CN106975099A - 一种制备胶原蛋白海绵的方法 - Google Patents

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Abstract

一种胶原蛋白海绵的制备方法,是将胶原蛋白海绵原料在透析过程中进行化学交联改性,形成胶原凝胶,这个过程不仅完成了胶原的透析、交联过程,而且能将多余的交联剂清洗出来,最后将得到的凝胶经均质匀浆后,注入适合的模具,进行冷冻干燥。该工艺所得产品纯度高,灰分含量低,降解时间适中,具有均匀的多孔结构、亲水强、吸水率大及良好的止血性能,解决了传统胶原海绵力学性能差、在应用过程中容易塌陷,难以维持其固有形态等缺陷。该制备方法产能高、工艺稳定,制得的胶原蛋白海绵可广泛应用于创伤、外科手术创口的止血和修复,具有良好的应用前景。

Description

一种制备胶原蛋白海绵的方法
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域,尤其涉及一种制备胶原蛋白海绵的方法。
背景技术
胶原是细胞外基质(Extracellular Matrix)的主要成分,是动物体内最多的蛋白质。胶原具有抗原性低、与细胞亲合力强、与血小板产生凝血作用等特点,因而在医药领域广泛应用。胶原蛋白海绵的主要成份是胶原蛋白,它与人体胶原蛋白结构相似,很适合人体器官的修复和再生。胶原蛋白能促进伤口愈合和肉芽组织的生长,具有良好的止血和填充作用,可用于促进创面愈合、止血、手术残腔填充等。然而,单独以胶原制备的胶原蛋白海绵的力学性能、热稳定性、抗酶降解能力等方面还常常不能满足应用的要求;特别是胶原的低力学性能,通常会使它用于制备的组织工程支架无法在较长的时间内维持较为固定的形态。胶原蛋白改性的方法很多,例如中国发明专利公开号第CN101234216A报道胶原–壳聚糖共混改性虽然能够提高胶原的力学强度和热学性能,但由于是氢键等次价键相互作用的结果,改善程度有限。又如中国发明专利公开号第CN 104558675 A号,公开了一种止血胶原蛋白海绵的制造工艺,其制备方式为调节胶原蛋白溶液的pH、温度、盐浓度,使胶原分子间通过电荷作用聚集,所得组装胶原再经冷冻干燥后制成胶原蛋白海绵,再经热交联即得微纤维止血胶原海绵。但其在体内降解周期较长,需15到30周的降解时间,且制备工艺繁琐,安全性不高。
发明内容
本发明解决的技术问题在于:提供一种制备胶原蛋白海绵的方法,采用化学交联,但在透析过程中就及时有效地将游离交联剂洗脱,改性胶原蛋白能获得均匀一致的交联,可有效调节、改进胶原的性质,提高其交联度、力学性能及生物相容性;同时有效避免交联剂所带来的生物毒性,在海绵冻干后无需再进行交联剂清洗再冻干等复杂工艺。此技术克服现有传统胶原蛋白海绵力学性能差、在应用过程中容易塌陷,难以维持其固有形态等缺陷,以及现有改性的胶原蛋白海绵在体内降解周期较长,制备工艺繁琐,安全性不高等缺陷。
本发明的技术方案:提供一种制备胶原蛋白海绵的方法,包括以下步骤:
步骤1:取胶原蛋白透析液与交联剂混合形成透析外液,将胶原蛋白置于透析外液中进行透析同时对胶原进行交联,得到均匀的胶原凝胶;
步骤2:以胶原蛋白透析液清洗所述第1步骤获得的胶原凝胶,洗脱残余交联剂,以获得纯净的胶原凝胶;
步骤3:对所述纯净的胶原凝胶进行均质匀浆,使之乳化发泡,形成多孔状胶原凝胶;
步骤4:注模成型,冷冻干燥后获得胶原海绵。
