WO2021184955A1 - 一种提高重组人白蛋白表达质量、减少降解的方法 - Google Patents

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韩旭
姜钧茹
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    • C12N9/90—Isomerases (5.)
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    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/04—Intramolecular oxidoreductases (5.3) transposing S-S bonds (5.3.4)
    • C12Y503/04001—Protein disulfide-isomerase (5.3.4.1), i.e. disufide bond-forming enzyme

Definitions

  • Yeast cells contain secretory pathway proteases (kex2 protease, Yap3 protease) and vacuolar proteases (protease A, protease B, carboxypeptidase Y).
  • the exogenous protein polypeptide chain is synthesized in the ribosome, and then enters the endoplasmic reticulum to be folded under the pull of the signal peptide, and is processed and modified by the Golgi apparatus, then transported to the plasma membrane of the cell and secreted to the outside of the cell.
  • Human Serum Album is a single-chain globular protein composed of 585 amino acids.
  • HSA Human Serum Album
  • a degraded fragment with a molecular weight of about 45kDa and an N-terminal amino acid sequence consistent with human serum albumin was found in the fermentation product of recombinant human albumin, and the C-terminus of the fragment contained single or paired base amino acid residues, which may be It is produced by the secretory pathway aspartic protease Yap3 cleavage.
  • “Operably linked” refers to the covalent attachment of transcription and translation control elements to the coding sequence, the spatial arrangement of which allows the control elements to direct the expression of the coding sequence.
  • “Expression cassette” refers to a gene expression system that contains all the necessary elements required for the expression of foreign proteins, including promoters, cloning sites for foreign genes, signal peptide sequences, mature peptide coding sequences of the target protein, terminator, selection markers, etc. .
  • Gene expression refers to the process by which the genetic information carried by the structural genes in the biological genome undergoes a series of processes such as transcription and translation to synthesize specific proteins and then exert their specific biological functions.
  • Recombinant promoter refers to a genetically modified or unmodified promoter, a promoter that does not naturally exist upstream of a gene in the genome, or a wild-type promoter.
  • Molecular chaperones refer to proteins and polypeptides that assist in the correct folding of macromolecular structures in cells.
  • AOX Alcohol oxidase, alcohol oxidase.
  • GAL Galactose, galactose.
  • PKI Protein Disulfide Isomerase, protein disulfide isomerase.
  • SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis, sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis.
  • Sequence Identity Document Number sequence number.
  • Yap Yeast aspartic protease, yeast aspartic protease.
  • YPD Yeast extract/peptone/dextrose-media, medium.
  • the purpose of the invention in order to provide a material method and application for improving the expression quality of recombinant human albumin and reducing degradation.
  • a further technical solution of the present invention is that the host cell is a yeast cell.
  • yeast is one or more of the following Saccharomyces: Hansenula, Pichia and Candida.
  • a further technical scheme of the present invention is that the endogenous gene encoding the protein disulfide bond isomerase is genetically modified or not.
  • a further technical solution of the present invention is that the host cell encodes human albumin modified by at least one recombinant promoter.
  • a further technical solution of the present invention is that the protein disulfide bond isomerase is yeast PDI, more preferably human PDI.
  • SEQ ID NO.1 Human albumin signal peptide coding sequence
  • SEQ ID NO. 2 Human albumin signal peptide preferred sequence
  • SEQ ID NO. 5 Preferred sequence of human albumin mature peptide
  • SEQ ID NO.7 Yeast protein disulfide bond isomerase mature peptide coding sequence
  • SEQ ID NO.13 Preferred sequence of mature peptide of human protein disulfide isomerase
  • SEQ ID NO. 19 human PDI-R primer sequence.
  • Methods for improving the expression quality of recombinant human albumin and reducing degradation Methods for the treatment of diseases in preparation of or after preparation of sequences, plasmids, cells, and products.
  • Methods for improving the expression quality of recombinant human albumin and reducing degradation The use of sequences, plasmids, cells, and products in the fermentation industry during preparation or after preparation.
  • this patent can minimize the degradation of secreted protein
  • the present invention provides a host cell that over-expresses protein disulfide isomerase to reduce protein The secretion pathway is wrongly cut to improve protein quality.
  • Figure 1 is a schematic diagram of the structure of the recombinant plasmid pPic9-HSA.
  • Figure 3 is a schematic diagram of the structure of the recombinant plasmid pPic9-HSA-PDI.
  • Figure 4 is a schematic diagram of the structure of the recombinant plasmid pPicZA-HSA-PDI.
  • FIG. 6 is a diagram showing the western blot result of recombinant human albumin expression in Example 5.
  • FIG. Lane 1 is recombinant engineered bacteria I
  • lane 2 is recombinant engineered bacteria III
  • lane 3 is recombinant engineered bacteria IV
  • lane 4 is recombinant engineered bacteria V
  • lane 5 is recombinant engineered bacteria VI. It can be observed that the 66.5kDa band and the 45kDa degradation band are both recombinant human albumin bands.
  • the 45kDa degradation fragments of recombinant engineering bacteria with protein disulfide isomerase overexpression are reduced, and human protein disulfide isomerase is overexpressed. The effect of recombinant engineering bacteria is more obvious.
  • the present invention relates to a method for improving the expression quality of foreign proteins, which includes but is not limited to:
  • the yeast cell recombinant promoter includes but is not limited to AOX1 promoter, GAP promoter, GAL promoter, FDH promoter and FLD promoter.
  • the yeast cells include, but are not limited to, Hansenula, Pichia, Schizosacchromyces, Candida, Schizosaccharomyces, and Saccharomyces sp. Genus (Torulopsis) and Aspergillus (Aspergillus).
  • it is Pichia, and more preferably Pichia pastoris (Pichia pastoris).
  • the endogenous gene encoding the protein disulfide bond isomerase is genetically modified or not.
  • the endogenous gene function of the genetically modified protein disulfide bond isomerase is weakened or eliminated.
  • the yeast cell comprises a recombinant promoter operably linked to at least one gene encoding human albumin, wherein the promoter is preferably a genetically modified or unmodified inducible yeast AOX1 promoter.
  • the yeast cell comprises human protein disulfide isomerase modified by a recombinant promoter or overload expression of yeast protein disulfide isomerase, wherein the promoter is preferably a genetically modified or unmodified inducible yeast AOX1 promoter son.
  • Expression cassette which encodes at least one recombinant nucleic acid molecule of human albumin
  • the recombinant promoter is operably linked to the signal peptide coding sequence (as shown in SEQ ID NO. 1) and the human albumin mature peptide coding sequence (as shown in SEQ ID NO. 3).
  • the signal peptide coding sequence preferably includes at least one nucleotide exchange selected from the preferred sequence shown in SEQ ID NO. 2, and the human albumin mature peptide coding sequence is preferably the sequence shown in SEQ ID NO. 4, or preferably It is a nucleotide exchange comprising at least one selected from the preferred sequence shown in SEQ ID NO.5.
  • the expression cassette and nucleic acid constructs include, but are not limited to, pHIL-D2, pPIC3.5, pHIL-S1, pPIC9, pPink-LC, pPink-HC, pPICZA, pPICZB, pPICZC, pPICZaA, pPICZaB and pPICZaC plasmids.
  • the recombinant promoter is operably linked to the signal peptide coding sequence and the yeast protein disulfide isomerase mature peptide coding sequence.
  • the signal peptide coding sequence is shown in SEQ ID NO. 6, and the yeast protein disulfide bond isomerase mature peptide coding sequence is shown in SEQ ID NO. 7.
  • the recombinant promoter is operably linked to the signal peptide coding sequence and the human protein disulfide isomerase mature peptide coding sequence (as shown in SEQ ID NO. 11).
  • the human protein disulfide isomerase mature peptide coding sequence is preferably the sequence shown in SEQ ID NO. 12, or preferably includes at least one nucleotide exchange selected from the preferred sequence shown in SEQ ID NO. 13.
  • yeast cells are cultured to induce expression of foreign proteins, and the degradation fragments of recombinant human albumin are significantly reduced.
  • the expression vector needs to be integrated in the form of single copy or multiple copies at a specific site of the host Pichia cell genome, and homologous recombination with the chromosome occurs to realize the expression of foreign genes.
  • the pPic9 yeast expression vector (Invitrogen) and the pPicZA yeast expression vector (Invitrogen) are preferred.
  • MD medium MD medium, LB medium, YPD medium, BMGY medium, BMMY medium.
  • the structure of the recombinant plasmid pPicZA-PDI (yeast PDI or human PDI) is shown in Figure 2.
  • HSA-F SEQ ID NO.14
  • HSA-R SEQ ID NO.15
  • yeast PDI-F in the sequence table respectively.
  • SEQ ID NO.16 and yeast PDI-R (SEQ ID NO.17), human PDI-F (SEQ ID NO.18) and human PDI-R (SEQ ID NO.19) and other corresponding primers for PCR to Screen positive clones.
  • the transformed recombinant plasmid is pPic9-HSA, and its structure is shown in Figure 1.
  • the coding sequence of human albumin signal peptide is shown in SEQ ID NO.1
  • the coding sequence of human albumin mature peptide is shown in SEQ ID NO.4.
