CN104498598A - 农田蜘蛛华丽肖蛸和锥腹肖蛸特异性鉴定引物及鉴定方法 - Google Patents
农田蜘蛛华丽肖蛸和锥腹肖蛸特异性鉴定引物及鉴定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种农田蜘蛛华丽肖蛸（ Tetragnatha nitens Audouin）和锥腹肖蛸（ T.maxillosa Thoren）的特异性鉴定引物，并利用该对引物的扩增产物快速鉴定这两种农田肖蛸属蜘蛛的方法。首先，提取蜘蛛基因组总DNA，以此为PCR模板，通过线粒体 COI 基因的通用引物对肖蛸属两种蜘蛛进行扩增；其次，依据序列差异各设计一条种特异引物，与通用引物的一条引物混合构成混合引物，再以蜘蛛基因组总DNA为模板进行特异性PCR扩增，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，依据片段长度的大小确定蜘蛛的种类。本发明具有快速、高效和便捷的特点，对鉴定人员的专业知识要求不高；且能对残缺个体进行准确鉴定，比传统的依赖形态特征鉴别更准确可靠。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种农田蜘蛛华丽肖蛸和锥腹肖蛸特异性鉴定引物及鉴定方法。
背景技术
农田蜘蛛是重要的害虫捕食性天敌，在农田有害生物综合防治过程中具有重要的作用和地位。保护天敌种库，促进天敌群落重建，能有效的控制诸多农业害虫，诸如飞虱、叶蝉、螟虫、棉蚜等害虫的发生和危害。肖蛸蛛隶属于蜘蛛目，后纺亚目，园蛛总科，是农田蜘蛛中的优势种群。然而，肖蛸属蜘蛛外观形态极其相似(卵期更是难以区分)，加之采用形态特征鉴定需要较高的专业技术和经验，鉴定过程常受主观因素的干扰，不仅耗时耗力，而且极易混淆出错。而快速而准确的物种鉴定是农田蜘蛛保护和利用的研究的必要前提和基础。因此，建立一种经济、高效、准确而快速的该属常见蜘蛛种类的鉴定方法，对于采取有效的保护措施具有重要意义。
随着分子生物学技术的快速发展，利用DNA序列(分子标记)对物种进行分类鉴定已经成为一种简单高效的物种鉴别方法。线粒体细胞色素C氧化酶亚基I (COI)基因和核糖体基因的转录内间隔区2 (ITS2)等基因是目前公认的进行物种鉴定的分子标记。分子标记快速而精确的特点弥补了传统形态鉴定的诸多不足，经过短短十年的发展，该技术已广泛应用于动物，植物和微生物的物种分类鉴定及生物多样性研究领域。但是目前国内外尚无利用分子标记区别鉴定农田蜘蛛的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了一种农田蜘蛛华丽肖蛸和锥腹肖蛸特异性鉴定引物及鉴定方法。
本发明的技术方案如下：
一种农田蜘蛛华丽肖蛸和锥腹肖蛸特异性鉴定方法，步骤为：
(1) 采用DNA抽提试剂盒提取华丽肖蛸蛛和锥腹肖蛸蛛的总基因组DNA。为避免污染，舍去头胸腹部，只从腿部提取DNA。
(2）利用COI的通用引物COI-F (SEQ ID NO:1：5′-ATTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和COI-R (SEQ ID NO:2：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAATCA-3′)，以两种肖蛸蛛基因组DNA为模板，进行 PCR 扩增（结果见图1）。该对引物在华丽肖蛸蛛和锥腹肖蛸中均能扩增出708 bp的产物。PCR 反应体系为 50μ1，其中：2μl模板 DNA (约20ng)，5μl 10×PCR buffer，4μl 2.5mM MgCl2, 1μl 10 mM dNTP，各1μl 10 mM正、反向引物，0.5μl 5U/μl TaqDNA聚合酶，加去离子水调至终体积50μ1；PCR反应条件为：95°C预变性3分钟，94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸50秒；35个循环后，72°C再延伸7分钟。
（3）将上一步得到的COI序列进行测序，根据测序结果搜寻种特异区段，根据特异区段的序列信息分别设计一条特异引物。
锥腹肖蛸：Tm-R SEQ ID NO:3： 5′-ATAAATAGTTCAACCTGCC-3′；
华丽肖蛸：Tn-R SEQ ID NO:4： 5′- GTAAAGACAAAAGAAGC-3′
(4) 将COI的正向引物COI-F与华丽肖蛸蛛和锥腹肖蛸蛛的特异性引物混合，构成混合引物，以华丽肖蛸和锥腹肖蛸基因组DNA作为模板，进行PCR扩增。为检验Tm-R及Tn-R引物的特异性，分别抽取前齿肖蛸，麟纹肖蛸，黑色肖蛸和长螯肖蛸的DNA，用上述混合引物进行PCR扩增。PCR 反应体系为 50μ1，其中：2μl模板 DNA (约20ng)，5μl 10×PCR buffer，4μl 2.5mM MgCl2, 1μl 10 mM dNTP，2μl 10 mM混合引物（COI-F，Tm-R和Tn-R），0.5μl 5U/μl TaqDNA聚合酶，加去离子水调至终体积50μ1；PCR反应条件为：95°C预变性3分钟，94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸50秒；35个循环后，72°C再延伸7分钟。
