CN113046470B

CN113046470B - 基因s9ap在检测杏鲍菇源性成分中的应用

Info

Publication number: CN113046470B
Application number: CN202110495559.6A
Authority: CN
Inventors: 商颖; 曹建新; 易伦朝; 魏元苗; 刘耀; 李玲
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2021-05-07
Filing date: 2021-05-07
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2041-05-07
Also published as: CN113046470A

Abstract

本发明公开一种基因s9ap在检测杏鲍菇源性成分中的应用，本发明建立一套定性定量PCR检测杏鲍菇的方法，以及对杏鲍菇的深加工产品进行检测验证；经过分析，发现s9ap基因的BLAST比对结果图中没有显示有任何其它基因的全部序列与s9ap基因的序列相同或相似，这说明s9ap基因与其它基因没有同源性，具有极强的物种特异性，因此，挑选s9ap基因作为杏鲍菇的候选内标准基因，可快速、灵敏地检测食品中的杏鲍菇源性成分，且灵敏度高，特异性强，操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，非常适用于现场实时检测，对杏鲍菇及其深加工产品进行快速生物源检测具有良好的发展前景。

Description

基因s9ap在检测杏鲍菇源性成分中的应用

技术领域

本发明涉及生物物种鉴定和PCR检测技术领域，具体涉及基因s9ap在检测杏鲍菇源性成分中的应用。

背景技术

杏鲍菇（Pleurotuseryngii）是近年来开发栽培成功的食用菌新品种，在食用菌中占据重要地位。杏鲍菇的风味独特，深受消费者的喜爱。杏鲍菇不仅营养丰富，同时具备一定的药用价值，所以随之产生一些掺假现象。食用菌掺假是一种危害消费者权益的行为，生产商人以此来谋取更多的经济利益。为了保证消费者权益，营造一个良好的市场氛围，建立起一个实用的食用菌检测体系是势在必行的。

较为常见的食用菌鉴别手段是形态识别法，判别结果的准确性很大程度上取决于鉴别对象是否有完整的外观形态。然而，市场上大多数深加工菌类产品都不具备形态识别法的鉴别条件，因此这种鉴别方法局限性很大，只能用于一些鲜销菌类的鉴别。理化检测法也是一种较为常见的食品鉴伪法。然而，通常情况下食品深加工产品的化学成分十分复杂，不同的产地，气候条件，采摘时机都会导致食品内的化学成分有所区别，而且大多数食品经过了复杂的工艺过程使得其发生了许多物理化学变化，因此，一般的理化检测法很难直接鉴别；由于核酸和蛋白质携带着生物体的遗传信息，具有稳定的特点，因此，通过分子生物学方法来分析食品深加工产品的成分结果具有很高的准确性。

目前，应用于食品鉴伪的分子生物学方法有很多种，例如DNA指纹图谱，随机扩增多态性 DNA等，然而，相对于其它分子生物学方法来说，通过内标准基因PCR(聚合酶链式反应)检测的技术成本相对更低而且所需要的条件简单。内标准基因已被广泛地用于鉴别食品掺假，如何筛选出合适的内标准基因显得尤为重要。迄今为止，内标准基因检测法主要应用于一些转基因农作物的检测，尚未见到应用于检测杏鲍菇的研究。为了建立高效便利检测杏鲍菇的方法，有必要对金针菇的内标准基因进行开发。

发明内容

本发明目的是提供基因s9ap在检测杏鲍菇源性成分中的应用，以基因s9ap作为内标基因，该内标基因s9ap在食品中杏鲍菇成分鉴定中的应用，基因s9ap的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

本发明还提供了一种用于检测杏鲍菇源性成分的试剂盒，以基因s9ap为靶基因建立的试剂盒，包括扩增基因s9ap的特异性引物，采用PCR方法检测内标基因s9ap，特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，试剂盒还包括扩增用常规试剂。

本发明确定的用于检测杏鲍菇源成分的基因s9ap，设计了用于检测该基因的定性PCR和定量PCR的引物并用于试剂盒，建立了检测杏鲍菇源性成分的相应PCR方法，该方法费时少，特异性好，灵敏度高，操作简单，不需要专业人员操作，结果易于观察，非常适于基层食品监督检验使用。