优选地,所述步骤1中,所述胶原蛋白透析液是注射用水;所述交联剂为尼京平、戊二醛、甲醛、碳化二亚胺、改性戊二醛中的一种或几种的混合物;所述交联剂在透析外液中的初始体积比浓度为0.005%~0.5%。
优选地,所述步骤1中,将胶原蛋白按胶原凝胶与透析外液体积比为1:5~1:20的用量置于透析外液中进行透析同时对胶原进行交联;在4~10℃下静置孵化12~48h,每6~8h更换透析外液,得到均匀的胶原凝胶。
作为优选,所述的胶原凝胶浓度为0.05%~2%。
优选地,所述步骤2中,利用胶原蛋白透析液进行清洗;更换纯透析液洗脱4~8次,每6~8h更换透析液,更换的新透析液不含交联剂,多次置换以利于洗脱去除游离的交联剂。
优选地,所述步骤3中,使用均质匀浆机进行均质匀浆,转速为9000~15000rpm,使之充分机械乳化发泡,然后再用搅拌器进行低速机械搅拌1~4小时,搅拌速度为700~1500rpm。
优选地,所述步骤4中,将发泡后的胶原蛋白乳化液注入模具,将模具注满为止,然后震荡使之表面平滑,在室温放置20~80min后,再放入冷冻干燥机进行冷冻干燥,所述冷冻干燥时间为24h-48h。
本发明的制备胶原蛋白海绵的方法,进一步包括步骤5:对胶原海绵进行辐照灭菌。
本发明还提供一种胶原蛋白海绵,产品纯度高达99%以上,灰分含量低于0.5%,具有均匀的多孔结构,吸水率达50~80倍,止血时间在5分钟以内,在机体内4~8周能完全降解。
所述的胶原蛋白海绵,是由上述的制备方法制成的。
本发明的技术效果:本发明在透析过程中进行化学交联处理,不仅达到了交联的目的,而且将游离的交联剂及时清除,减少游离交联剂对机体产生的生物毒性,有效克服了化学交联缺点,并且简化了海绵制备工艺。胶原凝胶经均质匀浆,机械乳化发泡后,注入适合的模具,再通过冷冻干燥制得胶原蛋白海绵。将此交联方式与冷冻干燥技术相结合,改善胶原材料的机械强度、热稳定性及降解性能,获得外观形貌良好,且有较合适的体内降解时间,安全有效的胶原蛋白海绵。本发明的制备方法产能高、工艺稳定,制得的胶原蛋白海绵可广泛应用于创伤、外科手术创口的止血和修复,具有良好的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例的制备胶原海绵的流程图。
图2是本发明实施例的胶原蛋白海绵的微观结构,图2-1和图2-2分别对应放大倍数为500倍和100倍的SEM电镜扫描图。
图3是本发明实施例的胶原蛋白海绵在动物体内降解对比图:其中图 3-1是本发明实施例所制备的胶原蛋白海绵植入动物体内降解7天10×5 HE染色;图 3-2是植入动物体内降解15天10×20三色染;图 3-3是植入动物体内降解60天10×10三色染。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
为了说明本发明所述的技术方案,下面通过具体实施例来进行说明。
本发明涉及一种胶原蛋白海绵的制备方法(参照图1)。本发明胶原蛋白海绵原料在透析过程中进行化学交联改性,形成胶原凝胶,这个过程不仅完成了胶原的透析、交联过程,而且能将游离交联剂洗脱出来,最后将得到的凝胶经均质匀浆后,注入适合的模具,进行冷冻干燥。该工艺所得产品纯度高达99%以上,灰分含量低于0.5%,具有均匀的多孔结构(参照图2-1、2-2),亲水性强、吸水率可达50~80倍,能及时有效止血,止血时间在5分钟以内,降解时间适中,在机体内4~8周能完全降解(参照图3)。解决了传统胶原蛋白海绵力学性能差、在应用过程中容易塌陷,难以维持其固有形态等缺陷。该制备方法产能高、工艺稳定,制得的胶原蛋白海绵可广泛应用于创伤、外科手术创口的止血和修复,具有良好的应用前景。
