CN115505545A - 植物乳杆菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及植物乳杆菌菌株及其应用。本发明筛选出一株本土植物乳杆菌P520并将该菌株和酿酒酵母同时/顺序接种混合发酵干红葡萄酒，具有良好增酸增香效果，且对葡萄酒质量无不良影响。

Description

植物乳杆菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及植物乳杆菌菌株及其应用。
背景技术
葡萄酒酿造主要是葡萄醪中微生物将糖转化为乙醇的复杂过程。发酵过程中，葡萄醪中微生物种类和含量呈规律变化，葡萄醪中乳酸菌和酵母菌之间的相互作用不仅影响发酵进程，而且对葡萄酒的色泽、香气、感官质量及产品风格的形成都起到至关重要的作用。葡萄酒工业发酵倾向于使用酿酒酵母纯种发酵以保证葡萄酒发酵顺利进行，但在一定程度上也降低了葡萄酒的风味多样性。随着全球气温变暖，葡萄采收期果实含糖量升高、酸度下降，香气物质积累不足，对葡萄酒酿造品质带来不良影响。过高的糖含量会对酿酒酵母的生存和代谢造成一定的影响，可能导致不良发酵产物(如乙酸)的生成。而低酸度条件下，葡萄酒酸甜失衡，且容易滋生其他微生物，造成微生物败坏。因此，亟需采取有效的技术手段解决葡萄酒香气物质单薄、酸甜失衡等问题。
为了解决这一问题，酿酒实践中通常通过化学增酸，如向葡萄酒中添加酒石酸、苹果酸，或者物理方法，如阳离子交换柱法和电渗析法来降低葡萄汁或葡萄酒的pH。但是这种方法仅仅能实现其酸度的暂时改善，容易出现陈酿后酸度降低，并不能从香气上改善葡萄酒质量，且该法在经济上和政策上存在诸多压力。生物增酸利用酵母菌或乳酸菌发酵糖类物质等产生乳酸等有机酸增酸，该方法的使用不会受到国际葡萄与葡萄酒组织相关条例的限制。此外通过微生物发酵产生的乳酸相当稳定不会随着葡萄酒处理而沉淀，赋予葡萄酒更加柔和的酸度和口感。植物乳杆菌是葡萄酒发酵过程中常见乳杆菌，通常用于葡萄酒酒精发酵结束后的苹果酸乳酸发酵的启动菌株，具有良好的耐酸性和产酸性能。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在筛选出在高糖低酸的葡萄汁环境具有优良生长特性和产酸特性的本土植物乳杆菌，其次探索在不同接种时间间隔条件下植物乳杆菌和酿酒酵母混合发酵过程中的菌落动态变化、有机酸的生成及其对葡萄酒质量及香气的影响，为利用植物乳杆菌实现生物增酸增香提供一定的理论依据。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供了植物乳杆菌菌株，其保藏编号为CGMCC No.22891。
第二方面，本发明还提供了混合菌株，包括所述植物乳杆菌菌株和其他菌株。
在本发明的一些具体实施方案中，所述其他菌株包括但不限于S.cerevisiaeNX11424；如权利要求1所述植物乳杆菌菌株和所述其他菌株同时或顺序接种发酵。
第三方面，本发明还提供了用于果酒发酵的组合物，包括所述植物乳杆菌菌株或所述的混合菌株。
第四方面，本发明还提供了所述植物乳杆菌菌株、所述的混合菌株、或所述的组合物在果酒发酵中的应用；作为优选，所述果酒包括葡萄酒；更优选的，所述葡萄酒包括干红葡萄酒、干白葡萄酒或桃红葡萄酒中的一种或多种。
第五方面，本发明还提供了所述植物乳杆菌菌株、所述的混合菌株、或所述的组合物增强果酒的香气、增加果酒的酸度、降低果酒的pH或提高果酒中有效物质的含量中的一种或多种的用途。
在本发明的一些具体实施方案中，所述增强果酒的香气包括提高香气的复杂性和/或提高香气的浓郁度。
在本发明的一些具体实施方案中，所述增强果酒的香气包括提高果酒中醇类、酯类或脂肪酸类物质中的一种或多种的含量；作为优选，所述增强果酒的香气包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、己醇、乙酸异戊酯、壬酸乙酯、苯乙酸乙酯、(Z)-3-己烯-1-醇、乳酸乙酯或2-苯乙醇中的一种或多种的含量；所述香气包括花香和/或果香。
