KR20170074363A - 락토바실러스 플란타럼 jh287과 사카로마이시스 세레비시아의 순차적 접종에 따른 와인의 제조방법 - Google Patents

락토바실러스 플란타럼 jh287과 사카로마이시스 세레비시아의 순차적 접종에 따른 와인의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 와인의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 포도에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287 및 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)를 순차적으로 접종하여 말로락틱 발효 후 알코올 발효시킴으로써 신맛을 유발하는 말산을 효과적으로 감소시키고, 향미를 풍부하게 하여 주질을 개선할 수 있는 와인의 제조방법에 관한 것이다.

Description

락토바실러스 플란타럼 JH287과 사카로마이시스 세레비시아의 순차적 접종에 따른 와인의 제조방법{Fermentation method of wine by sequential inoculation of Lactobacillus plantarum JH287 followed by Saccharomyces cereivisiae cells}
본 발명은 와인의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 포도즙에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287 및 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)를 순차적으로 접종하여 말로락틱 발효 후 알코올 발효시키는 것을 특징으로 하는 와인의 제조방법에 관한 것이다.
포도는 쌍자엽식물아강(Dicotyledoneae) 갈매나무목(Rhamnales) 포도과(Vitaceae) 포도속(Vitis)에 속하는 낙엽관목으로 원산지는 지중해와 소아시아 등지로 알려져 있다. 포도는 과실 중 재배역사가 가장 오래 되었고 생산량도 가장 많다. 포도의 품종은 크게 세 가지로 분류되는데, 첫째로 유럽에서 가장 많이 생산되는 것으로(약 95%) 와인 제조에 주로 이용되는 유럽종인 Vitis vinifera가 있는데, Vitis vinifera에는 수천개의 품종이 있다. 둘째, 아메리카 대륙에 자생하던 것이 고정된 것인 미국종(Vitis labrusca, Vitis rotundifolia)이 있는데, Vitis labrusca에 속하는 대표적인 품종은 콩코드(Concord, black), 나이아가라(Niagara, green), 카타바(Catawba, red)가 있다. 델라웨어(Delaware, red)는 Vitis vinifera와 Vitis labrusca의 교잡종이다. 세번째로는 유럽종인 Vitis vinifera를 육성한 "French hybrids"가 있다.
국내 포도 생산 및 가공현황을 살펴보면 1980년대 두산주류에서 출시한 '마주앙'의 인기와 더불어 와인 생산이 활발히 이루어졌으나, 1988년 서울올림픽을 계기로 국내 와인 수입이 자율화되면서 품질에서 경쟁력이 떨어지는 국내 와인의 생산율이 급감하여 1995년 이후로 포도 생산량이 크게 증가하였음에도 포도의 술 가공비율은 1996년 이후로 1% 미만을 나타내고 있다.
한편, 지금까지 와인의 알려진 효능으로는 레드 와인에 함유된 레스베라트롤(resveratrol), 퀘세틴(quercetin) 등의 다양한 폴리페놀이 강력한 항암작용과 함께 HDL 콜레스테롤의 수치를 높여주고, 동맥경화를 일으키는 LDL 콜레스테롤의 수치를 낮춰주어 심장병을 예방하는 효능이 보고되고 있으며, 이들 폴리페놀의 항산화작용이 뇌혈관을 보호하고 뇌신경세포의 노화와 손상을 억제시켜 알츠하이머 같은 치매성 질환의 예방과 피부노화 방지에 도움이 된다는 보고도 있다. 또한 레드 와인에 함유된 PST-P 같은 효소는 소화를 촉진시켜 위장액의 분비를 도와주며 우리 몸속 해로운 박테리아를 제거해주고 콜레라, 장티푸스균을 죽이는 역할을 한다고 보고되기도 하였으며, 레드와인에 함유된 다양한 미네랄과 비타민 등은 인체에 유용하다고 잘 알려져 있다.
