CN106434644A - 大泷六线鱼微卫星位点及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一类大泷六线鱼微卫星位点及其应用，所述的微卫星位点具有选自SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.15任一所示的核苷酸序列。所述微卫星位点可有效地应用于大泷六线鱼种群遗传学研究的遗传标记。本发明还提供了特异性扩增所述的微卫星位点序列的引物，所获引物的扩增结果具有高度的多态性和稳定性，为大泷六线鱼的遗传多样性以及种群间的亲缘关系的鉴定提供资料，弥补现有技术的不足。本发明还提供微卫星位点在大泷六线鱼群体遗传学分析、个体鉴定或分子辅助育种方面的应用。

Description

大泷六线鱼微卫星位点及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学DNA分子标记技术领域，具体涉及大泷六线鱼SSR分子标记的开发及遗传多样性以及种群间的亲缘关系的鉴定。
背景技术
大泷六线鱼(学名：Hexagrammos otakii)为六线鱼科六线鱼属的鱼类。分布于朝鲜、日本以及中国东海、黄海、渤海等海域，系冷温性近海底层鱼类。大泷六线鱼的食性很广，以底栖生物为主，也摄食小虾、小鱼。目前，国内外有关大泷六线鱼的研究报道还比较少，主要集中在生物学地位、生态分布以及种群资源量，还有一些学者对其生理、生化等方面进行了研究，但目前对于大泷六线鱼微卫星方面的研究则不多。这在一定程度上限制了大泷六线鱼的遗传育种和品质改良。
微卫星标记(SSRs：simple sequence repeats)或短串联重复(Short tandemrepeats，STRS)，是由2～6个核苷酸的串联重复片段构成的且均匀，分布于真核生物基因组中的简单重复序列，是一种广泛应用的遗传学领域的DNA分子标记。每个微卫星DNA都包括核心序列和侧翼序列，核心序列即为重复序列，而侧翼DNA序列是保守的特异单拷贝序列，但是侧翼序列却很保守，为分析微卫星序列多态性提供了可能性。通过侧翼序列设计引物对基因组进行扩增，然后对PCR产物即特异位点的微卫星序列进行多态性检测。微卫星具有多态性高，提供的遗传信息多，PCR扩增效果重复性好，以及在基因组中分散分布等优点，常用于生物的遗传多样性分析，遗传图谱和杂交育种等。由于微卫星研究所用DNA的数量少，对样品要求低，因此，微卫星分析在遗传学领域具有广泛的应用性。
发明内容
本发明第一方面提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸具有选自序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.15任一所示的核苷酸序列。本发明还提供所述多核苷酸的用途，作为微卫星标志物用于大泷六线鱼群体遗传学分析，遗传多样性检测，数量性状遗传图谱，遗传连锁作图，家系和个体鉴定，分子辅助育种。
本发明第二方面提供大泷六线鱼微卫星位点，所述位点选自序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.15任一所示的核苷酸序列，或选自任一在严格条件下与权利要求1中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。本发明还提供所述大泷六线鱼微卫星位点的组合，选自所述大泷六线鱼微卫星位点的两种或多种。
本发明第三方面提供选自SEQ ID NO：1-15任一所述的微卫星位点两端的侧翼序列上设计的大泷六线鱼微卫星引物。本发明提供的引物是引物对，所述的引物对具有选自以下序列对所示的序列：SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：24和SEQ IDNO：25；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：30和SEQID NO：31；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43；SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45。
本发明第四方面提供大泷六线鱼微卫星引物或其组合在大泷六线鱼群体遗传学分析，遗传多样性检测，数量性状遗传图谱，遗传连锁作图，家系和个体鉴定，分子辅助育种的用途。
本发明第五方面提供一种用于大泷六线鱼遗传多样性检测的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有选自本发明提供的任一所示的引物。
本发明第六方面提供一种大泷六线鱼遗传多样性检测的方法，包括以下步骤：
1)基因组DNA的提取：
2)微卫星PCR扩增：采用FAM荧光标记的微卫星引物扩增大泷六线鱼基因组DNA，获得其扩增产物；
3)扩增产物电泳：在毛细管电泳基因分析仪上电泳，用GS500LIZ作分子量内标，个体扩增产物用peak Scanner Software(v1.0)对毛细管电泳数据初步处理。
4)遗传多样性分析：根据每个个体微卫星扩增产物的分子量的大小取定基因型，利用PopGene 32计算遗传多样性参数。
本发明中微卫星位点，位点序列和对应的引物信息如表1：
表1
本发明的微卫星多态性引物用于大泷六线鱼遗传多样性检测以及种群间的亲缘关系的鉴定，包括以下步骤：
1)基因组DNA的提取：采用Omega公司的组织DNA提取试剂盒。
2)微卫星PCR扩增：采用FAM荧光标记的微卫星引物扩增大泷六线鱼基因组DNA，获得其扩增产物。
3)扩增产物电泳：在毛细管电泳基因分析仪上电泳，用GS500LIZ作分子量内标，个体扩增产物用peak Scanner Software(v1.0)对毛细管电泳数据初步处理。
4)遗传多样性分析：根据每个个体微卫星扩增产物的分子量的大小确定基因型，利用PopGene 32计算遗传多样性参数。
本发明从大泷六线鱼基因组DNA中筛选出15个微卫星位点，并根据这些位点在微卫星位点两端的侧翼序列设计特异性引物，使所获得引物的扩增结果具有多态性和稳定性，可适用于大泷六线鱼种群遗传学分析，种群遗传多样性检测，数量性状遗传图谱，遗传连锁作图个体鉴定以及分子辅助育种领域。
具体实施方式
一、微卫星分子标记的筛选
本发明根据基于简化基因组测序(RAD)利用二代测序技术所开发出的SSR文库，根据ncbi中与生长发育相关的碱基序列的比对结果，并根据相关位点，设计了60对的筛选引物，在大泷六线鱼的20个个体中进行验证。
微卫星引物的验证
以大泷六线鱼基因组为模板，用60对引物进行温度梯度PCR以摸索出最佳退火温度，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。在已摸索出最佳退火温度的引物中挑选出15对重新合成FAM标记的荧光标记引物。20μL体系PCR：ddH2O 7.5μL；上游引物(10mM)1μL；下游引物(10mM)1μL；DNA模板0.5μL；Premix Taq(TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)10μL。PCR程序：94℃3min，(94℃30s，Tm 30s，72℃1min)x32 cycle，72℃10min.用ABI3730xl全自动DNA测序仪(上海生物工程股份有限公司)测序。用Peak Scanner Software(v1.0)对毛细管电泳数据初步处理。软件PopGene 32进行遗传指标(等位基因(na：Observed number ofalleles)、有效等位基因(ne：Effective number of alleles)、观测杂合度(Observedheterozygosity)、期望杂合度(Expected heterozygosity)、香农遗传指数(Shannon’sInformation index(I))、Nei氏多样性指数(Nei’s gene diversity index(Nei))、多态信息含量(polymorphism information content(PIC)))计算。
大泷六线鱼微卫星引物在不同地理群体中的遗传多样性的应用
1.首先，采用Omega公司的组织DNA提取试剂盒提取大泷六线鱼的基因组DNA。利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量。
2.用FAM荧光标记的引物PCR扩增，20μL体系PCR：ddH2O 7.5μL；上游引物(10mM)1μL；下游引物(10mM)1μL；DNA模板0.5μL；Premix Taq(TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)10μL。PCR程序：94℃3min，(94℃30s，Tm 30s，72℃1min)x32 cycle，72℃10min.用毛细管电泳(上海生物工程股份有限公司)检测。
3.用Peak Scanner Software(v1.0)对毛细管电泳数据初步处理。软件PopGene32进行遗传指标测定。(等位基因(na：Observed number of alleles)、有效等位基因(ne：Effective number of alleles)、观测杂合度(Observed heterozygosity)、期望杂合度(Expected heterozygosity)、香农遗传指数(Shannon’s Information index(I))、Nei氏多样性指数(Nei’s gene diversity index(Nei))、多态信息含量(polymorphisminformation content(PIC)))计算。
表2：15个微卫星位点的重复单位、引物的相关信息
其中Tm是微卫星的退火温度，na为等位基因数，ne为有效等位基因数，Obs_Het观望杂合度，Exp-Het为期望杂合度。PIC为多态信息含量，I是香农指数，Nei为Nei氏多样性指数，PIC为多态信息含量。
本发明的15对引物对20个大泷六线鱼基因组DNA进行扩增，遗传多样性分析结果表明每个微卫星位点平均等位基因数为16.0667，平均有效等位基因数是6.7202，平均观望杂合度0.6323，平均期望杂合度为0.8075。
本发明的微卫星引物可用于大泷六线鱼遗传多样性检测，数量性状遗传图谱，遗传连锁作图、以及家系和个体鉴定。

