CN107937561A - 一种用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的引物及设计和扩增方法 - Google Patents

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龚理
杜珣
吕振明
刘立芹
陈永久
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Abstract

本发明涉及一种可用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸、成本低、省时省力准确度高的用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的引物及设计和扩增方法，所提供的用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的引物可以高效和特异地扩增弯斑蛸和卵蛸的ITS1，并能够一次性对两种物种同时进行扩增，具有高效快速和便捷的优点，并且在ITS1扩增后，可直接通过凝胶电泳肉眼观察ITS1的长度异质性对其进行物种鉴别，无需测序，十分高效并且准确度高。

Description

一种用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的引物及设计和扩增方法
技术领域
本发明涉及一种弯斑蛸和卵蛸的核糖体内转录间隔区1（ITS1）研究领域，尤其涉及一种可用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸、成本低、省时省力准确度高的用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的引物及设计和扩增方法。
背景技术
弯斑蛸（Octopus dollfusi）和卵蛸（O. ovulum）都是重要的经济种类，其分类主要依据传统的形态学方法，根据眼间是否具有斑块或银圈进行辨认。眼间具有斑块的为弯斑蛸，眼间具有银圈的为卵蛸。但是由于两者形态上非常相似，且离水后斑点或银圈会逐渐褪色或消失，导致两者很难通过形态特征进行鉴定，因而导致种类鉴定及系统进化上的混乱。因此，很有必要开发新的标记鉴别这两种蛸。随分子生物学的不断发展，分子标记越来越受到广泛的关注。核糖体内转录间隔区1（internal transcribed spacer1，简称ITS1）是一段位于核糖体RNA编码基因18S rDNA和5.8S rDNA中间的一段非编码区。18S rDNA和5.8SrDNA进化速率较慢，序列非常保守，而ITS1进化速率相对较快，在种内基本趋于相似，而在种间则表现出显著的差异，且不同种类的ITS1长度差异非常明显，因此可以在两端保守的18S和5.8S rDNA上设计扩增ITS1的引物，直接通过凝胶电泳肉眼观察ITS1的长度异质性进行种类鉴别，从而免去了测序过程，既节约了成本，更重要的是大大提高了工作效率。
中国专利局于2017年9月29日公开了一种蜘蛛线粒体基因组全序列扩增引物及扩增方法的发明授权，授权公开号：CN104531688B，该发明采用提取蜘蛛基因组的总DNA，通过线粒体基因组DNA的长PCR(L-PCR)扩增和测序对蜘蛛进行鉴定，同样是采用DNA技术对生物进行鉴定，但是其不能对明确的生物物种进行鉴定，且必须通过测序才能准确判定，并需要设计多对引物对基因组全序列进行扩增，耗时较长，过程繁琐。
发明内容
为解决上述传统形态学方法对弯斑蛸和卵蛸受条件影响，在离水后眼间斑块或银圈逐渐褪色或消失，导致难以通过形态特征进行鉴定，造成物种鉴定及系统进化上混乱的问题，本发明提供了一种可用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸、成本低、省时省力准确度高的一种用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的引物，并提供其设计和扩增方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的引物，所述用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的引物的上游引物为SEQ ID NO.1 : 5’-TCGCTACTACCGATCGAACGGT-3’，下游引物为SEQ ID NO.2：5’-GACGGCATTGCAATGTCG-3’。
作为优选，从Genbank数据库中下载弯斑蛸和卵蛸的rDNA序列，对这些序列进行多重比对，分别在3’端和5’端找出比较保守的序列以及变异较大的区域，并在两端保守的18S和5.8S rDNA上设计扩增核糖体ITS1基因的引物。
作为优选，所述用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的引物的扩增方法包括以下步骤：
（1）DNA抽提试剂盒法提取待测弯斑蛸和卵蛸的DNA；
（2）采用权利要求1中所述的用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的ITS1引物；
（3）以待测弯斑蛸和卵蛸的弯斑蛸和卵蛸的DNA作为模版，进行PCR扩增；
（4）扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，试剂盒法割胶回收扩增片段，直接肉眼观察。
作为优选，所述步骤（1）中为避免弯斑蛸和卵蛸肠道内容物污染，舍去其头颈部，只从其触手部提取DNA。
作为优选，步骤（3）所述PCR扩增的反应体系组成为：2.5mM的dNTP2μL、10×TaqDNA聚合酶Buffer2.5μL、10μM的上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2各1μL、5U/μL的TaqDNA聚合酶0.2μL、100g/μL的DNA模版溶液1μL及灭菌双蒸水17.3μL；
所述PCR扩增条件为：95℃预变性5min，随后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸55s，共进行35个循环，最后进行72℃延伸5min，4℃条件下保存。
传统的形态学判别方法在使用过程中，由于弯斑蛸和卵蛸在离水后其眼间的斑块或银圈等形态特征会逐渐褪色变淡甚至消失，导致造成判别上产生一定的难度，具有较大的局限性，因而在一些情况下会导致判别错误。本发明所提供的用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的引物，可在是在分子层面以一种鉴定分子标记的方式，从其rDNA角度对其进行鉴定，其主要是针对一段位于核糖体RNA编码基因18S rDNA和5.8S rDNA中间的一段非编码区的核糖体内转录间隔区1（internal transcribed spacer1，简称ITS1）进行扩增，由于18S rDNA和5.8S rDNA进化速率较慢，序列非常保守，而ITS1进化速率相对较快，在种内基本趋于相似，而在种间则表现出显著的差异，且不同种类的ITS1长度差异非常明显，因此可以直接通过凝胶电泳肉眼观察ITS1的长度异质性对形态相似的物种进行鉴别。
本发明的有益效果是：
1）本发明所提供的用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的引物可以高效和特异地扩增弯斑蛸和卵蛸的ITS1，并能够一次性对两种物种同时进行扩增，具有高效快速和便捷的优点；
2）本发明所提供的用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的引物在ITS1扩增后，可直接通过凝胶电泳肉眼观察ITS1的长度异质性对其进行物种鉴别，无需测序，十分高效并且准确度高。
附图说明
图1为本发明所提供的用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的引物扩增弯斑蛸和卵蛸的ITS1后的琼脂糖凝胶电泳图谱；
其中泳道M为DL2000，泳道1为弯斑蛸，泳道2为卵蛸。
具体实施方式
（1）弯斑蛸和卵蛸样品的采集、鉴定和保存
实施例中所用的弯斑蛸和卵蛸样品均采自野外自然环境中，并在其形态学特征消失前对其进行种类确定，所采样品均带回实验室制成标本并进行信息登记。种类鉴定完成的弯斑蛸和卵蛸样品用100%的纯酒精浸泡并保存于4℃的冰箱中备用。
（2）弯斑蛸和卵蛸的DNA提取
采用DNA抽提试剂盒法提取待测弯斑蛸和卵蛸样品的DNA，为避免弯斑蛸和卵蛸的肠道内容物污染，舍去其头颈部，只从其触手部提取DNA，DNA提取直接采用DNA提取试剂盒进行提取，提取的弯斑蛸和卵蛸DNA保存于-20℃条件下备用。
（3）用于快速鉴定弯斑蛸和卵蛸的引物的设计和合成
从Genbank数据库中下载弯斑蛸和卵蛸的rDNA序列，对这些序列进行多重比对，分别在3’端和5’端找出比较保守的序列以及变异较大的区域，并在两端保守的18S和5.8S rDNA上设计扩增核糖体RNA编码基因的引物。所合成的引物为
上游引物SEQ ID NO.1 : 5’-TCGCTACTACCGATCGAACGGT-3’；
下游引物SEQ ID NO.2 : 5’-GACGGCATTGCAATGTCG-3’。
（4）PCR扩增
PCR扩增的反应体系组成为：2.5mM的dNTP2μL、10×TaqDNA聚合酶Buffer2.5μL、10μM的上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2各1μL、5U/μL的TaqDNA聚合酶0.2μL、100g/μL的DNA模版溶液1μL及灭菌双蒸水17.3μL；
所述PCR扩增条件为：95℃预变性5min，随后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸55s，共进行35个循环，最后进行72℃延伸5min，4℃条件下保存。
（5）PCR产物的鉴定
PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，所扩增的片段均采用试剂盒法割胶回收，对回收所得的扩增产物进行肉眼观察，可通过其扩增产物的形态来进行准确快捷的判定，如图1中弯斑蛸的扩增产物1较长，卵蛸的扩增产物2较短。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的引物及设计和扩增方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 通用引物(consensus primer)
<400> 1
tcgctactac cgatcgaacg gt 22
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 通用引物(consensus primer)
<400> 2
gacggcattg caatgtcg 18

Claims (5)

1.一种用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的引物，其特征在于，所述用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的引物的上游引物为SEQ ID NO.1 : 5’- TCGCTACTACCGATCGAACGGT-3’，下游引物为SEQ ID NO.2：5’- GACGGCATTGCAATGTCG-3’。
2.一种如权利要求1所述的用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的引物的设计，其特征在于，从Genbank数据库中下载弯斑蛸和卵蛸的rDNA序列，对这些序列进行多重比对，分别在3’端和5’端找出比较保守的序列以及变异较大的区域，并在两端保守的18S和5.8S rDNA上设计扩增核糖体ITS1基因的引物。
3.一种如权利要求1所述用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的引物的扩增方法，其特征在于，所述用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的引物的扩增方法包括以下步骤：
（1）DNA抽提试剂盒法提取待测弯斑蛸和卵蛸的DNA；
（2）采用权利要求1中所述的用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的ITS1引物；
（3）以待测弯斑蛸和卵蛸的DNA作为模版，进行PCR扩增；
（4）扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，试剂盒法割胶回收扩增片段，直接肉眼观察。
4.根据权利要求3所述的一种用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的引物的扩增方法，其特征在于，所述步骤（1）中为避免弯斑蛸和卵蛸肠道内容物污染，舍去其头颈部，只从其触手部提取DNA。
5.根据权利要求3所述的一种用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的引物的扩增方法，其特征在于，步骤（3）所述PCR扩增的反应体系组成为：2.5mM的dNTP2μL、10×TaqDNA聚合酶Buffer2.5μL、10μM的上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2各1μL、5U/μL的TaqDNA聚合酶0.2μL、100g/μL的DNA模版溶液1μL及灭菌双蒸水17.3μL；
所述PCR扩增条件为：95℃预变性5min，随后95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸55s，共进行35个循环，最后进行72℃延伸5min，4℃条件下保存。
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US20040235021A1 (en) * 2003-03-10 2004-11-25 Kwan Hoi Shan Authentication of biologic materials using DNA-DNA hybridization on a solid support
CN104498598A (zh) * 2014-12-11 2015-04-08 中国计量学院 农田蜘蛛华丽肖蛸和锥腹肖蛸特异性鉴定引物及鉴定方法
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