국내에서 가장 많이 재배되는 품종인 캠벨얼리(Campbell Early)는 보통 생식용으로 이용되며 유럽 양조용 포도에 비하여 당도가 14~16Brixㅀ로 상대적으로 낮아 설탕으로 보당한 이후 양조에 이용되고 있다. 또한 캠벨얼리는 착색 등의 이유로 수확시기가 빨라 말산(malic acid)의 함량이 높아 유럽종 포도로 양조한 와인에 비하여 신맛이 상대적으로 강하기 때문에 품질 면에서 한계점을 보이고 있다. 따라서, 국내에서는 다양한 효모의 혼합발효 머스트 전처리 과정에서 탄산침용(carbonic maceration) 처리, 말로락틱 발효(malolactic fermentation) 등을 통해 캠벨얼리 와인의 말산 함량을 낮추는 연구가 계속 되어오고 있다.
이 중에서 말로락틱 발효는 젖산균(lactic acid bacteria; LAB)이 와인에 존재하는 말산을 대사과정을 통해 젖산과 탄산가스로 전환시키는 발효과정이다. 유기산의 종류가 과실 및 과실주의 신맛에 미치는 영향은 동일량 기준으로 말산 > 주석산 > 구연산 > 젖산의 순으로 산미가 강하다고 보고되어 있다. 따라서 말로락틱 발효를 이용하면 캠벨얼리 와인의 말산을 분해하여 와인의 신맛을 부드러운 맛으로 전환시켜 국내산 와인의 품질 향상에 큰 도움을 줄 것으로 기대된다. 현재 말로락틱 발효의 스타터로 잘 알려진 균주는 대표적으로 오에노코카스 오에나이(Oenococcus oeni)와 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)이 있으며 캐나다의 Lallemand사 등에서 수십여종의 종균 제품을 개발하여 세계 각국의 와이너리에 공급하고 있다.
인공적으로 유산균을 접종하여 말로락틱 발효를 유도하는 방법 이외의 종래의 방법은 와인을 제조할 때 아황산 처리를 하지 않고 무균 상태에서 발효를 진행시킨 후 병입하여 숙성 보관하는 동안 짧게는 6개월에서 길게는 수년 동안 자연적으로 존재하는 유산균에 의해 말로락틱 발효가 진행되는 방법을 사용하였다. 하지만 종래의 방법은 일반적인 와이너리에서 수행하기에는 전문적인 미생물 관리 기술이 부족하여 말로락틱 발효를 진행시키기 어려운 문제점이 있다. 또한 유산균 종균을 이용하여 알코올 발효 이후 접종하여 와인을 제조하는 방법 또는 알코올 발효와 동시에 말로락틱 발효를 진행시키는 방법 역시 국내에서는 유산균 종균의 관리 기술 부족, 접종 시기의 미확립, 잡균의 오염 등에 따른 문제점 등으로 인해 말로락틱 발효를 활용한 와인 제품의 생산이 거의 이루어지고 있지 못하고 있는 상황이다.
국내등록특허 제10-1096946호
상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자, 본 발명은 와인 제조 시 말로락틱 발효 후 알코올 발효를 순차적으로 진행하여 신맛에 의한 품질 저하를 방지할 수 있는 와인의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287을 이용하여 신맛을 줄이고 향미를 풍부하게 하여 주질이 개선된 와인을 제공할 수 있는 와인의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포도즙에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287을 접종하여 말로락틱 발효시키는 1차 발효 단계; 및 포도즙에 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 알코올 발효시키는 2차 발효 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 와인의 제조방법을 제공한다.
바람직하게 상기 제조방법은, 포도를 세척한 후 착즙하는 단계; 상기 착즙된 포도즙을 보당하는 단계; 상기 포도즙에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287을 접종하여 말로락틱 발효시키는 1차 발효 단계; 상기 말로락틱 발효가 완료된 포도즙에 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 알코올 발효시키는 2차 발효 단계; 및 상기 2차 발효된 포도즙을 숙성시키는 단계;를 포함한다.
상기 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287는 포도즙에 0.5~1.5중량%(w/v)로 접종되는 것이 바람직하다.
