CN105256035A - 用于鉴别金华两头乌和杜洛克猪遗传背景的分子标记及其应用 - Google Patents
用于鉴别金华两头乌和杜洛克猪遗传背景的分子标记及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供能鉴别金华两头乌和杜洛克猪遗传背景的分子标记及其应用。本发明通过分别对两个猪种的10个无亲缘关系个体的基因组进行PCR扩增和测序，筛选到一批单核苷酸多态位点（SNP）在两个猪种基因组序列中呈现完全不同的基因型。本发明涉及的分子标记可有效用于鉴别金华两头乌和杜洛克猪的遗传背景，从而提高猪新品种的选育效率。
Description
技术领域
本发明涉及一批猪基因组上的分子标记，共计52个单核苷酸多态位点，具体是一批能用于鉴别金华两头乌和杜洛克猪遗传背景的分子标记。
背景技术
杜洛克、长白、大约克等3大国外品种因其生长速度、瘦肉率、饲料报酬等生产性能较高，在目前养猪业中起主导地位。但引进主流猪种存在肉质不佳、繁殖率低、抗病抗逆性状不理想等弱点，如何在保持其高生长速度、高瘦肉率的前提下提升前述种质性能，成为国际猪育种界的主要研究课题。我国具有丰富的地方猪种资源，特别是我省的金华两头乌和嘉兴黑猪(太湖猪)因其具有肉质优、产仔率高的遗传特性，成为国际注目的宝贵猪育种素材。然而，地方品种的生长速度慢、瘦肉率和饲料转化率等性能远远低于外来品种，限制了其在现代养猪生产中的应用。如何综合地方猪种与外来品种的优点进行生产利用，成为养猪生产中亟待解决的问题。
传统育种依靠自然变异积累遗传多样性，依靠表型测定估计遗传性能，育种改进速度慢，花费巨大。要想进一步突破遗传进展瓶颈，很大程度上需要依靠现代分子育种技术手段。分子遗传标记为畜禽的早期遗传评估、活体无法测定性状的遗传评估和遗传力低性状的遗传评估提供了新的方法，已在畜禽育种先进国家的育种实践中得到应用，并显出巨大的优越性。
迄今为止，尚未将分子育种手段和传统育种技术相结合进行种质创新的应用，申请人根据已有猪基因组序列，利用PCR-测序方法筛选出一批能鉴别金华两头乌和杜洛克猪遗传来源的分子标记。为后续开展分子标记辅助基因导入猪育种技术研究，将金华猪肉质和毛色调控基因定向导入杜洛克猪，创制优质特色新种质提供宝贵材料。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的技术缺陷，发掘一批能够用于鉴别金华两头乌和杜洛克猪遗传来源的分子标记，开展分子标记辅助育种，加快猪新品种选育进度。
本发明是52个在金华两头乌和杜洛克猪中呈现不同基因型的分子标记，能用于鉴别后代的遗传背景，开展分子标记辅助选种，更有效率地引入金华两头乌血缘，从而加快新品种选育进度。分子标记由下述引物通过PCR扩增金华两头乌和杜洛克纯种猪耳组织DNA各10头，产物纯化后经测序筛选获得：
1)引物对名称，CHR1-0.6
正向引物：5’-TTTCTCTCTCCTCCCGTTGTCC-3’(SEQIDNO：1)
反向引物：5’-GGATCTCGTCGTATCTGTCGTTGT-3’(SEQIDNO：2)
2)引物对名称，CHR1-0.8
正向引物：5’-GGCAGGTATGTGAGGGAGTAAG-3’(SEQIDNO：3)
反向引物：5’-CAACTGAAAGACAAGCAAGGGA-3’(SEQIDNO：4)
3)引物对名称，CHR2-0.4
正向引物：5’-ATGACGCCAAGGACGCTATGAT-3’(SEQIDNO：5)
反向引物：5’-GAGGGCAGTCTTGGACCTTGTG-3’(SEQIDNO：6)
4)引物对名称，CHR2-0.8
正向引物：5’-GTCACCCCATCTCCCTCATCA-3’(SEQIDNO：7)
反向引物：5’-GTTGGGAGGCTTTCTATTCACG-3’(SEQIDNO：8)
5)引物对名称，CHR4-0.1
正向引物：5’-GAGGGTGAGGTCCTTCTTCCG-3’(SEQIDNO：9)
反向引物：5’-GCATTAACCTCGGCTACAACG-3’(SEQIDNO：10)
6)引物对名称，CHR4-0.5
正向引物：5’-GGCAAAAAAACAGGAACGGAA-3’(SEQIDNO：11)
反向引物：5’-CAGTAGTGCCAAGGGTTGAGAAAT-3’(SEQIDNO：12)
7)引物对名称，CHR4-0.6
正向引物：5’-GTGGGTTTGTTTCCGCTGAGTC-3’(SEQIDNO：13)
反向引物：5’-CAGTGGCACAGACCCAAAGTCC-3’(SEQIDNO：14)
8)引物对名称，CHR5-0.1
