CN114561480A - 一种用于检测阪崎克罗诺杆菌的rpa引物对、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种用于检测阪崎克罗诺杆菌的rpa引物对、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

一种用于检测阪崎克罗诺杆菌的RPA引物对、试剂盒及检测方法，属于食品安全技术领域。为了解决现有技术检测克罗诺杆菌存在的问题，本发明提供了一种更简单、快速的aRPA可视化检测方法。所述检测方法的检测原理为以阪崎克罗诺杆菌特异性靶基因设计引物，通过不对称RPA产生大量富含G的ssDNA，形成的G‑四联体与血红素形成具有过氧化物酶活性的DNA酶，催化H2O2和底物TMB的反应产生明显蓝色产物，实现阪崎克罗诺杆菌的可视化检测。本发明获得的可视化检测方法具有简单、快速和灵敏度高等特点，可用于实时和现场检测食品及食品加工过程中的阪崎克罗诺杆菌污染，尤其是婴幼儿配方奶粉生产中的克罗诺杆菌污染。

Description

一种用于检测阪崎克罗诺杆菌的RPA引物对、试剂盒及检测 方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测阪崎克罗诺杆菌的RPA引物对、试剂盒及检测方法，属于食品安全技术领域。
背景技术
阪崎克罗诺杆菌隶属于克罗诺杆菌属，是能运动、周生鞭毛的兼性厌氧革兰氏阴性菌，能通过肠上皮层附着并侵入宿主，引起新生儿或免疫功能较差的幼儿和老年人致死性疾病的发生，如败血症、脑膜炎和坏死性结肠炎等。此外，阪崎克罗诺杆菌传播范围广，在乳、肉、蔬菜、水果，甚至面粉、即时汤料中都可被检出。而婴幼儿配方乳粉与阪崎克罗诺杆菌的检出联系最为密切，因此该菌成为乳粉行业的重点防控对象。
目前对于阪崎克罗诺杆菌的检测主要有传统微生物培养法、免疫学检测以及分子生物学方法。国际上采用FDA颁布的“婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的分离计数”方法，但存在着耗时长、检测灵敏度不高以及操作复杂等缺点；免疫学方法主要依赖于抗原抗体反应，但是合成抗体价格昂贵，有些抗原甚至缺少合适的抗体，造成免疫学方法在快速检测应用中的限制。分子生物学检测技术克服了传统和免疫学检测方法的不足，PCR和LAMP虽然可以实现特异、灵敏的检测，但PCR无法摆脱精密的仪器设备，LAMP也存在着气溶胶污染等问题。因此，迫切需要一种更简单、经济、快速的现场检测分析系统。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)因其操作简单，具有高灵敏、高选择性，可兼容多重检测和实现极快的扩增，以及可在低温恒温下操作等优势引起广泛关注。该过程无需初始变性步骤和使用较少引物，是用于目标物快速检测的一种新型等温扩增技术，该反应可在短时间内迅速完成、温度需求低，已被用于扩增不同生物体和样本的靶标。到目前为止，大多数RPA产物终点检测大都依赖于琼脂糖凝胶电泳和侧向流动免疫试纸条。不对称RPA(aRPA)是通过添加不同浓度比的引物进而实现大量单链DNA的扩增，为终点检测带来更多的可能。
G-四联体是具有独特化学性质的DNA或RNA序列形成的非典型核酸结构，该结构富含鸟嘌呤(G)。G-四联体/血红素复合物是一种重要的DNA酶，具有过氧化物酶活性，可催化H2O2和3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)的氧化反应，并伴有颜色变化。DNA酶已被广泛应用于毒素和金属离子等小分子的检测。然而，对食源性致病菌的检测研究较少。因此，开发基于G-四联体的不对称重组酶聚合酶扩增(aRPA)可视化技术在阪崎克罗诺杆菌的现场检测中具有重要意义。
发明内容
为了解决利用传统微生物学方法以及分子生物学方法检测阪崎克罗诺杆菌中存在的问题，本发明提供了一种用于检测阪崎克罗诺杆菌的RPA引物对，所述RPA引物对基于阪崎克罗诺杆菌基因设计，所述RPA引物对中的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种用于可视化检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒，所述试剂盒包含上述的RPA引物对。
