CN112587647B - 鱼卵糖蛋白在保肝护肝制品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鱼卵糖蛋白在保肝护肝制品中的应用。其制备方法为将鱼卵脱脂干燥后，加入蛋白酶进行水解，超滤脱盐后得到鱼卵糖蛋白。本发明提供了鱼卵糖蛋白在保肝护肝制品中的应用，即通过给予有效量的鱼卵糖蛋白来预防和治疗化学物质所导致的肝损伤，从而弥补了当下肝损伤预防和治疗制剂的不足。
Description
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鱼卵糖蛋白在保肝护肝制品中的应用。
背景技术：
肝脏是机体最大的实质性器官，承担着营养物质的生物转化和排泄。随着化学物质的滥用和环境的日益恶劣，化学性肝损伤已成为我国的一大健康问题。肝损伤后，临床上轻者表现为血清转氨酶、胆红素升高等，而长期的肝损伤会导致肝脏炎症、纤维化、肝硬化和肝癌。研究表明，尽管肝损伤可能由多种治病因素造成，如酒精、药物、化学毒物等，但其具有相似的作用机制：化学物质或酒精作用于肝脏时，造成肝细胞坏死，肝脏中谷丙/谷草转氨酶大量释放到血液中。根据世界卫生组织的统计显示，全球有超过10％的人收到肝损伤的困扰，但目前对于肝损伤的治疗手段仍十分有限。
我国是世界第一水产大国，水产品总量超过6000万吨/年。鱼类作为水产养殖中的重要品种，在加工过程中产生大量的副产物。作为加工最重要的副产物，鱼卵重量能达到鱼总重的25％，但其往往用于生产鱼子酱或鱼粉等低值产品。研究表明，鱼卵中含有大量结构新颖的生物活性物质，例如多不饱和脂肪酸，卵磷脂，糖蛋白等。糖蛋白是由短的寡糖链与蛋白质共价相连构成的分子，研究证实其在改善心血管疾病、骨折愈合和炎症方面具有优越的生物活性。
目前关于鱼卵综合利用及活性物质提取方面已有报道，主要有磷脂及胶原蛋白的提取。在活性应用方面，公开号为CN103114117B的专利公开了鱼卵糖蛋白的制备方法及在骨质疏松中的应用。但尚未见鱼卵糖蛋白在保肝护肝领域中的相关报道。
发明内容：
本发明要解决的技术问题是全球有超过10％的人收到肝损伤的困扰，但目前对于肝损伤的治疗手段仍十分有限；而鱼卵作为鱼类加工过程中产生大量的副产物，往往用于生产鱼子酱或鱼粉等低值产品。
为解决上述问题，本发明提供了鱼卵糖蛋白在保肝护肝制品中的应用，即通过给予有效量的鱼卵糖蛋白来预防和治疗化学物质所导致的肝损伤，从而弥补当下肝损伤预防和治疗制剂的不足，
为达到上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：鱼卵糖蛋白在保肝护肝制品中的应用。谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)是肝功能损害最敏感的检测指标，当肝细胞损伤时，大量ALT和AST被释放，导致其血清水平升高。发明人研究发现鱼卵糖蛋白中的成分，特别是唾液酸是一种优秀的自由基清除剂，可以有效的清除化学毒物产生的自由基，从而降低小鼠血清ALT和AST水平，提升机体抗氧化能力，降低肝脏坏死面积；对于由四氯化碳导致的肝损伤模型，具有明显的肝保护作用。
进一步的，所述制品为保健食品、功能食品或药品。
进一步的，鱼卵糖蛋白在上述制品中的添加量为3g/天/60kg体重。即鱼卵糖蛋白摄入剂量为体重60kg的成年人3g/天。
一种上述鱼卵糖蛋白的制备方法，将鱼卵脱脂干燥后，加入蛋白酶进行水解，超滤脱盐后得到鱼卵糖蛋白。
进一步的，所述蛋白酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶中的任一种或几种。
所述鱼卵糖蛋白是从鱼卵中提取获得的；所述的鱼卵为唾液酸含量较高的鲫鱼、鳕鱼或鲤鱼。
本发明的有益效果如下：
(1)鱼卵属于鱼类加工中的副产物，往往作为废弃物丢弃。本发明开拓了鱼卵糖蛋白在保肝护肝制品中的应用，通过给与有效剂量的鱼卵糖蛋白来预防和治疗化学物质所导致的肝损伤，为鱼卵的高值化利用提供了新的方向。
(2)鱼卵糖蛋白是一种天然活性物质，可以作为一种膳食营养来源，可广泛应用于食品领域，开发保肝护肝食品、保健食品及特医食品，其安全性更高，无毒副作用。
附图说明
图1是鱼卵糖蛋白对急性肝损伤小鼠肝组织病理形态的影响；
图2是鱼卵糖蛋白对慢性肝损伤小鼠肝组织病理形态的影响。
具体实施方式：
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
鱼卵糖蛋白在保肝护肝制品中的应用；其制备方法为将鱼卵脱脂干燥后，加入蛋白酶进行水解，超滤脱盐后得到鱼卵糖蛋白。
应用实施例1：鱼卵糖蛋白在四氯化碳诱导的急性肝损伤中的预防作用1实验动物
SPF级雄性ICR小鼠40只，体重18～22克，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。
2实验方法：
2.1动物分组与建模
将小鼠随机分为四组：正常对照组、模型组、阳性药组、鱼卵糖蛋白预防组，每组10只实验小鼠。1组为正常对照组，2组为模型组，3组为阳性对照水飞蓟宾组，4组为鱼卵糖蛋白组，每天早上灌胃给予受试药和阳性对照组药,模型组和正常对照组灌胃同体积的生理盐水。连续灌胃15天,除正常组外其余各组腹腔注射5％四氯化碳建立急性肝损伤模型。
2.2血清指标测定
实验结束后，颈椎脱臼处死小鼠，摘眼球取血，离心，分离血清。取血清，按照试剂盒的方法进行谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(S0D)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、和丙二醛(MDA)的测定。
2.3肝脏指标测定
取每只实验动物的肝脏组织，按组织:稀释液＝1:9(w/v)加入生理盐水稀释,混匀后离心(6000r/min，20min)取上清液。按照试剂盒的方法进行S0D、GSH-PX、和MDA的测定。
2.4肝脏病理学观察
取各组肝脏组织，用4％甲醛固定，石蜡切片，H&E染色，显微镜下观察肝脏的结构，鉴定肝脏的损伤情况。
2.5统计学分析
采用SPSS17.0统计分析软件进行t检验，数据用“均数±标准差”表示，双侧检验以P＜0.05表示差别有统计学意义。
3实验结果：
3.1预防性给予鱼卵糖蛋白对急性肝损伤小鼠的血清指标的影响
与正常组相比，模型组小鼠血清中ALT、AST、SOD和MDA水平显著升高(P＜0.01)；与模型组组相比，预防性给予鱼卵糖蛋白可以显著降低血清中的ALT、AST、SOD和MDA的水平(P<0.01)。结果见表1。
表1鱼卵糖蛋白对血清ALT，AST，SOD及MDA水平的影响(n＝10)
注：“##”：P＜0.01，与正常对照组相比具有极显著性差异；“**”P＜0.01，与模型组相比具有极显著性差异
3.2预防性给予鱼卵糖蛋白对急性肝损伤小鼠肝组织SOD和MDA含量的影响
与正常对照组比较，模型组小鼠肝脏SOD活性明显降低(P＜0.01)，MDA活性极显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，鱼卵糖蛋白组的SOD活性显著升高(P＜0.01)，MDA活性显著降低(P＜0.01)，结果见表2。
表2鱼卵糖蛋白对肝脏SOD及MDA水平的影响(n＝10)
注：“##”：P＜0.01，与正常对照组相比具有极显著性差异；“**”P＜0.01，与模型组相比具有极显著性差异
3.2预防性给予鱼卵糖蛋白对急性肝损伤小鼠肝组织病理形态的影响
如图1所示，正常对照组小鼠的肝小叶结构清晰完整，肝细胞呈索状以肝小叶中央静脉为中心向周围呈放射状排列。模型组小鼠以肝小叶中央静脉为中心出现大面积坏死，肝细胞排列紊乱，细胞核大小不等，大量炎性细胞浸润；补充鱼卵糖蛋白可明显改善肝脏病理改变，形态结构改变轻微，无明显炎性细胞浸润。
4.结果分析
以上结果表明，鱼卵糖蛋白对肝脏具有保护作用，可以改善肝脏损伤造成的血清转氨酶升高，降低大鼠肝脏组织中氧自由基和脂质过氧化物的含量，提高SOD活性，且抑制肝细胞损伤、坏死，核碎裂等病理状况，有助于肝损伤的预防。
应用实施例2：鱼卵糖蛋白在慢性肝损伤中的治疗作用
1实验动物
SPF级雄性ICR小鼠40只，体重18～22克，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。
2实验方法：
2.1动物分组与建模
将小鼠随机分为4组：正常对照组、模型组、阳性药组、鱼卵糖蛋白治疗组，每组10只实验小鼠。1组为正常对照组，2组为模型组，3组为阳性对照水飞蓟宾组，4组为鱼卵糖蛋白组，每天早上灌胃给予受试药和阳性对照组药,模型组和正常对照组灌胃同体积的生理盐水,除正常组外其余各组每7天腹腔注射2.5％四氯化碳两次建立慢性肝损伤模型，实验周期30天。
2.2血清指标测定
实验结束后，颈椎脱臼处死小鼠，摘眼球取血，离心，分离血清。取血清，按照试剂盒的方法进行谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、和丙二醛(MDA)的测定。
2.3肝脏指标测定
取每只实验动物的肝脏组织，按组织:稀释液＝1:9(w/v)加入生理盐水稀释,混匀后离心(6000r/min，10min)取上清液。按照试剂盒的方法进行SOD、MDA、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的测定。
2.4肝脏病理学观察
取各组肝脏组织，用4％甲醛固定，石蜡切片，H&E染色，显微镜下观察肝脏的结构，鉴定肝脏的损伤情况。
2.5统计学分析
采用SPSS22.0统计分析软件进行t检验，数据用“均数±标准差”表示，双侧检验以P＜0.05表示差别有统计学意义。
3实验结果：
3.1鱼卵糖蛋白对慢性肝损伤小鼠的血清指标的影响
与正常组相比，模型组小鼠血清中ALT、AST、SOD和MDA水平显著升高(P＜0.01)；与模型组组相比，鱼卵糖蛋白治疗可以显著降低血清中的ALT、AST、SOD和MDA的水平(P<0.01)。结果见表3。
表3鱼卵糖蛋白对血清ALT，AST，SOD及MDA水平的影响(n＝10)
注：“##”：P＜0.01，与正常对照组相比具有极显著性差异；“**”P＜0.01，与模型组相比具有极显著性差异
3.2鱼卵糖蛋白对慢性肝损伤小鼠肝组织SOD和MDA含量的影响
与正常对照组比较，模型组小鼠的SOD活性明显降低(P＜0.01)，MDA活性极显著升高(P＜0.01)；与模型组比较，鱼卵糖蛋白组的SOD活性显著升高(P＜0.05，P＜0.01)，MDA活性显著降低(P＜0.05，P＜0.01)，结果见表4。
表4鱼卵糖蛋白对肝脏SOD及MDA水平的影响(n＝10)
注：“##”：P＜0.01，与正常对照组相比具有极显著性差异；“**”P＜0.01，与模型组相比具有极显著性差异
3.3鱼卵糖蛋白对慢性肝损伤小鼠肝组织病理形态的影响
如图2所示，相比正常组，模型组小鼠肝脏形态发生严重变化，包括大面积肝细胞坏死、脂肪变性和炎性细胞浸润；补充鱼卵糖蛋白可明显减少肝脏中的炎症浸润和肝细胞坏死。
4.结果分析
以上结果表明，鱼卵糖蛋白能改善四氯化碳引起的慢性肝损伤，降低血清转氨酶水平，改善慢性肝损伤小鼠机体的氧化应激，缓解脂代谢紊乱，减少肝脏中肝细胞的坏死和炎症细胞浸润。
在本发明所述的小鼠肝损伤试验中，鱼卵糖蛋白的剂量为500mg/kg/d。换算为人(以成人体重60kg计算)剂量为3g/d。考虑到人的体重有不同，及各种其他病理情况，推荐剂量为每日2-3次，每次1-1.5g。最常用的剂量为每日3次，每次1g。
以上应用实施例1和实施例2的实验结果证明，鱼卵糖蛋白具有显著的保肝护肝活性，且具有毒副作用小的特点，在制备保肝类药品的开发上具有广泛的应用，尤其对于化学性肝损伤疾病的治疗。对鱼卵进一步开发利用具重要意义。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (2)
1.鱼卵糖蛋白在制备改善化学物质所导致的慢性肝损伤药物中的应用，所述鱼卵糖蛋白的制备方法为：将鱼卵脱脂干燥后，加入蛋白酶进行水解，超滤脱盐后得到鱼卵糖蛋白；
所述鱼卵为鲫鱼、鳕鱼或鲤鱼鱼卵。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶中的任一种或一种以上的混合物。
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