  • the pPicZA-PDI structure diagram is shown in Figure 2 and the pPic9-HSA plasmid were recombined into the genome of KM71 cells in two times.
  • the human albumin signal peptide coding sequence is shown in SEQ ID NO.1, and the human albumin mature peptide
  • the coding sequence is shown in SEQ ID NO.3.
  • the coding sequence of the yeast protein disulfide isomerase signal peptide is shown in SEQ ID NO. 6, and the coding sequence of the mature peptide is shown in SEQ ID NO. 7.
  • the plasmids pPic9-HSA-PDI (as shown in Figure 3) and pPicZA-HSA-PDI (as shown in Figure 4) were recombined into the genome of KM71 cells in two times.
  • the coding sequence of human albumin signal peptide is as follows: SEQ ID NO.1 is shown, and the human albumin mature peptide coding sequence is shown in SEQ ID NO.3.
  • the coding sequence of the yeast protein disulfide isomerase signal peptide is shown in SEQ ID NO. 6, and the coding sequence of the mature peptide is shown in SEQ ID NO. 7.
  • the pPicZA-PDI and pPic9-HSA plasmids were recombined into the genome of KM71 cells in two times.
  • the coding sequence of human albumin signal peptide is shown in SEQ ID NO. 1
  • the coding sequence of human albumin mature peptide is shown in SEQ ID NO. 3.
  • the human protein disulfide isomerase signal peptide coding sequence is shown in SEQ ID NO.9
  • the mature peptide coding sequence is shown in SEQ ID NO.11.
  • the transformed recombinant plasmid is pPic9-HSA-PDI, and the schematic diagram of the structure is shown in Figure 3.
  • the coding sequence of human albumin signal peptide is shown in SEQ ID NO. 1, and the coding sequence of human albumin mature peptide is shown in SEQ ID NO. 3.
  • the coding sequence of the human protein disulfide isomerase signal peptide is shown in SEQ ID NO.10, and the coding sequence of the mature peptide is shown in SEQ ID NO.12.
  • the plasmids pPic9-HSA-PDI (as shown in Figure 3) and pPicZA-HSA-PDI (as shown in Figure 4) were recombined into the genome of KM71 cells in two times.
  • the coding sequence of human albumin signal peptide is as follows: SEQ ID NO.1 is shown, and the human albumin mature peptide coding sequence is shown in SEQ ID NO.3.
  • the coding sequence of the human protein disulfide isomerase signal peptide is shown in SEQ ID NO.10, and the coding sequence of the mature peptide is shown in SEQ ID NO.12.
  • Example 4 Cultivation of engineered bacteria in shake flasks to induce the expression of recombinant human albumin
  • the supernatant was subjected to western blot with rabbit anti-HSA primary antibody (see Figure 6 for the map), and it can be observed that the 66.5kDa band and the 45kDa degradation band are both recombinant human albumin bands.
  • the degraded fragments of 45kDa recombinant human albumin are reduced, and the effect of recombinant engineered bacteria with over-expression of human protein disulfide isomerase is more obvious.
  • the invention relates to a material method and application for improving the expression quality of recombinant human albumin and reducing degradation.
  • the term “recombinant human albumin” may also be referred to as “recombinant human serum albumin” and/or “recombinant human serum albumin” and/or “rHA” and/or “rHSA”.
  • human serum albumin refers to human albumin extracted from human serum, and can also be referred to as “human serum albumin” and/or "HSA” and/or "HA” and/or "pdHSA”.
  • human albumin The main pharmacological effects of human albumin include regulating the dynamic balance of water between tissues and blood vessels, maintaining a normal and constant plasma volume, and at the same time having a high affinity for certain ions and compounds, reversibly binding with these substances, and exerting a transport function.
  • Human albumin also provides a large amount of amino acid reserves for the body. Due to the above-mentioned effects of human albumin, it can be used in various clinical disciplines and exert a variety of therapeutic effects. Human albumin is clinically mainly used to regulate plasma colloidal osmotic pressure, expand blood volume, treat trauma, hemorrhagic shock, severe burns and hypoproteinemia. It is widely used in common diseases such as stroke, liver cirrhosis, liver ascites, and kidney disease. application.
  • albumin has also been widely used in many aspects such as culture media, pharmaceutical excipients, diagnostic reagents, new tumor long-acting products, cosmetics, laboratory biological reagents, etc. used in vaccine production. .
  • human albumin is a single-chain non-glycosylated protein with a heart-shaped structure, with 585 amino acids, 17 pairs of disulfide bonds, a free sulfhydryl group, and a molecular weight of 66438 Daltons.
  • the half-life of human albumin in the human body is 19-21 days.
  • the heart-shaped structure of human albumin consists of three main domains and six subdomains wrapped by 17 disulfide bonds, which are loosely bound together by van der Waals forces. It can be seen from its crystal structure that the disulfide bridge imparts rigidity to the helical spherical structure, but provides enough flexibility to enable the protein to undergo conformational changes according to changes in the surrounding medium.
