CN107794257B - 一种dna大片段文库的构建方法及其应用 - Google Patents

一种dna大片段文库的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种DNA大片段文库的构建方法及其应用。本发明提供的DNA大片段文库的构建方法用于DNA大片段文库的构建，通过采用FLP/FRT特异性重组系统优化建库流程，提高了大片段文库测序结果的有效数据率。

Description

一种DNA大片段文库的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种DNA大片段文库的构建方法，由该方法构建的DNA大片段文库以及该DNA大片段文库在测序中的应用。
背景技术
对基因组序列未知或没有近源物种基因组信息的某个物种，对其不同长度基因组DNA片段及其文库进行序列测定，然后用生物信息学方法进行拼接、组装和注释，从而获得该物种完整的基因组序列图谱，称为基因组从头测序，也叫de novo测序。在基因组学飞速发展的今天，de novo测序与比较基因组方法联合可以用来探索该物种的起源和进化，研究其生长发育、形状生产以及环境适应的分子机制，是快速了解一个物种的途径之一。一个物种基因组序列图谱的完成，也将带动这个物种下游一系列研究的开展，可以构建该物种的基因组数据库，为该物种的后基因组学研究搭建一个高效的平台；为后续的基因挖掘、功能验证提供DNA序列信息。
高通量测序也叫二代测序，它可以对上千万条DNA片段同时进行测序，通量、时效和单碱基成本上较Sanger测序有着突破性的提高，这些优点使得目前de novo测序主要由二代测序来完成。二代测序的缺点是读长短，二代测序仪里读长最长的罗氏454也仅能进行最长400bp的DNA测序，这使得二代测序在进行de novo项目时要先构建小片段文库，根据不同小片段上的重合序列将其测序结构拼接成大小不一的contig(片段重叠群)。这些contig进一步拼接成基因组，则需要一种称为大片段文库的DNA文库，来确定不能重叠的contig在基因组中的位置和距离。
大片段文库是一种从一定片段大小的随机打断基因组DNA构建过来的文库，这些片段大小通常从2k到200k不等。由于这些片段大小已经远超二代测序读长的极限，因此在测序时不能采用全部测通的方法，而是采用双端配对测序，仅对这些片段的两端进行成对测序，以此判断测出的成对序列在基因组上的距离。为达到这个目的，构建大片段文库时，通常采用的方法是：(1)回收固定大小的DNA大片段；(2)对固定大小的DNA大片段进行末端修复和添加生物素标记，或者将固定大小的DNA大片段末端加上带有生物素标记的接头；(3)将带有生物素标记的DNA大片段或者带有生物素标记接头的DNA大片段进行环化；(4)将未环化的DNA大片段进行消化；(5)将环化的DNA大片段进行随机打断，使用链霉亲和素磁珠钓取带有生物素标记的打断片段(即末端配对片段)；(6)将调取出的打断片段进行扩增，建成测序用DNA大片段文库。但是现有方法得到的大片段文库经测序后得到的有效数据率偏低。
非专利文献
1.Illumina.(2009)Mate Pair Library v2Sample Preparation Guide For 2-5kb Libraries.
2.Filip Van Nieuwerburgh,Ryan C.Thompson,Jessica Ledesma,etal.Illumina mate-paired DNA sequencing-library preparation using Cre-Loxrecombination.Nucleic Acids Research.2012,40(3):e24.
