CN1733914A - 高活性液体食品级果胶酶的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种果胶酶的制造方法，尤其涉及高活性液体食品级果胶酶的制造方法，该方法以HB－006为出发菌株，经紫外线、亚硝基胍、60COr射线、DES等诱变剂复合诱变和微波诱变处理，定向筛选，选育出高产果胶酶菌株YS－435；并对传统工艺进行了改进，以二级发酵菌丝体接种代替孢子悬浮液直接接种和采用稀醪发酵，适时限量补料，控制pH值的办法，提高发酵单位20％，缩短发酵周期34小时；并把二滤除菌技术应用于食品级果胶酶生产，开发出食品级果胶酶产品，形成一套完整的果胶酶生产工艺技术。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶制剂的制造方法，尤其涉及一种高活性液体食品级果胶酶的制造方法，属微生物发酵领域。
背景技术
果胶酶是分解果胶质的多种酶的总称，是一类复合酶.主要应用于食品工业中，还可应用在麻脱胶、木材防腐等方面。目前，水果加工业中使用量最大的酶制剂是果胶酶，它能有效地提高水果加工的出汁率，降低粘度、提高果汁澄清度，改善产品品质。随着山楂和猕猴桃等果品的开发利用，尤其是酶法液化生产果汁技术的推广应用，果胶酶的需求量正在逐步增大。
在国内酶制剂的工业化生产中，一般有固态发酵法和液体深层发酵法之分。采用固体发酵法较多。固态发酵法又称曲法培养，该方法比较粗放，往往混杂有其它杂菌菌株混合发酵，不能达到纯种发酵，酶分离提纯难度大，发酵提取易感染杂菌，劳动强度大，难于对工艺参数进行合理控制，产品质量很难达到食品行业的使用要求，只能生产工业用酶。这使得果胶酶在食品工业中的应用受到很大限制，而液体深层发酵法机械化程度高，发酵条件易控制(部分罐实现自动化控制)，而且酶的产率高、质量好，可实现食品级产品开发。
但目前，在由黑曲霉菌株选育经液体深层发酵法制取果胶酶的生产工艺中，大多采用单因子诱变筛选突变株，效果不理想，也有用复合诱变的方法筛选突变株，它通过多因子不同剂量复合诱变，有效改善菌株对诱变剂的敏感性，提高变异率。为此，选择适当的诱变条件筛选菌株是获得高活性果胶酶的关键。特别是近几年，菌种选育工作已成为国内外果胶酶生产的研究重点。
发明内容
本发明目的在于提供一种采用液体发酵法利用复合诱变的菌种生产高活性液体食品级果胶酶的制造方法。
为实现本发明目的，本发明技术方案通过如下方式实现：
本发明把微波诱变和常规诱变技术相结合应用于黑曲霉果胶酶菌株选育，通过多因子不同剂量复合诱变和微波诱变处理相结合诱变方法，有效地改善菌株对诱变剂的敏感性，提高变异率，逐步提高突变株的产酶水平，按照液体发酵法的条件和要求，筛选出适合液体发酵的生产菌株。在发酵工艺技术中，选用二级发酵菌丝体接种代替孢子悬浮液直接接种和采用稀醪发酵，适时限量补料，控制pH值；在提取工艺上，以板框过滤，超滤膜浓缩为基础，增加二滤和精滤技术，以确保产品质量符合食品用酶卫生要求。具体方法如下：
(1)选育出高产果胶酶菌株YS-435：采用HB-006为出发菌株，依次经紫外线、亚硝基胍、60COr射线、DES诱变剂复合诱变和微波诱变处理，定向筛选、选育出高产果胶酶菌株YS-435；
(2)配制发酵培养基原料，以重量百分比计：甜菜渣2％、苹果渣1.2％、乳清粉0.4％、硫酸铵0.3％、硫酸镁0.1％、氯化钾0.5％、硫酸钙0.15％、硫酸亚铁40ppm、磷酸氢二钾0.01％、余量为水，调节pH5.0-5.5；
(3)配制发酵补料培养基原料：甜菜渣6.5％、苹果渣2％、麸皮1％、硫碳酸铵0.3％、柠檬酸钠0.3％、消后pH5.0-5.5；
(4)调节二级发酵菌丝体接种代替孢子悬浮液直接接种，按发酵培养剂原料量2.5-3％的比例接入选育出的高产果胶酶菌株YS-435并使之混合均匀，调节PH 3.0-4.5，于28-30℃条件下稀醪发酵，当DE低于0.4时补补入上述发酵补料培养基原料，使DE值达到0.5，发酵60-65小时；
(5)提取滤液：将滤液与滤渣用板框过滤、再二次过滤，然后经超滤膜浓缩，最后精滤得液体成品。