(5) 将上一步骤所得到的扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，根据DNA扩增产物的电泳条带长度大小，确定蜘蛛的种类。
其中锥腹肖蛸为扩增片段长度为365 bp，序列如SEQ ID NO:5所示：ATTCAACTAATCATAAAGATATTGGGAGTTTATATTTTTTATTTGGAGTTTGATCAGCAATAGTTGGGACAGCAATAAGAGTTTTAATTCGAATTGAGTTAGGCCAAACAGGTAGATTTTTGGGAGATGATCAGTTATATAATGTAATTGTTACTGCTCATGCTTTTGTTATAATTTTTTTTATAGTTATACCAATTTTGATTGGGGGATTCGGAAATTGGTTAGTTCCTTTAATATTAGGGGCACCCGATATAGCTTTCCCTCGAATAAACAATCTTAGATTCTGATTATTACCTCCTTCTTTATTTATGTTATTTATTTCTTCTATAGTTGATGTAGGGGTAGGGGCAGGTTGAACTATTTAT；
华丽肖蛸扩增片段长度为576 bp，序列如SEQ ID NO:6所示：
ATTCTACTAATCATAAGGATATTGGGAGATTATATTTTTTATTTGGAGTCTGATCTGCGATGGTAGGGACAGCAATAAGAGTTTTAATTCGAATTGAATTAGGACAATCAGGGAGATTTTTAGGAGATGATCAATTGTACAACGTAATTGTTACTGCACATGCCTTTGTAATAATTTTTTTTATAGTGATACCGATTTTAATCGGTGGTTTTGGAAATTGGTTAGTGCCTTTAATGTTGGGAGCTCCTGATATAGCATTTCCGCGAATAAATAACTTAAGATTTTGATTGTTGCCCCCTTCTTTATTTATATTATTTATTTCATCTATAGCAGATGTGGGGGCAGGAACTGGATGAACAGTTTACCCCCCGCTGGCTTCTTTAGAAGGTCATTCGGGTAGTTCAGTTGATTTTGCTATTTTTTCTTTACATTTGGCGGGTGCTTCTTCTATTATAGGTGCAATTAATTTTATTTCTACTATTATTAATATGCGAATAAGAGGGGTAAGAATAGAAAAAGTTCCTCTTTTTGTTTGGTCAGTTCTTATTACTGCTGTTTTGCTTCTATTGTCTTTAC。
其他种类肖蛸未见扩增出条带。
本发明的优点是：
1. 筛选出的引物是华丽肖蛸和锥腹肖蛸的特异性引物，只有在相应种才能扩增出相应大小的片段，根据条带的大小来作出鉴定，快速、高效；
2. 该方法可以对华丽肖蛸和锥腹肖蛸的卵及残缺个体进行鉴定，大大克服了形态鉴定的困难，缩短了鉴定的周期；
3.该农田肖蛸属蜘蛛的分子生物学鉴别方法对使用的仪器设备要求较低，且无需复杂的技术步骤和昂贵的试剂，一般的技术人员均可操作，比传统的形态学鉴别更准确可靠。
附图说明
图1为两种农田肖蛸蛛的COI及特异性片段PCR扩增示意图。M: 100 bp DNA Marker; 泳道1: 锥腹肖蛸COI; 泳道2: 华丽肖蛸COI; 泳道3: 锥腹肖蛸特异性片段; 泳道4: 华丽肖蛸特异性片段。
图2为利用特异性引物PCR性检测锥腹肖蛸和华丽肖蛸示意图。M: 100 bp DNA Marker; 泳道1: 锥腹肖蛸COI; 泳道2: 华丽肖蛸COI; 泳道3: 前齿肖蛸; 泳道4: 麟纹肖蛸，泳道5: 黑色肖蛸; 泳道6: 长螯肖蛸; 泳道7: 双蒸水（阴性对照）。
具体实施方式
本发明所涉及的引物序列如下：
SEQ ID NO:1 5′-ATTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′；
SEQ ID NO:2 5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAATCA-3′；
SEQ ID NO:3 5′-ATAAATAGTTCAACCTGCC-3′；
SEQ ID NO:4 5′- GTAAAGACAAAAGAAGC-3′。
SEQ ID NO:5：