发明内容
本发明的发明人为解决上述技术问题进行了深入研究，结果发现：通过采用Flp/FRT特异性重组系统优化建库流程，可以提高大片段文库的有效数据率，从而完成了本发明。
即，基于上述认识的本发明包括：
1.一种DNA大片段文库的构建方法，包括：
步骤B：将DNA大片段的两端加接头，得到加接头DNA大片段；
步骤C：将加接头DNA大片段进行环化，得到环化DNA大片段与未环化DNA大片段的混合物；
步骤D：将混合物进行线性消化，得到环化DNA大片段；
步骤E：将环化DNA大片段进行打断，得到测序用DNA片段；
步骤F：将测序用DNA片段进行片段捕获，采用链霉亲和素化固相载体钓取带有生物素标记的测序用DNA片段；
步骤G：将带有生物素标记的测序用DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物，从而构建DNA大片段文库。
其中，
所述接头为包含FLP重组酶靶位点的接头，所述环化采用FLP重组酶。
2.根据项1所述的DNA大片段文库的构建方法，
所述步骤G为步骤H-步骤J，
步骤H：将带有生物素标记的测序用DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段；
步骤I：将步骤G中得到的平末端DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；和
步骤J：将加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物，从而构建DNA大片段文库。
3.根据项1或2所述的DNA大片段文库的构建方法，还包括
在所述步骤B之前进行的步骤A-1：将希望进行测序的DNA片段进行打断，得到打断的DNA大片段，将打断的DNA大片段进行末端修复，得到DNA大片段；或者，
在所述步骤B之前进行的步骤A-1：将希望进行测序的DNA片段进行打断，得到打断的DNA大片段，将打断的DNA大片段进行末端修复和加A碱基，得到DNA大片段。
4.根据项1-3任一项所述的DNA大片段文库的构建方法，所述DNA大片段的片段大小为1k～200kbp，优选1.5k～30kbp，更优选2k～20kbp，更优选2k～10kbp。
5.根据项1-4任一项所述的DNA大片段文库的构建方法，所述测序用DNA片段的片段大小为400～600bp。
6.根据项1-5任一项所述的DNA大片段文库的构建方法，步骤C中环化的反应温度为30±2℃。
7.根据项1-6所述的DNA大片段文库的构建方法，所述固体载体为磁珠。
8.一种DNA大片段文库，其是通过项1-7中任一项所述的DNA大片段文库的构建方法构建得到的。
9.一种DNA大片段文库的测序方法，其以项8所述的DNA大片段文库作为对象进行测序。
10.根据项9所述的测序方法，其中，所述测序为双端测序。
11.根据项9所述的测序方法，其中，所述测序利用Illumina平台进行。
12.一种用于构建DNA大片段文库的试剂盒，包括接头试剂和环化试剂，所述接头试剂为包含FLP重组酶靶位点的接头，所述环化试剂为FLP重组酶。
13.根据项12所述的试剂盒，还包括选自下组试剂中的至少一种或两种以上：用于末端修复的试剂，用于加接头的试剂，用于DNA片段环化的试剂，用于线性消化的试剂，用于生物素钓取的试剂和用于DNA片段扩增的试剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：解决了现有大片段建库方案中测序结果有效数据率偏低的问题，提高了DNA大片段文库的有效数据率。
附图说明
图1是实施例1得到的文库的插入片段大小分布图。
具体实施方式
本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。
首先，在一个方面，本发明提供一种DNA大片段文库的构建方法(本发明的文库构建方法)，包括：
步骤B：将DNA大片段的两端加接头，得到加接头DNA大片段；
步骤C：将加接头DNA大片段进行环化，得到环化DNA大片段与未环化DNA大片段的混合物；
步骤D：将混合物进行线性消化，得到环化DNA大片段；
步骤E：将环化DNA大片段进行打断，得到测序用DNA片段；
步骤F：将测序用DNA片段进行片段捕获，采用链霉亲和素化固相载体钓取带有生物素标记的测序用DNA片段；
步骤G：将带有生物素标记的测序用DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物，从而构建DNA大片段文库。
其中，
所述接头为包含FLP重组酶靶位点的接头，所述环化采用FLP重组酶。
在所述步骤B中，加接头可以通过任何本领域技术人员已知的方法来实现，例如，可以通过例如使用具有平末端连接功能的DNA连接酶(例如T4DNA连接酶、T3DNA连接酶)来进行。需要说明的是，在本说明书中对于步骤B中的“DNA大片段”的大小没有特殊限制，从构建De Novo测序文库的需求或者其他任何需要进行大片段文库的要求来看，可以是1k～100kbp左右的片段，优选是1.5k～30kbp左右的片段，更优选是2k～20kbp左右的片段，更优选是2k～10kbp左右的片段。