附图说明

图1为s9ap基因在Nucleotide数据库中的BLAST分析；

图2为杏鲍菇s9ap基因的定性PCR验证特异性，图中泳道1-40分别为1：空白对照，2-3：黄牛肝菌（Boletus auripes Pk.），4-5：北风菌（Pleurotuscitrinipileatus），6-7：黑牛肝（Boletus griseus Frost），8-9：奶浆菌（Lactariusvolemus），10-11：青头菌（Russulavirescens），12-13：干巴菌（Thelephoraganbajun），14-15：鸡油菌（Cantharelluscibarius），16-17：松茸（Tricholomamatsutake），18-19：红见手青（Boletus sinicusW.F.Chiu），20-21：白牛肝（Boletus bainiuganDentinger），22-23：大红菇菌（Russulavinosa），24：空白对照，25-26：黄赖头（Leccinumextremiorientale (L.Vass.) Singer），27-28：鸡枞（Collybiaalbuminosa），29-30：老人头（Catathelasmaventricosum （Peck）Singer），31-32：珊瑚菌（Ramariaflava），33-34：香菇（Lentinusedodes），35-36：茶树菇（Agrocybeaegirit），37-38：杏鲍菇（Pleurotuseryngii），39-40：口蘑（Tricholomamongolicum），M：DNA marker DL 2000；

图3为杏鲍菇s9ap基因引物检测灵敏度的定性检测，图中泳道1-15分别为，1：空白对照，2-3：30ng，4-5：6ng，6-7：1.2ng，8-9：0.24ng，10-11：0.048ng，12-13：0.0096ng，14-15：0.00192ng，M：DNA marker DL 2000；

图4为杏鲍菇s9ap基因引物检测灵敏度的定量检测，图A为扩增曲线；图B为标准曲线；

图5为引物s9ap2-F/B对杏鲍菇深加工样品的PCR检测，图中泳道1-2：饭扫光(野香菌)，3-4:香辣杏鲍菇，M：DNA marker DL 2000。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

黄牛肝菌、北风菌、黑牛肝菌、奶浆菌、青头菌、干巴菌、鸡油菌、松茸、红见手、白牛肝、大红菇、黄癞头、鸡枞、老人头、珊瑚菌、香菇、茶树菇、杏鲍菇、口蘑购买于云南当地野生菌市场。

实施例1：杏鲍菇源通用内标基因s9ap的筛选

在NCBI的Nucleotide数据库中，搜索杏鲍菇的基因信息，通过BLAST比对分析，最终筛选出杏鲍菇s9ap丝氨酸氨基肽酶基因(登录号：AB918644)作为内标准基因，s9ap基因的BLAST结果见图1，s9ap基因的BLAST比对结果图中没有显示有任何其它基因的全部序列与s9ap基因的序列相同或相似，这说明s9ap基因与其它基因没有同源性，具有极强的物种特异性。

实施例2：杏鲍菇源性成分通用内标基因的验证

1、针对实施例1筛选的内部基因s9ap，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，并对设计好的引物进行BLAST对比分析，保证引物的特异性，引物序列见表1；扩增的序列为SEQ ID NO:1的第880位碱基～第1215位碱基；

表1 s9ap基因的PCR引物序列

;

2、杏鲍菇内标准基因引物物种特异性的定性验证

以黄牛肝菌、北风菌、黑牛肝菌、奶浆菌、青头菌、干巴菌、鸡油菌、松茸、红见手、白牛肝、大红菇、黄癞头、鸡枞、老人头、珊瑚菌、香菇、茶树菇、杏鲍菇、口蘑十九种蘑菇的基因组DNA作为模板，使用引物s9ap-F/R进行普通PCR扩增检测，定性验证杏鲍菇内标准基因的种间特异性。用2%的琼脂糖凝胶电泳 (含有0.1μg/mL Ts-Gelred10000X) 分析扩增产物，电压为120V，电泳缓冲液为1×TAE。扩增产物上样量为5μL，用凝胶成像仪扫描产生图像并进行图像分析，PCR扩增程序：预变性 (95℃，5min)；30个循环：变性 (95℃，30s)，退火 (60℃，30s)，延伸 (72℃，30s)；终止延伸 (72℃，5min)。PCR反应体系见表2；

结果表明，杏鲍菇的基因组DNA均成功扩增s9ap基因，条带明显，而其余蘑菇没有扩增产物，如图2所示；

表2 定性PCR反应体系

；

3、杏鲍菇内标准基因定性检测体系灵敏度验证

为了检测杏鲍菇s9ap基因引物的检测灵敏度，将样品进行梯度稀释 (15ng/μL、3ng/μL、0.6ng/μL、0.12ng/μL、0.024ng/μL、0.0048ng/μL、0.00096ng/μL) 进行定性检测，使用引物s9ap-F/R进行普通PCR扩增检测；用2%的琼脂糖凝胶电泳 (含有0.1μg/mL Ts-Gelred10000X) 分析扩增产物，电泳缓冲液为1×TAE，上样量为5μL；用凝胶成像仪扫描产生图像并进行图像分析，PCR反应体系同表2；

