CN111893151A - 一种连续化生产低分子量透明质酸的方法及所得低分子量透明质酸和应用 - Google Patents

一种连续化生产低分子量透明质酸的方法及所得低分子量透明质酸和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供给了一种连续化生产低分子量透明质酸的方法及所得低分子量透明质酸和应用，属于生物技术领域。本发明提供的连续化生产低分子量透明质酸的方法，包括如下步骤：获得透明质酸酶；将高分子量透明质酸溶液持续加入设置有超滤膜的装置；在所述透明质酸酶的作用下进行酶解；酶解所得低分子量透明质酸透过超滤膜，得到低分子量透明质酸滤液；所述超滤膜的孔径为2～20KDa之间的任意一种；将所述低分子量透明质酸滤液进行脱水干燥，得到低分子量透明质酸。本发明提供的方法制备的低分子量透明质酸分子量分布较窄，分子结构完整，且制备条件温和高效、生产成本低，可实现连续化生产，易于工业化生产。

Description

一种连续化生产低分子量透明质酸的方法及所得低分子量透 明质酸和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种连续化生产低分子量透明质酸的方法及所得低分子量透明质酸和应用。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid，HA)，又称为玻尿酸，是一种以D-葡萄糖醛酸(Glca)和N-乙酰-葡萄糖胺(GlcNAC)为双糖单位聚合而成的酸性粘多糖。广泛存在于动物和人体的组织细胞间质和某些细菌的荚膜中。
透明质酸由于具有高保水性和良好的生物相容性，而广泛应用于化妆品、保健品和临床医学。不同分子量的透明质酸展现出不同的生物学活性。分子量一般在1×106～1.5×106Da，透明质酸具有粘弹性好、流动性弱的特点，在医药上用做眼药水，具有良好的药物缓释作用，眼球起到润滑和保护的作用，有效的治疗眼睛干涩；相对分子量为20到60kDa的低分子可刺激体外培养的骨细胞的增生，增加培养基中骨细胞的数目；3～6个双糖单位的寡聚HA在体内能促进血管的生成，在体外可以促进内皮细胞的增生；酶解法制备的8～16个双糖单位的寡聚HA能明显促进鸡胚角膜血管的生成，而高分子量的透明质酸则没有这种功能。
HA制备方法主要有动物组织提取法和微生物发酵法，但得到透明质酸分子量一般在0.8×106～1.5×106Da，要得到更小分子量的透明质酸必须经过水解，一般水解方法有三种：物理法、化学法和酶法，但这些方法水解过程都是随机性的，水解产物的分子量分布较广，直接使用就会影响产品功效，要得到分子量分布窄的低分子量透明质酸就必须再次经过分步提纯法才能获得，但这就增加了生产成本，也影响产品收率。
现在有较多的专利和文献报道透明质酸的制备方法，在制备小分子或寡聚透明质酸方面都是采用水解工序与提取工序独立分批的传统方式，难于同时兼顾到提高产量质量和降低成本，给产业化生产带来了难点。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种连续化生产低分子量透明质酸的方法及所得低分子量透明质酸和应用，本发明提供的方法制备的低分子量透明质酸分子量分布较窄，分子结构完整，且制备条件温和高效、生产成本低，可实现连续化生产，易于工业化生产。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种连续化生产低分子量透明质酸的方法，包括如下步骤：
1)获得透明质酸酶；所述透明质酸酶由重组毕氏酵母LC32136发酵培养得到；