出发菌株HB-006(Aspergillus)通过如下方式获得：选用河南省科学院生物研究所保藏的黑曲霉5株，中国工业微生物菌种保藏中心黑曲霉3株，以及我们从霉变苹果中分离的10株，共18株，通过选择性培养基和5％果胶的麦芽汁检查方法进行初筛，并通过发酵摇床测定酶活力，最终选出产酶399μ/ml的HB-006(Aspergillus)为出发菌株。
紫外线诱变条件：20W紫外线灯30cm处照射5-30min；亚硝基胍(NTG)诱变条件：用pH6.0、0.2mol/l磷酸盐缓冲液制成的孢子悬液于同样的磷酸盐缓冲液的NTG液等量混合，分别以0.25、0.5、1.0mg/ml NTG浓度，30℃温度20min，稀释法终止反应；60COr射线辐射诱变：分别以8万、10万伦琴进行60COr照射处理；紫外线DES复合诱变，吸取50％的DES乙醇液0.2ml，置于100ml三角瓶中，加入0.2mol/l、pH 7.2的磷酸缓冲液5ml，经紫外照射10分钟的单孢子悬浮液5ml，于30℃摇床转速200r/min条件下振荡培养60分钟，加入25％的硫代硫酸钠溶液1ml，终止反应；微波诱变：调整微波炉功率为700W，脉冲频率为2450HZ，辐照处理20-60分。
该发明工艺特点：
1、采用中间补料能延长发酵产物的分泌期，推迟菌种的自溶期，保持较高的发酵产物增长辐度，并增加发酵体积，使单罐产量大幅度上升。果胶酶发酵过程中的补料既包括营养物质C、N源的补入，也包括无机盐(氨水、硫酸)的补入。氨水、硫酸的补入在于维持pH稳定在3.0-4.5之间，以利于最适产酶pH。营养物质的补入在于及时补充菌体代谢活动和合成酶产品所需的C.N源及合适C/N。果胶酶属于诱导酶，补入的甜菜渣、苹果渣既充当C源又是酶合成的诱导物，对酶合成产量提高有较大影响。同时，为防止黑曲霉在酸性条件下产生酸性蛋白酶，在补料配料中加入柠檬酸钠作抑制剂。补料要根据菌体生长代谢规律和产酶合成途径，采取少补、勤补的原则，补料后提高酶活力33％，适时限量补料对果胶酶生产来说十分重要。
2、采用稀醪低浓度发酵更有利于菌体生长产酶，可避免原料中果胶类物质降解过量而引起分解代谢阻遏，有利于pH值控制，延长产酶期，提高产量。浓醪发酵较稀醪发酵单位时间产酶率低，周期长。
3、提取浓缩工艺：按照食品级酶制剂生产要求，不但选育了适合生产的安全菌株，而且在提取工艺上增加二滤、精滤过滤设备，以充分保证成品酶制剂中不含发酵液残渣，不夹带危害健康的杂质，细菌总数控制在限定范围之内，实现了食品级果胶酶的生产。
4、二滤设备的选择及二滤工艺：对于液体酶的生产，滤液的清浊直接影响着液体酶品质及超滤设备的使用。发酵成熟醪打入回收罐后，加入0.2％的苯甲酸钠抑菌剂，防止提纯过程中杂菌生长，然后直接进入大板框过滤机进行过滤(简称粗滤或一滤)。在粗滤过程中，往往由于设备原因及人为原因造成浑液少量误流入清液中，不但达不到分离的效果，而且影响产品质量，影响后道工序超过滤膜通透性及使用寿命。为此，在工艺制定中增加二滤设备，并连接了相关管道，滤液经二滤后进入超滤膜过滤。
5、超滤浓缩工艺与精滤除菌工艺：采用精滤板框过滤机，配合硅藻土(藻土)预涂工艺进行过滤除菌，利用硅藻土较大的比表面积(10-20m2/g)，较少粒度2-100um，具有较大的吸附和渗透能力，能滤降0.1-1.0um粒子和菌体，在以滤布为支持介质的表面上预涂硅藻土薄层(预涂层)以保护支持介质的毛细孔道在较长时间内不被悬浮液中的固体粒子所堵塞，从而提高过滤速度，达到稳定过滤除菌效果。因此，成品中杂菌数明显降低，除菌率达80％以上，成品精滤菌除后存放60天，杂菌数几乎没有增长或增长甚少。
本发明有益效果在于，
1、通过UV、CO60、NTG、DES等传统诱变与微波处理相结合的复合诱变技术，选育出一株果胶酶高产菌株YS-435，经小试和中试产酶试验，活力分别达到1062u/ml和1394u/ml。
2、利用本技术工业化生产果胶酶平均放罐活力2009u/ml，最高产酶水平达2136u/ml(以行业标准QB1502-1992测定)，产品综合回收率60％以上。
3、本工艺以二级发酵菌丝体接种代替孢子悬浮液直接接种和采用稀醪发酵，适时限量补料，控制PH值的办法，提高发酵单位20％，缩短发酵周期34小时；并把二滤除菌技术应用于食品级果胶酶生产，开发出食品级果胶酶产品，具有较高的生产、应用价值。