本发明实施例所获得的胶原蛋白海绵,其具备多孔结构,参照图2-1、2-2,此两图为海绵的切面图,可以看出海绵为网状结构,空间分布均匀,孔隙分布均匀,经检测分析得出孔径大小为100~300μm。其这种多孔结构具有较好的力学性能及有效的止血功能。若海绵孔径过大,会导致其机械性能降低,容易形成二次出血;孔径过小,使其单位体积内材料增多,不利于后期止血材料的体内降解。
本发明实施例所指灰分是指胶原蛋白海绵经高温煅烧后残留的无机盐成分。
如图1的所示,本发明实施例的制备胶原蛋白海绵的方法,包括下列步骤1~ 5。
步骤1:进行透析同时交联的工艺,得到均匀的胶原凝胶。
该步骤1具体为:取胶原蛋白透析液与交联剂混合形成透析外液。其中胶原蛋白透析液为注射用水,用量为透析内液体积的5~20倍。透析内液即为要进行透析工艺的胶原蛋白原液。交联剂为尼京平、戊二醛、甲醛、碳化二亚胺、改性戊二醛中的一种或几种的混合物。交联剂在透析外液中的初始质量体积比浓度为0.005%~0.5%。将胶原蛋白按胶原凝胶与透析外液体积比为1:5~1:20的用量置于透析外液中进行透析同时对胶原进行交联;在4~10℃下静置孵化12~48h,每6~8h更换透析外液,得到均匀的胶原凝胶。所述的胶原凝胶质量分数为0.05%~2%。
步骤2:洗脱游离交联剂,获得不含游离交联剂的胶原蛋白。具体地,利用胶原蛋白透析液进行清洗,具体是更换纯透析液洗脱4~8次,每6~8h更换透析液,更换的新透析液不含交联剂,多次置换以利于洗脱去除游离的交联剂。
步骤3:使用均质匀浆机进行均质匀浆,转速为9000~15000rpm,使之充分机械乳化发泡,然后再用搅拌器进行低速机械搅拌1~4小时,速度为700~1500rpm。
步骤4:注模成型,从而获得所需要的胶原蛋白海绵。具体是将发泡后的胶原蛋白乳化液注入模具,将模具注满为止,然后震荡使之表面平滑,在室温放置20~80min后,再放入冷冻干燥机进行冷冻干燥,所述冷冻干燥时间为24h-48h。
步骤5:包装灭菌。具体是密封包装后,进行辐照灭菌。
本发明实施例的制备胶原蛋白海绵的方法,是针对现有技术存在的不足和缺陷,在透析过程中进行化学交联处理,不仅达到了交联的目的,而且将游离的交联剂及时清除,减少游离交联剂对人体产生的副作用,并且简化了海绵制备工艺。胶原凝胶经均质匀浆,乳化发泡后,注入适合的模具,再通过冷冻干燥制得胶原蛋白海绵。将此交联方式与冷冻干燥技术相结合,改善了胶原材料的机械性、热稳定性及降解性能,获得外观形貌良好,且有较合适的体内降解时间,安全有效的胶原蛋白海绵。
实施例1
生产胶原蛋白海绵,具体步骤如下:
(1)胶原蛋白原液体积为200ml,其质量分数为2%,将其装入透析袋,将透析袋两端密封,置于4~10℃4L的透析外液进行透析24h,即可得已交联的胶原凝胶。透析外液中含甲醛和戊二醛浓度均为0.5%;
(2)清洗,以注射用水为透析液,水温保持在4~10℃,更换4次,每次间隔6h;
(3)均质匀浆,均质匀浆机转速为9000rpm,乳化发泡后,然后再用搅拌器进行低速机械搅拌1小时,速度为7000rpm,即可得乳化的胶原浊液;
(4)入模,将模具注满为止,然后震荡使之表面平滑,在室温放置30min后,再放入冷冻干燥机进行冷冻干燥48h;