正向引物：5’-CACATTCCTCGATTCCATCAAAA-3’(SEQIDNO：15)
反向引物：5’-TCCGAGATTTCCACTTCACCCTG-3’(SEQIDNO：16)
9)引物对名称，CHR5-0.2
正向引物：5’-TCAAATTCGCTGACTCTTCTTG-3’(SEQIDNO：17)
反向引物：5’-TGTATGTAACTCCCAGGGTCCTAA-3’(SEQIDNO：18)
10)引物对名称，CHR6-0.1
正向引物：5’-CTAGGCATTGACAGTTTATTGAG-3’(SEQIDNO：19)
反向引物：5’-TATGTATGTGATGATCTTGGAGC-3’(SEQIDNO：20)
11)引物对名称，CHR6-0.9
正向引物：5’-CACAGGATGTTGTCACCGATTC-3’(SEQIDNO：21)
反向引物：5’-GCCACCTCTGTTTGAGCACTAC-3’(SEQIDNO：22)
12)引物对名称，CHR7-0.4
正向引物：5’-CCCTGGTGGGCATTTGGTAAGT-3’(SEQIDNO：23)
反向引物：5’-TACGGACTGGATGTGAAAAGAGGG-3’(SEQIDNO：24)
13)引物对名称，CHR10-0.9
正向引物：5’-CACGATGTCATGCCCGCCTCC-3’(SEQIDNO：25)
反向引物：5’-AGCAGCGACCCAGCCACTTCA-3’(SEQIDNO：26)
14)引物对名称，CHR12-0.9
正向引物：5’-AAACCAGCTTCCATGCCCTCAC-3’(SEQIDNO：27)
反向引物：5’-GAAGGCCGTGAACGGGTGAAT-3’(SEQIDNO：28)
15)引物对名称，CHR13-0.1
正向引物：5’-ATACAAGGCCAAGCAAGGTGAG-3’(SEQIDNO：29)
反向引物：5’-GCTTAGGTTCCAAGGGTTCACA-3’(SEQIDNO：30)
16)引物对名称，CHR14-0.8
正向引物：5’-CAGAACAGGCTTCCCACACATA-3’(SEQIDNO：31)
反向引物：5’-TGTCTGCCTTTAGTGACCTCTGG-3’(SEQIDNO：32)
17)引物对名称，CHR15-0.4
正向引物：5’-CTGCCTACCCACCCTCATCTTC-3’(SEQIDNO：33)
反向引物：5’-CTGGACCTCACCCTGGAAAGC-3’(SEQIDNO：34)
18)引物对名称，CHR15-0.9
正向引物：5’-TCACTTGACAGATTTGGGCAACTTA-3’(SEQIDNO：35)
反向引物：5’-GAAAGGAAGTATGGCAATCGGAGA-3’(SEQIDNO：36)
19)引物对名称，CHR17-0.2
正向引物：5’-CCATCCCGCTCTGCTTGCCC-3’(SEQIDNO：37)
反向引物：5’-ACCCCGACCTGCTGAACCCTG-3’(SEQIDNO：38)
20)引物对名称，CHR17-0.8
正向引物：5’-CCTGGATGCTGGGAAGAAATAG-3’(SEQIDNO：39)
反向引物：5’-GCTCTGGGTGCGGAACTTGTAG-3’(SEQIDNO：40)
21)引物对名称，CHRX-0.4
正向引物：5’-GTGAATGAGGCAGGATGAACTGG-3’(SEQIDNO：41)
反向引物：5’-CTCAGCAGCTTGTTGATCTCGTTC-3’(SEQIDNO：42)
本发明还提供一种鉴别金华两头乌和杜洛克猪遗传背景的方法，主要包括以下步骤：
1)分别随机选取无亲缘关系的金华两头乌和杜洛克猪各10头，采集耳组织，提取基因组DNA；
2)利用上述引物进行PCR扩增；PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和EB染色法检测。PCR产物经DNA纯化试剂盒(TIANGEN)纯化。
3)纯化后的产物由上海生工进行测序。将同一对引物扩增得到的产物测序结果进行比对，筛选出能鉴别金华两头乌和杜洛克猪遗传来源的SNP位点。
本发明分子标记的应用，将通过对后代基因组DNA的PCR扩增和测序，能有效选留金华两头乌遗传物质更多的个体，更高效准确地完成金华两头乌血缘的导入，从而加快育种进程。
本发明首次将所述分子标记在选育猪肉质优良品种中应用。借助分子标记辅助选择技术，有目的得进行金华两头乌血缘的导入和聚合，培育肉质更优良的猪新品种核心群。
本发明的有益效果表现在：本发明首次筛选得到能鉴别金华两头乌和杜洛克猪遗传背景的且基因组覆盖面较广的一批分子标记，共计52个单核苷酸多态位点(SNP)。