附图说明
图1果胶酶液体发酵法工艺流程图
图2果胶酶生产菌诱变选育路线图谱
具体实施方式
为更好地对本发明进行详细说明，举实施例如下：
实施例
1、选育出高产果胶酶菌株YS-435：
选用河南省科学院生物研究所保藏的黑曲霉5株，中国工业微生物菌种保藏中心黑曲霉3株，以及我们从霉变苹果中分离的10株，共18株，通过选择性培养基和5％果胶的麦芽汁检查方法进行初筛，并通过发酵摇床测定酶活力，最终选出产酶399μ/ml的HB-006(Aspergillus)为出发菌株。依次经紫外线、亚硝基胍、60COr射线、DES诱变剂复合诱变和微波诱变处理，定向筛选、选育出高产果胶酶菌株YS-435。
诱变方法：
(1)孢子悬浮液制备：培养5天的斜面菌种，用无菌生理盐水洗下孢子，经玻璃珠打散，镜头纸8层过滤，制成含孢子106-108孢子悬液。
(2)紫外线诱变：取10ml孢子悬浮液于9cm平皿中，磁力搅拌，20W紫外线灯30cm处照射5-30min。
(3)亚硝基胍(NTG)诱变：用pH6.0、0.2mol/1磷酸盐缓冲液制成的孢子悬液于同样的磷酸盐缓冲液的NTG液等量混合，分别以0.25、0.5、1.0mg/ml NTG浓度，30℃温度20min，稀释法终止反应。
(4)60COr射线辐射诱变：取10ml孢子悬浮液于无菌试管中，分别以8万、10万伦琴进行60COr照射处理(委托省科学院同位素所辐照中心处理)。
(5)紫外线DES复合诱变，吸取50％的DES乙醇液0.2ml，置于100ml三角瓶中，加入0.2mol/l、pH 7.2的磷酸缓冲液5ml，经紫外照射10分钟的单孢子悬浮液5ml，于30℃摇床转速200r/min条件下振荡培养60分钟，加入25％的硫代硫酸钠溶液1ml，终止反应。
(6)微波诱变：吸取制得孢子悬浮液，注入底部平整的平皿中，每个平皿的悬液量为10ml，调整微波炉(格兰仕)功率为700W，脉冲频率为2450HZ，辐照处理40分，然后适当稀释涂选择平板。
表一：果胶酶诱变选育产酶结果
| 诱变剂名称 | 出发菌株 | 剂量或时间 | 致死率 | 挑菌数(株) | 正变率 | 代表株 | 产酶μ/ml |
| 紫外线 | HB-006 | 5min | 79％ | 38 | 40％ | YS-001YS-012YS-026YS-027YS-033 | 441489500456443 |
| 15min | 92％ | 31 | 52％ | YS-041YS-055YS-057YS-060 | 465511508440 | ||
| 30min | 99％ | 36 | 18％ | YS-088YS-092YS-093YS-094 | 469495474478 |
| 亚硝基胍 | YS-055 | 0.25mg/ml | 97％ | 21 | 27％ | YS-108YS-113YS-120 | 563562563 |
| 0.50mg/ml | 98.5％ | 34 | 42％ | YS-137YS-138YS-142 | 564566569 | ||
| 1.0mg/ml | 99.6％ | 19 | 32％ | YS-161YS-162YS-169 | 564570577 | ||
| 60Cor射线辐射 | YS-169 | 8万伦琴 | 99％ | 42 | 46％ | YS-211YS-234YS-235 | 670716696 |
| 10万伦琴 | 99.7％ | 21 | 23％ | YS-241YS-248YS-263 | 703700679 | ||
| 紫外线DES | YS-234 | 紫外线照10分钟1％DES | 98％ | 35 | 34％ | YS-308YS-321YS-322YS-329 | 823800799795 |
| 微波处理 | YS-308 | 30秒 | 95％ | 41 | 48％ | YS-421YS-424YS-435 | 98710211062 |
| 60秒 | 99％ | 29 | 35％ | YS-440YS-455YS-469 | 10411015999 |