  • human albumin The conventional production method of human albumin is to extract, separate and purify from human serum, collectively referred to as human serum albumin.
  • Human albumin derived from human blood is affected by the limited number of plasma sources, viral contamination of plasma donors, and differences in individual antibodies and proteins, and there is a greater risk in clinical use. Therefore, there are viral safety statements in the instructions for use of human albumin in many countries, for example: "The standard measures taken to prevent infections caused by the use of human blood or plasma products include the selection of blood donors and the screening of single blood supply. Or the screening of special infection markers in the plasma pool and the adoption of effective production steps for inactivating/removing viruses. Even so, when choosing medical products prepared from blood or plasma, the possibility of infection by infectious agents cannot be ruled out. Including unknown or emerging viruses and other pathogens". Therefore, the method of genetic recombination is the best way to effectively obtain albumin without virus contamination.
  • the most commonly used method to express human albumin by genetically recombinant microorganisms that can achieve large-scale production is mainly the yeast expression system.
  • yeast endogenous protease due to the expression of yeast endogenous protease, it is found that there are recombinant human albumin degradation fragments in the fermentation product. It affects the subsequent purification work and greatly reduces the quality of protein expression.
  • culturing yeast cells and inducing protein expression under conditions suitable for the production of recombinant human albumin can improve the quality of recombinant human albumin and greatly reduce the degraded fragments.

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Abstract

提供一种提高重组人白蛋白表达质量、减少降解的方法。该方法通过在重组宿主细胞中过载表达蛋白二硫键异构酶(Protein Disulfide Isomerase，PDI)，从而帮助减少蛋白分泌途径中被错误剪切，降低蛋白降解，提高外源蛋白表达质量。

Description

[根据细则37.2由ISA制定的发明名称]　一种提高重组人白蛋白表达质量、减少降解的方法 技术领域
本发明涉及基因领域，尤其涉及一种提高重组人白蛋白表达质量减少降解的物质方法和用途。
背景技术
酵母表达体系具有发酵密度高、分泌能力强、糖基化程度低等优势，但在外源蛋白表达的同时也伴随着一定量蛋白酶的表达，从而使表达的外源蛋白出现了不同程度的降解，直接影响了后续的纯化工作和重组蛋白的质量。
酵母细胞中包含分泌途径蛋白酶(kex2蛋白酶、Yap3蛋白酶)和液泡蛋白酶(蛋白酶A、蛋白酶B、羧肽酶Y)。外源蛋白多肽链在核糖体合成，然后在信号肽的牵引下进入内质网进行折叠，经高尔基体进行加工修饰后，运输至细胞质膜分泌到胞外。而分泌途径蛋白酶是位于高尔基体或细胞质膜上的水解酶，高尔基体膜上的蛋白酶kex2负责蛋白信号肽的加工处理。细胞质膜上的天冬氨酸蛋白酶Yap3在kex2的作用下，特异性切割C端单个或成对的碱基氨基酸残基位点，是外源蛋白被错误剪切的主要原因。在发酵过程中，当细胞处于胁迫影响，位于酵母液泡内的蛋白酶过表达或细胞自溶破裂而释放到胞外，从而对分泌到胞外的重组蛋白产生降解作用。
人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)是一种单链球形蛋白质，由585个氨基酸构成。对于重组人白蛋白工程，蛋白质在前导肽作用下以全长分泌到细胞外尤其重要。然而，在重组人白蛋白发酵产物中发现了分子量约为45kDa、N-端氨基酸序列与人血清白蛋白一致的降解片段，并且片段C末端含有单个或成对的碱基氨基酸残基，这可能是由分泌途径天冬氨酸蛋白酶Yap3剪切产生的。
定义术语
“载体”指能将外源DNA带入宿主细胞，进行复制或最终使外源基因DNA得以表达的自主DNA。主要分为克隆载体和表达载体，前者主要用于基因的复制、扩增等，后者主要用于目的基因的表达。
“宿主细胞”指在转化或转导过程中接受外源基因的细胞。
“可操作的连接”指转录和翻译调控元件共价连接至编码序列，其空间排布 使得调控元件可以指导编码序列的表达。
“信号肽”指新合成的多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移的N端氨基酸序列。
“表达盒”指包含外源蛋白表达所需的所有必要元件的基因表达系统，包括启动子、外源基因克隆位点、信号肽序列、目的蛋白的成熟肽编码序列、终止子、筛选标记等。
“基因表达”指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定生物学功能的过程。
“重组启动子”指经遗传修饰的或未经修饰的启动子，不天然存在于基因组中基因上游的启动子或野生型启动子。存在于目的基因编码序列5’端上游，与RNA聚合酶识别、结合的特异DNA序列，控制目的基因的转录。
“分子伴侣”指协助细胞内大分子结构正确折叠的蛋白质和多肽。
“Amp”Ampicillin，氨苄青霉素钠。
“AOX”Alcohol oxidase，醇氧化酶。
“BMGY”Buffered Glycerol-complex Medium，培养基。
“BMMY”Buffered Methanol-complex Mdeium，培养基。
“Da”Dalton，道尔顿。
“DNA”Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸。
“FDH”Formate dehydrogenase，甲酸脱氢酶。
“FLD”Formaldehyde dehydrogenase，甲醛脱氢酶。
“GAL”Galactose，半乳糖。
“GAP”Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，三磷酸甘油醛脱氢酶。
“His”Histidinol dehydrogenase，组氨酸脱氢酶。
“HSA”Human Serum Albumin，人血清白蛋白。
“LB”Luria bertani medium，培养基。
“MD”Minimal Dextrose medium，培养基。
“ml”milliliter，毫升。
“Mut s”Methanol utilization slow，甲醇利用慢表型。
“Mut +”Methanol utilization plus，甲醇利用快表型。
“PCR”Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应。
“PDI”Protein Disulfide Isomerase，蛋白二硫键异构酶。
“rpm”Rounds per minute，转/每分。
“SDS-PAGE”Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
“SEQ ID NO.”Sequence Identity Document Number，序列编号。
“Western blot”，蛋白质免疫印迹。
“Yap”Yeast aspartic protease，酵母天冬氨酸蛋白酶。
“YPD”Yeast extract/peptone/dextrose-media，培养基。
“Zeo”zeocin，博来霉素。
发明内容
发明的目的：为了提供一种效果更好的提高重组人白蛋白表达质量减少降解的物质方法和用途，具体目的见具体实施部分的多个实质技术效果。
为了达到如上目的，本发明采取如下技术方案：
方案一：
一种提高重组人白蛋白表达质量减少降解的方法，其特征在于，通过在重组宿主细胞中过载表达蛋白二硫键异构酶，从而帮助减少蛋白分泌途径中被错误剪切，降低蛋白降解，提高外源蛋白表达质量。
方案二：
一种提高重组人白蛋白表达质量减少降解的方法，其特征在于，实现步骤其包含：
(1)编码至少一个重组人白蛋白的宿主细胞；
(2)过载表达蛋白二硫键异构酶的宿主细胞。
本发明进一步技术方案在于，所述的宿主细胞为酵母细胞。
本发明进一步技术方案在于，所述的酵母为如下酵母属的一种或者多种：汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)和假丝酵母属(Candida)。
本发明进一步技术方案在于，所述的毕赤酵母属的细胞是巴斯德毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)。
本发明进一步技术方案在于，编码蛋白二硫键异构酶的内源基因是经遗传修饰的或未经遗传修饰的。
本发明进一步技术方案在于，编码人白蛋白基因和蛋白二硫键异构酶基因的重组表达盒是在一个核酸构建体上或在两个不同选择标志的核酸构建体上。
本发明进一步技术方案在于，所述核酸构建体包括但不限于pHIL-D2、pPIC3.5、pHIL-S1、pPIC9、pPink-LC、pPink-HC、pPICZA、pPICZB、pPICZC、pPICZaA、pPICZaB和pPICZaC质粒。