第六方面，本发明还提供了果酒的发酵方法，取所述植物乳杆菌菌株、所述的混合菌株、或所述的组合物与原料混合发酵；作为优选，所述果酒包括葡萄酒；更优选的，所述葡萄酒包括干红葡萄酒、干白葡萄酒或桃红葡萄酒中的一种或多种。
第七方面，本发明还提供了所述的发酵方法制得的果酒。
综上所述，本申请的有益效果包括但不限于：
(1)通过混合接种，明显缩短整体发酵进程，显著提高果酒中乳酸含量
增加果酒酸度且不会引起挥发酸含量的升高。(2)通过混合接种，提高香气的复杂性，增强果酒的香气质量。
本发明筛选出一株具有潜在增酸性能的本土植物乳杆菌L.plantarum P520并将该菌株和S.cerevisiae同时/顺序接种混合发酵赤霞珠干红葡萄酒具有良好增酸增香效果，且对葡萄酒质量无不良影响。
生物保藏说明
菌株：LP520；保藏日期为2021年07月13日，保藏编号为CGMCC No.22891，分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示不同菌株发酵曲线；其中，CO+菌株编号表示该L.Plantarum和S.cerevisiaeNX11424混合发酵；CK表示S.cerevisiae NX11424纯种发酵；
图2示不同发酵处理发酵曲线及CO533处理发酵过程中菌落变化；其中，实线表示S.cerevisiae的数量变化，虚线表示L.plantarum的数量变化；
图3示不同接种处理发酵中S.cerevisiae(A)与L.plantarum(B)菌落变化；其中，CO520、SI520分别表示L.plantarum P520和S.cerevisiae NX11424同时、顺序接种；COCK、SICK分别表示商业L.plantarum LPV22和NX11424同时、顺序接种；CK、P520分别表示S.cerevisiae NX11424、L.plantarum P520纯种发酵；
图4示不同发酵组别pH(A)和总酸(B)变化图。
具体实施方式
本发明公开了植物乳杆菌菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明的研究内容包括：
本发明提供的植物乳杆菌菌株及其应用中，所用原料及试剂均可由市场购得。
材料与方法
试验材料
商业植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)：LPV22，购于科汉森有限公司。
本土植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)：P520，P511，P544，P202，P519，P510，P533，P110。
本土酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)：NX11424，分离自宁夏产区自然发酵葡萄醪。
葡萄原料：赤霞珠(2016年采自陕西张裕瑞那城堡酒庄，初始糖度180g/L(调整糖度为250g/L)，pH 3.85，总酸4.8g/L。
美乐葡萄(2017年采自宁夏御马国际酒庄葡萄基地，初始糖度254g/L，pH 3.70，总酸5.1g/L)。
高糖低酸模拟葡萄汁培养基：
Ergo stock：12.5mL Tween80，37.5mL 95％乙醇，0.125g麦角固醇，于4℃保存；
溶液A：125g葡萄糖，125g果糖，4mL ergo stock溶解，去离子水定容到500mL；溶液B：3g酒石酸，2g苹果酸，0.5g柠檬酸去离子水定容到250mL。溶液C：1.7g YNB，2g酸水解酪蛋白，6mg肌醇，0.2g无水氯化钙，0.8g L-精氨酸，1g L-脯氨酸，0.1g DL-色氨酸，1g磷酸铵溶解，去离子水定容到250mL。
将A、B、C溶液混合，用0.22μm滤膜过滤除菌，KOH溶液调整pH为3.60。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
菌株活化
L.Plantarum菌株：取-20℃甘油保藏菌液50μL于10mL MRS试管中，37℃活化20h后，划线于MRS固体培养基，37℃培养24h。
S.cerevisiae菌株：取-20℃甘油保藏菌液于5mL YPD试管中，28℃活化24h后，划线于YPD固体培养基，28℃培养24h。
