CN112921113A - 基因tps2在检测金针菇源性成分中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基因TPS2在检测金针菇源性成分中的应用，基因TPS2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；挑选TPS2基因作为金针菇的检测内标准基因；可快速、灵敏地检测食品中的金针菇源性成分，灵敏度高，特异性强，操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，非常适用于现场实时检测，对金针菇及其深加工产品进行快速生物源检测具有良好的发展前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物物种鉴定和PCR检测技术领域，具体的说涉及一种基因TPS2在检测金针菇源性成分中的应用。
背景技术
金针菇（Flammulina velutipes）是中国最早进行人工栽培的食用菌之一，中国已近成为世界上金针菇产量和出口量最多的国家。目前金针菇的生产用菌种比较混乱，异名同种和异种同名的现象在生产栽培上非常普遍，这不仅对实际生产中的规范化菌种管理造成了严重影响，而且对金针菇的种性鉴定、品种审定与认定、良种选育等基础科研及相关产业技术体系建立产生了明显的制约作用。
随着金针菇进行深加工产品日益增多，掺伪造假现象也日趋严重。此外，由金针菇冒充其他昂贵野生菌的现象也时有发生。传统的依赖形态学的检测方法存在着一定的局限性，随着现代分子生物技术在食品领域的广泛应用，使用分子生物技术对金针菇及其深加工产品进行快速生物源检测具有良好的发展前景。
目前，内标准基因已被广泛地用于鉴别食品掺假，但如何筛选出合适的内标准基因显得尤为重要。rDNA-ITS (Internal Transcribed Spacers) 方法是目前采用较多的野生菌菌种鉴定方法。尽管DNA条形码技术在物种分类鉴定、真菌及植物种质资源研究中取得一定的成果，但是仍然存在缺点和局限性。相比之下，基于内标准基因的检测技术更加方便经济，目前，对于内标准基因的开发与研究主要集中在农作物上，比如小麦、油菜、大豆、棉花、玉米、水稻等，其内标准基因已被广泛应用于成分来源的鉴别和分析中。而金针菇的内标准基因尚未见到相关报道，为了建立高效便利检测金针菇的方法，有必要对金针菇的内标准基因进行开发。
发明内容
本发明目的是提供基因TPS2在检测金针菇源性成分中的应用，以基因TPS2作为内标基因，该内标基因TPS2在金针菇源性成分鉴定中的应用，基因TPS2的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
本发明还提供一种用于检测金针菇源性成分的试剂盒，以基因TPS2为靶基因建立的试剂盒，包括扩增基因TPS2的特异性引物，采用PCR方法检测内标基因TPS2，特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；试剂盒还包括扩增用常规试剂。
本发明确定的用于检测金针菇源成分的基因TPS2，设计了用于检测该基因的定性PCR和定量PCR的引物作为试剂盒，建立了检测金针菇源性成分的相应PCR方法，该方法费时少，特异性好，灵敏度高，操作简单，不需要专业人员操作，结果易于观察，非常适于基层食品监督检验使用。
附图说明
图1为金针菇TPS2基因的定性PCR验证特异性，图中：1：空白对照，2-3：白色金针菇（white Flammulina velutipes），4-5：黄色金针菇（yellow Flammulina velutipes），6-7：平菇（Pleurotus ostreatus），8-9：松茸（Tricholoma matsutake），10-11：茶树菇（Agrocybe cylindracea），12-13：鸡枞（Collybia albuminosa），14-15：黄谷熟（lactarius deliciosus），16-17：姬松茸（Agaricus blazei），18-19：青头菌（Russula virescens），21-20：香菇（Lentinus edodes），22-23：黑牛肝菌（Boletus griseus Frost），M：DNA markerDL 2000；
图2为金针菇TPS2基因引物检测灵敏度的定性检测，图中：1：空白对照，2-3：100ng，4-5：25ng，6-7：4ng，8-9：0.8ng，10-11：0.16ng，12-13：0.032ng，14-15：0.00064ng，M：DNA marker DL 2000；
图3为金针菇TPS2基因引物检测灵敏度的定量检测，A图是扩增曲线；B图是标准曲线；
图4为引物TPS2-F/B对金针菇深加工样品的PCR检测，图中：1：空白对照，2：白色金针菇，3-4：金针菇饼干，5-6：金针菇酱，M：DNA marker DL 2000。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
白色金针菇（white Flammulina velutipes）、黄色金针菇（yellow Flammulina velutipes）、平菇（Pleurotus ostreatus）、松茸（Tricholoma matsutake）、茶树菇（Agrocybe cylindracea）、鸡枞（Collybia albuminosa）、黄谷熟（lactarius deliciosus）、姬松茸（Agaricus blazei）、青头菌（Russula virescens）、香菇（Lentinus edodes）、黑牛肝菌（Boletus griseus Frost）均购买于云南当地野生菌市场。
实施例1：金针菇源通用内标基因TPS2的筛选
在NCBI的Nucleotide数据库中，搜索金针菇的基因信息，通过BLAST比对分析，最终从499个基因序列中筛选出用于编码海藻糖-6-磷酸酯酶的TPS2基因 (登录号：KP221318.1) 作为内标准基因；经过分析，发现TPS2基因的BLAST比对结果图中没有显示有任何其它基因的全部或部分序列与TPS2基因的序列相同或相似，这说明TPS2基因与其它基因没有同源性，具有极强的物种特异性；