本发明进一步技术方案在于，重组启动子包括但不限于AOX1启动子、GAP启动子、GAL启动子、FDH启动子和FLD启动子。
本发明进一步技术方案在于，宿主细胞中编码至少一个重组启动子修饰的人白蛋白。
本发明进一步技术方案在于，序列优选为包含至少一个选自SEQ ID NO.5所示优选序列的核苷酸交换。
本发明进一步技术方案在于，所述重组细胞中重组启动子修饰的蛋白二硫键异构酶过载表达。
本发明进一步技术方案在于，所述蛋白二硫键异构酶是酵母PDI，更优选为人PDI。
本发明进一步技术方案在于，人蛋白二硫键异构酶，序列优选为包含至少一个选自SEQ ID NO.13所示优选序列的核苷酸交换。
一种提高重组人白蛋白表达质量减少降解的物质，其特征在于，其为序列或者序列物质或者是序列所表达的物质，序列为如下任意一种或者多种序列：
SEQ ID NO.1人白蛋白信号肽编码序列；
SEQ ID NO.2人白蛋白信号肽优选序列；
SEQ ID NO.3人白蛋白成熟肽编码序列；
SEQ ID NO.4人白蛋白成熟肽优选序列；
SEQ ID NO.5人白蛋白成熟肽优选序列；
SEQ ID NO.6酵母蛋白二硫键异构酶信号肽编码序列；
SEQ ID NO.7酵母蛋白二硫键异构酶成熟肽编码序列；
SEQ ID NO.8酿酒酵母交配因子信号肽编码序列；
SEQ ID NO.9人蛋白二硫键异构酶信号肽编码序列；
SEQ ID NO.10人蛋白二硫键异构酶信号肽优选序列；
SEQ ID NO.11人蛋白二硫键异构酶成熟肽编码序列；
SEQ ID NO.12人蛋白二硫键异构酶成熟肽优选序列；
SEQ ID NO.13人蛋白二硫键异构酶成熟肽优选序列；
SEQ ID NO.14HSA-F引物序列；
SEQ ID NO.15HSA-R引物序列；
SEQ ID NO.16酵母PDI-F引物序列；
SEQ ID NO.17酵母PDI-R引物序列；
SEQ ID NO.18人PDI-F引物序列；
SEQ ID NO.19人PDI-R引物序列。
SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.19任意一种或者多种在提高重组人白蛋白表达质量减少降解中的用途。
利用SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.19任意一种或者多种序列基因操作后的宿主细胞。
利用SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.19任意一种或者多种序列基因操作后的宿主细胞表达的人白蛋白。
提高重组人白蛋白表达质量减少降解的方法制备中或者制备后的序列、质粒、细胞、产物在治疗疾病的方法。
提高重组人白蛋白表达质量减少降解的方法制备中或者制备后的序列、质粒、细胞、产物在治疗疾病中的用途。
提高重组人白蛋白表达质量减少降解的方法制备中或者制备后的序列、质粒、细胞、产物在发酵产业中的用途。
采用如上技术方案的本发明，相对于现有技术有如下有益效果：本专利能最大限度减少分泌蛋白的降解，本发明提供了通过构建过载表达蛋白二硫键异构酶的宿主细胞，减少蛋白分泌途径中被错误剪切，从而提高蛋白质量的方法。
附图说明
为了进一步说明本发明，下面结合附图进一步进行说明：
图1为重组质粒pPic9-HSA的结构示意图。
图2为重组质粒pPicZA-PDI的结构示意图。
图3为重组质粒pPic9-HSA-PDI的结构示意图。
图4为重组质粒pPicZA-HSA-PDI的结构示意图。
图5为实施例4的重组人白蛋白表达SDS-PAGE结果图。泳道1为重组工程菌IV，泳道2为重组工程菌V，泳道3为重组工程菌VI，泳道4为重组工程菌I，泳道5为重组工程菌III。蛋白二硫键异构酶过载表达的重组工程菌45kDa降解片段减少，且人蛋白二硫键异构酶过载表达的重组工程菌效果更明显。
图6为实施例5的重组人白蛋白表达western blot结果图。泳道1为重组工程菌I，泳道2为重组工程菌III，泳道3为重组工程菌IV，泳道4为重组工程菌V，泳道5为重组工程菌VI。可以观察到66.5kDa条带和45kDa降解条带均为重组人白蛋白条带，蛋白二硫键异构酶过载表达的重组工程菌45kDa降解片段减少，且人蛋白二硫键异构酶过载表达的重组工程菌效果更明显。
具体实施方式
本专利提供多种并列方案，不同表述之处，属于基于基本方案的改进型方案或者是并列型方案。每种方案都有自己的独特特点。
本发明目的在于提供减少蛋白分泌途径中被错误剪切，降低蛋白降解，提高外源蛋白表达质量的方法。
因此，本发明涉及用于提高外源蛋白表达质量的方法，其包含但不限于：
1)经遗传修饰的酵母细胞
所述酵母细胞重组启动子包含但不限于AOX1启动子、GAP启动子、GAL启动子、FDH启动子和FLD启动子。
所述酵母细胞包含但不限于汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、酿酒酵母属(Schizosacchromyces)、假丝酵母属(Candida)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、球拟酵母属(Torulopsis)和曲霉属(Aspergillus)。优选为毕赤酵母属，更优选为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
所述酵母细胞的表型优选为甲醇慢利用型Mut s，包括但不限于KM71、KM71H；或甲醇快利用型Mut +，包括但不限于GS115、X-33。
所述酵母细胞，编码蛋白二硫键异构酶的内源基因是经遗传修饰的或未经遗传修饰的。经遗传修饰的蛋白二硫键异构酶内源基因功能减弱或去除。
所述酵母细胞包含重组启动子可操作地连接于编码人白蛋白的至少一个基因，其中启动子优选为经遗传修饰的或未经修饰的可诱导酵母AOX1启动子。
所述酵母细胞包含重组启动子修饰的人蛋白二硫键异构酶或酵母蛋白二硫键异构酶的过载表达，其中启动子优选为经遗传修饰的或未经修饰的可诱导酵母AOX1启动子。
2)表达盒，其编码至少一个人白蛋白的重组核酸分子
所述表达盒，核酸构建体包括但不限于pHIL-D2、pPIC3.5、pHIL-S1、pPIC9、pPink-LC、pPink-HC、pPICZA、pPICZB、pPICZC、pPICZaA、pPICZaB和pPICZaC质粒。
重组启动子可操作地连接于信号肽编码序列(如SEQ ID NO.1所示)，和人白蛋白成熟肽编码序列(如SEQ ID NO.3所示)。所述信号肽编码序列优选为包含至少一个选自SEQ ID NO.2所示优选序列的核苷酸交换，所述人白蛋白成熟肽编码序列优选为SEQ ID NO.4所示序列，或优选为包含至少一个选自SEQ ID NO.5所示优选序列的核苷酸交换。
3)表达盒，过载表达酵母蛋白二硫键异构酶
所述表达盒，核酸构建体包括但不限于pHIL-D2、pPIC3.5、pHIL-S1、pPIC9、pPink-LC、pPink-HC、pPICZA、pPICZB、pPICZC、pPICZaA、pPICZaB和pPICZaC质粒。
重组启动子可操作地连接于信号肽编码序列和酵母蛋白二硫键异构酶成熟肽编码序列。所述信号肽编码序列如SEQ ID NO.6所示，所述酵母蛋白二硫键异构酶成熟肽编码序列如SEQ ID NO.7所示。
4)表达盒，过载表达人蛋白二硫键异构酶
所述表达盒，核酸构建体包括但不限于pHIL-D2、pPIC3.5、pHIL-S1、pPIC9、pPink-LC、pPink-HC、pPICZA、pPICZB、pPICZC、pPICZaA、pPICZaB和pPICZaC质粒。
重组启动子可操作地连接于信号肽编码序列和人蛋白二硫键异构酶成熟肽编码序列(如SEQ ID NO.11所示)。
所述信号肽编码序列包括但不限于酿酒酵母交配因子信号肽编码序列(如SEQ ID NO.8所示)和人蛋白二硫键异构酶信号肽编码序列(如SEQ ID NO.9所 示)，其中人蛋白二硫键异构酶信号肽编码序列优选为SEQ ID NO.10所示序列。
所述人蛋白二硫键异构酶成熟肽编码序列优选为SEQ ID NO.12所示序列，或优选为包含至少一个选自SEQ ID NO.13所示优选序列的核苷酸交换。
依照但不限于本发明提供的方法，在适合生产重组人白蛋白的条件下，培养酵母细胞，诱导外源蛋白表达，重组人白蛋白降解片段明显减少。
菌株
大肠杆菌DH5a感受态细胞(康为世纪)用于所有大肠杆菌克隆实验。
重组人白蛋白宿主细胞是酵母细胞，优选巴斯德毕赤酵母细胞(Invitrogen)，更优选GS115(组氨酸脱氢酶His4基因突变的Mut +毕赤酵母菌株)和KM71(组氨酸脱氢酶His4基因突变、AOX1基因被破坏的Mut s毕赤酵母菌株)。
表达载体
表达载体需在宿主毕赤酵母细胞基因组特定位点以单拷贝或多拷贝形式整合，与染色体发生同源重组以实现外源基因的表达。优选pPic9酵母表达载体(Invitrogen)和pPicZA酵母表达载体(Invitrogen)。
试剂和培养基
StuI限制性内切酶(NEB)、PmeI限制性内切酶(NEB)、SacI限制性内切酶(NEB)、金牌超量无内毒素质粒大提试剂盒(康为世纪)、博来霉素zeocin(Invitrogen)、氨苄青霉素钠Ampicillin(上海生工生物工程股份有限公司)。
MD培养基、LB培养基、YPD培养基、BMGY培养基、BMMY培养基。
重组质粒
重组质粒pPic9-HSA，其结构示意图如图1所示。
重组质粒pPicZA-PDI(酵母PDI或人PDI)，其结构示意图如图2所示。
重组质粒pPic9-HSA-PDI(酵母PDI或人PDI)，结构示意图如图3所示。
重组质粒pPicZA-HSA-PDI(酵母PDI或人PDI)，结构示意图如图4所示。
转化、筛选阳性克隆
使用DNA限制性内切酶PmeI、StuI或SacI线性化质粒，再依照毕赤酵母表达试剂盒(Invitrogen)操作手册中电穿孔方法转化酵母细胞，将细胞涂布在含相应抗生素或营养缺陷的选择平板上，30℃培养48至72小时。
挑取平板上生长的单菌落至培养液中培养后，提取基因组DNA，分别采用序列表中HSA-F(SEQ ID NO.14)和HSA-R(SEQ ID NO.15)、酵母PDI-F(SEQ ID NO.16)和酵母PDI-R(SEQ ID NO.17)、人PDI-F(SEQ ID NO.18)和人PDI-R(SEQ ID NO.19)等相应引物进行PCR，以筛选阳性克隆。
实施例1构建仅含人白蛋白基因的工程菌
重组工程菌I
转化的重组质粒为pPic9-HSA，其结构示意图如图1所示。人白蛋白信号肽编码序列如SEQ ID NO.1所示，人白蛋白成熟肽编码序列如SEQ ID NO.4所示。
实施例2构建共表达酵母蛋白二硫键异构酶的工程菌
重组工程菌II
分别将pPicZA-PDI(结构示意图如图2所示)和pPic9-HSA质粒分两次重组至KM71细胞基因组中，人白蛋白信号肽编码序列如SEQ ID NO.1所示，人白蛋白成熟肽编码序列如SEQ ID NO.3所示。酵母蛋白二硫键异构酶信号肽编码序列如SEQ ID NO.6所示，成熟肽编码序列如SEQ ID NO.7所示。
重组工程菌III
分别将pPic9-HSA-PDI(结构示意图如图3所示)和pPicZA-HSA-PDI(结构示意图如图4所示)质粒分两次重组至KM71细胞基因组中，人白蛋白信号肽编码序列如SEQ ID NO.1所示，人白蛋白成熟肽编码序列如SEQ ID NO.3所示。酵母蛋白二硫键异构酶信号肽编码序列如SEQ ID NO.6所示，成熟肽编码序列如SEQ ID NO.7所示。
实施例3构建共表达人蛋白二硫键异构酶的工程菌
重组工程菌IV
分别将pPicZA-PDI和pPic9-HSA质粒分两次重组至KM71细胞基因组中，人白蛋白信号肽编码序列如SEQ ID NO.1所示，人白蛋白成熟肽编码序列如SEQ ID NO.3所示。人蛋白二硫键异构酶信号肽编码序列如SEQ ID NO.9所示，成熟肽编码序列如SEQ ID NO.11所示。