2)将高分子量透明质酸溶液持续加入设置有超滤膜的装置；在步骤1)所述透明质酸酶的作用下进行酶解；酶解所得低分子量透明质酸透过超滤膜，得到低分子量透明质酸滤液；所述超滤膜的孔径为2～20KDa之间的任意一种；
3)将所述低分子量透明质酸滤液进行脱水干燥，得到低分子量透明质酸。
优选的，步骤1)所述透明质酸酶的酶活为5.2×106～9.5×106IU/mL。
优选的，步骤2)所述高分子量透明质酸溶液中高分子透明质酸的质量百分含量为0.5％～20％；所述透明质酸酶的添加量为高分子量透明质酸溶液体积的0.5％～10％。
优选的，所述高分子透明质酸的分子量≥20KDa。
优选的，步骤2)所述水解的温度为30～50℃，所述水解的pH值为4.5～7.0。
优选的，自开始酶解4h后，所得酶解液开始通过超滤膜进行过滤截留；开始进行过滤截留后，每隔2～4h在所述酶解液中补加高分子量透明质酸，所述高分子量透明质酸的补加量为初始量的10～50％；每隔8～14h在所述酶解液中补加水，所述水的补加量为初始水体积30～50％；每隔1.5～2.5d在所述酶解液中补加透明质酸酶，所述透明质酸酶的补加量为初始酶液体积10～50％。
优选的，所述连续化生产结束前8～14h前，停止补加透明质酸和透明质酸酶。
优选的，步骤3)所述脱水干燥包括喷雾干燥和乙醇脱水干燥。
一种连续化生产低分子量透明质酸的装置，包括依次连通的酶催化反应釜、超滤膜、过滤收集罐和喷雾干燥塔；所述酶催化反应釜和超滤膜由管道连接，所述管道设置有输料泵；所述超滤膜设置回流装置，所述回流装置与酶催化反应釜连通；所述超滤膜和滤液收集罐连通，所述滤液收集罐和喷雾干燥塔连通。
本发明提供了上述技术方案的方法得到的低分子量透明质酸，所述低分子量透明质酸的平均分子量为超滤膜孔规格分子量的85％～95％之间，所述低分子量透明质酸的分子量分散系数PDI在1.2～1.5之间。
本发明提供了上述技术方案的方法得到的低分子量透明质酸在化妆品、保健品和医药上的应用。
有益效果：
本发明提供了一种连续化生产低分子量透明质酸的方法，包括如下步骤：获得透明质酸酶，所述透明质酸酶由重组毕氏酵母LC32136发酵培养得到；将高分子量透明质酸溶液持续加入设置有超滤膜的装置；在步骤1)所述透明质酸酶的作用下进行酶解；酶解所得低分子量透明质酸透过超滤膜，得到低分子量透明质酸滤液；所述超滤膜的孔径为2～20KDa之间的任意一种；将所述低分子量透明质酸滤液进行脱水干燥，得到低分子量透明质酸。本发明透明质酸酶由重组毕氏酵母LC32136表达，容易提纯，不含内毒素，且反应条件温和，专一性好，可良好保持低分子量透明质酸的完整性；本发明通过将酶催化和超滤膜藕联使酶催化反应和过滤同时进行，提高了制备效率；还能够及时将低分子量透明质酸分离出来，避免了低分子量透明质酸被继续水解成更小分子量的产物，使制备得到的低分子量透明质酸分子量分布更窄；将大分子量透明质酸和透明质酸酶回流至酶催化反应器，可以继续进行酶解反应，提高了大分子量透明质酸和透明质酸酶的利用率。本发明提供的方法制备的低分子量透明质酸分子量分布窄，分子结构完整，且制备条件温和高效、生产成本低，可实现连续化生产，易于工业化生产。实施例结果表明：本发明提供的低分子量透明质酸与酶解前高分子量的透明质酸红外图谱主要官能团一致，说明本发明得到的低分子量透明质酸分子结构完整；制备的低分子量透明质酸的凝胶渗透色谱分子量PDI值显著低于传统工艺的样品，说明本发明低分子量透明质酸分子量分布较窄；高分子量透明质酸转化成低分子量透明质酸的转化率高达94.3％～95.7％，转化效率高。
附图说明
图1为本发明连续化生产低分子量透明质酸的装置示意图；
图2为本发明连续化生产低分子量透明质酸的方法示意图；