结果表明，杏鲍菇DNA模板含量为30ng和6ng时，电泳图上出现清晰特异性条带，且亮度逐渐减弱，而当模板含量降至1.2ng时，未检测到扩增产物，因此，定性PCR的检出限为6ng，如图3所示。

4、杏鲍菇内标准基因定量检测体系灵敏度验证

为了检测杏鲍菇s9ap基因引物的检测灵敏度，将样品进行梯度稀释 (40ng/μL、4ng/μL、0.4ng/μL、0.08ng/μL、0.016ng/μL) 进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增检测，定量确定杏鲍菇内标准基因特异引物的检测灵敏度。SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增程序：预变性 (95℃，15min)；40个循环：变性 (95℃，10s)，退火 (60℃，20s)，延伸 (72℃，30s)，PCR反应体系见表3；

表3 特异性引物验证的SYBR Green I 实时荧光定量PCR反应体系

试剂名称	添加量 (μL)
		2×SuperReal PreMix Plus	12.5
正向引物 (10 μM)	0.75
		反向引物 (10 μM)	0.75
50×ROX Reference Dye	2.5
		DNA模板 (40 ng/μL)	5
无菌超纯水	补足反应体系至25

定量PCR扩增曲线及标准曲线见图4，由图4A可知，当模板含量为400pg时，仍能发生特异性扩增，Ct值明显高于阴性对照，这说明SYBR GreenⅠ定量PCR的最低检出限在400pg；根据图4B，可获得标准曲线公式：y=－0.732x+26.654，相关系数R²为0.98。

5、对杏鲍菇深加工样品的PCR检测

为验证内标准基因以及建立的定量PCR检测技术在实际样品检测过程中的准确性，对市场销售的2种杏鲍菇深加工制品（饭扫光、香辣杏鲍菇）进行检测；由图5中可以看出经过特异性引物s9ap-F/R对饭扫光的普通PCR扩增后无条带，则样品中不含杏鲍菇成分；而香辣杏鲍菇可以扩增与目标一致大小的扩增产物，确定样品中含有杏鲍菇，这些结果与样品成分表中一致，说明成功建立了一套定性定量PCR检测s9ap基因的体系。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 基因s9ap在检测杏鲍菇源性成分中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3204

<212> DNA

<213> 杏鲍菇(Pleurotus eryngii)