重组工程菌V
转化的重组质粒为pPic9-HSA-PDI，结构示意图如图3所示。人白蛋白信号肽编码序列如SEQ ID NO.1所示，人白蛋白成熟肽编码序列如SEQ ID NO.3所示。 人蛋白二硫键异构酶信号肽编码序列如SEQ ID NO.10所示，成熟肽编码序列如SEQ ID NO.12所示。
重组工程菌VI
分别将pPic9-HSA-PDI(结构示意图如图3所示)和pPicZA-HSA-PDI(结构示意图如图4所示)质粒分两次重组至KM71细胞基因组中，人白蛋白信号肽编码序列如SEQ ID NO.1所示，人白蛋白成熟肽编码序列如SEQ ID NO.3所示。人蛋白二硫键异构酶信号肽编码序列如SEQ ID NO.10所示，成熟肽编码序列如SEQ ID NO.12所示。
实施例4摇瓶中培养工程菌，诱导重组人白蛋白的表达
分别取各重组工程菌I、III、IV、V和VI，如表1所示。接种于40ml BMGY培养液中220rpm 30℃培养过夜，取细胞液离心，将沉淀重悬于40ml BMMY培养液中，220rpm 25℃开始诱导，每24小时加入0.4％甲醇，72小时后10000rpm离心5分钟，收集上清。
表1
重组工程菌 人白蛋白基因 酵母PDI基因 人PDI基因
I 有 无 无
III 有 有 无
IV 有 无 有
V 有 无 有
VI 有 无 有
将上清进行SDS-PAGE电泳检测(图谱见图5)，可以观察到重组人白蛋白66.5kDa条带和45kDa降解条带。以重组工程菌I在诱导72小时后，45kDa蛋白表达量(100％)作为对照，对SDS-PAGE电泳图45kDa降解条带进行相对定量分析，结果如表2所示。
在蛋白二硫键异构酶过载表达的重组工程菌中，45kDa重组人白蛋白降解片段减少，且人蛋白二硫键异构酶过载表达的重组工程菌效果更明显。
表2
泳道 重组工程菌 45kDa重组人白蛋白降解片段相对表达量
1 IV 23.9％
2 V 20.8％
3 VI 25.6％
4 I 100.0％
5 III 65.5％
实施例5摇瓶中培养工程菌，诱导重组人白蛋白的表达
分别取各重组工程菌I、III、IV、V和VI接种于40ml BMGY培养液中220rpm30℃培养过夜，取细胞液离心，将沉淀重悬于40ml BMMY培养液中，220rpm 25℃开始诱导，每24小时加入0.4％甲醇，72小时后10000rpm离心5分钟，收集上清。
将上清采用兔抗HSA一抗进行western blot(图谱见图6)，可以观察到66.5kDa条带和45kDa降解条带均为重组人白蛋白条带。45kDa重组人白蛋白降解片段减少，且人蛋白二硫键异构酶过载表达的重组工程菌效果更明显。
本发明涉及一种提高重组人白蛋白表达质量减少降解的物质方法和用途。在本说明书中，术语“重组人白蛋白”也可以称为“重组人血清白蛋白”和/或“重组人血白蛋白”和/或“rHA”和/或“rHSA”。术语“人血清白蛋白”是指从人血清中提取出来的人白蛋白，也可以称为“人血白蛋白”和/或“HSA”和/或“HA”和/或“pdHSA”。
需要说明的是，本专利能够实现多种菌种的构建，类似的菌种也在本专利的保护范围内。
人白蛋白主要的药理作用，包括调节组织与血管间水分的动态平衡，维持正常与恒定的血浆容量，同时还对某些离子和化合物有较高亲和力，与这些物质可逆结合，发挥转运功能。人白蛋白还为肌体提供了大量的氨基酸储备。由于人白蛋白的上述作用，使其可以应用于临床各学科，发挥多种治疗作用。人白蛋白临床主要用于调节血浆胶体渗透压、扩充血容量，治疗创伤性、出血性休克，严重烧伤及低蛋白血症，在中风，肝硬化肝腹水和肾病等常见疾病中都有着广泛的应用。除了直接在临床治疗领域，白蛋白还在疫苗生产所使用的培养基、药品辅料、诊断试剂、新型肿瘤长效制剂产品、化妆品、实验室生物试剂等多个方面都已经得到了极其广泛的应用。
人白蛋白的结构是一个心型结构的单链非糖基化蛋白，有585个氨基酸，17对二硫键，一个自由巯基，分子量为66438道尔顿。人白蛋白在人体中的半衰期为19～21天。人白蛋白的心形结构由三个主要结构域和六个被17个二硫键包裹的亚结构域组成，它们通过范德华力松散地结合在一起。从其晶体结构可以看出，二硫化物桥赋予螺旋状的球状结构刚度，但提供足够的灵活性，使蛋白质能够根据周围介质的变化进行构象变化。
人白蛋白常规的生产方法是从人血清中提取分离纯化出来，统称为人血清白蛋白。人血来源的人白蛋白受到血浆来源的数量限制和血浆供者的病毒污染以及个体抗体和蛋白差异的影响，其在临床使用中将存在较大的风险。因此，在很多国家的人血白蛋白使用说明书中都有病毒安全性声明，例如：“为预防因使用人血或血浆制品导致的感染所采取的标准措施包括供血者选择、单次供血的筛选或血浆池特殊感染标记的筛选及灭活/去除病毒的有效生产步骤的采用。即便如此，当选用由血液或血浆制备的医药产品时，被传染性致病因子感染的可能性不能排除。这包括了未知的或新出现的病毒和其它病原体”。因此，采用基因重组的方法是有效获取无病毒污染的白蛋白最好途径。
目前，最常用的可实现规模化生产的基因重组微生物表达人白蛋白的方式，主要是酵母表达系统，但由于酵母内源蛋白酶的表达，发现在发酵产物中存在重组人白蛋白降解片段，不仅影响了后续的纯化工作，还大大降低了蛋白表达质量。依照但不限于本发明提供的方法，在适合生产重组人白蛋白的条件下，培养酵母细胞，诱导蛋白表达，可以使重组人白蛋白质量提高，降解片段大大减少。
需要说明的是，本专利提供的多个方案包含本身的基本方案，相互独立，并不相互制约，但是其也可以在不冲突的情况下相互组合，达到多个效果共同实现。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本领域的技术人员应该了解本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。

Claims (18)

  1. 一种提高重组人白蛋白表达质量减少降解的方法，其特征在于，通过在重组宿主细胞中过载表达蛋白二硫键异构酶，从而帮助减少蛋白分泌途径中被错误剪切，降低蛋白降解，提高外源蛋白表达质量。
  2. 一种提高重组人白蛋白表达质量减少降解的方法，其特征在于，实现步骤其包含：
    编码至少一个重组人白蛋白的宿主细胞；
    过载表达蛋白二硫键异构酶的宿主细胞。
  3. 如权利要求2所述的一种提高重组人白蛋白表达质量减少降解的方法，其特征在于，所述的宿主细胞为酵母细胞。
  4. 如权利要求2所述的一种提高重组人白蛋白表达质量减少降解的方法，其特征在于，所述的酵母细胞为如下酵母属的一种或者多种：汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)和假丝酵母属(Candida)。
  5. 如权利要求4所述的一种提高重组人白蛋白表达质量减少降解的方法，其特征在于，所述的毕赤酵母属的细胞是巴斯德毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)。
  6. 如权利要求2所述的一种提高重组人白蛋白表达质量减少降解的方法，其特征在于，编码蛋白二硫键异构酶的内源基因是经遗传修饰的或未经遗传修饰的。
  7. 如权利要求2-6任意所述的一种提高重组人白蛋白表达质量减少降解的方法，其特征在于，编码人白蛋白基因和蛋白二硫键异构酶基因的重组表达盒是在一个核酸构建体上或在两个不同选择标志的核酸构建体上。
  8. 如权利要求7所述的一种提高重组人白蛋白表达质量减少降解的方法，其特征在于，所述核酸构建体包括但不限于pHIL-D2、pPIC3.5、pHIL-S1、pPIC9、pPink-LC、pPink-HC、pPICZA、pPICZB、pPICZC、pPICZaA、pPICZaB和pPICZaC质粒。
  9. 如权利要求8所述的一种提高重组人白蛋白表达质量减少降解的方法，其特征在于，重组启动子包括但不限于AOX1启动子、GAP启动子、GAL启动子、FDH启动子和FLD启动子。
  10. 如权利要求8所述的一种提高重组人白蛋白表达质量减少降解的方法，其特征在于，宿主细胞中编码至少一个重组启动子修饰的人白蛋白。
  11. 如权利要求10所述的一种提高重组人白蛋白表达质量减少降解的方法，序 列优选为包含至少一个选自SEQ ID NO.5所示优选序列的核苷酸交换：
    SEQ ID NO.5人白蛋白成熟肽优选序列：
    优选序列1(4-6)： GCT 优选序列2(7-9)： CAT 优选序列3(13-15)： TCT 优选序列4(16-18)： GAA 优选序列5(28-30)： AGA 优选序列6(34-36)： AAG 优选序列7(43-45)： GGT 优选序列8(52-54)： AAC 优选序列9(55-57)： TTT 优选序列10(58-60)： AAG 优选序列11(61-63)： GCT 优选序列12(67-69)： GTT 优选序列13(76-78)： GCT 优选序列14(85-87)： CAA 优选序列15(88-90)： TAC 优选序列16(91-93)： TTG 优选序列17(94-96)： CAA 优选序列18(97-99)： CAA 优选序列19(118-120)：
    GTT 优选序列20(121-123)： AAG 优选序列21(124-126)： TTG 优选序列22(127-129)： GTT 优选序列23(130-132)： AAC 优选序列24(136-138)： GTT 优选序列25(148-150)： GCT 优选序列26(151-153)： AAG 优选序列27(154-156)： ACT 优选序列28(169-171)： GAA 优选序列29(172-174)： TCT 优选序列30(181-183)： AAC 优选序列31(187-189)： GAT 优选序列32(190-192)： AAG 优选序列33(193-195)： TCT 优选序列34(196-198)： TTG 优选序列35(202-204)： ACT 优选序列36(205-207)： TTG 优选序列37(211-213)： GGT 优选序列38(214-216)： GAT 优选序列39(217-219)： AAG 优选序列40(220-222)：
    TTG 优选序列41(223-225)： TGT 优选序列42(226-228)： ACT 优选序列43(232-234)： GCT 优选序列44(238-240)： TTG 优选序列45(241-243)： AGA 优选序列46(247-249)： ACT 优选序列47(250-252)： TAC 优选序列48(265-267)： GAT 优选序列49(268-270)： TGT 优选序列50(274-276)： GCT 优选序列51(277-279)： AAG 优选序列52(286-288)： CCA 优选序列53(289-291)： GAA 优选序列54(295-297)： AAC 优选序列55(301-303)： TGT 优选序列56(304-306)： TTT 优选序列57(313-315)： CAT 优选序列58(316-318)： AAG 优选序列59(322-324)： GAT 优选序列60(334-336)： TTG 优选序列61(337-339)：
    CCA 优选序列62(340-342)： AGA 优选序列63(346-348)： GTT 优选序列64(355-357)： GAA 优选序列65(364-366)： GTT 优选序列66(370-372)： TGT 优选序列67(385-387)： GAT 优选序列68(388-390)： AAC 优选序列69(394-396)： GAA 优选序列70(397-399)： ACT 优选序列71(406-408)： AAG 优选序列72(409-411)： AAG 优选序列73(415-417)： TTG 优选序列74(418-420)： TAC 优选序列75(427-429)： GCT 优选序列76(439-441)： CCA 优选序列77(448-450)： TAC 优选序列78(451-453)： GCT 优选序列79(454-456)： CCA 优选序列80(460-462)： TTG 优选序列81(463-465)： TTG 优选序列82(466-468)：