상기 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)는 포도즙에 0.005~0.015 중량%(w/v)로 접종되는 것이 바람직하다.
상기 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287 접종 후 4~10시간이 경과된 뒤에 접종하는 것이 바람직하다.
상기 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)를 이용하여 알코올 발효가 종료된 이후에는 메타중아황산칼륨(K2S2O5: potassium metabisulfite)을 100~200ppm을 첨가하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.
본 발명에 따르면 와인 제조 시 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287에 의해 말로락틱 발효시킨 후 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)에 의해 알코올 발효를 순차적으로 진행함으로써 신맛을 줄여 와인의 품질 저하를 방지하고, 향미를 풍부하게 하여 주질이 현저히 개선된 와인을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따라 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287의 와인 내 말산 분해 효과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287의 아황산 존재 유무에 따른 말로락틱 발효 활성을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287로 말로락틱 발효를 진행 후 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)로 알코올 발효를 진행한 와인과 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)로 알코올 발효만을 진행한 와인의 당도 및 알코올 변화를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따라 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287로 말로락틱 발효를 진행 후 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)로 알코올 발효를 진행한 와인과 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)로 알코올 발효만을 진행한 와인의 pH 및 총산 변화를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따라 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287로 말로락틱 발효를 진행 후 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)로 알코올 발효만을 진행한 와인의 발효과정 중 말산 및 젖산의 변화와 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287의 생균수의 변화를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서는 와인 제조 시 포도에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287과 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)를 순차적으로 접종함으로써 말로락틱 발효에 의해 신맛을 유발하는 말산을 현저히 감소시킬 수 있어 주질이 개선된 와인을 제조할 수 있음을 확인하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.
이러한 본 발명의 와인 제조방법은, 포도에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287를 접종하여 말로락틱 발효시키는 1차 발효 단계; 및 상기 말로락틱 발효가 완료된 후 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 알코올 발효시키는 2차 발효 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 본 발명은 포도를 세척한 후 착즙하는 단계, 상기 착즙된 포도즙을 보당하는 단계, 상기 포도즙을 발효시키는 단계 및 상기 발효가 종료된 후 숙성시키는 단계를 포함하는 와인의 제조방법에 있어서, 상기 발효 시 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287를 접종하여 말로락틱 발효시킨 후, 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 알코올 발효시킴으로써 말로락틱 발효가 충분히 이루어져 신맛을 유발하는 말산을 현저히 감소시킬 수 있는 와인의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 와인의 제조방법을 자세히 설명하면 다음과 같다.
먼저, 수득된 포도는 세척하고 파쇄 등의 과정을 거쳐 착즙한다.
상기 포도는 통상 와인의 제조에 사용되는 품종이라면 제한없이 사용될 수 있으며, 예를 들어 캠벨얼리(Campbell Early), 머스켓 베일리 A(Muscat Bailey A) 등의 품종이 사용될 수 있다.
본 발명에서는 일예로 국내에서 가장 많이 생산되는 캠벨얼리(Campbell Early) 품종을 사용한다. 상기 캠벨얼리 품종의 경우 당도가 14~16ㅀBrix 정도로 통상 와인의 제조에 사용되는 품종들과 대비하여 당도가 낮기 때문에 보당을 통해 당도를 높여주는 과정이 필요하다. 따라서, 상기 캠벨얼리로부터 얻어진 포도즙은 설탕을 이용해 당도가 22~26ㅀBrix가 되도록 보당하는 것이 좋다.
상기 보당 이후에는 포도즙의 발효를 위해 효모를 첨가한다.
상기 발효는 말산의 충분한 분해가 이루어지도록 포도즙에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287를 접종하여 말로락틱 발효를 진행하고, 말로락틱 발효가 충분히 진행된 후 와인 효모인 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 알코올 발효가 진행되도록 하는 것이 바람직하다.
특히, 본 발명에서 말로락틱 발효를 위해 사용한 유산균인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287은 캠벨얼리 품종으로 발효를 진행하면서 분리해낸 유산균 중 말로락틱 활성을 가지는 균주로, 본 발명에서는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287를 2015년 11월 13일자로 국립농업과학원 농업유전자센터에 기탁하였으며, 이의 기탁번호는 KACC92106P이다.
본 발명에서는 상기 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287을 말로락틱 발효를 위한 균주로 사용할 수 있다.
상기 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287은 MRS 액체 배지에서 37℃, 16시간 조건으로 배양하여 사용하며, 말로락틱 발효가 빠르게 진행되기 위한 초기 균수의 확보를 위하여 포도즙에 0.5~1.5중량%(w/v)로, 바람직하게는 1중량%(w/v)로 접종되는 것이 바람직하며, 충분한 말로락틱 발효의 진행을 위하여 15~25℃, 바람직하게는 20℃의 온도에서 4~10시간 동안, 바람직하게는 6시간 동안 발효를 진행하는 것이 좋다. 본 발명의 와인 제조공정 중 말로락틱 발효 시에는 아황산 처리가 되지 않아 잡균에 오염되기 쉬운 상태이기 때문에 오랜 시간 동안 말로락틱 발효를 진행하기 어렵다. 따라서, 전술한 조건으로 말로락틱 발효를 진행하는 것이 좋다.
뿐만 아니라, 본 발명에서는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287에 의한 말산의 분해가 충분히 이루어질 수 있는 환경을 조성하기 위해 말로락틱 발효 이전에는 아황산을 첨가하지 않는 것이 바람직하다.
즉, 본 발명에서는 알코올 발효에 앞서 말로락틱 발효를 수행하며, 이때에 말로락틱 발효를 위한 유산균으로는 MRS 액체 배지에서 배양한 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287 사용하며, 신맛을 유발하는 말산의 충분한 분해를 위하여 아황산이 무첨가된 조건에서 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287을 접종하여 말로락틱 발효를 수행하며, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287의 접종 이후 말로락틱 발효가 충분히 이루어지도록 4~10시간이 경과된 뒤에 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 알코올 발효를 수행하는 것이 바람직하다.
상기 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)는 알코올의 생성을 늦추어 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287이 말산을 분해할 수 있는 충분한 시간을 확보하기 위하여, 통상 사용되는 양보다 적은 양인 포도즙에 0.005~0.015중량%(w/v)로, 바람직하게는 0.01중량%(w/v)로 접종되는 것이 좋다. 이때 상기 알코올 발효는 15~25℃, 바람직하게는 20℃의 온도에서 알코올 발효가 종료될 때까지 진행될 수 있다.
알코올 발효가 종료된 후 얻어진 포도즙(와인)에는 이후 산화 방지와 미생물 오염의 방지를 위해 메타중아황산칼륨(K2S2O5: potassium metabisulfite) 100~200 ppm을 첨가하는 단계를 추가로 더 수행할 수도 있다.
이후 발효가 완료된 포도즙은 숙성시킨다. 이때 포도즙의 숙성은 통상의 와인 제조 시와 동일한 조건에서 수행될 수 있다.
상기와 같은 본 발명에 따르면 말산의 충분한 분해로 신맛이 현저히 감소되고, 향미가 풍부하여 기존 와인과 달리 주질이 현저히 향상된 고품질의 와인을 제조할 수 있다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명에 관하여 더욱 상세하게 설명할 것이나. 이들 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것으로 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1. 와인제조를 위한 락토바실러스 플란타럼( Lactobacillus plantarum ) JH287과 사카로마이시스 세레비시아( Saccharomyces cerevisiae )의 준비
본 실험에서는 2012년 9월 충북 영동에서 수확한 Campbell Early 품종으로 발효를 진행하면서 분리해낸 유산균 중 말로락틱 발효 활성을 지닌 균주인 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287(기탁번호 KACC92106P)을 선별하여 사용하였다. 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287을 MRS 배지에서 37℃, 16시간의 조건으로 배양한 배양액을 원심분리(3,600×g, 10분)한 후 0.85% NaCl로 2회 세척하여 균체를 취하여 포도즙에 접종하였다. 알코올 발효에 사용된 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)는 상업용 와인 발효 효모로 판매되고 있는 사카로마이시스 세레비시아 퍼미빈(Saccharomyces cerevisiae Fermivin, DSM Food Specialties, Delft, Netherlands)을 구입하여 사용하였다.
실시예 2. 환경에 따른 말산 분해 효과
2-1. 와인에서의 말산 분해 효과
완성된 와인에서의 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287의 말산 분해능을 알아보기 위하여, 본 연구실에서 보관중인 Campbell Early로 제조한 와인에 MRS 액체 배지에서 배양한 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287 1중량%(w/v)를 접종한 후 20℃에서 보관하며 말산과 젖산의 함량 변화를 관찰하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287 접종 이전 와인의 말산 함량은 1.95㎎/mL였고, 젖산은 검출되지 않았다. 또한 와인의 알코올 함량은 10.9%였으며, 유리아황산 농도는 0.5ppm으로 거의 검출되지 않았다. 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287을 접종 후 3일차에 말산은 1.13㎎/mL로 크게 감소하였고, 14일차에는 대부분 분해되어 0.24㎎/mL가 되었다. 젖산 함량은 3일차에 0.50㎎/mL가 생성되었고, 14일차에는 0.86㎎/mL가 생성되었다.
알코올이 존재하는 경우 알코올 무첨가에 대비하여 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)의 생육도가 감소하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 12~13%의 알코올을 함유한 와인에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287을 접종할 경우 알코올이 생성되기 이전에 비하여 말산 분해능이 감소할 것으로 보여지며, 알코올이 생성되기 이전에 유산균의 활성을 증가시킨다면 말로락틱 발효를 빠르게 진행시킬 수 있을 것으로 판단되었다.
2-2. 아황산 농도에 따른 말산 분해 효과
아황산 농도에 따른 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287의 말산 분해능을 알아보기 위하여, 포도즙에 메타중아황산칼륨(K2S2O5: potassium metabisulfite)을 각각 0, 50ppm으로 처리한 후 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287을 1중량%(w/v) 접종하여 20℃에서 보관하면서 말산과 젖산의 함량 변화를 관찰하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 아황산을 처리하지 않은 시험구에서는 1일차부터 말산이 분해되기 시작하여 7일이 지났을 때 전량이 분해됨을 확인할 수 있었다. 그러나, 아황산을 50ppm 처리한 시험구에서는 2일차부터 말산이 분해되기 시작하여 7일이 지난 시점에서 약 16.2%의 말산만 분해되어 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287의 활성이 크게 지연됨을 알 수 있었다.
이같은 결과로부터, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287을 말로락틱 발효를 위한 스타터로 이용할 경우, 발효 과정 중에 아황산을 첨가하지 않아야 빠르게 말로락틱 발효를 유도할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3. 락토바실러스 플란타럼( Lactobacillus plantarum ) JH287에 의한 말로락틱 발효를 이용한 와인 제조
와인의 제조는 원료인 2014년 9월 경상북도 영천에서 수확한 Campbell Early 품종을 이용하였으며, 각각 3 ㎏씩 세척, 제경 및 파쇄한 후 착즙하여 10L 발효용기에 담은 후 설탕을 첨가하여 최종 당도가 약 24°Brix가 되도록 보당하였다. 그 후 하루 동안 당을 평형화시킨 후 MRS 액체 배지에서 배양시킨 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287을 1중량%(w/v)로 접종한 후 6시간 뒤 사카로마이시스 세레비시아 퍼미빈(Saccharomyces cerevisiae Fermivin)(DSM Food Specialties, Heerlen, Netherlands) 0.01중량%(w/v)를 접종하였다. 이어서, 20℃의 온도 조건에서 보관하면서 말로락틱 발효 이후 알코올 발효가 진행되도록 하였다. 알코올 발효가 종료된 이후 와인의 산화 방지 및 미생물의 오염을 방지를 위하여 메타중아황산칼륨(K2S2O5: potassium metabisulfite) 100 ppm을 첨가하여 와인을 제조하였다. 대조구로는 사카로마이시스 세레비시아 퍼미빈(Saccharomyces cerevisiae Fermivin)을 0.02중량%(w/v) 접종하여 알코올 발효만 진행시킨 와인으로 비교하였다.
실시예 4. 와인의 발효 특성 평가
4-1. 당도 및 알코올 변화
상기 실시예 3에 따른 와인 발효과정 중 당도 및 알코올 변화를 측정하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 이때, 와인의 당도는 발효액을 3,600×g로 10분간 원심 분리하여 얻은 상징액을 당도계(ATAGO, Japan)를 사용하여 측정하였다. 또한 와인의 알코올 함량은 3,600×g로 10분간 원심분리하여 얻은 상징액을 100mL 메스실린더에 취하여 증류 플라스크로 옮긴 후 메스실린더를 15mL 증류수로 2회 세척하고 증류 플라스크로 세척액을 합쳐서 증류하여 70mL의 증류액을 받아 증류수 30mL를 더하여 잘 혼합한 다음, 주정계로 측정하여 주류분석규정 0.1도당 알코올 온도 환산표에서 보정한 후 나타내었다(국세청, 2010).
도 3에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287에 의해 말로락틱 발효를 먼저 진행한 후 사카로마이시스 세레비시아 퍼미빈(Saccharomyces cerevisiae Fermivin)의 접종량을 줄이고 접종시기를 늦추어 알코올 발효를 지연시켜 제조한 와인에서의 알코올 생성 속도는 대조구보다 약간 늦게 나타났으며, 이같은 결과로부터 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287이 말산을 분해할 수 있는 시간을 확보할 수 있는데 도움을 줄 수 있는 것으로 보여졌다.
4-2. pH 및 총산 변화
상기 실시예 3에 따른 와인 발효과정 중 pH 및 총산 함량의 변화를 측정하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.
와인의 pH와 총산을 측정하기 위해 와인을 3,600×g로 10분간 원심분리하여 얻은 상징액 10mL를 자동적정장치(DL22 Food & Beverage Analyzer, Mettler-Toledo AG Analytical, Schwerzenbach, Switzerland)를 사용하여 분석하였다. 총산은 국세청 주류분석규정(국세청, 2010)에 따라 역가를 아는 0.1N NaOH 용액을 사용하여 pH 6.8로 적정한 후 소비된 mL수를 아래 식에 따라 말산의 환산지수로 나타내었다.
Figure pat00001
와인의 pH는 발효과정, 숙성 및 저장 중 와인의 맛에 많은 영향을 주는 것으로 와인의 pH는 3.2에서 3.6 사이가 적당하다고 보고되었다. 실험결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 두 시험구 모두 pH가 감소하는 경향을 보이다가 발효 종료 시점에는 일부 증가하여 최종 pH 값은 3.57~3.61의 적당한 수치를 나타내었다. 일반적인 포도 내 총산도는 0.6~0.8%으로(American Wine Society, 1999), 본 실험에서는 그보다 약간 낮은 0.5344~0.5513%로 시작하여 3일차까지 계속 증가하여 0.779~0.788%이 되었으며, 이후 점차적으로 감소하여 총산 함량이 0.710~0.749%로 나타남을 확인할 수 있었다. 특이한 점은, 말로락틱 발효를 진행한 와인에서 약간 더 높은 pH 값과 약간 낮은 총산 수치를 나타내었다.
4-3. 말산, 젖산 함량 및 락토바실러스 플란타럼( Lactobacillus plantarum ) JH287의 생균수 변화
상기 실시예 3에 따른 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287로 말로락틱 발효를 진행한 후 사카로마이시스 세레비시아 퍼미빈(Saccharomyces cerevisiae Fermivin)으로 알코올 발효를 진행한 와인의 발효과정 중 말산, 젖산의 변화를 측정한 결과와 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287의 생균수 변화를 도 5에 나타내었다.
말산과 젖산의 함량은 L-MALIC ACID ASSAY KIT(K-LMALR, Megazyme, Wicklow, Ireland)와 L-LACTIC ACID ASSAY KIT(K-LATE, Megazyme, Wicklow, Ireland)를 구입하여 측정하였다. 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287의 생균수는 발효 중인 와인을 일부 채취하여 단계 희석한 후 100μL를 MRS 배지(bromophenol blue 20㎍/mL, cycloheximide 100㎍/mL)에 도말하여 37℃에서 48시간 배양시킨 후 형성된 colony 수를 계산하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 말산의 함량은 생균수가 최대로 증가한 2일 이후인 3일차부터 크게 감소하여 최종적으로 1.57㎎/mL 함량값을 나타내었고, 젖산의 함량은 말산 분해 경향에 따라 발효 3일차부터 크게 증가하기 시작하여 최종적으로 0.62㎎/mL 값을 나타내었다. 생균수는 알코올이 생성되기 시작한 3일차부터 감소하여 조금씩 감소하여 최종적으로 5.48Log CFU/mL 값을 나타내었다.
실시예 5. 와인의 향기 성분 분석
락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287이 발효 과정 중에 와인의 향기 성분의 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287로 말로락틱 발효를 진행한 후 사카로마이시스 세레비시아 퍼미빈(Saccharomyces cerevisiae Fermivin)으로 알코올 발효를 진행한 와인과 사카로마이시스 세레비시아 퍼미빈(Saccharomyces cerevisiae Fermivin)으로 알코올 발효만 진행한 와인을 이용하여 와인의 휘발성 향기 성분을 분석하고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
향기 성분의 포집은 SPME fiber(50/30um DVB/CAR/PDMS, Supelco, Bellefonte, PA, USA)를 이용한 head-space 분석법을 이용하였다. 휘발성 향기 성분을 흡착하기 전에 SPME fiber는 GC를 이용하여 240℃에서 1시간 예열하여 사용하였다. 시료의 준비는 headspace vial(20㎜, PTFE/silicon septum, magnetic cap)에 시료 5mL을 넣고 NaCl을 25% 첨가한 다음 완벽히 밀봉하였다. SPME 포집은 준비된 시료를 35℃로 유지하며 자력교반기로 20분간 교반을 해주어 시료와 headspace의 휘발성 성분이 평형을 이루게 하고, SPME fiber를 주입하여 같은 조건으로 40분간 향기 성분을 fiber에 포집하였다. 그리고 GC로 주입한 후 fiber의 세척을 위해 30분간 유지한 다음 시료에 사용하였다. 휘발 성분 분석을 위해 사용된 GC-MS 분석 조건은 하기 표 1과 같고, 사용된 library는 Wiley9Nist0.8(Wiley9Nist0.8 Library, mass spectral search program, version 5.0, USA)이었다.
Item Condition
Instruments Agilent 7890A with Agilent 5975C inert XL MSD
Column DB-WAX(60 m × 250㎛ × Ø0.25 mm, Waters)
Column temp 40℃(2 min)→220℃(2℃/min)→240℃(20℃/min)->240℃(5 min)
Carrier gas He (1 mL/min)
Inlet temp. 240℃
Split ratio 20 : 1
Figure pat00002
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 사카로마이시스 세레비시아 퍼미빈(Saccharomyces cerevisiae Fermivin)으로 알코올 발효만 진행시킨 대조군에서는 총 745.27㎎/L의 휘발성 에스테르 화합물이 검출되었으며, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287로 말로락틱 발효를 진행시킨 후 사카로마이시스 세레비시아 퍼미빈(Saccharomyces cerevisiae Fermivin)으로 알코올 발효시킨 와인에서는 총 1564.54㎎/L의 휘발성 에스테르 화합물이 검출되었다. 특히, 저분자 물질인 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 이소아밀 아세테이트(isoamyl acetate), 에틸 헥사노에이트(ethyl hexanoate), 에틸 락테이트(ethyl lactate), 에틸 글리콜레이트(ethyl glycolate)에서 말로락틱 발효를 진행하였을 때, 대조구보다 현저히 높아지거나 새로 생성되는 것을 확인할 수 있었다. 이같은 결과로부터, 다양한 휘발성 향기 성분 함량의 변화로 인한 복합적인 효과로 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287과 사카로마이시스 세레비시아 퍼미빈(Saccharomyces cerevisiae Fermivin)으로 혼합발효된 와인의 경우 향미가 더욱 풍부해짐을 알 수 있다.
실시예 6. 관능검사
락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287로 말로락틱 발효를 진행시킨 후 사카로마이시스 세레비시아 퍼미빈(Saccharomyces cerevisiae Fermivin)으로 알코올 발효시킨 와인과 사카로마이시스 세레비시아 퍼미빈(Saccharomyces cerevisiae Fermivin)으로 알코올 발효만 진행한 와인을 비교한 관능검사는, 경북대학교 식품공학과 학생 중 본 실험에 관심이 있는 관능 요원 20명을 선정하여, 본 연구에 관한 설명과 관능검사의 평가기준을 숙지시킨 후 블라인드 테스팅(blind testing)을 진행하였다. 색, 향, 단맛, 신맛 및 전반적인 기호도의 항목이 적힌 설문지를 이용하여 5점 척도법으로 진행하였다. 이때, 관능평점은 5:매우 좋다, 4:좋다, 3:보통이다, 2:나쁘다, 1:매우 나쁘다로 평가하였다. 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
Figure pat00003
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287로 말로락틱 발효를 진행시킨 후 사카로마이시스 세레비시아 퍼미빈(Saccharomyces cerevisiae Fermivin)으로 알코올 발효시킨 와인은 사카로마이시스 세레비시아 퍼미빈(Saccharomyces cerevisiae Fermivin)으로 알코올 발효만 진행한 와인보다 신맛을 제외한 모든 항목에서 높은 점수를 받았고, 특히 향미와 전반적인 기호도에서 높은 점수를 받았다. 또한 신맛의 경우에서도 혼합발효시킨 와인에서 상대적으로 신맛이 감소한 것으로 조사되었다. 이같은 결과는 말로락틱 발효 과정 중에 말산이 분해되어 상대적으로 신맛이 적은 젖산으로 전환되었기 때문인 것으로 고려되었다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
기탁기관명 : 농업생명공학연구원
수탁번호 : KACC92106P
수탁일자 : 20151113

Claims (7)

  1. 포도즙에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287를 접종하여 말로락틱 발효시키는 1차 발효 단계; 및
    포도즙에 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 알코올 발효시키는 2차 발효 단계;
    를 포함하는 와인의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제조방법은,
    포도를 세척한 후 착즙하는 단계;
    상기 착즙된 포도즙을 보당하는 단계;
    상기 포도즙에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287를 접종하여 말로락틱 발효시키는 1차 발효 단계;
    상기 말로락틱 발효가 완료된 포도즙에 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 알코올 발효시키는 2차 발효 단계; 및
    상기 2차 발효된 포도즙을 숙성시키는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 와인의 제조방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287는 포도즙에 0.5~1.5중량%(w/v)로 접종되는 것을 특징으로 하는 와인의 제조방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)는 포도즙에 0.005~0.015중량%(w/v)로 접종되는 것을 특징으로 하는 와인의 제조방법.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 사카로마이시스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) JH287 접종 후 4~10시간이 경과된 뒤에 접종하는 것을 특징으로 하는 와인의 제조방법.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 포도는 켐벨얼리(campbell early) 및 머스켓 베일리 A(Muscat Bailey A) 중 선택된 어느 하나 이상의 품종인 것을 특징으로 하는 와인의 제조방법.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 알코올 발효 이후에 포도즙에 메타중아황산칼륨(K2S2O5: potassium metabisulfite) 100~200 ppm을 첨가하는 단계를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 와인의 제조방법.
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