本发明还提供了一种用于检测阪崎克罗诺杆菌的aRPA可视化检测方法，包括如下步骤：
(1)提取样品中的DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用RPA引物对进行RPA扩增反应，获得RPA扩增产物；所述RPA引物对中的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
(3)将步骤(2)获得的RPA扩增产物与KCl缓冲液混合，加入氯化血红素溶液孵育，再加入TMB溶液孵育，观察反应产物的颜色，若反应产物变蓝则证明样品中含有阪崎克罗诺杆菌。
进一步地限定，步骤(2)所述RPA扩增反应体系为50μL，包括引物对4.8μL，Buffer29.5μL，模板DNA 1μL，醋酸镁1～3μL，余量为ddH2O。
进一步地限定，所述引物对中上游引物与下游引物的浓度比为(1～100)：1。
进一步地限定，步骤(2)所述RPA扩增反应的反应时间为15～30min，反应温度为35℃～39℃。
进一步地限定，步骤(3)所述KCl缓冲液的添加量为50μL，浓度为90～120mM
进一步地限定，步骤(3)所述氯化血红素浓度为4.5～5.5μM。
进一步地限定，步骤(3)加入氯化血红素溶液后于37℃孵育10min～20min。
进一步地限定，步骤(3)添加TMB溶液的量为40μL，添加TMB后于37℃的条件下孵育20～30min。
本发明的有益效果：
本发明的原理在于，以阪崎克罗诺杆菌特异性靶基因设计引物，通过不对称RPA产生大量富含G的ssDNA，形成的G-四联体与血红素形成具有过氧化物酶活性的DNA酶，催化H2O2和底物TMB的反应，使溶液变为明显的蓝色，实现阪崎克罗诺杆菌的可视化检测。
1)本发明首次构建针对阪崎克罗诺杆菌的aRPA可视化检测方案，该方案特异性好、灵敏度高、操作简单且检测速度快，为检测阪崎克罗诺杆菌提供新思路，为可视化致病菌检测提供理论基础，在乳及乳制品安全保障方面具有重要意义。
2)本发明利用G-四联体和血红素结合产生具有过氧化物酶活性DNA酶的原理，实现更为直观的阪崎克罗诺杆菌的可视化检测，摆脱了对复杂仪器和加热设备的依赖，更加适用于资源短缺的现场检测。
3)本发明建立的可视化方法可用于乳及乳制品中阪崎克罗诺杆菌的实时检测，尤其是对婴幼儿配方奶粉生产中的阪崎克罗诺杆菌污染。
附图说明
图1为aRPA可视化方法检测阪崎克罗诺杆菌的原理图；
图2为引物对筛选结果图；其中，泳道1为阴性对照，泳道2-7分别对应引物对NA-1，NA-2，NA-3，NA-4，NA-5，NA-6和NK-1；
图3为RPA扩增体系反应时间的优化结果图；其中，泳道1为阴性对照，泳道2-7对应的反应时间分别为5min，10min，15min，20min，25min和30min；
图4为RPA扩增体系反应温度的优化结果图；其中，泳道1为阴性对照，泳道2-7对应的反应温度分别为30℃，35℃，37℃，39℃，41℃和43℃；
图5为醋酸镁添加量的优化结果图；其中，泳道1为阴性对照，泳道2-8对应的醋酸镁的添加量分别为0.5μL，1μL，1.5μL，2μL，2.5μL，3μL和3.5μL；
图6为引物对中上游引物与下游引物的浓度比的优化结果图，其中，图6中的A为琼脂糖凝胶电泳图，图中泳道1为阴性对照，泳道2-7对应的下游引物与上游引物的浓度比分别为1:1，1:10，1:20，1:50，1:75，1:100，1:200；图6中的B为吸光度检测结果图；
图7为氯化钾浓度的优化结果图；
图8为氯化血红素浓度的优化结果图；
图9为对G-四联体进行表征的结果图；其中图9中的a)为利用紫外吸收光谱进行G-四联体表征的结果图；图9中的b)为利用圆二色光谱进行G-四联体表征的结果图；图9中的c)为利用琼脂糖凝胶电泳进行G-四联体表征的结果图，图中泳道1对应的引物对为NA-3，泳道2对应常规引物(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.2)；