<400> 1

acatccactt cgaaattcag aagcaacccg agccccacgc ggtggctctt gactgaccta 60

cgcgaagttt ggcatagaag ccgaaatctc ttgctgttcc atgggctatc gtatatgtac 120

gtccctgtga ccggagagct gggaatcttc taacaactca ggtacgaaag ttgtacagca 180

agaaacggtg ccaatccagc ggatcctcga tgcctcaaat attaatagct ttttcggttc 240

agctgcgcgg gaatgacggt atgctgtatg cgtgggtctt gagtctgtat atagacggtc 300

tataagtaag ggctttgcat ccttcacctc ccaaactcca atcacttcgt atcagtatga 360

ccacccccac aaaagccccc tacggtactt gggaatcgcc aatcagtgcc gacgatattg 420

ttcaaggagt gagtactact tgacgttcgc cgtgacctaa attctaattc gtcgtccatc 480

tagtccaagc caattgcaga gctccttgtc gattccatca ctcacacaat ttaccatgtt 540

gaatcccggc cagcagagga cggaaggaac gtcctagtcg agactgagac aggccgagat 600

ttggttggta aggagtggaa tgtgcgcaca ggggtgcacg agtacggcgg gggcgctgcg 660

atcgtctacg gcaatatcgc ctatttctcc cactacgtcg atggcagggt atacagtgtc 720

gatgtcaaaa cagacggcgc tacccctgag gccgtcactc caggtacgtg gctgacgcaa 780

ccgccgtcaa atcaaccagc aatcaactta tgcttcatac ttatagatag caataatctt 840

catcggtttg ccgatttcga tgtgcatccc aggatttctg aactcgtggt cgcgattatg 900

gaagatcaca ctaacgatcc caccggcgaa gccccatcac aagtagtgaa cactctctgc 960

gtcatcgaca cggtggcgaa gtccgtcagc cctttggttt ctggcgccga cttctattcc 1020

aatgcaaggt tctcgccgga tggtagtcgt ctcgtctggc ttcagtggtt ccacccggat 1080

atgccttggg agggctccga gctgaggcac gctgacgtcg ccatcacaga ggggaaagtg 1140

agcttgacga acaccatcac tatcgacggt gtgccatcca agatcagtgt cgcctttcca 1200

tcttgggtca acaacgacac cctactcttc accagtgatc gatccggata tcaaaaccct 1260

cacaagtatg taggtggcca agctacgccg gtattcctcg aacccattgc ccaggacttc 1320

agccagccag cctggacact aggctggtca ccgcatgccc ctatcgacga gactgggcaa 1380

aatatcctat gcacggcgtg gaaggacggg aaaaccgtta tatacctcgt cgacatccaa 1440

agcagggctc ctccgcaact cgtcgagtcg tcgtttgtgg ccattgatat catccgcgcg 1500

gtttctacgg aaagtcatca agcggtgttc tcgtccccta aagttgatgc agacaatgct 1560

atcattcgtt gcaccctgcc gtcttccctt gatcccaaag acgctgaatt tacagtggtt 1620

gcccctgctg aagggacgcc agtcgagttc cctgacggaa ttatttccat tcctcagcct 1680

cttgacattg gtcctcaaga cgccctcgtc cacgtcgttt attatccccc aaacaaccca 1740

gcgtacagcg gtagtagcat cccggatgaa tcaccgcctt gcgttgtgaa tgtccatgga 1800

ggtccgacgg ccctcgagaa ccaggctcta aactggaaga agcaatattt tacaagccga 1860

ggttgggcct ggtgcgtagt acccatgcgt tctgtgatgc gtttccacaa tttcttacac 1920

aggttggatg tcaattacgg tggttcctcg ggttacggtc gtgaatatat gtacgtcatg 1980

cctctccctg tttcgcgctt cattctaagt cgtgttcgaa gtcaacgtct tgcaggaaat 2040

tggggaattg tagatacgga ggattcaatc aaagcggtgg atatcctttc ggaagccccg 2100

tatcgcaatc tccttgacgc taagagaagc gcgatccggg gaggctctgc aggaggatat 2160

actacccttg ccacactttc gataagctcg aatccagccg ccttcgctgc cggtacctcg 2220

tcctatggta tatccgactt agccgggctc gctgagtcca cgcacaagtt tgaatctcaa 2280

tacatgaaca agctcgtagg agcctcttta gaagaggacc ctcaactata caaggataga 2340

tctccgcttt atcatgcgga taaaatcaca tccccgctct tggtaagtac ttgctgcgtc 2400

cgtatctaaa cggaataact cctcaactca ctgcataaaa acgtagatat tacaaggaga 2460

actcgatcga gtcgttccaa aggaacaggc tgaacagatg cgagatacta tttgcgcaaa 2520

tggtggggtg gtgtgctata aactatatga gggcgaaggt catgggtggc gtctggaaga 2580

aaccatcaag gatgcactcg aacgggagtt gcatttctat gaaggtcaat tgttgaagtt 2640

gaagtaagcg atggaaggaa accgccgtcg ccgttgagta gtaacagatg gtaatccaaa 2700

tgtaagatcg agtcgaatgt atgattatac cacaagcatg aggtgatgta ggccatagcc 2760

tgaggctgaa tgtctatact ctggtaggtt tacaactgtc cgcgatagaa tctaacattt 2820

gaaaggaagt agcgacttgt caagtgttag cgcgtcggaa acaacaaagc aatctacatc 2880

ggcacctacg gaaccaatcc agggcggtat gcaaaggctt ttggacgtgg ctgcagggca 2940

tacattggtg gcgctcgaag caccgatgag actctcccta tgatactcga cctcttggtc 3000

tcatgcatta tccagggcca tgccacaatg tagacgcagt acgccgacgg ggatagggat 3060

aggcccgtag agtagttata atgcgttgta gtgtagagcg atactccttt ctggactgga 3120

tggccttgtg gagtcagcgt tccagcgctc aggcgaacgg cgcgccgcgc agcatgccta 3180

agtagcaggc tgctccatca attt 3204

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

gaactcgtgg tcgcgattat 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

gttgttgacc caagatggaa ag 22

Claims

1. 一种基因s9ap在检测杏鲍菇源性成分中的应用，基因s9ap的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，使用扩增权利要求1所述基因s9ap的特异性引物，特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。