Claims (9)

1.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸具有选自序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.15任一所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的多核苷酸的用途，其特征在于，所述的多核苷酸作为微卫星标志物用于大泷六线鱼群体遗传学分析，遗传多样性检测，数量性状遗传图谱，遗传连锁作图，家系和个体鉴定，分子辅助育种。
3.大泷六线鱼微卫星位点，其特征在于，选自序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.15任一所示的核苷酸序列，或选自任一在严格条件下与权利要求1中的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
4.权利要求3所述大泷六线鱼微卫星位点的组合，其特征在于选自权利要求3中所述大泷六线鱼微卫星位点的两种或多种。
5.在选自权利要求1中SEQ ID NO：1-15任一所述的微卫星位点两端的侧翼序列上设计的大泷六线鱼微卫星引物。
6.如权利要求5所述的引物，其特征在于，所述的引物是引物对，所述的引物对具有选自以下序列对所示的序列：SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：24和SEQ IDNO：25；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：30和SEQID NO：31；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43；SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45。
7.权利要求5或6所述大泷六线鱼微卫星引物或其组合在大泷六线鱼群体遗传学分析，遗传多样性检测，数量性状遗传图谱，遗传连锁作图，家系和个体鉴定，分子辅助育种。
8.一种用于大泷六线鱼遗传多样性检测的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有：选自权利要求5或6中任一所示的引物。
9.一种大泷六线鱼遗传多样性检测方法，包括以下步骤：
1)基因组DNA的提取；
2)微卫星PCR扩增：采用权利要求5或6所述微卫星引物扩增大泷六线鱼基因组DNA，获得其扩增产物；
3)扩增产物电泳：在毛细管电泳基因分析仪上电泳，对毛细管电泳数据初步处理；
4)遗传多样性分析：根据每个个体微卫星扩增产物的分子量的大小取定基因型，计算遗传多样性参数。
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