图3为实施例2酶解前高分子量透明质酸红外图谱；
图4为实施例2酶解后低分子量透明质酸红外图谱。
具体实施方式
本发明提供了一种连续化生产低分子量透明质酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)获得透明质酸酶；所述透明质酸酶由重组毕氏酵母LC32136发酵培养得到；
2)将高分子量透明质酸溶液持续加入设置有超滤膜的装置；在步骤1)所述透明质酸酶的作用下进行酶解；酶解所得低分子量透明质酸透过超滤膜，得到低分子量透明质酸滤液；所述超滤膜的孔径为2～20KDa之间的任意一种；
3)将所述低分子量透明质酸滤液进行脱水干燥，得到低分子量透明质酸。
本发明获得透明质酸酶；所述透明质酸酶由重组毕氏酵母LC32136发酵培养得到。在本发明中，所述重组毕氏酵母LC32136中透明质酸酶的基因来源为水蛭，本发明所述重组毕氏酵母LC32136由浙江绿创生物科技股份有限公司实验室提供。在本发明中，所述透明质酸酶的酶活优选为5.2×106～9.5×106IU/mL，进一步优选为8.0×106IU/mL。本发明的透明质酸酶由酵母表达，容易提纯，不含内毒素；反应条件温和，专一性好，只能水解透明质酸，产物含有还原性末端，还原性末端具有抗氧化性，可以提高减缓皮肤衰老的功效。
获得透明质酸酶后，本发明将高分子量透明质酸溶液持续加入设置有超滤膜的装置；在所述透明质酸酶的作用下进行酶解；酶解所得低分子量透明质酸透过超滤膜，得到低分子量透明质酸滤液；所述超滤膜的孔径为2～20KDa之间的任意一种。在本发明中，所述设置有超滤膜的装置包括酶催化反应釜和超滤膜。在本发明中，所述酶解反应优选在酶催化反应釜进行，所述高分子量透明质酸溶液优选在所述酶催化反应釜配制。在本发明中，所述高分子量透明质酸溶液中高分子透明质酸的质量百分含量优选为0.5％～20％，进一步优选为2％；所述高分子透明质酸的分子量优选≥20kDa，进一步优选为600～800kDa，更进一步优选为650kDa，本发明选择该分子量的透明质酸能够使生产的低分子量透明质酸质量稳定，且易于溶解，操作更加方便。在本发明中，所述透明质酸酶的添加量优选为高分子量透明质酸溶液体积的0.5％～10％，进一步优选为2％。在本发明中，所述酶解的温度优选为30～50℃，进一步优选为38℃；所述酶解的pH值优选为4.5～7.0，进一步优选为5。本发明的酶解条件温和，通过酶解条件的优化，提高了酶解效率。本发明自开始酶解4h后，所得水解液开始通过超滤膜进行过滤截留，得到低分子量透明质酸滤液，所述超滤膜的孔径为2～20KDa之间的任意一种。在本发明中，所述超滤膜分离出分子量小于超滤膜孔径的低分子量透明质酸，得到低分子量透明质酸滤液，分子量大于超滤膜孔径的大分子透明质酸和透明质酸酶被截留，返回酶催化反应器继续酶切。在本发明中，所述超滤膜进行过滤截留优选在超滤膜过滤器中进行，所述超滤膜过滤器优选与酶催化反应釜藕联；如图1所示，所述超滤膜过滤器和酶催化反应釜通过输料泵连通；酶解所得水解液通过输料泵进入超滤膜过滤器进行过滤截留。本发明的超滤膜过滤器与酶催化反应釜藕联，使酶催化反应和过滤同时进行，能够及时将低分子量透明质酸分离出来，避免了低分子量透明质酸被继续水解成更小分子量的产物；同时，将大分子量透明质酸和透明质酸酶回流至酶催化反应器，可以继续进行酶解反应，提高了大分子量透明质酸和透明质酸酶的利用率。本发明将酶催化和超滤膜过滤藕联制备低分子量透明质酸，实现了低分子量透明质酸连续化生产，且制备工艺简单、制备的低分子量透明质酸结果完整，分子量分布较窄，大大降低了生产成本。本发明连续化生产低分子量透明质酸的方法示意图见图2。