实施例2：金针菇源性成分通用内标基因的验证
1、针对实施例1筛选的内标基因TPS2，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，并对设计好的引物进行BLAST对比分析，保证引物的特异性，引物序列见表1；
表1 TPS2基因的PCR引物序列
2、金针菇内标准基因引物物种特异性的定性验证
以黄色金针菇和白色金针菇的基因组DNA作为模板，进行普通PCR扩增检测，验证金针菇内标准基因的种内特异性；以平菇、松茸、茶树菇、鸡枞、黄谷熟、姬松茸、青头菌、香菇、牛肝菌九种蘑菇的基因组DNA作为模板（采用宝生物有限公司Ver.3.0试剂盒提取），使用引物TPS2-F/B进行普通PCR扩增检测，定性验证金针菇内标准基因的种间特异性；用2%的琼脂糖凝胶电泳 (含有0.1μg/mL EB) 分析扩增产物，电压为120 V，电泳缓冲液为1×TAE。扩增产物上样量为5μL，用凝胶成像仪扫描产生图像并进行图像分析。普通PCR扩增程序：94℃，预变性5min；30个循环：94℃变性 30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；72℃终止延伸5min；PCR反应体系见表2；
表2 定性PCR反应体系
图1结果表明，黄色金针菇和白色金针菇两种金针菇的基因组DNA均成功扩增TPS2基因，条带明显，而其余食用菌没有扩增产物。
3、金针菇内标准基因定性检测体系灵敏度验证
为了检测金针菇TPS2基因引物的检测灵敏度，挑选白色金针菇作为检测样品，将样品进行梯度稀释 (100ng/μL、20ng/μL、4ng/μL、0.8ng/μL、0.16ng/μL、0.032ng/μL、0.0064ng/μL) 进行定性检测，使用引物TPS2-F/B进行普通PCR扩增检测；用2%的琼脂糖凝胶电泳 (含有0.1μg/mL EB) 分析扩增产物，电泳缓冲液为1×TAE，上样量为5μL；用凝胶成像仪扫描产生图像并进行图像分析；PCR反应体系同表2；
图2结果表明，金针菇DNA模板含量为100ng、25ng和4ng时，电泳图上出现清晰特异性条带，且亮度逐渐减弱，而当模板含量降至0.8ng时，未检测到扩增产物，因此，定性PCR的检出限为4ng。
4、金针菇内标准基因定量检测体系灵敏度验证
为了检测金针菇TPS2基因引物的检测灵敏度，挑选白色金针菇作为检测样品，将样品进行梯度稀释 (20ng/μL、4ng/μL、0.8ng/μL、0.16ng/μL、0.032ng/μL) 进行SYBRGreenⅠ实时定量PCR扩增检测，定量确定金针菇内标准基因特异引物的检测灵敏度。SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR扩增程序：95℃预变性10min)；40个循环：95℃变性30 s，60℃退火30 s，68℃延伸30s)；PCR反应体系见表3；
表3 特异性引物验证的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应体系
定量PCR扩增曲线及标准曲线见图3；由图3A可知，当模板含量为320pg时，仍能发生特异性扩增，Ct值明显高于阴性对照，这说明SYBR GreenⅠ定量PCR的最低检出限在320pg。根据图3B，可获得标准曲线公式：y=-3.24x+23.651，相关系数R2为0.995。
5、对金针菇深加工样品的PCR检测
为验证内标准基因以及建立的定量PCR检测技术在实际样品检测过程中的准确性，对市场销售的2种金针菇深加工制品（金针菇饼干和金针菇酱）进行检测，其中以白色金针菇作为阳性对照，以蒸馏水作为空白对照；由图4中可以看出经过特异性引物TPS2-F/B对金针菇饼干的普通PCR扩增后可以和阳性对照（白色金针菇）一样呈现清晰条带，最终确定金针菇饼干中含有金针菇成分。而金针菇酱中未扩增出相应条带，说明该产品中金针菇成分含量低于检测限，或未出现金针菇成分，通过以上实施例，成功建立了一套定性定量PCR检测TPS2基因的体系。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 基因TPS2在检测金针菇源性成分中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 480
<212> DNA
<213> 金针菇(Flammulina velutipes)
<400> 1
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<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
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<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
taccctgaaa tagagtaaga acggt 25
Claims (2)
1.基因TPS2在检测金针菇源性成分中的应用，基因TPS2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种用于检测金针菇源性成分的试剂盒，其特征在于：包括扩增权利要求1所述基因TPS2的特异性引物，特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
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-
2021
- 2021-03-29 CN CN202110333643.8A patent/CN112921113B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112921113B (zh) | 2024-05-24 |
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