CN101182357A - 河豚鱼皮活性胶原蛋白及其肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
河豚鱼皮的活性胶原蛋白及其肽的制备方法，是将河豚鱼皮剪成小块冷冻干燥粉碎，放入氯化钠溶液中搅拌12h，然后离心，弃上清液除去非胶原蛋白，将沉淀放入醋酸溶液中，在0～10℃下，加入胃蛋白酶，酶解，离心，上清液通过的超滤膜，上面部分冷冻干燥得胶原蛋白。将制备活性胶原蛋白后离心所剩下的沉淀洗至pH2.0～7.0，向沉淀中加入木瓜蛋白酶酶解，灭酶后离心上清液分别通过超滤膜，得到不同分子量范围的河豚鱼皮胶原蛋白肽，经冷冻干燥后得到淡黄色或白色粉状的河豚鱼皮胶原蛋白活性肽。所制得的胶原蛋白可用于医药、化工、食品等领域，河豚鱼皮胶原蛋白活性肽有较好的抗氧化性，发挥其清除自由基，降低衰老程度的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种来源于鱼的活性胶原蛋白及其肽的制备技术，特别是用微生物处理的技术领域。
背景技术
研究表明，活性胶原蛋白有着多种生理功能，其在医药、化工、食品等领域有着广泛的应用，其酶解产物胶原蛋白肽也具有多种生理功效，主要表现在抗氧化、降血压、降血脂、抗肿瘤等。因此人们对胶原蛋白及其肽类的研究开发相当关注。胶原蛋白的利用首先是从陆生动物开始的，但仅是陆生动物的胶原蛋白制品难以满足人们的需求，因此，近几年，人们把目光转向了胶原蛋白资源更丰富的水产动物，尤其是淡水以及海水鱼类。秦玉青等研究了鱿鱼皮胶原蛋白提取的最佳工艺条件(中医研究，2002，1：20-21)，王静凤等(中国专利申请号200710013140.2)提供了一种鱿鱼皮胶原蛋白活性肽的制备方法，他们都是单独的制备胶原蛋白或胶原蛋白活性肽，没有把二者制备的工艺结合起来，以达到对原料更充分的利用。
河豚鱼是琼目、河豚科的水产动物，它含有剧毒物质河豚鱼毒素，因此对它的开发利用存在一定的困难，目前对于河豚鱼的研究大都停留在河豚鱼毒素上，而对河豚鱼其它方面的研究涉猎的不多。陈丁丁等(中国专利申请号03152847.3)采用常规的制取明胶的方法制备河豚胶，并对其医药保健用途进行了研究，但没有进行河豚鱼皮胶原蛋白活性肽的提取研究。
发明内容
本发明利用无毒的河豚鱼皮，提供一种将河豚鱼皮活性胶原蛋白与其活性肽的结合起来制备的方法，达到对河豚鱼皮高的利用率，保持制备的胶原蛋白的结构及生理功能，制取高活性的河豚鱼胶原蛋白肽，不仅解决了河豚鱼下脚料的环境污染问题，而且提高了产品的附加值，拓宽河豚鱼的利用领域。
本发明的技术方案按如下所述实现：
(一)活性胶原蛋白的制取
1.原料处理
将河豚鱼皮剪成小块冷冻干燥，然后用粉碎机将其粉碎。
2.非胶原蛋白的去除
将冷冻干燥粉碎后的鱼皮放入5～100倍体积0.5～15％的氯化钠溶液中，在0～4℃下搅拌12h，然后在10000r/min、0～4℃条件下离心10～30min，弃去上清液，以除去非胶原蛋白，沉淀用于提取活性胶原蛋白。其中以粉碎鱼皮放入50～100倍体积5～15％的氯化钠溶液中，在0～4℃下搅拌12h为好。
3.活性胶原蛋白的提取
将除去非胶原蛋白的鱼皮放入5～100倍体积0.05～1％醋酸溶液中，在0～10℃的低温条件下，按1000～10000U/g底物的比例加入胃蛋白酶，酶解时间8～96h，然后在5000r/mim 0～5℃下离心10～30min。将上清液通过5000～100000Da的超滤膜，收集超滤的上面部分，在-20～-80℃下冷冻干燥。其中以除去非胶原蛋白的鱼皮放入20～100倍体积0.5～1.0％醋酸溶液中，在0～10℃的低温条件下，按3000～10000U/g底物的比例加入胃蛋白酶，酶解时间50～100h为好。得到的河豚鱼皮胶原蛋白色泽洁白，无酸味，略有轻微的腥味，纯度可达80％以上。所制得的胶原蛋白可用于医药、化工、食品等领域。离心所得到的沉淀用于制备胶原蛋白活性肽。