ATTCAACTAATCATAAAGATATTGGGAGTTTATATTTTTTATTTGGAGTTTGATCAGCAATAGTTGGGACAGCAATAAGAGTTTTAATTCGAATTGAGTTAGGCCAAACAGGTAGATTTTTGGGAGATGATCAGTTATATAATGTAATTGTTACTGCTCATGCTTTTGTTATAATTTTTTTTATAGTTATACCAATTTTGATTGGGGGATTCGGAAATTGGTTAGTTCCTTTAATATTAGGGGCACCCGATATAGCTTTCCCTCGAATAAACAATCTTAGATTCTGATTATTACCTCCTTCTTTATTTATGTTATTTATTTCTTCTATAGTTGATGTAGGGGTAGGGGCAGGTTGAACTATTTAT；
SEQ ID NO:6：
ATTCTACTAATCATAAGGATATTGGGAGATTATATTTTTTATTTGGAGTCTGATCTGCGATGGTAGGGACAGCAATAAGAGTTTTAATTCGAATTGAATTAGGACAATCAGGGAGATTTTTAGGAGATGATCAATTGTACAACGTAATTGTTACTGCACATGCCTTTGTAATAATTTTTTTTATAGTGATACCGATTTTAATCGGTGGTTTTGGAAATTGGTTAGTGCCTTTAATGTTGGGAGCTCCTGATATAGCATTTCCGCGAATAAATAACTTAAGATTTTGATTGTTGCCCCCTTCTTTATTTATATTATTTATTTCATCTATAGCAGATGTGGGGGCAGGAACTGGATGAACAGTTTACCCCCCGCTGGCTTCTTTAGAAGGTCATTCGGGTAGTTCAGTTGATTTTGCTATTTTTTCTTTACATTTGGCGGGTGCTTCTTCTATTATAGGTGCAATTAATTTTATTTCTACTATTATTAATATGCGAATAAGAGGGGTAAGAATAGAAAAAGTTCCTCTTTTTGTTTGGTCAGTTCTTATTACTGCTGTTTTGCTTCTATTGTCTTTAC。
实施例1：锥腹肖蛸和华丽肖蛸特异性引物的设计及其快速鉴定方法
（1）标本采集鉴定及基因组总DNA提取
实施例中所用肖蛸种类均用陷阱法采自浙江省余姚市农田。所采标本均用体视显微镜鉴定，以确定种类，用于分子生物学实验的蜘蛛标本用100%的酒精浸泡并保存于4°C冰箱。采用DNA抽提试剂盒提取华丽肖蛸蛛和锥腹肖蛸蛛的总基因组DNA。为避免污染，舍去头胸腹部，只从腿部提取DNA。DNA提取直接利用DNA抽提试剂盒(天根生化科技有限公司）提取。提取的总基因组–20°C保存备用。
（2）利用DNA条形码通用引物PCR扩增线粒体COI基因片段和序列测定
PCR 反应体系为 50μ1，其中：2μl模板 DNA (约20ng)，5μl 10×PCR buffer，4μl 2.5mM MgCl2, 1μl 10 mM dNTP，各1μl 10 mM正、反向引物，0.5μl 5U/μl TaqDNA聚合酶，加去离子水调至终体积50μ1；
PCR反应条件为：95°C预变性3分钟，94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸50秒；35个循环后，72°C再延伸7分钟。
PCR扩增和测序所用引物为：
COI-F (5′-ATTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′) 和
COI-R (5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAATCA-3′)
PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测（结果见图1），扩增片段(708 bp)用凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)割胶回收。回收产物送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
（3）特异性引物设计及片段扩增
根据华丽肖蛸蛛和锥腹肖蛸蛛的COI序列的特异区分别设计一条特异引物(锥腹肖蛸：Tm-R 5′-ATAAATAGTTCAACCTGCC-3′和华丽肖蛸：Tn-R 5′- GTAAAGACAAAAGAAGC-3′)，与上一步中的COI-F（5′-ATTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′）引物混合，构成混合引物，以提取的锥腹肖蛸和华丽肖蛸的基因组作为模板，进行PCR扩增；
PCR 反应体系为 50μ1，其中：2μl模板 DNA (约20ng)，5μl 10×PCR buffer, 4μl 2.5mM MgCl2, 1μl 10 mM dNTP，2μl 10 mM混合引物（COI-F，Tm-R和Tn-R），0.5μl 5U/μl TaqDNA聚合酶，加去离子水调至终体积50μ1；
PCR反应条件为：95°C预变性3分钟，94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸50秒；35个循环后，72°C再延伸7分钟。