在所述步骤C中，加接头DNA大片段的环化采用具有特异性重组功能的FLP重组酶进行。FLP重组酶是酵母细胞内的一个由423个氨基酸组成的单体蛋白，在适当的条件下可以使两端有FLP重组酶靶位点(Flp Recognition Target，FRT)的DNA片段自身环化。对于包含FRT的接头，本领域技术人员可以采用已知的方法制备，也可以通过本领域技术人员已知的方法从商业途径可获得的产品制备，还可以原样使用商业途径可获得的产品。
在所述步骤D中，环化DNA大片段的线性消化可以通过任何本领域技术人员已知的线性消化方法来实现。例如，plasmid safe ATP-Dependent DNase线性DNA消化体系。
在所述步骤E中，DNA片段的打断方式是本领域技术人员已知的，如可以采用超声打断法、液压剪切法，将所述环化DNA大片段进行打断，得到测序用DNA片段。需要说明的是，在本发明中对于“测序用DNA片段”没有特殊限制，从测序仪可接受的角度来看，优选是10～1000bp左右，更优选是20～800bp左右，更优选是30～750bp左右，更优选是40～700bp左右，更优选是50～650bp左右，更优选是100～600bp左右，更优选是150～550bp左右，更优选是300～400bp左右的DNA片段。
在所述步骤F中，对测序用DNA片段进行片段捕获是将带有生物素标记的测序用DNA片段钓取出来，通常采用链霉亲和素化固相载体来完成。所述链霉亲和素化固相载体可以是，例如链霉亲和素化的磁珠。以所述步骤F中得到的带有生物素标记的测序用DNA片段，构建测序用DNA文库，可以采用例如标准Illumina DNA小片段建库方法、PCR free方法、一步法等DNA小片段建库方法来构建所述测序用DNA文库。各种构建测序用DNA文库的方法是本领域技术人员已知的，可以由本领域技术人员按照常规操作来进行。例如，标准IlluminaDNA小片段建库方法通常包括末端修复、末端加A、Adapter连接、扩增、扩增产物纯化等步骤，可以按照Illumina公司推荐的方法来进行。
在所述步骤G中，PCR(聚合酶链反应)扩增是本领域技术人员熟知的，其一般通过一定的PCR反应程序(温度循环)来实现。所述PCR反应程序一般包括变性、退火、延伸等步骤。对于扩增方法没有特殊限制，只要能够获得对构建测序用DNA文库而言为充足量(例如0.001～1000ng)的扩增产物即可。扩增方法的具体条件可由本领域技术人员视需要适宜选择。
优选地，步骤C中环化的反应温度为30±2℃。
优选地，所述步骤G为步骤H-步骤J，
步骤H：将带有生物素标记的测序用DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段；
步骤I：将步骤G中得到的平末端DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；和
步骤J：将加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物，从而构建DNA大片段文库。
上述步骤H、I和J均可采用本技术领域的常规方法来进行。
此外，进一步提供了本发明的文库构建方法的优选技术方案。本发明的文库构建方法，还包括在所述步骤B之前进行的步骤A-1：将希望进行测序的DNA片段进行打断，得到打断的DNA大片段，将打断的DNA大片段进行末端修复，得到DNA大片段；或者，在所述步骤B之前进行的步骤A-2：将希望进行测序的DNA片段进行打断，得到打断的DNA大片段，将打断的DNA大片段进行末端修复和加A碱基，得到DNA大片段。
在所述步骤A-1和步骤A-2中，希望进行测序的DNA片段的打断方法是本领域技术人员已知的，如可以采用超声打断法、液压剪切法，将希望进行测序的DNA片段进行打断，得到打断的DNA大片段。需要说明的是，对于“打断的DNA大片段”的大小没有特殊限制，从构建De Novo测序文库的需求或者其他任何需要进行大片段文库的要求来看，可以是1k～100kbp左右的片段，优选是1.5k～30kbp左右的片段，更优选是2k～20kbp左右的片段，更优选是2k～10kbp左右的片段。
在所述步骤A-1和步骤A-2中，打断的DNA大片段的末端修复可以通过任何本领域技术人员已知的方法来实现，例如，可以通过使用具有上述功能的DNA聚合酶(例如T4DNA聚合酶)来进行。
在所述步骤A-2中，加A碱基可以通过任何本领域技术人员已知的方法来实现，例如，可以通过使用具有加A碱基功能的DNA聚合酶(例如缺失3'端到5'端外切酶活性的Klenow片段)来进行。
优选地，在本发明的文库构建方法的各个步骤之间例如步骤A-1与步骤B之间、步骤A-2与步骤B之间、步骤B与步骤C之间、步骤C与步骤D之间、步骤D与步骤E之间、步骤E与步骤F之间、步骤F与步骤G之间、步骤F与步骤H之间、步骤H与步骤I之间、步骤I与步骤J之间，和/或在步骤J之后可以加入对DNA片段进行纯化的步骤。该纯化步骤可以采用本技术领域的常规方法来进行，例如可以通过使用纯化磁珠来进行。
在一个方面，本发明提供一种DNA大片段文库(本发明的文库)，其可以采用例如本发明的文库构建方法来构建。
此外，在一个方面中，本发明提供一种DNA大片段文库的测序方法(本发明的测序方法)，其中，以本发明的DNA大片段文库作为对象进行测序。本发明的测序方法可以采用本技术领域的常规方法来进行。优选地，本发明的测序方法可以采用双端测序，例如利用Illumina平台(例如HiSeq2500或NextSeq500)进行的双端测序。但在一次测序可以将待测序DNA片段测通的情况下，也可以是单端测序。
