的量分别为0.3μL、0.5μL、0.8μL，HLN-S和HLN-A在反应体系中的浓度分别为0.15μM，HLD-S和HLD-A在反应体系中的浓度分别为0.25μM，HLJ-S和HLJ-A在反应体系中的浓度分别为0.4μM，DNA模板，无菌水补至20μl。
PCR扩增程序均为：94℃5min，35个循环(94℃30s，47℃30s，72℃15s)，72℃7min，4℃∞，所用PCR仪为Applied Biosystems，Veriti 96-Well Thermal Cycler。
电泳检测PCR产物，结果如图4所示，由图可知，采用不同聚合酶的PCR反应，伪品扩增结果均为阴性，而正品均有特异性扩增条带。
4、PCR仪的确定
除棘刀海龙外，每种海龙随机选取两个样品的SH-P PCR产物，棘刀海龙只有一个样品的SH-P PCR产物，棘刀海龙的样品设置两个重复，确定最佳PCR仪，所用PCR仪为Applied Biosystems，Veriti 96-Well Thermal Cycler；Eppendorf AG，22331Hamburg；BIO-RAD，T100TM Thermal Cycler，按照如下体系确定最佳退火温度：2×EasyTaq PCRSuper Mix 10μL，成套试剂中HLN-P、HLD-P和HLJ-P的两条引物的量分别为0.3μL、0.5μL、0.8μL，HLN-S和HLN-A在反应体系中的浓度分别为0.15μM，HLD-S和HLD-A在反应体系中的浓度分别为0.25μM，HLJ-S和HLJ-A在反应体系中的浓度分别为0.4μM，DNA模板30ng，无菌水补至20μl。
PCR扩增程序为：94℃5min，35个循环(94℃30s，相应的退火温度30s，72℃15s)，72℃7min，4℃∞
电泳检测PCR产物，结果如图5所示，结果显示，海龙正品均出现整齐、清晰的条带，伪品扩增结果均为阴性。
三、海龙的鉴定
利用各个样品的SH-P PCR产物，对表1中的实验材料进行鉴定，多重PCR反应的反应体系如下：2×EasyTaq PCR Super Mix 10μL，成套试剂中HLN-P、HLD-P和HLJ-P的两条引物的量分别为0.3μL、0.5μL、0.8μL，HLN-S和HLN-A在反应体系中的浓度分别为0.15μM，HLD-S和HLD-A在反应体系中的浓度分别为0.25μM，HLJ-S和HLJ-A在反应体系中的浓度分别为0.4μM，DNA模板，无菌水补至20μl。
PCR扩增程序为：94℃5min，35个循环(94℃30s，47℃30s，72℃15s)，72℃7min，4℃∞，所用PCR仪为Applied Biosystems，Veriti 96-Well Thermal Cycler。
电泳检测PCR产物，部分样品的结果如图6(图6中的棘刀海龙结果为一个棘刀海龙的样品设置了两个重复)所示，结果显示，拟海龙，刁海龙，尖海龙三种药典海龙正品均扩增出单一清晰特异性条带，长度分别为209bp，318bp，139bp左右，而各伪品结果为阴性，无特异性条带生成。表明此引物在鉴别海龙正伪品的同时，也可以区分三种正品海龙的品种，特异性高，准确率达100％。
<110> 中国中医科学院中药研究所
<120> 鉴定海龙的成套试剂与方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
aaacattgat tcatcttacc ctt 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
gccaattatg ctcactttga tg 22
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
aacattgata acaacttacc cacat 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
cctttaggtt tatgttttca ataa 24
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
ttgtgaaaga ttataagtga gcaag 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
ctccttcagt tttatttttc aataa 25
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
aaaaagcttc aaactgggat tagatacccc actat 35
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
tgactgcaga gggtgacggg cggtgtgt 28

Claims (10)

1.鉴定或辅助鉴定海龙的成套试剂，包括名称分别为HLN-P、HLD-P和HLJ-P的引物对中的三种、任两种或任一种；
所述HLN-P由名称分别为HLN-S和HLN-A的单链DNA组成；所述HLN-S是如下a1)至a4)中的任一种单链DNA：
a1)序列表中序列1所示的单链DNA；
a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
a3)与a1)或a2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述HLN-A是如下b1)至b4)中的任一种单链DNA：
b1)序列表中序列2所示的单链DNA；
b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
b3)与b1)或b2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述HLD-P由名称分别为HLD-S和HLD-A的单链DNA组成；所述HLD-S是如下c1)至c4)中的任一种单链DNA：
c1)序列表中序列3所示的单链DNA；
c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