    TTT 优选序列83(475-477)： AAG 优选序列84(478-480)： AGA 优选序列85(481-483)： TAC 优选序列86(484-486)： AAG 优选序列87(496-498)： ACT 优选序列88(505-507)： TGT 优选序列89(520-522)： AAG 优选序列90(526-528)： GCT 优选序列91(529-531)： TGT 优选序列92(532-534)： TTG 优选序列93(544-546)： TTG 优选序列94(553-555)： TTG 优选序列95(556-558)： AGA 优选序列96(565-567)： GGT 优选序列97(574-576)： TCT 优选序列98(580-582)： GCT 优选序列99(583-585)： AAG 优选序列100(586-588)： CAA 优选序列101(592-594)： TTG 优选序列102(601-603)： GCT 优选序列103(604-606)：
    TCT 优选序列104(607-609)： TTG 优选序列105(613-615)： AAG 优选序列106(619-621)： GGT 优选序列107(631-633)： TTT 优选序列108(634-636)： AAG 优选序列109(637-639)： GCT 优选序列110(643-645)： GCT 优选序列111(646-648)： GTT 优选序列112(652-654)： AGA 优选序列113(655-657)： TTG 优选序列114(658-660)： TCT 优选序列115(661-663)： CAA 优选序列116(670-672)： CCA 优选序列117(673-675)： AAG 优选序列118(679-681)： GAA 优选序列119(685-687)： GCT 优选序列120(694-696)： TCT 优选序列121(700-702)： TTG 优选序列122(703-705)： GTT 优选序列123(706-708)： ACT 优选序列124(712-714)：
    TTG 优选序列125(715-717)： ACT 优选序列126(718-720)： AAG 优选序列127(721-723)： GTT 优选序列128(724-726)： CAT 优选序列129(727-729)： ACT 优选序列130(733-735)： TGT 优选序列131(736-738)： TGT 优选序列132(742-744)： GGT 优选序列133(748-750)： TTG 优选序列134(751-753)： TTG 优选序列135(766-768)： GAT 优选序列136(769-771)： AGA 优选序列137(772-774)： GCT 优选序列138(775-777)： GAT 优选序列139(778-780)： TTG 优选序列140(781-783)： GCT 优选序列141(787-789)： TAC 优选序列142(790-792)： ATT 优选序列143(799-801)： AAC 优选序列144(808-810)： TCT 优选序列145(811-813)：
    ATT 优选序列146(814-816)： TCT 优选序列147(817-819)： TCT 优选序列148(820-822)： AAG 优选序列149(823-825)： TTG 优选序列150(832-834)： TGT 优选序列151(841-843)： AAG 优选序列152(844-846)： CCA 优选序列153(847-849)： TTG 优选序列154(856-858)： AAG 优选序列155(859-861)： TCT 优选序列156(862-864)： CAT 优选序列157(865-867)： TGT 优选序列158(871-873)： GCT 优选序列159(877-879)： GTT 优选序列160(883-885)： AAC 优选序列161(889-891)： GAA 优选序列162(895-897)： CCA 优选序列163(901-903)： GAT 优选序列164(907-909)： CCA 优选序列165(910-912)： TCT 优选序列166(913-915)：
    TTG 优选序列167(934-936)： TCT 优选序列168(946-948)： TGT 优选序列169(949-951)： AAG 优选序列170(955-957)： TAC 优选序列171(961-963)： GAA 优选序列172(964-966)： GCT 优选序列173(973-975)： GTT 优选序列174(976-978)： TTT 优选序列175(979-981)： TTG 优选序列176(982-984)： GGT 优选序列177(994-996)： TAC 优选序列178(1000-1002)： TAC 优选序列179(1003-1005)： GCT 优选序列180(1009-1011)： AGA 优选序列181(1015-1017)： CCA 优选序列182(1027-1029)： GTT 优选序列183(1030-1032)： GTT 优选序列184(1033-1035)： TTG 优选序列185(1036-1038)： TTG 优选序列186(1039-1041)： TTG 优选序列187(1045-1047)：
    TTG 优选序列188(1048-1050)： GCT 优选序列189(1054-1056)： ACT 优选序列190(1057-1059)： TAC 优选序列191(1063-1065)： ACT 优选序列192(1069-1071)： TTG 优选序列193(1072-1074)： GAA 优选序列194(1078-1080)： TGT 优选序列195(1084-1086)： GCT 优选序列196(1090-1092)： GCT 优选序列197(1096-1098)： CCA 优选序列198(1105-1107)： TGT 优选序列199(1108-1110)： TAC 优选序列200(1111-1113)： GCT 优选序列201(1114-1116)： AAG 优选序列202(1117-1119)： GTT 优选序列203(1120-1122)： TTT 优选序列204(1132-1134)： AAG 优选序列205(1135-1137)： CCA 优选序列206(1138-1140)： TTG 优选序列207(1141-1143)： GTT 优选序列208(1147-1149)：
    GAA 优选序列209(1150-1152)： CCA 优选序列210(1153-1155)： CAA 优选序列211(1156-1158)： AAC 优选序列212(1159-1161)： TTG 优选序列213(1162-1164)： ATT 优选序列214(1165-1167)： AAG 优选序列215(1171-1173)： AAC 优选序列216(1177-1179)： GAA 优选序列217(1180-1182)： TTG 优选序列218(1186-1188)： GAA 优选序列219(1189-1191)： CAA 优选序列220(1192-1194)： TTG 优选序列221(1195-1197)： GGT 优选序列222(1198-1200)： GAA 优选序列223(1204-1206)： AAG 优选序列224(1207-1209)： TTT 优选序列225(1210-1212)： CAA 优选序列226(1213-1215)： AAC 优选序列227(1216-1218)： GCT 优选序列228(1219-1221)： TTG 优选序列229(1222-1224)：
    TTG 优选序列230(1228-1230)： AGA 优选序列231(1234-1236)： ACT 优选序列232(1240-1242)： AAG 优选序列233(1243-1245)： GTT 优选序列234(1246-1248)： CCA 优选序列235(1252-1254)： GTT 优选序列236(1255-1257)： TCT 优选序列237(1267-1269)： TTG 优选序列238(1270-1272)： GTT 优选序列239(1273-1275)： GAA 优选序列240(1276-1278)： GTT 优选序列241(1279-1281)： TCT 优选序列242(1288-1290)： TTG 优选序列243(1291-1293)： GGT 优选序列244(1294-1296)： AAG 优选序列245(1297-1299)： GTT 优选序列246(1300-1302)： GGT 优选序列247(1303-1305)： TCT 优选序列248(1306-1308)： AAG 优选序列249(1315-1317)： AAG 优选序列250(1321-1323)：
    CCA 优选序列251(1327-1329)： GCT 优选序列252(1330-1332)： AAG 优选序列253(1339-1341)： CCA 优选序列254(1345-1347)： GCT 优选序列255(1351-1353)： GAT 优选序列256(1354-1356)： TAC 优选序列257(1357-1359)： TTG 优选序列258(1360-1362)： TCT 优选序列259(1363-1365)： GTT 优选序列260(1366-1368)： GTT 优选序列261(1369-1371)： TTG 优选序列262(1375-1377)： CAA 优选序列263(1378-1380)： TTG 优选序列264(1384-1386)： GTT 优选序列265(1393-1395)： GAA 优选序列266(1396-1398)： AAG 优选序列267(1399-1401)： ACT 优选序列268(1405-1407)： GTT 优选序列269(1408-1410)： TCT 优选序列270(1411-1413)： GAT 优选序列271(1417-1419)：
    GTT 优选序列272(1420-1422)： ACT 优选序列273(1423-1425)： AAG 优选序列274(1426-1428)： TGT 优选序列275(1429-1431)： TGT 优选序列276(1432-1434)： ACT 优选序列277(1438-1440)： TCT 优选序列278(1444-1446)： GTT 优选序列279(1450-1452)： AGA 优选序列280(1453-1455)： AGA 优选序列281(1459-1461)： TGT 优选序列282(1465-1467)： TCT 优选序列283(1471-1473)： TTG 优选序列284(1477-1479)： GTT 优选序列285(1486-1488)： ACT 优选序列286(1495-1497)： CCA 优选序列287(1498-1500)： AAG 优选序列288(1501-1503)： GAA 优选序列289(1507-1509)： AAC 优选序列290(1516-1518)： ACT 优选序列291(1519-1521)： TTT 优选序列292(1522-1524)：
    ACT 优选序列293(1525-1527)： TTT 优选序列294(1531-1533)： GCT 优选序列295(1537-1539)： ATT 优选序列296(1540-1542)： TGT 优选序列297(1543-1545)： ACT 优选序列298(1546-1548)： TTG 优选序列299(1552-1554)： GAA 优选序列300(1558-1560)： GAA 优选序列301(1567-1569)： ATT 优选序列302(1573-1575)： AAG 优选序列303(1582-1584)： GCT 优选序列304(1585-1587)： TTG 优选序列305(1591-1593)： GAA 优选序列306(1594-1596)： TTG 优选序列307(1597-1599)： GTT 优选序列308(1600-1602)： AAG 优选序列309(1603-1605)： CAT 优选序列310(1609-1611)： CCA 优选序列311(1615-1617)： GCT 优选序列312(1618-1620)： ACT 优选序列313(1621-1623)：
    AAG 优选序列314(1624-1626)： GAA 优选序列315(1630-1632)： TTG 优选序列316(1633-1635)： AAG 优选序列317(1651-1653)： TTT 优选序列318(1654-1656)： GCT 优选序列319(1663-1665)： GTT 优选序列320(1666-1668)： GAA 优选序列321(1672-1674)： TGT 优选序列322(1675-1677)： TGT 优选序列323(1684-1686)： GAT 优选序列324(1693-1695)： GAA 优选序列325(1696-1698)： ACT 优选序列326(1699-1701)： TGT 优选序列327(1705-1707)： GCT 优选序列328(1708-1710)： GAA 优选序列329(1711-1713)： GAA 优选序列330(1717-1719)： AAG 优选序列331(1720-1722)： AAG 优选序列332(1723-1725)： TTG 优选序列333(1732-1734)： GCT 优选序列334(1735-1737)：
    TCT 优选序列335(1744-1746)： GCT 优选序列336(1747-1749)： TTG 优选序列337(1750-1752)： GGT 优选序列338(1753-1755)： TTG
    。
  12. 如权利要求2所述的一种提高重组人白蛋白表达质量减少降解的方法，其特征在于，所述重组细胞中重组启动子修饰的蛋白二硫键异构酶过载表达。
  13. 如权利要求2所述的一种提高重组人白蛋白表达质量减少降解的方法，其特征在于，所述蛋白二硫键异构酶是酵母PDI或者人PDI。
  14. 如权利要求13所述的一种提高重组人白蛋白表达质量减少降解的方法，其特征在于，人蛋白二硫键异构酶，序列优选为包含至少一个选自SEQ ID NO.13所示优选序列的核苷酸交换：
    SEQ ID NO.13人蛋白二硫键异构酶成熟肽优选序列：
    优选序列1：(1-3) GAT 优选序列2：(4-6) GCT 优选序列3：(7-9) CCA 优选序列4：(10-12) GAA 优选序列5：(13-15) GAA 优选序列6：(16-18) GAA 优选序列7：(19-21) GAT 优选序列8：(22-24) CAT 优选序列9：(25-27) GTT
    优选序列10：(28-30) TTG 优选序列11：(31-33) GTT 优选序列12：(34-36) TTG 优选序列13：(37-39) AGA 优选序列14：(40-42) AAG 优选序列15：(43-45) TCT 优选序列16：(49-51) TTT 优选序列17：(52-54) GCT 优选序列18：(55-57) GAA 优选序列19：(58-60) GCT 优选序列20：(61-63) TTG 优选序列21：(64-66) GCT 优选序列22：(67-69) GCT 优选序列23：(70-72) CAT 优选序列24：(79-81) TTG 优选序列25：(82-84) TTG 优选序列26：(85-87) GTT 优选序列27：(88-90) GAA 优选序列28：(91-93) TTT 优选序列29：(94-96) TAC 优选序列30：(97-99) GCT
    优选序列31：(100-102) CCA 优选序列32：(109-111) GGT 优选序列33：(112-114) CAT 优选序列34：(115-117) TGT 优选序列35：(124-126) TTG 优选序列36：(127-129) GCT 优选序列37：(130-132) CCA 优选序列38：(133-135) GAA 优选序列39：(136-138) TAC 优选序列40：(139-141) GCT 优选序列41：(142-144) AAG 优选序列42：(145-147) GCT 优选序列43：(151-153) GGT 优选序列44：(157-159) TTG 优选序列45：(163-165) GCT 优选序列46：(172-174) TCT 优选序列47：(175-177) GAA 优选序列48：(178-180) ATT 优选序列49：(181-183) AGA 优选序列50：(187-189) GCT 优选序列51：(193-195) GTT
    优选序列52：(196-198) GAT 优选序列53：(199-201) GCT 优选序列54：(202-204) ACT 优选序列55：(205-207) GAA 优选序列56：(208-210) GAA 优选序列57：(214-216) GAT 优选序列58：(217-219) TTG 优选序列59：(220-222) GCT 优选序列60：(223-225) CAA 优选序列61：(226-228) CAA 优选序列62：(232-234) GGT 优选序列63：(235-237) GTT 优选序列64：(238-240) AGA 优选序列65：(241-243) GGT 优选序列66：(244-246) TAC 优选序列67：(247-249) CCA 优选序列68：(250-252) ACT 优选序列69：(253-255) ATT 优选序列70：(259-261) TTT 优选序列71：(262-264) TTT 优选序列72：(265-267) AGA
    优选序列73：(268-270) AAC 优选序列74：(271-273) GGT 优选序列75：(274-276) GAT 优选序列76：(277-279) ACT 优选序列77：(283-285) TCT 优选序列78：(286-288) CCA 优选序列79：(295-297) TAC 优选序列80：(298-300) ACT 优选序列81：(304-306) GGT 优选序列82：(310-312) GAA 优选序列83：(319-321) GAT 优选序列84：(322-324) ATT 优选序列85：(325-327) GTT 优选序列86：(334-336) TTG 优选序列87：(343-345) AGA 优选序列88：(346-348) ACT 优选序列89：(349-351) GGT 优选序列90：(352-354) CCA 优选序列91：(358-360) GCT 优选序列92：(361-363) ACT 优选序列93：(364-366) ACT
    优选序列94：(367-369) TTG 优选序列95：(370-372) CCA 优选序列96：(373-375) GAT 优选序列97：(376-378) GGT 优选序列98：(379-381) GCT 优选序列99：(385-387) GCT 优选序列100：(388-390) GAA 优选序列101：(391-393) TCT 优选序列102：(397-399) GTT 优选序列103：(400-402) GAA 优选序列104：(403-405) TCT 优选序列105：(406-408) TCT 优选序列106：(409-411) GAA 优选序列107：(412-414) GTT 优选序列108：(418-420) GTT 优选序列109：(421-423) ATT 优选序列110：(424-426) GGT 优选序列111：(427-429) TTT 优选序列112：(430-432) TTT 优选序列113：(436-438) GAT 优选序列114：(439-441) GTT
    优选序列115：(442-444) GAA 优选序列116：(445-447) TCT 优选序列117：(448-450) GAT 优选序列118：(454-456) GCT 优选序列119：(460-462) CAA 优选序列120：(469-471) CAA 优选序列121：(472-474) GCT 优选序列122：(475-477) GCT 优选序列123：(478-480) GAA 优选序列124：(481-483) GCT 优选序列125：(484-486) ATT 优选序列126：(490-492) GAT 优选序列127：(493-495) ATT 优选序列128：(502-504) GGT 优选序列129：(505-507) ATT 优选序列130：(511-513) TCT 优选序列131：(517-519) TCT 优选序列132：(520-522) GAT 优选序列133：(523-525) GTT 优选序列134：(526-528) TTT 优选序列135：(529-531) TCT
    优选序列136：(532-534) AAG 优选序列137：(538-540) CAA 优选序列138：(541-543) TTG 优选序列139：(544-546) GAT 优选序列140：(547-549) AAG 优选序列141：(553-555) GGT 优选序列142：(559-561) GTT 优选序列143：(562-564) TTG 优选序列144：(583-585) GGT 优选序列145：(586-588) AGA 优选序列146：(601-603) GGT 优选序列147：(604-606) GAA 优选序列148：(607-609) GTT 优选序列149：(610-612) ACT 优选序列150：(616-618) GAA 优选序列151：(622-624) TTG 优选序列152：(625-627) TTG 优选序列153：(628-630) GAT 优选序列154：(634-636) ATT 优选序列155：(637-639) AAG 优选序列156：(640-642) CAT
    优选序列157：(646-648) CAA 优选序列158：(649-651) TTG 优选序列159：(652-654) CCA 优选序列160：(655-657) TTG 优选序列161：(658-660) GTT 优选序列162：(661-663) ATT 优选序列163：(664-666) GAA 优选序列164：(667-669) TTT 优选序列165：(670-672) ACT 优选序列166：(673-675) GAA 优选序列167：(676-678) CAA 优选序列168：(679-681) ACT 优选序列169：(682-684) GCT 优选序列170：(685-687) CCA 优选序列171：(697-699) GGT 优选序列172：(706-708) ATT 优选序列173：(715-717) CAT 优选序列174：(718-720) ATT 优选序列175：(721-723) TTG 优选序列176：(724-726) TTG 优选序列177：(727-729) TTT