(5)用铝箔袋密封包装后,进行辐照灭菌。
实施例2
(1)胶原蛋白原液体积为200ml,其质量分数为0.05%,将其装入透析袋,将透析袋两端密封,置于4~10℃1L的透析外液进行透析24h,即可得已交联的胶原凝胶。透析外液中甲醛和戊二醛浓度均为0.005%。
(2)清洗,以注射用水为透析液,水温保持在4~10℃,更换8次,每次间隔8h;
(3)均质匀浆,均质匀浆机转速为15000rpm,乳化发泡后,然后再用搅拌器进行低速机械搅拌4小时,速度为1500rpm,即可得乳化的胶原浊液;
(4)入模,将模具注满为止,然后震荡使之表面平滑,在室温放置80min后,再放入冷冻干燥机进行冷冻干燥24h;
(5)用铝箔袋密封包装后,进行辐照灭菌。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种制备胶原蛋白海绵的方法,包括以下步骤:
步骤1:取胶原蛋白透析液与交联剂混合形成透析外液,将胶原蛋白置于透析外液中进行透析同时对胶原进行交联,得到均匀的胶原凝胶;
步骤2:以胶原蛋白透析液清洗所述第1步骤获得的胶原凝胶,脱除残余交联剂,以获得纯净的胶原凝胶;
步骤3:对所述纯净的胶原凝胶进行均质匀浆,使之乳化发泡,形成多孔状胶原凝胶;
步骤4:注模成型,冷冻干燥后获得胶原海绵。
2.如权利要求1所述的制备胶原蛋白海绵的方法,其特征在于,所述步骤1中,所述胶原蛋白透析液是注射用水;所述交联剂为尼京平、戊二醛、甲醛、碳化二亚胺、改性戊二醛中的一种或几种的混合物;所述交联剂在透析外液中的初始体积比浓度为0.005%~0.5%。
3.如权利要求2所述的制备胶原蛋白海绵的方法,其特征在于,所述步骤1中,将胶原蛋白按体积比为1:5~1:20的用量置于透析外液中进行透析同时对胶原进行交联;在4~10℃下静置孵化12~48h,每6~8h更换透析外液,得到均匀的胶原凝胶。
4.如权利要求2所述的制备胶原蛋白海绵的方法,其特征在于,所述步骤1中,所述的胶原凝胶质量分数为0.05%~2%。
5.如权利要求2所述的制备胶原蛋白海绵的方法,其特征在于,所述步骤2中,利用胶原蛋白透析液进行清洗;更换纯透析液洗脱4~8次,每6~8h更换透析液,更换的新透析液不含交联剂,多次置换以利于洗脱去除游离的交联剂。
6.如权利要求1所述的制备胶原蛋白海绵的方法,其特征在于,所述步骤3中,使用均质匀浆机进行均质匀浆,转速为9000~15000rpm,使之充分机械乳化发泡,然后再用搅拌器进行低速机械搅拌1~4小时,搅拌速度为700~1500rpm。
7.如权利要求1所述的制备胶原蛋白海绵的方法,其特征在于,所述步骤4中,将发泡后的胶原蛋白乳化液注入模具,将模具注满为止,然后震荡使之表面平滑,在室温放置20~80min后,再放入冷冻干燥机进行冷冻干燥,所述冷冻干燥时间为24h-48h。
8.如权利要求1所述的制备胶原蛋白海绵的方法,其特征在于,进一步包括步骤5:对胶原海绵进行辐照灭菌。
9.一种胶原蛋白海绵,产品纯度高达99%以上,灰分含量低于0.5%,具有均匀的多孔结构,吸水率达50~80倍,止血时间在5分钟以内,在机体内4~8周能完全降解。
10.如权利要求9所述的胶原蛋白海绵,是由如权利要求1-8中任一项所述的制备方法制成的;所述胶原蛋白海绵为网状结构,孔径大小为100~300μm,在空间分布均匀。
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