附图说明
图1为筛选分子标记的标准示意图；
图2为测序峰图，中间虚线靠左位置表示分子标记所在位点(由于数据量较大，附图只选取其中1个标记的测序峰图作为代表：CHR2-0.8C/T)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用材料均可从国家种质资源库或相关育种单位获得。
实施例1：能用于鉴别金华两头乌和杜洛克猪遗传背景的分子标记的获得及应用
(一)样品采集和基因组DNA提取
随机挑选无亲缘关系的金华两头乌和杜洛克猪各10头，使用酒精消毒的耳号剪剪取耳组织样品0.2g左右，低温保存。需要注意的是每个样品采集后都对耳号剪进行消毒处理，防止采样过程中的交叉污染。
基因组DNA提取使用TIANGEN公司生产的TIANampGenomicDNAKit(离心柱型)，参考试剂盒说明书进行操作，获得纯度较高的基因组DNA，分光光度计测定浓度后-20℃保存备用。
(二)引物对设计
从公开发表的文献及生物学数据库中获得一批梅山猪与国外猪种之间的SNP数据，基本覆盖猪19条染色体，在此基础上选取测定样本量最多的位点，截取两端侧翼序列各500bp，与NCBI上猪基因组序列(susscrofa10.2)BLAST，进一步确认所在染色体位置和所属基因结构，利用primer软件逐一设计PCR扩增用引物对。引物对具体序列、退火温度及产物长度见表1。所有引物对由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表1本发明所涉及所有引物对的名称、序列、Tm值及其目标产物大小
| 引物对名称 | 正向引物序列5‘-3’ | 反向引物序列5‘-3’ | Tm℃ | 产物bp |
| CHR1-0.6 | TTTCTCTCTCCTCCCGTTGTCC | GGATCTCGTCGTATCTGTCGTTGT | 57 | 725 |
| CHR1-0.8 | GGCAGGTATGTGAGGGAGTAAG | CAACTGAAAGACAAGCAAGGGA | 60 | 475 |
| CHR2-0.4 | ATGACGCCAAGGACGCTATGAT | GAGGGCAGTCTTGGACCTTGTG | 63 | 719 |
| CHR2-0.8 | GTCACCCCATCTCCCTCATCA | GTTGGGAGGCTTTCTATTCACG | 60 | 661 |
| CHR4-0.1 | GAGGGTGAGGTCCTTCTTCCG | GCATTAACCTCGGCTACAACG | 62 | 750 |
| CHR4-0.6 | GTGGGTTTGTTTCCGCTGAGTC | CAGTGGCACAGACCCAAAGTCC | 62 | 622 |
| CHR5-0.1 | CACATTCCTCGATTCCATCAAAA | TCCGAGATTTCCACTTCACCCTG | 60 | 685 |
| CHR5-0.2 | TCAAATTCGCTGACTCTTCTTG | TGTATGTAACTCCCAGGGTCCTAA | 60 | 430 |
| CHR6-0.1 | CTAGGCATTGACAGTTTATTGAG | TATGTATGTGATGATCTTGGAGC | 60 | 462 |
| CHR6-0.9 | CACAGGATGTTGTCACCGATTC | GCCACCTCTGTTTGAGCACTAC | 62 | 715 |
| CHR7-0.4 | CCCTGGTGGGCATTTGGTAAGT | TACGGACTGGATGTGAAAAGAGGG | 60 | 464 |
| CHR10-0.9 | CACGATGTCATGCCCGCCTCC | AGCAGCGACCCAGCCACTTCA | 63 | 727 |
| CHR11-0.6 | GGCAAAAAAACAGGAACGGAA | CAGTAGTGCCAAGGGTTGAGAAAT | 60 | 524 |
| CHR12-0.9 | AAACCAGCTTCCATGCCCTCAC | GAAGGCCGTGAACGGGTGAAT | 60 | 468 |
| CHR13-0.1 | ATACAAGGCCAAGCAAGGTGAG | GCTTAGGTTCCAAGGGTTCACA | 60 | 581 |
| CHR14-0.8 | CAGAACAGGCTTCCCACACATA | TGTCTGCCTTTAGTGACCTCTGG | 60 | 650 |
| CHR15-0.4 | CTGCCTACCCACCCTCATCTTC | CTGGACCTCACCCTGGAAAGC | 60 | 670 |
| CHR15-0.9 | TCACTTGACAGATTTGGGCAACTTA | GAAAGGAAGTATGGCAATCGGAGA | 60 | 700 |
| CHR17-0.2 | CCATCCCGCTCTGCTTGCCC | ACCCCGACCTGCTGAACCCTG | 63 | 640 |
| CHR17-0.8 | CCTGGATGCTGGGAAGAAATAG | GCTCTGGGTGCGGAACTTGTAG | 60 | 750 |
| CHRX-0.4 | GTGAATGAGGCAGGATGAACTGG | CTCAGCAGCTTGTTGATCTCGTTC | 60 | 760 |
(三)PCR扩增和纯化
PCR扩增条件：10uL的反应体系中加入DNA模板0.5μL，10PCRbuffer1μL，dNTP0.3μL，10mM引物前后各0.2μL，Taq酶1U。PCR反应条件为：94℃预变性5min后，94℃变性30s、X℃退火30s、72℃延伸40s，35个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。
PCR产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mL离心管中，于65℃温育至凝胶完全融化，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自TIANGEN公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是在每300μL融化的凝胶中加入1mLResin试剂，混匀20s，将Resin/DNA混合物转移至带有吸附柱的离心管，离心除去液体。再向吸附柱中加入80％的异丙醇2mL，离心除去液体，取下吸附柱装入1.5mL离心管中，10,000g离心2min以干燥Resin，将吸附柱装入另一个干净的1.5mL离心管中，加入30-50μL灭菌水，静置1min，10,000g离心20s，以洗脱DNA存于离心管中。
(四)测序和序列比对分析
纯化后的产物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序完成后，利用Taqman软件进行序列比对，如图1示意图所示原则，筛选出在金华两头乌和杜洛克猪中呈现不同纯合型的SNP位点，由图2所示的其中一个SNP位点的测序峰图可知，该SNP在杜洛克猪中的测序结果全部是C，在金华两头乌中全部为T。然后截取侧翼序列200bp左右，利用ensemble数据库的genomicBLAST功能确定该位点的染色体位置，所属基因结构，进一步对照氨基酸密码子表确定该SNP位点是否改变了氨基酸，具体结果见表2。
表2本发明所涉及的分子标记类型、染色体位置及在两个猪种中的基因型
(五)上述分子标记在后代选育过程中的应用
为了培育肉质更细嫩、肌内脂肪更丰富的猪新品种，试将金华两头乌血缘尽可能多的引入到杜洛克猪中，如采用传统育种的杂交方式，进程缓慢且血缘容易丢失与稀释。在表型选育的基础上，进行分子标记辅助选种，将提高选育的进度和准度。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
SEQUENCELISTING
<110>浙江省农业科学院
<120>用于鉴别金华两头乌和杜洛克猪遗传背景的分子标记及其应用
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ctcagcagcttgttgatctcgttc
Claims (2)
1.能用于鉴别金华两头乌和杜洛克猪遗传背景的分子标记，其特征在于：PCR扩增及测序用引物对为：
1)引物对名称，CHR1-0.6
正向引物：5’-TTTCTCTCTCCTCCCGTTGTCC-3’（SEQIDNO：1）
反向引物：5’-GGATCTCGTCGTATCTGTCGTTGT-3’（SEQIDNO：2）
2)引物对名称，CHR1-0.8
正向引物：5’-GGCAGGTATGTGAGGGAGTAAG-3’（SEQIDNO：3）
反向引物：5’-CAACTGAAAGACAAGCAAGGGA-3’（SEQIDNO：4）
3)引物对名称，CHR2-0.4
正向引物：5’-ATGACGCCAAGGACGCTATGAT-3’（SEQIDNO：5）
反向引物：5’-GAGGGCAGTCTTGGACCTTGTG-3’（SEQIDNO：6）
4)引物对名称，CHR2-0.8
正向引物：5’-GTCACCCCATCTCCCTCATCA-3’（SEQIDNO：7）