图10为阪崎克罗诺杆菌纯培养物检测灵敏度的考察结果图，其中泳道1-10对应的纯培养物浓度分别为2.2×108CFU/mL，2.2×107CFU/mL，2.2×106CFU/mL，2.2×105CFU/mL，2.2×104CFU/mL，2.2×103CFU/mL，2.2×102CFU/mL，2.2×101CFU/mL，2.2×100CFU/mL，2.2×10-1CFU/mL，泳道11为阴性对照；
图11为人工污染的婴幼儿配方乳粉样品中阪崎克罗诺杆菌检测灵敏度的考察结果图，其中泳道1-10对应的阪崎克罗诺杆菌浓度分别为5.4×108CFU/g，5.4×107CFU/g，5.4×106CFU/g，5.4×105CFU/g，5.4×104CFU/g，5.4×103CFU/mL，5.4×102CFU/g，5.4×101CFU/g，5.4×100CFU/g，5.4×10-1CFU/g，泳道11为阴性对照；
图12为aRPA可视化方法的特异性考察结果图；
图13为aRPA可视化方法的现场检测模拟结果图；其中a为34℃～42℃，b为34℃～37℃，c为42℃，d为37℃，e为34℃，f为阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明做出进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
以下实施例所用的材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域常规的材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得，所用各种菌株均来源于东北农业大学乳品重点实验室。
实施例1：阪崎克罗诺杆菌aRPA可视化检测方法的建立
(1)阪崎克罗诺杆菌引物设计及筛选
基于阪崎克罗诺杆菌特异性基因nanC和nanK，参考Twist Dx公司建议的RPA引物设计原则，并通过在线软件PrimerExplorerV5(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计7套RPA引物对(见表1)，并对其进行BLAST比对，在正向引物5’端连接一段具有过氧化物活性的DNA片段的一段互补序列，该互补序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：5’-AAAAAATTTACCCAACCCGCCCTACCCAAAAAATTTACCCAACCCGCCCTACCCAAAAAA-3’，利用RPA反应筛选出扩增效果最好的引物对用于后续实验，反应原理见图1，RPA反应体系见表2，引物对筛选结果见图2。
表1用于检测阪崎克罗诺杆菌的引物对
Figure BDA0003532586670000041
Figure BDA0003532586670000051
表2 RPA扩增体系
Figure BDA0003532586670000052
Figure BDA0003532586670000061
注：表2所示的RPA扩增体系的总体积为50μL。
根据图2展示的结果可以看出，引物对NA-1、NA-2、NA-3、NC-6和NK-1扩增条带较亮，其中NA-3扩增条带最亮，且没有引物二聚体，说明引物对NA-3特异性良好。
(2)基于上述筛选获得的引物对NA-3构建RPA扩增体系
RPA反应体系中组分如复杂酶系以及反应条件如反应温度、反应时间等对反应效率和结果造成很大影响，因此分别对反应时间、反应温度和醋酸镁添加量进行优化。
①反应时间优化
固定除反应时间外的其他条件，调节反应时间分别为5min、10min、15min、20min、25min、30min，39℃条件下扩增后，吸取5μL的反应产物并利用1.5％琼脂糖凝胶电泳法进行检测，将在紫外光下电泳条带最亮的反应条件记为最优反应时间，结果如图3。
结果表明，RPA反应在醋酸镁加入到体系中即开始反应，随着反应时间延长，电泳条带逐渐变亮，当反应时间达到15min时，电泳条带亮度达到最亮且清晰并趋于稳定，说明此时RPA扩增反应基本结束，最终确定反应时间为15～30min。
②反应温度优化
固定除反应温度外的其他条件，调节温度分别为30℃、35℃、37℃、39℃、41℃、43℃，扩增30min，吸取5μL的反应产物并利用1.5％琼脂糖凝胶电泳法进行检测，将在紫外光下电泳条带最亮的反应条件记为最优反应温度，结果如图4。