种子培养
挑取培养后的L.Plantarum和S.cerevisiae单菌落分别于MRS培养基和YPD培养基中，25℃培养24h。
植物乳杆菌纯种发酵
将对数生长期L.Plantarum菌液按2％的接种量接种到20mL模拟汁中，25℃静置培养7d，同时以商业L.Plantarum LPV22为对照，每个试验三次重复。培养结束后，观察菌株生长状况，采用滴定法测定总酸含量，测定菌株OD、pH、苹果酸、乳酸、酒石酸、乙酸含量。
Figure BDA0003876486650000041
式中C0为培养之前总酸浓度；C1为培养结束后总酸浓度。
植物乳杆菌和酿酒酵母混合发酵
(1)混合发酵初筛
在2L玻璃罐中加入约1.5L除梗破碎后赤霞珠葡萄醪，随后添加30mg/L SO2和600mg/L二甲基二碳酸盐过夜灭菌处理，果胶酶处理3h后同时接入L.Plantarum和S.cerevisiae混合发酵，S.cerevisiae接种量约为1×108cfu/mL，L.Plantarum接种量约为5×107cfu/mL(各处理组分别以CO+菌株编号表示该菌株和S.cerevisiae同时接种混合发酵)，以S.cerevisiae(简称CK)纯种发酵为对照，发酵温度为25℃，每个处理3组重复。
(2)混合发酵复筛
在20L玻璃罐中加入约15L除梗破碎后葡萄醪，无DMDC灭菌处理，其他操作同(1)。
发酵期间，每24h测定还原糖含量。发酵结束后，测定葡萄酒酒样各理化指标。
理化指标测定
发酵结束后，测定发酵液中常规理化指标及有机酸和香气含量。
有机酸测定采用高效液相离子排阻色谱法：
色谱柱：HPX-87H氢离子柱(300mm×7.8mm)；色谱条件：流动相：0.01M H2SO4(HPLC等级水溶液)；流速：0.6mL/min；柱温：55℃室温；检测波长：210nm；进样量：5μL。
香气测定采用SPME-GC/MS法：
取5.0mL葡萄酒加入到15mL样品瓶中，同时加入1.0gNaCl和10μL的4-甲基-2-戊醇(内标，2.004g/L)后密封样品瓶，在40℃，180r/min条件平衡30min，然后插入萃取头萃取30min后进样，解析8min。升温程序为：50℃保持1min，然后以3℃/min的速率升到220℃，保持5min。载气为氦气，平均线速率为25cm/s。采用不分流进样模式，所有质谱在电子能量70eV条件下冲击，质量扫描范围为29～350m/z。
质谱结果利用计算机谱库(NIST14)并结合文献进行各挥发性物质的定性。对于已有标样的物质，采用外标法定量；没有标样的物质利用化学结构相似、碳原子数相近的标样物质的标准曲线进行相对定量。
结果与分析
植物乳杆菌产酸特性
以商业L.Plantarum LPV22为对照，对试验8株L.Plantarum进行乳酸发酵分析其在高糖低酸葡萄汁条件下的生长情况、增酸能力、苹果酸-乳酸发酵能力以及乳酸发酵能力，结果如表1所示。
在葡萄酒发酵过程中存在乳酸菌菌群变化，且L.Plantarum较其他菌株更能够耐受葡萄醪环境。试验通过测定OD600以考察供试L.Plantarum在高糖低酸模拟葡萄汁条件下的生长状况。供试L.Plantarum在高糖低酸模拟葡萄汁环境中均能存活，且在发酵3d后，模拟葡萄汁pH均下降约0.3个单位。在接种后9d测定发酵液残糖和有机酸含量。发酵液中乳酸的来源主要包括利用糖类物质进行乳酸发酵和苹果酸-乳酸发酵。发酵液中葡萄糖利用量在29.75～40.09g/L。苹果酸消耗完全表明试验菌株L.Plantarum接种于葡萄汁中时具有完成苹果酸-乳酸发酵的能力。
表1乳酸发酵后理化指标
Figure BDA0003876486650000051
注：nd表示未检出；表中不同的字母表示差异显著(P<0.5)。
植物乳杆菌和酿酒酵母混合发酵特性
混合发酵初筛
(1)发酵曲线
不同发酵处理的发酵曲线如图1所示。所有处理均能完成发酵。其中S.cerevisiae纯种发酵处理(CK)约9d完成发酵。发酵前2d，CO520和CO110处理糖含量迅速下降，而其他处理与纯种发酵处理保持一致。但随着发酵进行，发酵速率呈现明显差异，CO511、CO520、CO533混合发酵处理明显加快。