(二)胶原蛋白肽的制备
1.原料处理
将(一)中制备活性胶原蛋白后离心所剩下的沉淀用去离子水洗至pH2.0～7.0，在4000r/min条件下离心10min，弃上清，沉淀用于胶原蛋白肽的制备。
2.胶原蛋白肽的制备
在20～85℃、pH值2.0～10.0的条件下，按1000～12000U/g底物的比例向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶解0.5～10.0h后在80～120℃下灭酶2～5min。在4000r/min下离心10～20min，上清液分别通过10000Da、5000Da、3000Da、1000Da的超滤膜，得到10000以上、5000～10000、3000～5000、1000～3000、1000以下等不同分子量范围的河豚鱼皮胶原蛋白肽。经喷雾干燥或冷冻干燥后得到淡黄色或白色粉状、复溶性好、略带腥味的河豚鱼皮胶原蛋白活性肽。其中以在40～85℃、pH值6.0～10.0的条件下，按3000-10000U/g底物的比例向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶解1.5-10.0h为好。
本发明以无毒河豚鱼皮为原料，以酶解物队羟自由基清除率为指标，从木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶中优选出最高清除率的一种酶为木瓜蛋白酶。
本发明制得的河豚鱼皮胶原蛋白活性肽有较好的抗氧化性，可用于食品、药品及化妆品的有效成分，发挥其清除自由基，降低衰老程度的作用。
下面对河豚鱼皮胶原蛋白活性肽的体外抗氧化性作进一步的说明。
①清除H0·自由基的能力：本实验以Fenton体系检测了河豚鱼皮胶原蛋白太清除H0·自由基的能力，结果表明，采用木瓜蛋白酶制得的河豚鱼皮胶原蛋白肽有显著的清除HO·自由基的能力，其中分子量为3000-5000、1000-3000、1000以下分子量范围的清除率最高，IC50值分别为0.4425mg/ml、0.3761mg/ml、0.373mg/ml，均小于对照维生素C的IC50值0.9289mg/ml。说明该肽的清除HO·自由基的能力比维生素C要强。
②清除DPPH·自由基的能力：二苯代苦味酰自由基(DPPH·)是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能将其清除，则提示受试物具有降低羟自由基，烷自由基或过氧化自由基的有效浓度和打断脂质过氧化链反应的作用。实验结果表明，河豚鱼皮胶原蛋白活性肽有较强的清除DPPH·自由基的能力。其中分子量为3000-5000、1000-3000、1000以下分子量范围的清除率最高，IC50值分别为3.0650mg/ml、2.9609mg/ml、2.4651mg/ml，小于维生素E的IC50值4.7329mg/ml，说明该肽的清除DPPH·自由基的能力比维生素E要强。
③实验还表明河豚鱼皮胶原蛋白肽具有一定的清除O2-·自由基和还原能力。
本发明的创新性如下所述：
(一)本发明的一大特点是注重提取的目的性与过程性的结合
1.在原料处理的过程中，先把河豚鱼皮剪成小块然后冷冻干燥，这样节省了原料处理的时间，并且使干燥后的鱼皮粉碎效果好。
2.在制取活性胶原蛋白的过程中，整个过程都是在低温条件下进行，避免了高温对胶原蛋白的破坏作用，确保所提取胶原的结构完整性和性能优良性。
3.制备胶原蛋白活性肽所用的原料是制备活性胶原蛋白的河豚鱼皮残渣，即将河豚鱼胶原蛋白的提取与河豚鱼胶原蛋白活性肽的制备结合在一起，不仅节省了处理原料的时间和费用，而且使原料得到了充分的利用。
4.经优选，采用木瓜蛋白酶制备胶原蛋白肽，使制取的活性肽具有更高的抗氧化活性。
(二)首次用河豚鱼鱼皮制取胶原蛋白活性肽
下面是本发明实施例。
实施例一