开始通过超滤膜进行过滤截留后，本发明优选每隔2～4h在所述水解液中补加高分子量透明质酸，所述高分子量透明质酸的补加量优选为初始量的10～50％，进一步优选每隔2h补加初始量的20％；本发明优选每隔8～14h在所述水解液中补加水，所述水的补加量为初始水体积的30～50％，进一步优选每隔12h补加40％；本发明优选每隔1.5～2.5d在所述水解液中补加透明质酸酶，所述透明质酸酶的补加量为初始酶液体积的10～50％，进一步优选每隔48h补加20％。本发明优选在所述连续化生产结束前8～14h，停止补加透明质酸和透明质酸酶，进一步优选在所述连续化生产结束前12h停止补加。本发明通过补加底物和酶液保证了低分子量透明质酸可以连续化进行。
本发明提供了一种连续化生产低分子量透明质酸的装置，包括依次连通的酶催化反应釜、超滤膜、过滤收集罐和喷雾干燥塔；所述酶催化反应釜和超滤膜由管道连接，所述管道设置有输料泵；所述超滤膜设置回流装置，所述回流装置与酶催化反应釜连通；所述超滤膜和滤液收集罐连通，所述滤液收集罐和喷雾干燥塔连通。
本发明提供了上述技术方案的方法得到的低分子量透明质酸，所述低分子量透明质酸的分子量为超滤膜孔规格分子量的85％～95％之间，所述低分子量透明质酸的分子量分散系数PDI在1.2～1.5之间。
本发明提供了上述技术方案的方法得到的低分子量透明质酸在化妆品、保健品和医药上的应用。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种连续化生产低分子量透明质酸的方法及所得低分子量透明质酸和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的先定。
实施例1
透明质酸酶的制备
种子培养基：甘油20g/L，酵母浸膏10g/L，蛋白胨20g/L，用盐酸调pH至5.5。
发酵培养基：甘油2％，KH2PO40.2％，NH4H2PO41％，MgSO4.7H2O 0.5％，生物素50ppm条件下发酵240～300h。发酵培养基中包含甘油2～3％，KH2PO40.2～0.3％，NH4H2PO40.5～1％，MgSO4.7H2O 0.2～0.5％，生物素50～100ppm，PTM溶液0.2～0.5％。
取冻存管菌种(基因重组毕氏酵母(P.pastoris)LC32136)接种于已消毒的种子培养基中，30℃，220rpm培养24小时，然后接种于50L搅拌发酵罐(迪必尔生物工程(上海)有限公司，使用两组圆盘六平直叶涡轮搅拌浆)已消毒的培养基中进行分批发酵240h。接种量5％，发酵温度30℃，搅拌转速500r/min，通气比1.5VVM，发酵过程补加氨水控pH5.0。发酵生产得到的透明质酸酶发酵液经1000rpm三足离心机除去菌体得到清液，清液再经过200nm陶瓷膜过滤除去大分子蛋白和菌体碎片，滤液再经50nm陶瓷膜过滤除去色素和培养基中盐份及小分子杂质，截留液再用pH5.0的醋酸-磷酸盐缓冲液顶洗2遍，得到纯化后的透明质酸酶液。
采用中国药典方法测定发酵液中透明质酸酶活力为1.2×105IU/mL，纯化后的透明质酸酶活为9.5×106IU/mL。
实施例2
低分子量透明质酸制备
在50L酶催化反应釜中加入40L纯净水，边搅拌边加入分子量860kDa的高分子量透明质酸800g，完全溶解后用冰醋酸调pH5.0，温度控制在38℃，然后加入实例1制备的纯酶液800ml。酶切4h后通过与酶催化反应釜藕联的20kDa超滤膜装备分离出小于20kDa分子量的透明质酸，分子量大于20kDa的透明质酸和酶返回酶催化反应釜继续酶切，在酶催化反应釜每隔2h加入400g分子量860kDa的高分子量透明质酸，每12h补水15L，每2d补加实例1制备的纯酶液100ml，转化结束前12h停止补加透明质酸和纯酶液，连续转化7d，共投入高分子量透明质酸32kg，超滤膜透过液经喷雾干燥得30.2kg低分子量透明质酸粉末，平均分子量18.144kDa。