(2)理化指标
发酵结束后酒样的基本理化指标如表2所示。试验葡萄酒酒精度为11.31％～12.94％(v/v)，残糖量为3.09～5.03g/L，挥发酸含量为0.26～0.90g/L，总酸含量为4.84～9.12g/L，pH在3.61～3.98。所有发酵处理均具有一定的增酸效果，发酵结束后酒样总酸均较初始葡萄醪总酸(4.80g/L)增高。其中较S.cerevisiae纯种发酵处理(CK)，CO202处理葡萄酒总酸无显著变化，而其他混合接种处理能显著提高葡萄酒总酸，其增酸率在52.71％～90.00％。
结合8株L.Plantarum纯种发酵特性和混合发酵特性可知，在纯种发酵试验中各试验菌株在高糖低酸模拟葡萄汁环境中均能代谢葡萄糖产酸，并能有效增酸。在2L赤霞珠葡萄酒酿造试验中，各混合发酵处理均能正常完成发酵，并在一定程度上具有葡萄酒增酸的能力，增酸率在0.83％～90.00％。
表2不同发酵组别理化指标
Figure BDA0003876486650000061
注：表中不同的字母表示差异显著(P<0.5)。
混合发酵复筛
(1)发酵曲线
不同发酵处理葡萄汁比重变化如图2所示。
随着发酵的进行，葡萄汁比重由1.108降至0.993结束发酵。混合发酵减缓了葡萄酒发酵进程，其中CO533、CO520和CK处理均在接种后8d结束发酵，CO519、CO202、CO511三组处理完成发酵较晚，约历时10d。
在发酵前期，CO202较CK比重下降缓慢，其他各处理发酵速率与CK相比无明显差别。菌落监测表明P533的接入使得S.cerevisiae菌落数显著降低，说明此时已存在对S.cerevisiae的抑制作用。乳酸菌代谢产生乙酸，乳酸等可能会抑制酵母菌的生长。此外细菌代谢产物，如葡聚糖酶的产生可能会酶解酵母菌细胞壁而抑制S.cerevisiae的生长。
(2)理化指标
发酵结束后按照标准测定酒样的基本理化指标，结果见表3。发酵结束后各处理理化指标均符合国家标准，其中酒精度为12.70％～13.80％(v/v)，残糖含量为2.44～4.95g/L。混合发酵使得发酵结束后残糖量稍上升。CO202处理酒样酒精度和还原糖含量与CK相比有显著差异，发酵结束后残糖含量为4.95g/L，而其他处理发酵结束后糖含量均在4g/L以下。挥发酸含量在0.27～0.41g/L，总酸含量为5.70～7.03g/L，总酸增加率在12.00％～38.00％。相较于CK，混合发酵处理使总酸含量升高，挥发酸含量降低，pH降低，其中CO520处理pH最低(3.64)。
表3不同发酵组别理化指标
Figure BDA0003876486650000071
注：表中不同的字母表示差异显著(P<0.5)。
比较5株L.plantarum菌株和S.cerevisiae NX11424混合发酵后酒样理化指标的差异。结果显示，相较于初始葡萄醪总酸，各发酵处理总酸均增加，挥发酸含量均在合理范围内。与CK相比，L.plantarum的接入在一定程度上能降低葡萄酒中挥发酸含量，提高总酸含量，具有一定的增酸效果。其中CO202、CO520、CO519酒样增酸效果较好，总酸增加率≥25％。此外CO520处理发酵完全，较CK处理能显著降低葡萄酒pH。
(3)有机酸
葡萄酒中有机酸主要来自于葡萄果实及葡萄酒发酵过程中微生物的有机酸分解代谢和合成。有机酸含量受到葡萄原料、发酵条件、微生物菌群等的影响，其含量一般在6～10g/L为宜。在发酵结束后，利用液相色谱法检测葡萄酒中有机酸含量。不同发酵处理的葡萄酒中有机酸含量结果如表4所示。
表4不同发酵组别有机酸含量变化
Figure BDA0003876486650000081
注：表中不同的字母表示差异显著(P<0.5)。
葡萄酒中苹果酸及乳酸含量的变化主要是乳酸菌代谢造成的。乳酸菌可以代谢葡萄糖和苹果酸生成乳酸。相较于CK处理，各混合发酵处理中苹果酸含量显著下降，总含量为0.47～0.90g/L。其中CK处理苹果酸含量最高为1.80g/L，CO511处理中苹果酸含量最低，降低73.89％。CK处理中乳酸含量最低，为0.04g/L，说明纯种发酵过程中基本没有乳酸的生成。相较于CK处理而言，各混合发酵处理中乳酸含量显著增高，总含量为0.83～1.31g/L，其中CO520处理中乳酸含量最高。研究表明乳酸菌除了能代谢苹果酸产生乳酸外还能代谢利用柠檬酸，琥珀酸等有机酸产生乳酸。
(4)香气分析
试验对发酵后葡萄酒样进行GC-MS香气分析，共检测到38种香气物质，包括21种酯类、9种醇类、5种脂肪酸类以及3种其他物质(见表5)。醇类和酯类物质是葡萄酒发酵结束后主要香气成分。各处理酒样间香气物质组成种类没有显著差异，但物质组成含量存在显著差异。
CO533处理酒样中香气物质总含量为355.13mg/L，其中酯类物质总含量为114.53mg/L，醇类物质总含量为237.81mg/L，脂肪酸总含量为2.78mg/L。该酒样中酯类物质含量显著高于其他处理，以乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯香气物质为主，且香气物质含量均显著高于CK处理，赋予葡萄酒桃子、香蕉、葡萄等甜果香及花香。乙酸乙酯在浓度较低时对葡萄酒果香具有明显增强作用，但在浓度过高时可能会带来类似香蕉水等刺激性气味。CO533中乙酸乙酯含量(82.66mg/L)＜100mg/L，赋予葡萄酒愉人的果香气味，且其含量显著高于其他处理，该物质含量的上升是造成CO533处理酯类物质总含量与其他混合发酵处理显著差异的主要原因。辛酸乙酯、癸酸乙酯、丁酸乙酯有利于丰富葡萄酒果香和甜香风味。在所有的酯类物质中，乙酸异戊酯OAV值最高(18.69)，其含量的显著增高可赋予葡萄酒香蕉风味。醇类物质以异戊醇(果香、指甲油气味)、己醇(生青味)、3-己烯-1-醇(青草味、生青味)类香气物质为主。其中与CK相比，该处理酒样中异戊醇含量显著提高。3-己烯-1-醇和己醇含量的降低可减弱其带来的生青类香气，但己醇含量较其他混合发酵处理仍显著升高。3-己烯-1-醇通常会带有青草味和生青味，CO533中该物质含量较CK处理显著降低。异戊醇含量较CK显著升高。
CO519、CO202混合发酵处理酒样中香气物质总含量分别为328.39mg/L和356.66mg/L。酯类物质以乙酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等香气物质为主，总含量与CK处理无显著差别，赋予葡萄酒葡萄、桃子、菠萝等果香。其中与CK处理相比，两个处理酒样中乙酸异戊酯、乙酸己酯、乳酸乙酯含量均显著提高，丁二酸二乙酯(葡萄、果香及瓜香)含量略降低。醇类物质以异戊醇、3-己烯-1-醇、2-苯乙醇、异丁醇类香气物质为主，给葡萄酒带来类似玫瑰、杏仁、烘烤类香气。其中3-己烯-1-醇、2-苯乙醇含量较CK显著增高，异丁醇含量较CK处理显著降低。此外两个处理酒样中脂肪酸含量与CK处理相比无显著差异，其中己酸含量显著降低。
CO520混合发酵处理酒样香气物质总含量为360.84mg/L，其中酯类物质总含量为196.66mg/L，醇类物质总含量为260.99mg/L，脂肪酸总含量为3.92mg/L。该处理中酯类主要香气物质与其他混合发酵处理大致相似，乙酸异戊酯、乙酸己酯、乳酸乙酯和癸酸乙酯含量较CK处理均显著提高，其中乳酸乙酯含量(39.46mg/L)较其他处理中显著提高，约为CK处理的6.7倍，为葡萄酒带来乳香、黄油风味，同时丁二酸二乙酯含量(111.56mg/L)显著降低。醇类物质总含量与CK处理酒样存在显著差异，2-苯乙醇、4-甲基-1-戊醇、异戊醇含量显著增高，且2-苯乙醇含量较其他处理中显著增高，赋予葡萄酒玫瑰香和烘烤香气。
CO511酒样香气物质总含量为281.63mg/L，其中酯类物质总含量为71.77mg/L，醇类物质总含量为206.32mg/L，脂肪酸总含量为2.77mg/L。C0511酯类及醇类物质含量与CK处理之间无显著差异，其中CO511处理能够显著提高庚酸乙酯、癸酸乙酯的含量，而乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯等物质含量均降低。CO511醇类物质大部分与CK处理无显著差异，甚至降低。异丁醇含量较CK处理显著降低，2-苯乙醇含升高，但效果不显著。
CO202和CO520处理能够显著提高葡萄酒中醇类、酯类及脂肪酸类物质含量，葡萄酒香气物质丰富，以醇香、玫瑰花香、乳香、香蕉等香气为主。CO533酒样中酯类物质含量显著高于其他处理，但醇类物质总含量较CK处理无显著差异，脂肪酸类物质总含量显著降低。葡萄酒果香突出，以葡萄、菠萝、香蕉及乳香为主，香气复杂度中等。CO519及CO511处理醇类、酯类及脂肪酸类香气与CK处理相比均无显著差异，香气特点不鲜明。
表5不同菌株发酵的干红葡萄酒中香气物质(均值±方差，μg/L)
Figure BDA0003876486650000091
Figure BDA0003876486650000101
Figure BDA0003876486650000111
Figure BDA0003876486650000121
注：表中同行不同小写字母表示表示处理间差异性显著(Duncan检验，P<0.05)；nd表示未检出。
本部分研究中，对供试8株L.Plantarum进行纯种发酵特性分析和混合发酵特性分析。
(1)研究8株L.Plantarum菌株在高糖低酸模拟葡萄汁培养基纯种发酵特性。结果显示，供试L.Plantarum均能适应高糖胁迫环境产酸，8株L.Plantarum在250g/L高糖低酸模拟葡萄汁培养基中发酵9d后可将培养基中苹果酸消耗完全，乳酸生成量在15.80～18.27g/L，总酸增加率62.86％～71.13％。
(2)对8株L.Plantarum菌株分别与S.cerevisiae NX11424混合接种进行赤霞珠干红葡萄酒酿造初筛(2L)。结果显示，L.Plantarum和S.cerevisiae混合发酵可以正常进行。除CO202外，其他处理在发酵后期发酵速率加快且与CK处理相比，发酵后葡萄酒pH显著降低，总酸显著增加，总酸增加率52.71％～90.00％。
(3)将优选5株L.Plantarum与S.cerevisiaeNX11424混合接种进行美乐干红葡萄酒酿造复筛(20L)。各处理组均能顺利完成发酵且发酵趋势基本一致。混合发酵能够使得美乐干红葡萄酒总酸含量升高，挥发酸含量降低，pH降低。菌株P520能显著提高葡萄酒总酸，增酸率达25.00％，乳酸产量1.31g/L且不会造成挥发酸含量的显著升高。香气分析结果表明，混合发酵有利于醇类和酯类香气物质的形成，不同L.Plantarum菌株对葡萄酒香气的影响不同，其中P520和NX11424混合发酵处理可显著提高葡萄酒中醇类、酯类及脂肪酸类物质含量，尤其是乙酸异戊酯、壬酸乙酯、苯乙酸乙酯、(Z)-3-己烯-1-醇、乳酸乙酯、2-苯乙醇的含量，带来花香、果香，提高葡萄酒香气复杂度。
实施例2接种方式对葡萄酒增酸效果的影响
菌株活化和种子培养
见实施例1。
模拟葡萄汁发酵
设置同时接种和顺序接种(48h)两个接种时间间隔分别接入S.cerevisiae和L.plantarum到高糖低酸模拟葡萄汁培养基中，处理好的模拟葡萄汁先接入L.plantarum，同时或顺序接种S.cerevisiae NX11424，S.cerevisiae接种量为1×106，L.plantarum接种量为1×107，25℃静置培养。文中以CO520、SI520分别表示P520和NX11424同时、顺序接种。以商业L.plantarum LPV22和S.cerevisiae同时(简称COCK)、顺序(简称SICK)接种发酵以及S.cerevisiae NX11424(CK)纯种发酵为对照。发酵温度为25℃，每个处理设置3组重复。
菌落数监测
菌落数监测采用稀释平板计数法：WLN培养基中添加20μg/mL氯霉素，排除杂菌生长对酵母菌总菌数检测的干扰，同时根据酿酒酵母和非酿酒酵母在WLN平板上菌落形态进行分类统计酿酒酵母菌落数。MRS培养基添加100μg/mL放线菌酮以抑制酵母菌的生长，同时向平板中加入2％的碳酸钙，以溶钙圈区分乳酸菌和细菌。发酵过程中取酒样梯度稀释后涂布并于适宜温度下培养后计数。
理化指标测定
理化指标测定同实施例1。
有机酸测定
发酵液中有机酸的测定方法同实施例1。
结果与分析：
菌落变化
发酵过程中S.cerevisiae和L.plantarum的菌落动态变化分别如图3(A)、图3(B)所示。