（4）：PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测（结果见图1）
将上一步骤所得到的扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，根据DNA扩增产物的电泳条带长度大小，确定蜘蛛的种类。其中锥腹肖蛸为扩增片段长度为365 bp，华丽肖蛸扩增片段长度为576 bp。
实施例2：采用特异性引物快速鉴定锥腹肖蛸和华丽肖蛸
（1）引物特异性检测
为检测常规PCR条件下所设计的引物特异性，实验材料中除待鉴定区分的锥腹肖蛸和华丽肖蛸之外，还将前齿肖蛸，麟纹肖蛸，黑色肖蛸和长螯肖蛸等4中同源性较高的肖蛸蜘蛛一起进行了PCR反应。
PCR 反应体系为 50μ1，其中：2μl模板 DNA (约20ng)，5μl 10×PCR buffer, 4μl 2.5mM MgCl2, 1μl 10 mM dNTP，2μl 10 mM混合引物（COI-F，Tm-R和Tn-R），0.5μl 5U/μl TaqDNA聚合酶，加去离子水调至终体积50μ1；
PCR反应条件为：95°C预变性3分钟，94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸50秒；35个循环后，72°C再延伸7分钟。
上述PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，参加附图2。由附图2可知，除锥腹肖蛸在365 bp，华丽肖蛸在576 bp处出现目标扩增条带外，其他4中肖蛸均无特异性目标条带，从而证明该引物在实验涉及到的这些近缘种范围内，能特异性的鉴定锥腹肖蛸和华丽肖蛸。
（2）特异性引物PCR扩增片段测序
除了对上述PCR产物琼脂糖凝胶电泳，检查锥腹肖蛸和华丽肖蛸特异引物扩增特异片段大小是否与预期的一致外，同时对产物进行测序并进行序列分析，将序列与原序列比对，进一步确认产物的特异性。实验结果表明，PCR产物的测序结果与原序列一致。
其中锥腹肖蛸为扩增片段长度为365 bp，序列如SEQ ID NO:5所示：ATTCAACTAATCATAAAGATATTGGGAGTTTATATTTTTTATTTGGAGTTTGATCAGCAATAGTTGGGACAGCAATAAGAGTTTTAATTCGAATTGAGTTAGGCCAAACAGGTAGATTTTTGGGAGATGATCAGTTATATAATGTAATTGTTACTGCTCATGCTTTTGTTATAATTTTTTTTATAGTTATACCAATTTTGATTGGGGGATTCGGAAATTGGTTAGTTCCTTTAATATTAGGGGCACCCGATATAGCTTTCCCTCGAATAAACAATCTTAGATTCTGATTATTACCTCCTTCTTTATTTATGTTATTTATTTCTTCTATAGTTGATGTAGGGGTAGGGGCAGGTTGAACTATTTAT；
华丽肖蛸扩增片段长度为576 bp，序列如SEQ ID NO:6所示：
ATTCTACTAATCATAAGGATATTGGGAGATTATATTTTTTATTTGGAGTCTGATCTGCGATGGTAGGGACAGCAATAAGAGTTTTAATTCGAATTGAATTAGGACAATCAGGGAGATTTTTAGGAGATGATCAATTGTACAACGTAATTGTTACTGCACATGCCTTTGTAATAATTTTTTTTATAGTGATACCGATTTTAATCGGTGGTTTTGGAAATTGGTTAGTGCCTTTAATGTTGGGAGCTCCTGATATAGCATTTCCGCGAATAAATAACTTAAGATTTTGATTGTTGCCCCCTTCTTTATTTATATTATTTATTTCATCTATAGCAGATGTGGGGGCAGGAACTGGATGAACAGTTTACCCCCCGCTGGCTTCTTTAGAAGGTCATTCGGGTAGTTCAGTTGATTTTGCTATTTTTTCTTTACATTTGGCGGGTGCTTCTTCTATTATAGGTGCAATTAATTTTATTTCTACTATTATTAATATGCGAATAAGAGGGGTAAGAATAGAAAAAGTTCCTCTTTTTGTTTGGTCAGTTCTTATTACTGCTGTTTTGCTTCTATTGTCTTTAC。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国计量学院
<120> 农田蜘蛛华丽肖蛸和锥腹肖蛸特异性鉴定引物及鉴定方法
<130> 123456
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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attcaacaaa tcataaagat attgg 25