反向引物：5’-GTTGGGAGGCTTTCTATTCACG-3’（SEQIDNO：8）
5)引物对名称，CHR4-0.1
正向引物：5’-GAGGGTGAGGTCCTTCTTCCG-3’（SEQIDNO：9）
反向引物：5’-GCATTAACCTCGGCTACAACG-3’（SEQIDNO：10）
6)引物对名称，CHR4-0.5
正向引物：5’-GGCAAAAAAACAGGAACGGAA-3’（SEQIDNO：11）
反向引物：5’-CAGTAGTGCCAAGGGTTGAGAAAT-3’（SEQIDNO：12）
7)引物对名称，CHR4-0.6
正向引物：5’-GTGGGTTTGTTTCCGCTGAGTC-3’（SEQIDNO：13）
反向引物：5’-CAGTGGCACAGACCCAAAGTCC-3’（SEQIDNO：14）
8)引物对名称，CHR5-0.1
正向引物：5’-CACATTCCTCGATTCCATCAAAA-3’（SEQIDNO：15）
反向引物：5’-TCCGAGATTTCCACTTCACCCTG-3’（SEQIDNO：16）
9)引物对名称，CHR5-0.2
正向引物：5’-TCAAATTCGCTGACTCTTCTTG-3’（SEQIDNO：17）反向引物：5’-TGTATGTAACTCCCAGGGTCCTAA-3’（SEQIDNO：18）
10)引物对名称，CHR6-0.1
正向引物：5’-CTAGGCATTGACAGTTTATTGAG-3’（SEQIDNO：19）
反向引物：5’-TATGTATGTGATGATCTTGGAGC-3’（SEQIDNO：20）
11)引物对名称，CHR6-0.9
正向引物：5’-CACAGGATGTTGTCACCGATTC-3’（SEQIDNO：21）反向引物：5’-GCCACCTCTGTTTGAGCACTAC-3’（SEQIDNO：22）
12)引物对名称，CHR7-0.4
正向引物：5’-CCCTGGTGGGCATTTGGTAAGT-3’（SEQIDNO：23）反向引物：5’-TACGGACTGGATGTGAAAAGAGGG-3’（SEQIDNO：24）
13)引物对名称，CHR10-0.9
正向引物：5’-CACGATGTCATGCCCGCCTCC-3’（SEQIDNO：25）
反向引物：5’-AGCAGCGACCCAGCCACTTCA-3’（SEQIDNO：26）
14)引物对名称，CHR12-0.9
正向引物：5’-AAACCAGCTTCCATGCCCTCAC-3’（SEQIDNO：27）反向引物：5’-GAAGGCCGTGAACGGGTGAAT-3’（SEQIDNO：28）
15)引物对名称，CHR13-0.1
正向引物：5’-ATACAAGGCCAAGCAAGGTGAG-3’（SEQIDNO：29）反向引物：5’-GCTTAGGTTCCAAGGGTTCACA-3’（SEQIDNO：30）
16)引物对名称，CHR14-0.8
正向引物：5’-CAGAACAGGCTTCCCACACATA-3’（SEQIDNO：31）反向引物：5’-TGTCTGCCTTTAGTGACCTCTGG-3’（SEQIDNO：32）
17)引物对名称，CHR15-0.4
正向引物：5’-CTGCCTACCCACCCTCATCTTC-3’（SEQIDNO：33）反向引物：5’-CTGGACCTCACCCTGGAAAGC-3’（SEQIDNO：34）
18)引物对名称，CHR15-0.9
正向引物：5’-TCACTTGACAGATTTGGGCAACTTA-3’（SEQIDNO：35）
反向引物：5’-GAAAGGAAGTATGGCAATCGGAGA-3’（SEQIDNO：36）
19)引物对名称，CHR17-0.2
正向引物：5’-CCATCCCGCTCTGCTTGCCC-3’（SEQIDNO：37）
反向引物：5’-ACCCCGACCTGCTGAACCCTG-3’（SEQIDNO：38）
20)引物对名称，CHR17-0.8
正向引物：5’-CCTGGATGCTGGGAAGAAATAG-3’（SEQIDNO：39）反向引物：5’-GCTCTGGGTGCGGAACTTGTAG-3’（SEQIDNO：40）21)引物对名称，CHRX-0.4
正向引物：5’-GTGAATGAGGCAGGATGAACTGG-3’（SEQIDNO：41）
反向引物：5’-CTCAGCAGCTTGTTGATCTCGTTC-3’（SEQIDNO：42）。
2.根据权利要求1所述分子标记在选育更多的金华两头乌血缘猪育种中的应用。
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