分析方法：
(1)果胶酶酶活力测定：中华人民共和国行业标准QB1502-1992，酶活力定义为：1g固体酶粉(或lml液体酶)在50℃，PH3.5条件下，每小时水解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活单位。
(2)还原糖测定：裴林法
(3)pH值测定：精密pH仪测定
(4)菌体生长量：取发酵5ml，4000r/min离心10min，蒸馏水洗3次，弃上清液，湿菌体105℃干燥至衡重后称重。
2、培养基的配制：
(1)斜面培养基：葡萄糖30g，硝酸钠2g，磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，琼脂20g，定容1L，pH6.0。
(2)平板选择培养基：2％蔗糖、2％果胶、0.2％硝酸铵、0.2％硝酸钠、0.05％硫酸钠、0.5％硫酸镁、0.5％氯化钾、0.1％磷酸氢二钾、硫酸亚铁20ppm、2％琼脂、pH5.0。
(3)摇瓶发酵培养基：2％蔗糖、2％果胶、0.2％硝酸铵、0.2％硝酸钠、0.05％硫酸钠、0.5％硫酸镁、0.5％氯化钾、0.1％磷酸氢二钾、硫酸亚铁20ppm、pH5.0。
(4)液体种子培养基：苹果渣2％、麸皮1％、甜菜渣1％、葡萄糖0.6％、硫酸铵1％、氯化钙0.1％、硫酸镁0.2％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸亚铁0.01％、氯化钾0.12％、消后pH5.0-5.5。
(5)发酵培养基：甜菜渣2％、苹果渣1.2％、乳清粉0.4％、硫酸铵0.3％、硫酸镁0.1％、氯化钾0.5％、硫酸钙0.15％、硫酸亚铁40ppm、磷酸氢二钾0.01％、pH5.0-5.5。
(6)发酵补料培养基：甜菜渣6.5％、苹果渣2％、麸皮1％、硫碳酸铵0.3％、柠檬酸钠0.3％、消后pH5.0-5.5。
3、发酵：
将培养成熟的YS-435茄子瓶斜面菌株，制成孢子悬浮液，用接种钢瓶接入装有0.7m3种子发酵培养基的1m3种子发酵罐培养，温度30±1℃，罐压0.06-0.08Mpa(表)，通风量30-90m3/hr，培养约30hr接入35m3大发酵罐(装料系数70％)，温度控制在30±1℃，罐压0.06-0.08mpa(表)，通风量400-1000m3/hr，pH值3.0-4.5，pH低于3.0时通氨，pH高于4.5时加酸回调至4.0。当DE下降至0.4时补料，补料要少补、勤补。连续试验8批次，发酵试验结果如表二。
表二：连续8批次发酵试验结果
| 序号 | 罐号 | 消后PH | 消后DE值(mg/ml) | 首次通氨时间(hr) | 放罐DE(mg/ml) | 放罐PH | 放罐酶活力(μ/ml) | 发酵周期(hr) |
| 1 | 303 | 5.1 | 0.61 | 10 | 0.15 | 3.5 | 1900 | 56 |
| 2 | 304 | 5.3 | 0.62 | 12 | 0.13 | 3.5 | 2086 | 57 |
| 3 | 305 | 5.3 | 0.57 | 11 | 0.18 | 3.6 | 1924 | 64 |
| 4 | 308 | 5.1 | 0.54 | 13 | 0.20 | 3.6 | 1897 | 65 |
| 5 | 307 | 5.4 | 0.55 | 13 | 0.19 | 3.5 | 2008 | 58 |
| 6 | 306 | 5.0 | 0.60 | 11 | 0.11 | 3.6 | 2136 | 70 |
| 7 | 303 | 5.2 | 0.61 | 12 | 0.13 | 3.6 | 2014 | 68 |
| 8 | 302 | 5.2 | 0.58 | 10 | 0.20 | 3.5 | 2107 | 60 |
| 平均值 | 5.2 | 0.58 | 11.5 | 0.16 | 3.55 | 2009 | 62 |
采用适时限量补料，调控PH值的办法，通过对发酵过程的控制，使YS-435菌株在深层液体发酵中产酶能力有极大提高，8批次35吨罐生产平均产酶2009μ/ml，最高罐产酶2136μ/ml。