在发酵过程中S.cerevisiae菌落变化均遵循先上升后下降的变化趋势。同时接种处理中S.cerevisiae在接种后1d菌落数从1×106cfu/mL迅速增殖到最大增殖量约8.7×108cfu/mL，而顺序接种处理中S.cerevisiae在接种后2d菌落数从1×106cfu/mL迅速增殖到最大增殖量4.0×107cfu/mL。此外同时接种处理中S.cerevisiae的增殖和CK无显著差异，说明同时接种处理对S.cerevisiae的影响较小，而顺序接种处理中L.plantarum的提前接入使得S.cerevisiae的最大增殖量显著降低，并延缓了S.cerevisiae到达最大增殖量的时间。L.plantarum发酵过程产生的植物乳杆菌素以及代谢产酸可能是酵母菌衰亡的主要原因(Alexandre et al.2004；Jussier et al.2006)。早期研究表明酵母菌和乳酸菌之间的相互作用取决于参与发酵菌株。同时接种和CK在接种后7d S.cerevisiae菌落数开始下降，其中CO520处理中S.cerevisiae菌落下降趋势较COCK和CK处理更显著。顺序接种处理在酵母菌接种后5d菌落数开始下降，其下降趋势较同时接种发酵处理明显放缓。
L.plantarum菌落数均经历了先上升再稳定，后下降的趋势。CO520、SI520、COCK混合发酵处理中L.plantarum均在接种后2d达到最大生物菌落数，且SI520＞COCK＞CO520。SICK和P520纯种发酵在接种后3d达到最大生物菌落数，约为3.8×106cfu/mL。与P520纯种发酵处理的最大生物菌落数相比，SI520中L.plantarum的最大生物菌落数显著降低，但SICK发酵处理中L.plantarum的最大生物菌落数并没有显著降低。S.cerevisiae接种时间对L.plantarum的增殖有显著影响，同时接种处理时L.plantarum的最大增殖量数显著低于顺序接种时的最大生物菌落数。随着发酵的进行，葡萄醪中L.plantarum菌落数不断下降，在发酵后9d，P520纯种发酵处理菌落数最高，约为3.9×105cfu/mL，并在发酵后13d维持在生物量水平。而其他发酵处理L.plantarum菌落数不断下降。
理化指标
在模拟汁发酵过程中每天取样测定发酵液pH和总酸变化，并在发酵结束后对其基本理化指标进行测定。
不同发酵组的pH和总酸变化如图4A和图4B所示，各组发酵处理pH变化均呈先下降后上升的趋势，总酸变化则先上升后下降。各处理pH在接种前期变化均下降，通过苹果酸-乳酸监测发现在发酵1d天混合接种处理葡萄酒样中就已经有乳酸产生。
同时接种发酵处理酒样和CK处理酒样的pH变化和总酸变化在整个发酵过程中均保持一致。在接种后2d，三组发酵处理pH均降至最低，且总酸增加至最高值，约为8.00g/L。其中CK处理酒样pH值最低(3.43)，总酸含量最高(8.18g/L)。葡萄酒中S.cerevisiae发酵旺盛时期可代谢葡萄糖产酸。随后pH上升，总酸含量下降后保持在一定水平。顺序接种处理和P520纯种发酵处理中pH和总酸含量分别在接种后3d和4d达到顶值，其pH下降幅度和总酸增高幅度显著高于同时接种处理。此外P520的pH变化最大，但总酸增幅低于顺序接种处理。
模拟发酵结束后，测定各处理酒样基本理化指标，如表6所示。各处理酒样残糖含量在38.20～45.72g/L，酒精度为10.50％～11.34％(v/v)。顺序接种处理中残糖量和酒精度与CK相比有显著差异。在高糖低酸模拟汁条件下，同时接种处理总酸的变化与CK相比无显著差异，而顺序接种处理中总酸含量较CK显著增高。挥发酸含量在0.42～0.56g/L,总酸含量为6.99～9.57g/L，总酸增加率在27.05％～74.06％。其中SI520处理总酸最高，为CK的1.31倍。
表6不同发酵组别理化指标
Figure BDA0003876486650000141
Figure BDA0003876486650000151
注：表中不同的字母表示差异显著(P<0.5)。
有机酸