1.活性胶原蛋白的制备
将冷冻干燥的鱼皮粉碎后称取10g放入50ml、0.5％的氯化钠溶液中，在0℃下搅拌12h，然后在10000r/min、0℃条件下离心10min，弃上清液，以除去非胶原蛋白，沉淀用于提取活性胶原蛋白。将除去非胶原蛋白的鱼皮放入50ml、0.05％醋酸溶液中，在0℃的低温条件下，加入100000U的胃蛋白酶，酶解时间96h，然后在5000r/min 0℃下离心30min。将上清液通过5000的超滤膜，收集超滤的上面部分，在-20℃下冷冻干燥。得到的河豚鱼皮胶原蛋白色泽洁白，无酸味，略有轻微的腥味，纯度可达80％以上。所制得的胶原蛋白可用于医药、化工、食品等领域。离心所得到的沉淀用于制备胶原蛋白活性肽。
2.胶原蛋白活性肽的制备
将制备活性胶原蛋白后离心所剩下的沉淀用去离子水洗至pH2.0，在4000r/min条件下离心10min，弃上清液，沉淀用于胶原蛋白活性肽的制备。在20℃、pH2.0的条件下，按1000U/g底物的比例向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶解10h后，在80℃条件下灭酶30min，在4000r/min下离心10min，上清液分别通过10000Da、5000Da、3000Da、1000Da的超滤膜，得到10000以上、5000～10000、3000～5000、1000～3000、1000以下等不同分子量范围的河豚鱼皮胶原蛋白肽。经喷雾干燥后得到淡黄色或白色粉状、复溶性好、略带腥味的河豚鱼皮胶原蛋白活性肽。
实施例二
1.活性胶原蛋白的制备
将冷冻干燥的鱼皮粉碎后称取10g放入1000ml 15％的氯化钠溶液中，在4℃下搅拌12h，然后在10000r/min、4℃条件下离心30min，弃上清液，以除去非胶原蛋白，沉淀用于提取活性胶原蛋白。将除去非胶原蛋白的鱼皮放入1000ml1％的醋酸溶液中，在10℃的低温条件下，加入10000U的胃蛋白酶，酶解时间96h，然后在5000r/min、5℃下离心10min。将上清液通过5000的超滤膜，收集超滤的上面部分，在-80℃下冷冻干燥。得到的河豚鱼皮胶原蛋白色泽洁白，无酸味，略有轻微的腥味，纯度可达80％以上。所制得的胶原蛋白可用于医药、化工、食品等领域。离心所得到的沉淀用于制备胶原蛋白活性肽。
2.胶原蛋白活性肽的制备
将制备活性胶原蛋白后离心所剩下的沉淀用去离子水洗至pH7.0，在4000r/min条件下离心10min，弃上清液，沉淀用于胶原蛋白活性肽的制备。在85℃、pH10.0的条件下，按1000U/g底物的比例向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶解0.5h后，在90℃条件下灭酶20min，在4000r/min下离心20min，上清液分别通过10000Da、5000Da、3000Da、1000Da的超滤膜，得到10000以上、5000～10000、3000～5000、1000～3000、1000以下等不同分子量范围的河豚鱼皮胶原蛋白肽。经喷雾干燥后得到淡黄色或白色粉状、复溶性好、略带腥味的河豚鱼皮胶原蛋白活性肽。
实施例三
活性胶原蛋白的制备
1.活性胶原蛋白的制备
将冷冻干燥的鱼皮粉碎后称取10g放入500ml、5％的氯化钠溶液中，在2℃下搅拌12h，然后在10000r/min、2℃条件下离心20min，弃上清液，以除去非胶原蛋白，沉淀用于提取活性胶原蛋白。将除去非胶原蛋白的鱼皮放入500ml、0.5％醋酸溶液中，在4℃的低温条件下，加入60000U的胃蛋白酶，酶解时间48h，然后在5000r/min 3℃下离心20min。将上清液通过10000的超滤膜，收集超滤的上面部分，在-45℃下冷冻干燥。得到的河豚鱼皮胶原蛋白色泽洁白，无酸味，略有轻微的腥味，纯度可达80％以上。所制得的胶原蛋白可用于医药、化工、食品等领域。离心所得到的沉淀用于制备胶原蛋白活性肽。