结果表明，RPA反应在温度较低时即可发生，随着反应温度升高，电泳条带先变亮后变暗，当反应温度为39℃时，电泳条带亮度达到最亮且清晰，说明此时扩增效果最好。最终确定反应温度为35～39℃。
③醋酸镁添加量优化
固定除醋酸镁添加量外的其他条件，调节280mM醋酸镁添加量分别为0.5μL、1μL、1.5μL、2μL、2.5μL、3μL、3.5μL，在39℃条件下扩增30min，吸取5μL的反应产物并利用1.5％琼脂糖凝胶电泳法进行检测，将在紫外光下电泳条带最亮的反应条件记为最优醋酸镁添加量，结果如图5所示。
结果表明，醋酸镁添加量低于0.5μL时不能进行有效扩增，当醋酸镁添加量高于1μL时电泳条带明亮且清晰且稳定，说明扩增效果好，为避免醋酸镁添加过多而引起试剂浪费。最终确定醋酸镁(280mM)添加量1～3μL。
(3)基于上述获得的优选方案，构建aRPA可视化方法，分别优化引物对中上游引物和下游引物的浓度比、氯化钾浓度和氯化血红素浓度。
①引物对中上游引物和下游引物浓度比优化
固定除引物浓度外的其他条件，下游引物与上游引物的比例分别为1:1、1:10、1:20、1:50、1:75、1:100和1:200。在39℃条件下扩增30min。利用2.5％琼脂糖凝胶电泳对5μL的反应产物进行检测。分别将50μL不同引物浓度比的aRPA产物与50μL缓冲液混合，并加入10mL 5.5μM氯化血红素溶液于37℃孵育15min，再加入40μLTMB溶液于37℃孵育20min，用酶标仪测定λ为370nm处的吸光度。结合琼脂糖凝胶电泳结果以及吸光度确定最优引物浓度比，结果如图6所示。
由图6中的A可以看出，随着上游引物浓度的增加，条带逐渐微弱，当下游引物与上游引物浓度比为1：75时，条带最微弱，当下游引物与上游引物浓度比为1:100时，条带消失。根据图6中的B对比不同引物浓度比下的吸光度，当下游引物与上游引物浓度比为1:100时吸光度达到最大，与电泳图一致。最终确定上游引物与下游引物的浓度比为(1～100)：1。
②氯化钾浓度优化
固定除氯化钾的所有成分的添加量和浓度，调节氯化钾浓度使终浓度分别为70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM。扩增后产物加入50μL缓冲液(pH＝8)，并同时分别加入10μL 5.5μM氯化血红素37℃孵育15min，随后加入40μLTMB溶液并在37℃条件下孵育20min，利用酶标仪测定λ为370nm处的吸光度，结果如图7所示。
结果表明，随着氯化钾浓度不断升高，吸光度随之增大，说明氯化钾促进aRPA产物所形成的G-四联体越多，当氯化钾浓度继续升高时，出现了过饱和状态，抑制了G-四联体形成，最终确定氯化钾浓度为90～120mM。
③氯化血红素浓度
固定除氯化血红素的所有成分的添加量和浓度，调节氯化血红素浓度使终浓度分别为3.5μM、4μM、4.5μM、5μM、5.5μM、6μM、6.5μM。扩增后产物加入50μL缓冲液(pH＝8)，并同时分别加入一定浓度的氯化血红素后37℃孵育15min，随后加入40μLTMB溶液并在37℃条件下孵育20min，利用酶标仪测定λ为370nm处的吸光度，结果如图8所示。
结果表明，随着氯化血红素浓度不断升高，吸光度随之增大，当氯化血红素浓度达到5.5μM时，吸光度达到最大值，当氯化血红素浓度继续升高时，抑制了G-四联体/血红素复合物对底物TMB的氧化反应。最终确定氯化血红素浓度为4.5～5.5μM。
(4)基于上述构建的aRPA可视化方法，对G-四联体的形成进行表征，分别采用紫外吸收光谱、圆二色光谱和琼脂糖凝胶电泳方法。
①紫外吸收光谱
通过
Figure BDA0003532586670000081
QuickDropTM超微量分光度计扫描产物在不同温度下的紫外吸收光谱(5℃，95℃)，结果如图9中的a)所示。
DNA在紫外区260nm呈现增色效应，在295nm处呈现减色效应，且在温度范围0～95℃内DNA紫外吸收与温度变化关系的曲线中，295nm处5℃条件下的DNA紫外吸收值明显高于95℃是G-四联体形成的重要标志。结果表明，aRPA扩增产物在一定条件下可以形成G-四联体。
②圆二色光谱
将50μL扩增产物加入KCl缓冲液(pH＝8)至1mL，测定波长在200～320nm范围内的圆二色光谱，光谱扫描速度设定为50nm/min，波长间隔设定为0.2nm，结果如图9中的b)所示。
结果表明，aRPA产物在缓冲液(pH＝8)离子条件下，在265nm和245nm附近分别出现正峰和负峰，是平行G-四联体结构的典型标志。
③琼脂糖凝胶电泳
为了进一步表征G-四联体的形成，验证比色法检测阪崎克罗诺杆菌的可行性，分别采用引物对NA-3(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)以及常规引物(SEQ ID NO.3(5’-TGATGAAGATAGCCGGGATGGTAAAGAAGA-3’)和SEQ ID NO.2)分别对阪崎克罗诺杆菌进行扩增，扩增后产物加入50μL缓冲液(pH＝8)，并同时分别加入10μL 5.5μM氯化血红素37℃孵育15～20min，随后加入40μL TMB溶液并在37℃条件下孵育20～30min，观察颜色变化，结果如图9中的c)所示。
琼脂糖凝胶电泳条带显示，带有G-四联体功能序列引物扩增出的RPA产物长于常规引物RPA扩增产物，这种差异在于产物中存在60bp的G-四联体功能序列，由图9中的c)可以看出，常规引物不能产生颜色变化，而基于带有G-四联体功能性序列引物的RPA产物可产生颜色变化，进一步证实了可视化检测阪崎克罗诺杆菌的可行性。
实施例2、利用可视化aRPA方法检测阪崎克罗诺杆菌
(一)利用可视化aRPA检测阪崎克罗诺杆菌
(1)阪崎克罗诺杆菌的活化与培养
取用浓度为80％的甘油保藏的阪崎克罗诺杆菌菌液，以2％接种量加入到TSB液体培养基中，并于37℃在摇床中以200r/min培养8h，将二次活化后的菌液三区划线于TSA固体培养基上，并于37℃在恒温培养箱中培养14～16h，培养后的平板可用封口膜密封后4℃短期保藏。挑取单菌落接种于20mL TSB液体培养基中，并于37℃在摇床中以200r/min培养8h，使菌株达到对数期，用于后续实验。
(2)细菌DNA的提取
采用试剂盒提取细菌基因组DNA，提取方法参考DNA提取试剂盒说明书(TIANGEN公司)，最后用100μL的TE洗脱液将DNA洗脱出来，并于-20℃储存、备用。
采用一步水浴法提取细菌DNA，吸取300μL菌悬液到2ml EP管中，在离心条件为12000r/min下收集沉淀菌泥，用移液器吸取300μL的DNA提取液加入其中，利用振荡器振荡混匀，将混合物于56℃水浴加热30min，100℃加热10min，并在离心条件12000r/min下处理2min，回收的上清液即为DNA溶液。
(3)可视化检测阪崎克罗诺杆菌
基于实施例1中筛选出的阪崎克罗诺杆菌特异性引物以及优化的反应条件。SEQID NO.2与SEQ ID NO.1浓度比为1:(1～100)，按表2的反应体系进行aRPA反应，以35～39℃反应15～30min，将50μL扩增产物与50μLKCl(90～120mM)缓冲液混合，并加入10μL氯化血红素(4.5～5.5μM)氯化血红素溶液于37℃孵育10～20min，再加入40μLTMB溶液于37℃孵育20～30min，若孵化后溶液颜色变蓝则说明有阪崎克罗诺杆菌的存在。
(二)可视化方法灵敏度考察
①纯培养物灵敏度考察
基于实施例1及实施例2，选取阪崎克罗诺杆菌ATCC 29544为标准菌株，在20mLTSB培养基中在37℃、200r/min条件下培养8h以达到生长对数期，用PBS缓冲液将菌液进行10倍梯度稀释为108～10-1CFU/mL纯菌液并涂布计数，确定其活菌浓度，利用DNA试剂盒提取不同浓度菌液的DNA进行aRPA扩增，利用所构建的aRPA可视化方法对50μL产物进行灵敏度检测，结果如图10。
结果表明，琼脂糖凝胶电泳法与可视化方法的结果均表现一致。在对照组显示阴性结果的情况下，当纯培养物的浓度在2.2×108CFU/mL至2.2CFU/mL时，结果为阳性，而在2.2×10-1CFU/mL浓度时呈现阴性。因此，RPA可视化方法检测阪崎克罗诺杆菌纯培养物灵敏度为2.2CFU/mL。
②人工污染婴幼儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌灵敏度考察
将市售的婴幼儿配方乳粉按照FDA的检测方法进行检测，排除奶粉中含有阪崎克罗诺杆菌。称取10g的无菌PIF溶于90mL无菌的蛋白胨水溶液，涡旋振荡并混合均匀，分别加入不同稀释度的阪崎克罗诺杆菌ATCC29544的纯培养菌液，获得终浓度范围在稀释为108～10-1CFU/g之间的人工污染PIF样品。利用试剂盒提取乳样品中阪崎克罗诺杆菌的基因组DNA，利用所构建的可视化方法进行灵敏度检测，结果如图11。
结果表明，琼脂糖凝胶电泳法与可视化方法的结果均表现一致。在对照组显示阴性结果的情况下，当培养物的浓度在5.4×108CFU/g至5.4×101CFU/g时，结果为阳性，而在5.4CFU/g浓度以下时呈现阴性。因此，RPA可视化方法检测婴幼儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌灵敏度为5.4×101CFU/g。
(三)可视化方法特异性考察
基于实施例1及实施例2，选取了克罗诺杆菌属的全部7个菌种和非克罗诺杆菌属的9个菌种，共16个菌株进行了特异性实验。通过对琼脂糖凝胶电泳条带的观察和反应体系最终颜色变化来判断该方法检测特异性。每个菌株均做三组平行试验，结果如图12所示。
结果表明，阪崎克罗诺杆菌ATCC29544结果均为阳性，而对6株除阪崎克罗诺杆菌的克罗诺杆菌以及9株非克罗诺杆菌的致病菌比色结果均为阴性。结果表明建立的方法对阪崎克罗诺杆菌表现出良好的特异性。
(四)现场检测模拟考察
基于实施例1和实施例2，采用一步水浴法提取目标菌株DNA，用热水泡沫箱作为反应容器来模拟现场检测。首先盒子里放上热水，温度随时间而下降，由于RPA酶系存在着高温失活的问题，我们分别选择水温为37℃、40℃时启动不对称RPA反应，并在20min内以34℃结束反应，模拟现场环境，并以34℃、37℃和40℃恒定反应温度为对照，扩增完毕后50μL产物加入50μL缓冲液，并加入10μL 5.5μM氯化血红素孵育15min，再加入40μL TMB反应20min，用酶标仪测定波长λ为370nm处溶液的吸光度，结果如图13。
结果表明，结果表明，34℃～42℃梯度和34℃～37℃梯度溶液的吸光度与34℃、37℃、42℃等温度条件下的吸光度相近，说明在现场检测没有恒温条件下，可以在水中进行RPA反应。试验结果表明，该方法在实验室外是可行的，使用泡沫箱和热水即可，不需要加热设备，在这种情况下，可以选择温度梯度为34℃～42℃的水实现反应。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 东北农业大学
<120> 一种用于检测阪崎克罗诺杆菌的RPA引物对、试剂盒及检测方法
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
aaaaaattta cccaacccgc cctacccaaa aaatttaccc aacccgccct acccaaaaaa 60
tgatgaagat agccgggatg gtaaagaaga 90
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
aaagggcgat agtgcgtatt ggttttagtg 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tgatgaagat agccgggatg gtaaagaaga 30
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
aaaaaattta cccaacccgc cctacccaaa aaatttaccc aacccgccct acccaaaaaa 60
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<212> DNA
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ttttggtgat gaagatagcc gggatggta 89
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<212> DNA
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tggtgatgaa gatagccggg atggtaaaga 90
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<213> 人工合成
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
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ttggtgatga agatagccgg gatggtaaag a 91
<210> 12
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 13
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<211> 90
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
aaaaaattta cccaacccgc cctacccaaa aaatttaccc aacccgccct acccaaaaaa 60
gcgggaaata cccacgcctg ccagcaaaac 90
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
aacaccatct cgctcactat gcctttacgc 30

Claims (10)

1.一种用于检测阪崎克罗诺杆菌的RPA引物对，其特征在于，所述RPA引物对基于阪崎克罗诺杆菌基因设计，所述RPA引物对中的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种用于可视化检测阪崎克罗诺杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的RPA引物对。
3.一种用于检测阪崎克罗诺杆菌的aRPA可视化检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取样品中的DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用RPA引物对进行RPA扩增反应，获得RPA扩增产物；所述RPA引物对中的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(3)将步骤(2)获得的RPA扩增产物与KCl缓冲液混合，加入氯化血红素溶液孵育，再加入TMB溶液孵育，观察反应产物的颜色，若反应产物变蓝则证明样品中含有阪崎克罗诺杆菌。
4.根据权利要求3所述的aRPA可视化检测方法，其特征在于，步骤(2)所述RPA扩增反应体系为50μL，包括引物对4.8μL，Buffer 29.5μL，模板DNA 1μL，醋酸镁1～3μL，余量为ddH2O。
5.根据权利要求4所述的aRPA可视化检测方法，其特征在于，所述引物对中上游引物与下游引物的浓度比为(1～100)：1。
6.根据权利要求3所述的aRPA可视化检测方法，其特征在于，步骤(2)所述RPA扩增反应的反应时间为15～30min，反应温度为35℃～39℃。
7.根据权利要求3所述的aRPA可视化检测方法，其特征在于，步骤(3)所述KCl缓冲液的添加量为50μL，浓度为90～120mM。
8.根据权利要求3所述的aRPA可视化检测方法，其特征在于，步骤(3)所述氯化血红素浓度为4.5～5.5μM。
9.根据权利要求3所述的aRPA可视化检测方法，其特征在于，步骤(3)加入氯化血红素溶液后于37℃孵育10min～20min。
10.根据权利要求3所述的aRPA可视化检测方法，其特征在于，步骤(3)添加TMB溶液的量为40μL，添加TMB后于37℃的条件下孵育20～30min。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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