不同发酵组别有机酸的变化如表7所示。发酵结束后混合发酵处理苹果酸含量显著降低，但均未消耗完全，乳酸含量显著升高，CO520乳酸产量最低3.96g/L，SICK乳酸产量最高(16.37g/L)，为CO520处理的4.13倍。
表7不同发酵组别有机酸含量变化(g/L)
Figure BDA0003876486650000152
注：表中不同的字母表示差异显著(P<0.5)。
小结
(1)将L.plantarum P520与S.cerevisiae NX11424按照同时接种和顺序接种两种接种方式进行高糖低酸模拟葡萄汁发酵，L.plantarum和S.cerevisiae之间存在明显相互作用。其中同时接种处理对S.cerevisiae的影响较小，严重影响了L.plantarum的增殖。而顺序接种处理中S.cerevisiae的最大增殖量显著降低，发酵结束后菌落数显著增高，L.plantarum在接种后3d实现有效增殖。
(2)理化分析显示，将L.plantarum P520与S.cerevisiae NX11424在高糖低酸模拟葡萄汁环境混合发酵时，发酵结束后酒样残糖含量在38.20～45.72g/L，酒精度为10.50％～11.34％(v/v)，挥发酸含量在0.42～0.56g/L，总酸含量为6.99～9.57g/L，总酸增加率在27.05％～74.06％。顺序接种处理残糖量和酒精度与CK相比有显著差异。混合发酵处理样品中均有乳酸生成，总酸含量上升且顺序发酵后，模拟葡萄酒总酸增加率(74.06％)和乳酸产量(15.98g/L)较同时接种处理显著增加。
(3)菌株L.plantarum P520与S.cerevisiae NX11424顺序接种有利于混合发酵模拟葡萄汁体系中L.plantarum的增殖，促进其产酸代谢从而提高葡萄酒增酸率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.植物乳杆菌菌株，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.22891。
2.混合菌株，其特征在于，包括如权利要求1所述植物乳杆菌菌株和其他菌株。
3.如权利要求1所述的混合菌株，其特征在于，所述其他菌株包括但不限于S.cerevisiae NX11424；如权利要求1所述植物乳杆菌菌株和所述其他菌株同时或顺序接种发酵。
4.用于果酒发酵的组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述植物乳杆菌菌株或如权利要求2或3所述的混合菌株。
5.如权利要求1所述植物乳杆菌菌株、如权利要求2或3所述的混合菌株、或如权利要求4所述的组合物在果酒发酵中的应用；作为优选，所述果酒包括葡萄酒；更优选的，所述葡萄酒包括干红葡萄酒、干白葡萄酒或桃红葡萄酒中的一种或多种。
6.如权利要求1所述植物乳杆菌菌株、如权利要求2或3所述的混合菌株、或如权利要求4所述的组合物增强果酒的香气、增加果酒的酸度、降低果酒的pH或提高果酒中有效物质的含量中的一种或多种的用途。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述增强果酒的香气包括提高香气的复杂性和/或提高香气的浓郁度。
8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述增强果酒的香气包括提高果酒中醇类、酯类或脂肪酸类物质中的一种或多种的含量；作为优选，所述增强果酒的香气包括乙酸乙酯、乳酸乙酯、己醇、乙酸异戊酯、壬酸乙酯、苯乙酸乙酯、(Z)-3-己烯-1-醇、乳酸乙酯或2-苯乙醇中的一种或多种的含量；所述香气包括花香和/或果香。
9.果酒的发酵方法，其特征在于，取如权利要求1所述植物乳杆菌菌株、如权利要求2或3所述的混合菌株、或如权利要求4所述的组合物与原料混合发酵；作为优选，所述果酒包括葡萄酒；更优选的，所述葡萄酒包括干红葡萄酒、干红葡萄酒、干白葡萄酒或桃红葡萄酒中的一种或多种。
10.如权利要求9所述的发酵方法制得的果酒。
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