4、提取滤液：将滤液与滤渣用板框过滤、再二次过滤，然后经超滤膜浓缩，最后精滤得液体成品。
表三果胶酶提纯试验结果
5、果胶酶的应用试验
一般新鲜水果含果胶1％左右，植物果实中含有较多果胶，水果在加工过程中如压榨过滤时因粘度大而受到阻碍，因此在水果加工中使用果胶酶能有效地将果胶水解，降低果汁粘度，加快过滤速度，提高出汁率，我们将自己开发的果胶酶产品在苹果汁、葡萄汁中进行了应用试验，并与进口德国酶相对比，其结果如下：
表四果胶酶在果汁中的应用试验结果
| 果汁种类 | 加酶情况 | 果汁装量(ml) | 不同时间澄清效果 | ||
| 5hr(葡萄汁3hr) | 13hr | 22hr(葡萄汁20hr) | |||
| 苹果汁 | 仰韶生化酶 | 25 | 3/5黄色透明 | 1/6黄色透明 | 黄色透明液 |
| 进口德国酶 | 25 | 1/6黄色透明 | 1/6黄色透明 | 黄色透明液 | |
| 对照 | 25 | 混浊 | 混浊 | 混浊 | |
| 葡萄汁 | 仰韶生化酶 | 100 | 颗粒凝集底部下沉物16ml | / | 下沉物10ml清液90ml |
| 进口德国酶 | 100 | 沉淀物14ml | / | 下沉物9ml清液91ml | |
| 对照 | 100 | 略有下降 | / | 液体混浊 | |
上表说明，通过本工艺制取的果胶酶(仰韶生化酶)与德国进口酶在苹果汁，葡萄汁澄清效果上相差不大，与对照相比，具有明显的澄清效果，降低了粘度，起到加快滤速作用。
Claims (3)
1、一种高活性液体食品级果胶酶的制造方法，其特征在于，按如下步骤进行：
(1)选育出高产果胶酶菌株YS-435：采用HB-006为出发菌株，依次经紫外线、亚硝基胍、60COr射线、DES诱变剂复合诱变和微波诱变处理，定向筛选、选育出高产果胶酶菌株YS-435；
(2)配制发酵培养基原料，以重量百分比计：甜菜渣2％、苹果渣1.2％、乳清粉0.4％、硫酸铵0.3％、硫酸镁0.1％、氯化钾0.5％、硫酸钙0.15％、硫酸亚铁40ppm、磷酸氢二钾0.01％、余量为水，调节pH5.0-5.5；
(3)配制发酵补料培养基原料：甜菜渣6.5％、苹果渣2％、麸皮1％、硫碳酸铵0.3％、柠檬酸钠0.3％、消后pH5.0-5.5；
(4)调节二级发酵菌丝体接种代替孢子悬浮液直接接种，按发酵培养剂原料量2.5-3％的比例接入选育出的高产果胶酶菌株YS-435并使之混合均匀，调节PH 3.0-4.5，于28-30℃条件下稀醪发酵，当DE低于0.4时补入上述发酵补料培养基原料，使DE值达到0.5，发酵55-60小时；
(5)提取滤液：将滤液与滤渣用板框过滤、再二次过滤，然后经超滤膜浓缩，最后精滤得液体成品。
2、如权利要求1所述的果胶酶的制造方法，其特征在于，出发菌株HB-006(Aspergillus)通过如下方式获得：选用河南省科学院生物研究所保藏的黑曲霉5株，中国工业微生物菌种保藏中心黑曲霉3株，以及我们从霉变苹果中分离的10株，共18株，通过选择性培养基和5％果胶的麦芽汁检查方法进行初筛，并通过发酵摇床测定酶活力，最终选出产酶399μ/ml的HB-006(Aspergillus)为出发菌株。
3、如权利要求1所述的果胶酶的制造方法，其特征在于，紫外线诱变条件：20W紫外线灯30cm处照射5-30min；亚硝基胍(NTG)诱变条件：用pH6.0、0.2mol/l磷酸盐缓冲液制成的孢子悬液于同样的磷酸盐缓冲液的NTG液等量混合，分别以0.25、0.5、1.0mg/ml NTG浓度，30℃温度20min，稀释法终止反应；60COr射线辐射诱变：分别以8万、10万伦琴进行60COr照射处理；紫外线DES复合诱变，吸取50％的DES乙醇液0.2ml，置于100ml三角瓶中，加入0.2mol/l、pH7.2的磷酸缓冲液5ml，经紫外照射10分钟的单孢子悬浮液5ml，于30℃摇床转速200r/min条件下振荡培养60分钟，加入25％的硫代硫酸钠溶液1ml，终止反应；微波诱变：调整微波炉功率为700W，脉冲频率为2450HZ，辐照处理20-60分。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |