CN110982703B - 一株高产黄曲霉毒素的真菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高产黄曲霉毒素的真菌及其应用。该真菌为黄曲霉(Aspergillus flavus)，菌株号为YZ‑2‑3，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.18545。经检测发现，本发明菌株为一株高产黄曲霉菌素的真菌，发酵培养7d后产生AFB₁、AFB₂、AFG₁和AFG₂的浓度分别为1229.35μg/mL、43.37μg/mL、493.37μg/mL和40.72μg/mL，该菌株可用于生产黄曲霉毒素标准品。

Description

一株高产黄曲霉毒素的真菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株高产黄曲霉毒素的真菌及其应用。

背景技术

黄曲霉毒素(AFT)是霉菌毒素中较普遍的一种，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类毒素，黄曲霉毒素主要是由黄曲霉、寄生曲霉等霉菌产生。目前已经报道的黄曲霉毒素有20余种，包括黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂、M₁、M₂等，以黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁和G₂最为常见，其中黄曲霉毒素B₁最为多见，其毒性和致癌性也最强。

据报道，黄曲霉菌主要产生黄曲霉毒素B₁和B₂，寄生曲霉主要产生黄曲霉毒素G₁、G₂、B₁、B₂。目前已知的黄曲霉菌中，产毒量较小，难以满足毒素标准品的需求。高产毒素的黄曲霉并不多见，高产黄曲霉毒素B₁和G₂的黄曲霉菌更是难得。

发明内容

鉴于现有技术中的不足，本发明提供一株高产黄曲霉毒素的真菌，可应用于产生黄曲霉毒素。

本发明采取的技术方案如下：

一株高产黄曲霉毒素的真菌，所述真菌为黄曲霉(Aspergillus flavus)，菌株号为YZ-2-3，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.18545。

经分子鉴定，确定其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

产毒检测结果显示，本发明真菌高产AFB₁、AFB₂、AFG₁和AFG₂，产毒量高于其他黄曲霉菌株，其中，AFB₁和AFG₁浓度显著高于对照菌，提示本发明黄曲霉可用于制备黄曲霉毒素，特别是制备AFB₁和AFG₁。

本发明菌株的分离方法是：

选取远志药材，与无菌水混合，置于摇床上120～150r/min室温震荡20～30min，静置5～10min，得上清液；上清液稀释后涂布至含抗生素的MEA培养皿中，放置25～28℃培养箱中培养，对长出的菌落进行单孢分离。

本发明还具体公开了通过菌株YZ-2-3的发酵培养生产黄曲霉毒素的方法，具体为将黄曲霉YZ-2-3菌株接种于温度为20-35℃的液体MEA培养基中摇床培养7d,得到菌株发酵液。培养温度优选为30℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明黄曲霉发酵培养7d后产生黄曲霉AFB₁、AFB₂、AFG₁和AFG₂的浓度达1229.35μg/mL、43.37μg/mL、493.37μg/mL和40.72μg/mL，该菌株可用于生产黄曲霉毒素标准品。

附图说明

图1为本发明黄曲霉的菌落形态和孢子形态；

图2为本发明实施例二试纸条检测结果图；图中从上至下依次为黄曲霉YZ-2-3、黄曲霉HBSQ1-5、黄曲霉CQSQ1-2；

图3为黄曲霉产毒检测结果-MRM色谱图，其中，A:标准品，B:YZ-2-3，C:HBSQ1-5D:CQSQ1-2；

图4为本发明菌株与对照菌株产毒检测结果统计图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例所用MEA培养基：称取麦芽汁20.0g、蛋白胨1.0g、葡萄糖20.0g、琼脂粉15.0g，加入适量纯化水加热溶解，最后定容至1000mL。自然灭菌条件：121℃，20min。

实施例一、黄曲霉(A.flavus)菌株的分离和鉴定

1、黄曲霉(A.flavus)的分离

本发明利用表面分离法进行菌株分离。具体方法如下所述：

选取10g远志药材，加入至含90mL无菌水含有玻璃珠的三角瓶中，置于摇床上120r/min室温震荡20min，静置5min，上清液即为10^-1悬液。依次梯度稀释后，选择合适的浓度(10^-1-10^-5)，取1mL悬液，涂布至含抗生素(氯霉素100ppm)的MEA培养皿中，置于25℃培养箱中培养，每个浓度3皿重复。7d后对长出的菌落进行计数并单孢分离。

2、黄曲霉(A.flavus)的鉴定

将分离到的菌株在PDA液体培养基培养7d，于载玻片中央滴加15μL无菌水，用无菌接种针从真菌菌落边缘处挑取一小块菌丝体放入载玻片上的无菌水中，混匀，盖上盖玻片，最后在显微镜下观察真菌形态，并拍照。菌落淡绿色(图1中A)。利用电子显微镜对其进行观察发现有柱状孢子头(图1中B)。

采用分子方法再进一步鉴定，使用真菌提取试剂盒提取真菌DNA，以通用引物β-tublin Bt2a/Bt2b为引物进行PCR扩增，克隆测序获得577bp的序列，碱基序列如序列表SEQID NO:1所示。将获得的序列在Genbank数据库中进行Blast比对，结果显示其序列与Aspergillus flavus(Accession NO.KY698416和Accession NO.MK271279)同源性达99.3％，与Aspergillus flavus(Accession NO.MH645064和KY234268)同源性达99.47％。通过形态特征和分子特征将其鉴定为黄曲霉(A.flavus)。

黄曲霉(A.flavus)已于2019年9月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为：CGMCC NO.18545。

实施例二、黄曲霉(A.flavus)产毒检测-试纸条检测

将黄曲霉(A.flavus)菌株在20～35℃(优选30℃)MEA液体培养基上培养7d，得到菌株发酵液，取除菌滤液备用。将除菌滤液与甲醇按体积比2:1混合，剧烈震荡混匀或涡旋5min，静置20min或4000r/min离心5min。取100μL上清液置于离心管中，加入700μL样品稀释液混合均匀，此为待测液。

检测步骤：

1)使用前将试纸条和待测液恢复至室温(20℃-30℃)；

2)从原包装中取出试纸条和金标微孔，打开后立即使用。

3)吸取100μL待测液滴加到金标微孔中，然后用滴管吹打金标微孔中的溶液，直至孔内红色物质完全溶解；

4)将试纸条白色端插入微孔中，使之充分浸入溶液；

5)结果在10-12min内判读，其他时间判读无效。

黄曲霉毒素B₁胶体金快速检测条检测结果：本发明菌株与对照菌株检测结果均为阳性(图2)。

实施例三、黄曲霉(A.flavus)产毒检测-UPLC-MS/MS检测

待测液配置方法参照实施例二，对照菌(黄曲霉HBSQ1-5、黄曲霉CQSQ1-2)为参照本发明方法从党参药材表面分离并鉴定的黄曲霉。

混合对照品溶液：黄曲霉混合标准品为2.6μg/mL(其中黄曲霉毒素B₁和G₁是1μg/mL，B₂和G₂是0.3μg/mL),用甲醇稀释浓度为26ng-520ng/mL的工作液。

检测方法：将培养7d(25℃，120r/min)的菌液，通过多功能净化柱处理，然后通过0.2μL的滤纸过滤，然后上液相。UPLC-MS/MS条件：色谱柱：BEH C18(100mm×2.1mm i.d.,1.7μm,Waters Corp.)，柱温：35℃；流动相：2mM乙酸铵水溶液(A)-甲醇(B，含-0.1％甲酸)，梯度洗脱：0min:25％A；2min:45％A；10min:90％A；12min:90％A；12.1min:25％，流速0.3mL/min，进样量2μL。质谱条件：离子源为电喷雾离子源(ESI),正离子模式，多反应离子监测(Multiple reaction monitoring，MRM)扫描，毛细管电压2.5Kv；离子源温度150℃；去溶剂温度350℃。

检测结果：黄曲霉YZ-2-3检测到AFB₁、AFB₂、AFG₁和AFG₂的浓度分别为1229.35μg/mL、43.37μg/mL、493.37μg/mL和40.72μg/mL，黄曲霉HBSQ1-5中产生AFB₁、AFB₂、AFG₁和AFG₂的浓度分别为60.25μg/mL、23.83μg/mL、373.52μg/mL和13.04μg/mL；黄曲霉CQSQ1-2产生AFB1浓度为4.56μg/mL。结果见表1。

表1.黄曲霉产生毒素的结果

结果显示，本发明黄曲霉产生AFB₁、AFB₂、AFG₁和AFG₂的浓度分别为1229.35μg/mL、43.37μg/mL、493.37μg/mL和40.72μg/mL，产毒量明显高于对照菌。其中，本发明AFB₁浓度达1229.35μg/mL，AFG₁浓度达493.37μg/mL，提示本发明黄曲霉可用于制作标准品。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

序列表

<110> 中国医学科学院药用植物研究所海南分所

<120> 一株高产黄曲霉毒素的真菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 56

<211> 577

<212> DNA

<213> 黄曲霉(Aspergillus flavus)

<400> 56

ggggataccg gagtgtaggt tcctagcgag cccaacctcc cacccgtgtt tactgtacct 60

tagttgcttc ggcgggcccg ccattcatgg ccgccggggg ctctcagccc cgggcccgcg 120

cccgccggag acaccacgaa ctctgtctga tctagtgaag tctgagttga ttgtatcgca 180

atcagttaaa actttcaaca atggatctct tggttccggc atcgatgaag aacgcagcga 240

aatgcgataa ctagtgtgaa ttgcagaatt ccgtgaatca tcgagtcttt gaacgcacat 300

tgcgccccct ggtattccgg ggggcatgcc tgtccgagcg tcattgctgc ccatcaagca 360

cggcttgtgt gttgggtcgt cgtcccctct ccggggggga cgggccccaa aggcagcggc 420

ggcaccgcgt ccgatcctcg agcgtatggg gctttgtcac ccgctctgta ggcccggccg 480

gcgcttgccg aacgcaaatc aatctttttc caggttgacc tcggatcagg tagggatacc 540

cgctgaactt aagcatatca ataggccgga gaaaatc 577

Claims (6)

1.一株高产黄曲霉毒素的真菌，其特征在于，所述真菌为黄曲霉(Aspergillusflavus)，菌株号为YZ-2-3，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.18545。

2.根据权利要求1所述的高产黄曲霉毒素的真菌，其特征在于，其碱基序列如SEQ IDNO:1所示。

3.权利要求1所述高产黄曲霉毒素的真菌在产生黄曲霉毒素中的应用，其特征在于，通过黄曲霉YZ-2-3发酵培养获得黄曲霉毒素；黄曲霉YZ-2-3菌株发酵液获得的方法为将黄曲霉YZ-2-3菌株接种于温度为20-35℃的液体MEA培养基中摇床培养7d,得到菌株发酵液。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述黄曲霉毒素为AFB₁、AFB₂、AFG₁和AFG₂中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述黄曲霉毒素为AFB₁和AFG₁。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，培养的温度为30℃。

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