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attcaactaa tcataaagat attgggagtt tatatttttt atttggagtt tgatcagcaa 60
tagttgggac agcaataaga gttttaattc gaattgagtt aggccaaaca ggtagatttt 120
tgggagatga tcagttatat aatgtaattg ttactgctca tgcttttgtt ataatttttt 180
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Claims (8)
1. 一种农田蜘蛛华丽肖蛸和锥腹肖蛸特异性鉴定方法，其特征在于该方法按以下述步骤进行：(1) DNA抽提试剂盒法提取待检测农田蜘蛛华丽肖蛸和锥腹肖蛸的总DNA ；(2) 利用通用引物PCR扩增线粒体COI前部序列；(3) 依据COI序列差异分别设计一条反向特异性引物，与正向通用引物混合组成混合引物，分别与两种蜘蛛总基因组DNA进行PCR扩增；(4) 扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，100 bp DNA Marker作为参照，进行PCR产物长度的判断，快速确定蜘蛛的种类。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中为避免蜘蛛肠道内容物的污染，舍去头腹部，只从其腿部提取 DNA。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的 PCR 反应体系为 50μ1，其中：2μl模板 DNA，5μl 10×PCR buffer，4μl 2.5 mM MgCl2, 1μl 10 mM dNTP，各1μl 10 mM正、反向引物，0.5μl 5U/μl TaqDNA聚合酶，加去离子水调至终体积50μ1；PCR反应条件如下：95°C预变性3分钟，94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸50秒；35个循环后，72°C再延伸7分钟；1.5%琼脂糖凝胶电泳，割胶试剂盒回收目的片段后测序。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中 PCR 反应通用引物为：
正向引物 COI-F 如SEQ ID NO:1所示；反向引物 COI-R 如SEQ ID NO:2所示
所示。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR 反应特异性引物为：锥腹肖蛸特异引物1Tm-R如SEQ ID NO:3所示；华丽肖蛸特异引物2Tn-R如SEQ ID NO:4所示 。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的 PCR 反应体系为 50μ1，其中：2μl模板 DNA，5μl 10×PCR buffer，4μl 2.5 mM MgCl2, 1μl 10 mM dNTP，2μl 10 mM混合引物，所述混合引物包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物序列，0.5μl 5U/μl TaqDNA聚合酶，加去离子水调至终体积50μ1；PCR反应条件如下：95°C预变性3分钟，94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸50秒；35个循环后，72°C再延伸7分钟。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中凝胶电泳采用1.5％琼脂糖凝胶电泳，根据片段大小判断蜘蛛的种类：锥腹肖蛸为365 bp；华丽肖蛸为576 bp。
8.一种如权利要求1所示方法的农田蜘蛛华丽肖蛸和锥腹肖蛸特异性鉴定引物，其特征在于包括正向引物和反向引物，所述正向引物如SEQ ID NO:1所示，反向引物包括锥腹肖蛸特异引物1Tm-R和华丽肖蛸特异引物2Tn-R，锥腹肖蛸特异引物1Tm-R如SEQ ID NO:3所示；华丽肖蛸特异引物2Tn-R如SEQ ID NO:4所示 。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107937561A (zh) * | 2017-11-20 | 2018-04-20 | 浙江海洋大学 | 一种用于快速鉴别弯斑蛸和卵蛸的引物及设计和扩增方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104498598B (zh) | 2016-08-24 |
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