本发明的建库方法可以例如使用试剂盒来实施，因此，在另一个方面中，本发明提供一种用于构建DNA大片段文库的试剂盒(本发明的建库试剂盒)，其可用于实施本发明的文库构建方法，其包括包括接头试剂和环化试剂，所述接头试剂为包含FLP重组酶靶位点的接头，所述环化试剂为FLP重组酶。
优选地，本发明的建库试剂盒还包括选自下组试剂中的至少一种或两种以上：用于末端修复的试剂，用于加接头的试剂，用于DNA片段环化的试剂，用于线性消化的试剂，用于生物素钓取的试剂和用于DNA片段扩增的试剂。上述试剂可以采用任何本领域技术人员已知的试剂，例如，T4DNA聚合酶、Klenow片段、Klenow缓冲液、DNA连接酶缓冲液、DNA连接酶、Taq酶、dNTP、T4多聚核苷酸激酶、以及T4多聚核苷酸激酶缓冲液。
在本发明的建库试剂盒中，各试剂或装置优选单独包装，但在不影响本发明的实施的前提下，也可以混合包装。
实施例
以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1DNA大片段文库构建
1.DNA样本的大片段处理
1.1取2mL健康人全血按血液基因组DNA提取系统(0.1-20mL)(天根生化科技<北京>有限公司)操作说明书进行提取，得到DNA样本。取10μgDNA样本，使用HydroShear PlusDNA片段化仪按照说明书进行DNA样本的大片段打断处理，目标大片段长度为10kb。
1.2配制0.8％的琼脂糖凝胶，使用TIANGEN公司1Kb DNA Ladder为分子量标准，100V电泳2小时。电泳结束后取出凝胶，放入含EB染料的TAE中染色20分钟。紫外照射下对9-12kb左右的片段进行切胶。
1.3将切下的胶块放入已称重的干净的2.0mL离心管中，用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行胶纯化回收DNA。
1.4回收得到大片段DNA样本，用于下步反应或置于-80℃储存。
2.末端修复
2.1在1.5mL的离心管中配制末端修复反应体系：
Figure BDA0001159370460000081
dNTP Mix(dNTP混合物)(10mM each)是含有dATP，dCTP，dGTP和dTTP的钠盐的预混溶液，各自的浓度分别为10mM，总浓度为40mM(pH7.5)。
2.2在Thermomixer C恒温混匀仪(EPPENDORF公司，以下简称恒温仪)中20℃温浴30分钟。
2.3用AgencourtAMPure XP beads(BECKMAN COULTER公司，以下简称纯化磁珠)100μL纯化回收DNA，用35μL的EB缓冲液洗脱得到末端修复DNA样品。
3.接头连接
本步采用包含FRT的接头，接头序列如下所示：
Figure BDA0001159370460000091
FRT adapters 1是核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的FRT adapters 1-top和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的FRT adapters 1-bot的退火产物。
FRT adapters 2是核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的FRT adapters 2-top和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的FRT adapters 2-bot的退火产物。
3.1在1.5ml的离心管中配制加接头反应体系：
Figure BDA0001159370460000092
3.2在恒温仪中25℃温浴15分钟。
3.3用1.0×纯化磁珠回收纯化反加接头应体系中的DNA，用40μL的EB缓冲液洗脱得到加接头DNA样品
4.缺刻平移反应(Fill-In Reaction)
4.1在1.5ml的离心管中配制缺刻平移体系：
Figure BDA0001159370460000101
4.2在恒温仪中50℃温浴15分钟。
4.3采用
Figure BDA0001159370460000102
2.0Flurometer(Life Technologies,CA,USA，以下简称Qubit2.0)检测步骤4.2的结果产物浓度，对浓度进行质量检测，确定回收DNA量大于400ng后进行下步反应。
5.DNA环化
5.1在1.5mL的离心管中配制环化反应体系：
Figure BDA0001159370460000103
5.2在恒温仪中30℃温浴50分钟，然后70℃温育10分钟。
6.线性DNA的消化
6.1在反应完的步骤5.1的反应体系中依次加入以下试剂：
Figure BDA0001159370460000104
6.2在恒温仪中37℃温浴30分钟消化线性DNA。
6.3在恒温仪中75℃温浴10分钟酶失活后置冰上。
6.4加入2μL EDTA(0.5M)到上述反应液中，充分终止消化作用，得到环化DNA。
7.环化DNA片段化
7.1使用Bioruptor DNA打断仪按下表打断程序打断环化DNA，得到打断DNA。
打断参数：
目标片段大小 ON/OFF时间(秒) 循环数
300-400bp 15/30 10
具体操作方法见《Bioruptor标准操作流程》
7.2用1×纯化磁珠回收纯化步骤7.1中的打断DNA，溶于约50μL的EB缓冲液中用于下步反应或置于-80℃储存。
8.纯化生物素标记的DNA
8.1振荡重悬
Figure BDA0001159370460000112
M-280Streptavidin magnetic beads(链霉亲和素磁珠)。
8.2吸取20μL重悬的磁珠置于1.5mL离心管，将离心管放置在磁分离架上等待1分钟，小心吸取弃上清。
8.3用50μLBead Binding Buffer(磁珠结合缓冲液)洗涤磁珠。小心的重悬沉淀，将离心管放置在磁分离架上，等待1分钟，弃上清。重复此步骤一次。
8.4用50μL磁珠结合缓冲液重悬磁珠。
8.5加入来自步骤7.2的结果产物50μL，在恒温仪中20℃温浴15分钟(每2分钟震荡15秒，600rpm)。
8.6将离心管放置在磁分离架上，等待1分钟，舍弃上清，用200μL的Bead WashBufferⅠ(磁珠洗涤缓冲液)洗涤磁珠三次。
8.7将离心管放置在磁分离架上，等待1分钟，舍弃上清，用200μL的EB缓冲液洗涤磁珠两次。
8.8移去最后一次洗涤的EB缓冲液，使用75μL的EB缓冲液重悬磁珠。
9.末端修复
9.1按照下表配制末端修复反应体系:
Figure BDA0001159370460000111
Figure BDA0001159370460000121
9.2在恒温仪中20℃温浴30分钟(每2分钟震荡15秒，600rpm)。
9.3将离心管放置在磁分离架上，等待1分钟，舍弃上清，用200μL的磁珠洗涤缓冲液洗涤磁珠三次。
9.4将离心管放置在磁分离架上，等待1分钟，舍弃上清，用200μL的EB缓冲液洗涤磁珠两次。
9.5移去最后一次洗涤的EB缓冲液，使用32μL的EB缓冲液重悬磁珠。
10.末端加“A”
10.1按照下表配制加“A”反应体系:
Figure BDA0001159370460000122
10.2置于恒温仪中37℃温浴30分钟(每2分钟震荡15秒，600rpm)。
10.3将离心管放置在磁分离架上，等待1分钟，舍弃上清，用200μL的磁珠洗涤缓冲液洗涤磁珠三次。
10.4将离心管放置在磁分离架上，等待1分钟，舍弃上清，用200μL的EB缓冲液洗涤磁珠两次。
10.5移去最后一次洗涤的EB缓冲液，使用18μL的EB缓冲液重悬磁珠。
11.Illumina测序接头连接：
11.1按照下表配制接头连接反应体系:
Figure BDA0001159370460000123
PE Adapters的碱基序列如下所示：
Figure BDA0001159370460000131
11.2置于恒温仪中20℃温浴15分钟(每2分钟震荡15秒，600rpm)。
11.3将离心管放置在磁分离架上，等待1分钟，舍弃上清，用200μL的磁珠洗涤缓冲液洗涤磁珠三次。
11.4将离心管放置在磁分离架上，等待1分钟，舍弃上清，用200μL的EB缓冲液洗涤磁珠两次。
11.5移去最后一次洗涤的EB缓冲液，使用21μL的EB缓冲液重悬磁珠。
12.文库扩增
12.1按照下表配制文库扩增反应体系:
Figure BDA0001159370460000132
引物1及引物2的碱基序列如下所示：
Figure BDA0001159370460000133
12.2PCR反应的程序设定如下：
Figure BDA0001159370460000134
Figure BDA0001159370460000141
12.3扩增产物使用琼脂糖电泳切胶回收400bp-600bp范围内的片段，获得大片段测序文库。
12.4文库质量检测
将步骤12.3得到的大片段测序文库，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/μL，随后使用Agilent 2100生物分析仪对文库的片段大小进行检测，与切胶回收一致后，使用Bio-RAD CFX 96荧光定量PCR仪，Bio-RAD KIT iQ SYBR GRN进行Q-PCR，对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度＞10nM)。本步检测结果符合上机测序要求。
13上机测序及测序结果分析
13.1将检测合格的步骤12.3得到的大片段测序文库，在HiSeq 2500测序平台上运行双端测序程序(PE150)，得到下机数据如表1所示。
表1
Figure BDA0001159370460000142
通过表1可知：Clean reads占Original reads比例较高，Q30较高，整体测序结果较好。
13.2截取100bp(PE100)的序列reads进行分析，通过去loxp接头的软件DeLoxer(非专利文献2)去掉本实施例的接头，将Clean reads数据进行分类，分类结果如表2所示。
表2：
Figure BDA0001159370460000143
Figure BDA0001159370460000151
Mate-paired数据为通过DeLoxer软件处理后得到的大片段文库中真实的末端配对片段的数值和比率，其是在没有参考基因组情况下可以用于构建基因组骨架的有效数据。本实施例中，有效数据率为可比对数据(Mate-paired pair number)占原始数据(Cleanreads number的一半)的百分比。如表2所示的步骤12.3所得文库的有效数据率为36.4％，而这个比率在参考文献2中仅有28.62％。
13.3将步骤13.2所得Mate-paired数据比对到人类参考基因组HG19，每对Mate-paired数据之间的距离对应一个大片段文库中原始大片段的大小(即插入片段大小，Insert size)，Insert size出现的频次强度如图1所示。
由图1可知，本实施例构建的文库的插入片段主峰为9227bp，在期望建库大小10kb±10％以内，与目标大片段长度10kb基本一致。插入片段主峰±20％的范围内插入片段比例为87.6％，即所得文库的插入片段大小主要分布在目标大片段长度10kb附近。
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 安诺优达基因科技（北京）有限公司
<120> 一种DNA大片段文库的构建方法及其应用
<130> 1608SDCN
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> FRT adapters 1-top
GAAGTTCCTATACATGTATGCGAATAGGAACTTC 34
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> FRT adapters 1-bot
GAAGTTCCTATTCGCATACATGTATAGGAACTTCACC 37
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> FRT adapters 2-top
TGAAGTTCCTATACATGTATGCGAATAGGAACTTCACC 38
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> FRT adapters 2-bot
GAAGTTCCTATTCGCATACATGTATAGGAACTTCA 35
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>
GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG 32
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC 32
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 引物1
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCT 38
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 引物2
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTC 38

Claims (7)

1.一种DNA大片段文库的构建方法，包括：
步骤B：将DNA大片段的两端加接头，得到加接头DNA大片段；
步骤C：将加接头DNA大片段进行环化，得到环化DNA大片段与未环化DNA大片段的混合物；
步骤D：将混合物进行线性消化，得到环化DNA大片段；
步骤E：将环化DNA大片段进行打断，得到测序用DNA片段；
步骤F：将测序用DNA片段进行片段捕获，采用链霉亲和素化固相载体钓取带有生物素标记的测序用DNA片段；
步骤G：将带有生物素标记的测序用DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物，从而构建DNA大片段文库，
其中，
所述接头为包含FRT的接头，所述环化采用FLP重组酶。
2.根据权利要求1所述的DNA大片段文库的构建方法，其特征在于，所述步骤G为步骤H-步骤J，
步骤H：将带有生物素标记的测序用DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA片段；
步骤I：将步骤G中得到的平末端DNA片段进行加接头，得到加接头DNA片段；和
步骤J：将加接头DNA片段进行PCR扩增，得到扩增产物，从而构建DNA大片段文库。
3.根据权利要求1所述的DNA大片段文库的构建方法，还包括
在所述步骤B之前进行的步骤A-1：将希望进行测序的DNA片段进行打断，得到打断的DNA大片段，将打断的DNA大片段进行末端修复，得到DNA大片段；或者，
在所述步骤B之前进行的步骤A-2：将希望进行测序的DNA片段进行打断，得到打断的DNA大片段，将打断的DNA大片段进行末端修复和加A碱基，得到DNA大片段。
4.根据权利要求1所述的DNA大片段文库的构建方法，其特征在于，所述DNA大片段的片段大小为1.5k~30kbp。
5.根据权利要求4所述的DNA大片段文库的构建方法，其特征在于，所述DNA大片段的片段大小为2k~20kbp。
6.根据权利要求4所述的DNA大片段文库的构建方法，其特征在于，所述DNA大片段的片段大小为2k~10kbp。
7.根据权利要求1所述的DNA大片段文库的构建方法，其特征在于，步骤C中环化的反应温度为30±2℃。
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