    优选序列178：(733-735) CCA 优选序列179：(739-741) TCT 优选序列180：(742-744) GTT 优选序列181：(748-750) GAT 优选序列182：(751-753) TAC 优选序列183：(754-756) GAT 优选序列184：(757-759) GGT 优选序列185：(760-762) AAG 优选序列186：(763-765) TTG 优选序列187：(766-768) TCT 优选序列188：(772-774) TTT 优选序列189：(775-777) AAG 优选序列190：(778-780) ACT 优选序列191：(781-783) GCT 优选序列192：(784-786) GCT 优选序列193：(787-789) GAA 优选序列194：(790-792) TCT 优选序列195：(793-795) TTT 优选序列196：(799-801) GGT 优选序列197：(805-807) ATT 优选序列198：(808-810) TTG
    优选序列199：(811-813) TTT 优选序列200：(814-816) ATT 优选序列201：(817-819) TTT 优选序列202：(820-822) ATT 优选序列203：(823-825) GAT 优选序列204：(826-828) TCT 优选序列205：(829-831) GAT 优选序列206：(832-834) CAT 优选序列207：(835-837) ACT 优选序列208：(838-840) GAT 优选序列209：(844-846) CAA 优选序列210：(847-849) AGA 优选序列211：(850-852) ATT 优选序列212：(853-855) TTG 优选序列213：(856-858) GAA 优选序列214：(859-861) TTT 优选序列215：(865-867) GGT 优选序列216：(868-870) TTG 优选序列217：(880-882) GAA 优选序列218：(883-885) TGT 优选序列219：(886-888) CCA
    优选序列220：(889-891) GCT 优选序列221：(892-894) GTT 优选序列222：(895-897) AGA 优选序列223：(898-900) TTG 优选序列224：(901-903) ATT 优选序列225：(904-906) ACT 优选序列226：(907-909) TTG 优选序列227：(910-912) GAA 优选序列228：(913-915) GAA 优选序列229：(916-918) GAA 优选序列230：(922-924) ACT 优选序列231：(934-936) CCA 优选序列232：(940-942) TCT 优选序列233：(943-945) GAA 优选序列234：(946-948) GAA 优选序列235：(949-951) TTG 优选序列236：(952-954) ACT 优选序列237：(955-957) GCT 优选序列238：(958-960) GAA 优选序列239：(961-963) AGA 优选序列240：(964-966) ATT
    优选序列241：(967-969) ACT 优选序列242：(970-972) GAA 优选序列243：(973-975) TTT 优选序列244：(976-978) TGT 优选序列245：(979-981) CAT 优选序列246：(982-984) AGA 优选序列247：(985-987) TTT 优选序列248：(988-990) TTG 优选序列249：(991-993) GAA 优选序列250：(994-996) GGT 优选序列251：(997-999) AAG 优选序列252：(1000-1002) ATT 优选序列253：(1006-1008) CCA 优选序列254：(1009-1011) CAT 优选序列255：(1012-1014) TTG 优选序列256：(1018-1020) TCT 优选序列257：(2021-1023) CAA 优选序列258：(1024-1026) GAA 优选序列259：(1027-1029) TTG 优选序列260：(1030-1032) CCA 优选序列261：(1033-1035) GAA
    优选序列262：(1036-1038) GAT 优选序列263：(1042-1044) GAT 优选序列264：(1048-1050) CAA 优选序列265：(1051-1053) CCA 优选序列266：(1054-1056) GTT 优选序列267：(1060-1062) GTT 优选序列268：(1063-1065) TTG 优选序列269：(1069-1071) GGT 优选序列270：(1084-1086) GAT 优选序列271：(1087-1089) GTT 优选序列272：(1099-1101) GAA 优选序列273：(1102-1104) AAG 优选序列274：(1105-1107) AAG 优选序列275：(1111-1113) GTT 优选序列276：(1117-1119) GTT 优选序列277：(1120-1122) GAA 优选序列278：(1123-1125) TTT 优选序列279：(1126-1128) TAC 优选序列280：(1129-1131) GCT 优选序列281：(1144-1146) CAT 优选序列282：(1147-1149) TGT
    优选序列283：(1150-1152) AAG 优选序列284：(1153-1155) CAA 优选序列285：(1162-1164) CCA 优选序列286：(1174-1176) AAG 优选序列287：(1177-1179) TTG 优选序列288：(1180-1182) GGT 优选序列289：(1183-1185) GAA 优选序列290：(1186-1188) ACT 优选序列291：(1195-1197) GAT 优选序列292：(1201-1203) GAA 优选序列293：(1207-1209) ATT 优选序列294：(1210-1212) GTT 优选序列295：(1213-1215) ATT 优选序列296：(1216-1218) GCT 优选序列297：(1225-1227) GAT 优选序列298：(1228-1230) TCT 优选序列299：(1234-1236) GCT 优选序列300：(1240-1242) GAA 优选序列301：(1243-1245) GTT 优选序列302：(1246-1248) GAA 优选序列303：(1249-1251) GCT
    优选序列304：(1252-1254) GTT 优选序列305：(1255-1257) AAG 优选序列306：(1258-1260) GTT 优选序列307：(1261-1263) CAT 优选序列308：(1264-1266) TCT 优选序列309：(1267-1269) TTT 优选序列310：(1270-1272) CCA 优选序列311：(1273-1275) ACT 优选序列312：(1276-1278) TTG 优选序列313：(1282-1284) TTT 优选序列314：(1288-1290) CCA 优选序列315：(1291-1293) GCT 优选序列316：(1294-1296) TCT 优选序列317：(1297-1299) GCT 优选序列318：(1300-1302) GAT 优选序列319：(1303-1305) AGA 优选序列320：(1306-1308) ACT 优选序列321：(1309-1311) GTT 优选序列322：(1324-1326) GGT 优选序列323：(1330-1332) AGA 优选序列324：(1333-1335) ACT
    优选序列325：(1336-1338) TTG 优选序列326：(1351-1353) AAG 优选序列327：(1354-1356) TTT 优选序列328：(1357-1359) TTG 优选序列329：(1360-1362) GAA 优选序列330：(1363-1365) TCT 优选序列331：(1369-1371) GGT 优选序列332：(1372-1374) CAA 优选序列333：(1378-1380) GGT 优选序列334：(1381-1383) GCT 优选序列335：(1384-1386) GGT 优选序列336：(1393-1395) GAT 优选序列337：(1399-1401) TTG 优选序列338：(1402-1404) GAA 优选序列339：(1405-1407) GAT 优选序列340：(1408-1410) TTG 优选序列341：(1417-1419) GCT 优选序列342：(1420-1422) GAA 优选序列343：(1423-1425) GAA 优选序列344：(1429-1431) GAT 优选序列345：(1435-1437) GAA
    优选序列346：(1441-1443) GAT 优选序列347：(1450-1452) CAA 优选序列348：(1453-1455) AAG 优选序列349：(1459-1461) GTT 优选序列350：(1462-1464) AAG 优选序列351：(1471-1473) TTG
    。
  15. 一种提高重组人白蛋白表达质量减少降解的物质，其特征在于，其为序列或者序列物质或者是序列所表达的物质，序列为如下任意一种或者多种序列：
    SEQ ID NO.1人白蛋白信号肽编码序列；
    SEQ ID NO.2人白蛋白信号肽优选序列；
    SEQ ID NO.3人白蛋白成熟肽编码序列；
    SEQ ID NO.4人白蛋白成熟肽优选序列；
    SEQ ID NO.5人白蛋白成熟肽优选序列；
    SEQ ID NO.6酵母蛋白二硫键异构酶信号肽编码序列；
    SEQ ID NO.7酵母蛋白二硫键异构酶成熟肽编码序列；
    SEQ ID NO.8酿酒酵母交配因子信号肽编码序列；
    SEQ ID NO.9人蛋白二硫键异构酶信号肽编码序列；
    SEQ ID NO.10人蛋白二硫键异构酶信号肽优选序列；
    SEQ ID NO.11人蛋白二硫键异构酶成熟肽编码序列；
    SEQ ID NO.12人蛋白二硫键异构酶成熟肽优选序列；
    SEQ ID NO.13人蛋白二硫键异构酶成熟肽优选序列；
    SEQ ID NO.14HSA-F引物序列；
    SEQ ID NO.15HSA-R引物序列；
    SEQ ID NO.16酵母PDI-F引物序列；
    SEQ ID NO.17酵母PDI-R引物序列；
    SEQ ID NO.18人PDI-F引物序列；
    SEQ ID NO.19人PDI-R引物序列。
  16. 一种用途，其特征在于，用途为如下任意一种用途：SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.19任意一种或者多种在提高重组人白蛋白表达质量减少降解中的用途；提高重组人白蛋白表达质量减少降解的方法制备中或者制备后的序列、质粒、细胞、产物在治疗疾病的用途；提高重组人白蛋白表达质量减少降解的方法制备中或者制备后的序列、质粒、细胞、产物作为药物在治疗疾病中的用途；提高重组人白蛋白表达质量减少降解的方法制备中或者制备后的序列、质粒、细胞、产物在发酵产业中的用途。
  17. 利用SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.19任意一种或者多种序列基因操作后的宿主细胞或者质粒。
  18. 利用SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.19任意一种或者多种序列基因操作后的宿主细胞表达的人白蛋白。
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