2.胶原蛋白活性肽的制备
将制备活性胶原蛋白后离心所剩下的沉淀用去离子水洗至pH3.0，在4000r/min条件下离心10min，弃上清液，沉淀用于胶原蛋白活性肽的制备。在65℃、pH7.0的条件下，按6000U/g底物的比例向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶解2h后，在100℃条件下灭酶5min，在4000r/min下离心10min，上清液分别通过10000Da、5000Da、3000Da、1000Da的超滤膜，得到10000以上、5000～10000、3000～5000、1000～3000、1000以下等不同分子量范围的河豚鱼皮胶原蛋白肽。经喷雾干燥后得到淡黄色或白色粉状、复溶性好、略带腥味的河豚鱼皮胶原蛋白活性肽。
实施例四
1.活性胶原蛋白的制备
将冷冻干燥的鱼皮粉碎后称取20g放入1400ml、10％的氯化钠溶液中，在2℃下搅拌12h，然后在10000r/min、4℃条件下离心20min，弃上清液，以除去非胶原蛋白，沉淀用于提取活性胶原蛋白。将除去非胶原蛋白的鱼皮放入1000ml、0.5％醋酸溶液中，在4℃的低温条件下，加入80000U的胃蛋白酶，酶解时间72h，然后在5000r/min 2℃下离心30min。将上清液通过30000的超滤膜，收集超滤的上面部分，在-65℃下冷冻干燥。得到的河豚鱼皮胶原蛋白色泽洁白，无酸味，略有轻微的腥味，纯度可达80％以上。所制得的胶原蛋白可用于医药、化工、食品等领域。离心所得到的沉淀用于制备胶原蛋白活性肽。
2.胶原蛋白活性肽的制备
将制备活性胶原蛋白后离心所剩下的沉淀用去离子水洗至pH4.0，在4000r/min条件下离心10min，弃上清液，沉淀用于胶原蛋白活性肽的制备。在70℃、pH6.0的条件下，按7000U/g底物的比例向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶解5h后，在100℃条件下灭酶2min，在4000r/min下离心25min，上清液分别通过10000Da、5000Da、3000Da、1000Da的超滤膜，得到10000以上、5000～10000、3000～5000、1000～3000、1000以下等不同分子量范围的河豚鱼皮胶原蛋白肽。经喷雾干燥后得到淡黄色或白色粉状、复溶性好、略带腥味的河豚鱼皮胶原蛋白活性肽。
实施例五
1.活性胶原蛋白的制备
将冷冻干燥的鱼皮粉碎后称取20g放入800ml 8％的氯化钠溶液中，在1℃下搅拌12h，然后在10000r/min、4℃条件下离心20min，弃上清液，以除去非胶原蛋白，沉淀用于提取活性胶原蛋白。将除去非胶原蛋白的鱼皮放入1200ml1％醋酸溶液中，在4℃的低温条件下，加入160000U的胃蛋白酶，酶解时间64h，然后在5000r/min、3℃下离心20min。将上清液通过50000的超滤膜，收集超滤的上面部分，在-45℃下冷冻干燥。得到的河豚鱼皮胶原蛋白色泽洁白，无酸味，略有轻微的腥味，纯度可达80％以上。所制得的胶原蛋白可用于医药、化工、食品等领域。离心所得到的沉淀用于制备胶原蛋白活性肽。
2.胶原蛋白活性肽的制备
将制备活性胶原蛋白后离心所剩下的沉淀用去离子水洗至pH5.0，在4000r/min条件下离心10min，弃上清液，沉淀用于胶原蛋白活性肽的制备。在55℃、pH7.5的条件下，按6000U/g底物的比例向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶解1.5h后，在80℃条件下灭酶25min，在4000r/min下离心15min，上清液分别通过10000Da、5000Da、3000Da、1000Da的超滤膜，得到10000以上、5000～10000、3000～5000、1000～3000、1000以下等不同分子量范围的河豚鱼皮胶原蛋白肽。经喷雾干燥后得到淡黄色或白色粉状、复溶性好、略带腥味的河豚鱼皮胶原蛋白活性肽。
实施例六
1.活性胶原蛋白的制备
将冷冻干燥的鱼皮粉碎后称取50g放入1000ml、12％的氯化钠溶液中，在2℃下搅拌12h，然后在10000r/min、2℃条件下离心30min，弃上清液，以除去非胶原蛋白，沉淀用于提取活性胶原蛋白。将除去非胶原蛋白的鱼皮放入1500ml、0.2％醋酸溶液中，在4℃的低温条件下，加入150000U的胃蛋白酶，酶解时间90h，然后在5000r/min 3℃下离心10min。将上清液通过10000的超滤膜，收集超滤的上面部分，在-75℃下冷冻干燥。得到的河豚鱼皮胶原蛋白色泽洁白，无酸味，略有轻微的腥味，纯度可达80％以上。所制得的胶原蛋白可用于医药、化工、食品等领域。离心所得到的沉淀用于制备胶原蛋白活性肽。
2.胶原蛋白活性肽的制备
将制备活性胶原蛋白后离心所剩下的沉淀用去离子水洗至pH6.0，在4000r/min条件下离心10min，弃上清液，沉淀用于胶原蛋白活性肽的制备。在75℃、pH6.0的条件下，按10000U/g底物的比例向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶解0.5h后，在80℃条件下灭酶30min，在4000r/min下离心10min，上清液分别通过10000Da、5000Da、3000Da、1000Da的超滤膜，得到10000以上、5000～10000、3000～5000、1000～3000、1000以下等不同分子量范围的河豚鱼皮胶原蛋白肽。经喷雾干燥后得到淡黄色或白色粉状、复溶性好、略带腥味的河豚鱼皮胶原蛋白活性肽。
实施例七
1.活性胶原蛋白的制备
将冷冻干燥的鱼皮粉碎后称取10g放入600ml、5％的氯化钠溶液中，在4℃下搅拌12h，然后在10000r/min、0℃条件下离心20min，弃上清液，以除去非胶原蛋白，沉淀用于提取活性胶原蛋白。将除去非胶原蛋白的鱼皮放入700ml、0.3％醋酸溶液中，在8℃的低温条件下，加入90000U的胃蛋白酶，酶解时间24h，然后在5000r/min 3℃下离心20min。将上清液通过100000的超滤膜，收集超滤的上面部分，在-45℃下冷冻干燥。得到的河豚鱼皮胶原蛋白色泽洁白，无酸味，略有轻微的腥味，纯度可达80％以上。所制得的胶原蛋白可用于医药、化工、食品等领域。离心所得到的沉淀用于制备胶原蛋白活性肽。
2.胶原蛋白活性肽的制备
将制备活性胶原蛋白后离心所剩下的沉淀用去离子水洗至pH6.5，在4000r/min条件下离心10min，弃上清液，沉淀用于胶原蛋白活性肽的制备。在45℃、pH8.0的条件下，按3000U/g底物的比例向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶解10h后，在90℃条件下灭酶20min，在4000r/min下离心10min，上清液分别通过10000Da、5000Da、3000Da、1000Da的超滤膜，得到10000以上、5000～10000、3000～5000、1000～3000、1000以下等不同分子量范围的河豚鱼皮胶原蛋白肽。经喷雾干燥后得到淡黄色或白色粉状、复溶性好、略带腥味的河豚鱼皮胶原蛋白活性肽。
实施例八
1.活性胶原蛋白的制备
将冷冻干燥的鱼皮粉碎后称取10g放入900ml 5％的氯化钠溶液中，在2℃下搅拌12h，然后在10000r/min 2℃条件下离心20min，弃上清液，以除去非胶原蛋白，沉淀用于提取活性胶原蛋白。将除去非胶原蛋白的鱼皮放入500ml、0.5％醋酸溶液中，在4℃的低温条件下，加入80000U的胃蛋白酶，酶解时间88h，然后在5000r/min 4℃下离心20min。将上清液通过10000的超滤膜，收集超滤的上面部分，在-45℃下冷冻干燥。得到的河豚鱼皮胶原蛋白色泽洁白，无酸味，略有轻微的腥味，纯度可达80％以上。所制得的胶原蛋白可用于医药、化工、食品等领域。离心所得到的沉淀用于制备胶原蛋白活性肽。
2.胶原蛋白活性肽的制备
将制备活性胶原蛋白后离心所剩下的沉淀用去离子水洗至pH5.5，在4000r/min条件下离心10min，弃上清液，沉淀用于胶原蛋白活性肽的制备。在60℃、pH7.0的条件下，按5000U/g底物的比例向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶解3h后，在80℃条件下灭酶30min，在4000r/min下离心10min，上清液分别通过10000Da、5000Da、3000Da、1000Da的超滤膜，得到10000以上、5000～10000、3000～5000、1000～3000、1000以下等不同分子量范围的河豚鱼皮胶原蛋白肽。经喷雾干燥后得到淡黄色或白色粉状、复溶性好、略带腥味的河豚鱼皮胶原蛋白活性肽。
Claims (4)
1.一种胶原蛋白、及其肽的制备方法，其特征在于河豚鱼皮的活性胶原蛋白及其肽的制备方法，工艺操作步骤为：
一.活性胶原蛋白的制取：
(1)原料处理：将河豚鱼皮剪成小块冷冻干燥，然后用粉碎机粉碎；
(2)非胶原蛋白的去除：将冷冻干燥粉碎后的鱼皮放入5-100倍体积0.5～15％的氯化钠溶液中，在0～4℃下搅拌12h，然后在10000r/min、0～4℃下离心10～30min，弃上清液，以除去非胶原蛋白，沉淀用于提取活性胶原蛋白；
(3)活性胶原蛋白的提取：将除去非胶原蛋白的鱼皮放入5～100倍体积的0.05～1％醋酸溶液中，在0～10℃下，按1000～10000U/g底物的比例加入胃蛋白酶，酶解8～96h，在5000r/min、0～5℃下离心10～30min，将上清液通过5000～100000Da的超滤膜，收集超滤的上面部分，在-20～-80℃下冷冻干燥，得到的河豚鱼皮胶原蛋白；色泽洁白，无酸味，略有轻微的腥味，纯度可达80％以上；
二.胶原蛋白肽的制备：
(1).原料处理：将(一)中制备活性胶原蛋白离心后所得到的沉淀用去离子水洗至pH2.0～7.0，4000r/min离心10min，沉淀用于胶原蛋白肽的制备；
(2).胶原蛋白肽的制取：在20～85℃、pH2.0～10.0下，按1000～12000U/g底物的比例向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶解0.5～10h，后80～120℃下灭酶2～5min，在4000r/min下离心10～20min，上清液分别通过10000Da、5000Da、3000Da、1000Da的超滤膜，得到10000以上、5000～10000、3000～5000、1000～3000、1000以下不同分子量范围的河豚鱼皮胶原蛋白肽，经喷雾干燥或冷冻干燥后得到淡黄色或白色粉状、复溶性好、略带腥味的河豚鱼皮胶原蛋白活性肽。
2.根据权利要求1所述胶原蛋白、及其肽的制备方法，其特征在于活性胶原蛋白的制取的(2)非胶原蛋白的去除的步骤中，粉碎鱼皮放入50～100倍体积5～15％的氯化钠溶液中，在0～4℃下搅拌12h。
3.根据权利要求1所述胶原蛋白、及其肽的制备方法，其特征在于活性胶原蛋白的制取的(3)活性胶原蛋白的提取步骤中，除去非胶原蛋白的鱼皮放入20～100倍体积0.5～1.0％醋酸溶液中，在0～10℃的低温条件下，按3000～10000U/g底物的比例加入胃蛋白酶，酶解时间50～100h。
4.根据权利要求1所述胶原蛋白、及其肽的制备方法，其特征在于胶原蛋白肽的制备的(2).胶原蛋白肽的制取步骤中，在40～85℃、pH值6.0～10.0的条件下，按3000～10000U/g底物的比例向沉淀中加入木瓜蛋白酶，酶解1.5～10.0h。
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