c3)与c1)或c2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述HLD-A是如下d1)至d4)中的任一种单链DNA：
d1)序列表中序列4所示的单链DNA；
d2)在d1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
d3)与d1)或d2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述HLJ-P由名称分别为HLJ-S和HLJ-A的单链DNA组成；所述HLJ-S是如下e1)至e4)中的任一种单链DNA：
e1)序列表中序列5所示的单链DNA；
e2)在e1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
e3)与e1)或e2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
e4)在严格条件下与e1)或e2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述HLJ-A是如下f1)至f4)中的任一种单链DNA：
f1)序列表中序列6所示的单链DNA；
f2)在f1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
f3)与f1)或f2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
f4)在严格条件下与f1)或f2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。
2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述成套试剂还包括名称为SH-P的引物对，所述SH-P由名称分别为SH-S和SH-A的单链DNA组成；所述SH-S是如下g1)至g4)中的任一种单链DNA：
g1)序列表中序列7所示的单链DNA；
g2)在g1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
g3)与g1)或g2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
g4)在严格条件下与g1)或g2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述SH-A是如下h1)至h4)中的任一种单链DNA：
h1)序列表中序列8所示的单链DNA；
h2)在h1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
h3)与h1)或h2)限定的单链DNA具有85％以上的同一性的单链DNA；
h4)在严格条件下与h1)或h2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。
3.鉴定或辅助鉴定海龙的系统，其特征在于：所述系统由权利要求1或2所述的成套试剂和M1组成；所述M1为进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器。
4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于：所述进行PCR扩增所需的试剂包括DNA聚合酶；和/或，所述进行PCR扩增所需的仪器包括PCR仪。
5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于：所述DNA聚合酶为Taq DNA聚合酶。
6.鉴定或辅助鉴定海龙的方法，包括：以待测样品的基因组DNA为模板，利用权利要求1或2中所述HLN-P、所述HLD-P和所述HLJ-P进行PCR扩增，得到PCR产物；按照如下方法确定所述待测样品是否为海龙或所述待测样品的海龙物种：检测所述PCR产物的大小，如所述PCR产物仅含有大小为209bp的DNA片段，所述待测样品为或候选为拟海龙；所述PCR产物仅含有大小为318bp的DNA片段，所述待测样品为或候选为刁海龙；所述PCR产物仅含有大小为139bp的DNA片段，所述待测样品为或候选为尖海龙；如所述PCR产物不含有大小为209bp的DNA片段、大小为318bp的DNA片段和大小为139bp的DNA片段中的任一种，所述待测样品不为或候选不为海龙。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述利用权利要求1或2中所述HLN-P、所述HLD-P和所述HLJ-P进行PCR扩增的退火温度为43-55℃。
8.鉴定或辅助鉴定海龙的方法，为下述M1、M2或M3：
M1、鉴定或辅助鉴定拟海龙的方法，包括：以待测样品的基因组DNA为模板，利用权利要求1中所述HLN-P进行PCR扩增，得到PCR产物；检测所述PCR产物的大小，如所述PCR产物含有大小为209bp的DNA片段，所述待测样品为或候选为拟海龙；如所述PCR产物不含有大小为209bp的DNA片段，所述待测样品不为或候选不为拟海龙；
M2、鉴定或辅助鉴定刁海龙的方法，包括：以待测样品的基因组DNA为模板，利用权利要求1中所述HLD-P进行PCR扩增，得到PCR产物；检测所述PCR产物的大小，如所述PCR产物含有大小为318bp的DNA片段，所述待测样品为或候选为刁海龙；如所述PCR产物不含有大小为318bp的DNA片段，所述待测样品不为或候选不为刁海龙；
M3、鉴定或辅助鉴定尖海龙的方法，包括：以待测样品的基因组DNA为模板，利用权利要求1中所述HLJ-P进行PCR扩增，得到PCR产物；检测所述PCR产物的大小，如所述PCR产物含有大小为139bp的DNA片段，所述待测样品为或候选为尖海龙；如所述PCR产物不含有大小为139bp的DNA片段，所述待测样品不为或候选不为尖海龙。
9.权利要求1或2所述成套试剂在鉴定或辅助鉴定海龙中的应用或在制备鉴定或辅助鉴定海龙产品中的应用。
10.权利要求3-5中任一所述系统在鉴定或辅助鉴定海龙中的应用或在制备鉴定或辅助鉴定海龙产品中的应用。
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