将酶解前的高分子量透明质酸和酶解后的低分子量透明质酸进行红外光谱扫描分析，结果见图3～4，图3为酶解前高分子量透明质酸红外图谱，图4为酶解后低分子量透明质酸红外图谱。由图3和图4可知，酶解前后的透明质酸分子主要官能团一致，说明酶解后得到的低分子量透明质酸的结构完整。
实施例3
低分子量透明质酸制备
在50L酶催化反应釜中加入40L纯净水，边搅拌边加入分子量860kDa的高分子量透明质酸800g，完全溶解后用冰醋酸调pH5.0，温度控制在38℃，然后加入实例1制备的纯酶液800ml。酶切4h后通过与酶催化反应釜藕联的10kDa超滤膜装备分离出小于10kDa分子量的透明质酸，分子量大于10kDa的透明质酸和酶返回酶催化反应釜继续酶切，在酶催化反应釜中每隔2h加入300g分子量860kDa的高分子量透明质酸，每12h补水15L，每2d补加实例1制备的纯酶液100ml，转化结束前12h停止补加透明质酸和酶液，连续转化7天，共投入高分子量透明质酸23kg，超滤膜透过液经喷雾干燥得21.5kg低分子量透明质酸粉末，平均分子量8.986kDa。
实施例4
低分子量透明质酸制备
在500L酶催化反应釜中加入400L纯净水，边搅拌边加入分子量1400kDa的高分子量透明质酸4kg，完全溶解后用冰醋酸调pH5.0，温度控制在38℃，然后加入实例1制备的纯酶液5L。酶切4h后通过与酶催化釜的6kDa超滤膜装备分离出小于6kDa分子量的透明质酸，分子量大于6kDa的透明质酸返回酶催化反应釜继续酶切，在酶切反应釜中每隔3h加入2kg分子量1400kDa的高分子量透明质酸，每12h补水150L，每2天补加实例1制备的纯酶液1L，转化结束前12小时停止补加透明质酸和酶液，连续转化15天，共投入高分子量透明质酸232kg，超滤膜透过液经喷雾干燥得220kg低分子量透明质酸粉末，平均分子量5.568kDa。
对比例1
传统酶解工艺制备低分子量透明质酸
在50L酶催化反应釜中加入40L纯净水，边搅拌边加入分子量860kDa的高分子量透明质酸800g，完全溶解后用冰醋酸调pH5.0，温度控制在38℃，然后加入实例1制备的纯酶液800ml进行酶解，酶解至所需分子量后升温至60℃维持30min灭酶，加入400g氯化钠，然后经孔径50nm陶瓷膜除去酶蛋白，在含低分子量透明质酸滤液中加入160kg乙醇，得低分子量透明质酸沉淀物，该沉淀物收集后用乙醇脱水，然后经真空干燥，得低分子量透明质酸721g，平均分子量8.658KDa。
对比例2
传统酶解工艺制备低分子量透明质酸
在50L酶催化反应釜中加入40L纯净水，边搅拌边加入分子量860kDa的高分子量透明质酸800g，完全溶解后用冰醋酸调pH5.0，温度控制在38℃，然后加入实例1制备的纯酶液800ml进行酶解，酶解至所需分子量后升温至60℃维持30分钟灭酶，然后经孔径50nm陶瓷膜除去酶蛋白，含低分子量透明质酸滤液经喷雾干燥得755g低分子量透明质酸粉末，平均分子量9.122kDa。
将本发明实施例2～4得到的低分子量透明质酸和对比例1和对比例2的传统工艺酶催化结束后经过滤除酶蛋白，然后脱水干燥得到的低分子量透明质酸样品，经GPC凝胶渗透色谱检测PDI值，考察透明质酸分子量分布。PDI值表示大分子的分子量分布表征，PDI＝1为单分散性聚合物；PDI<1.2为窄分布聚合物；PDI<1.5为较窄分布聚合物；PDI<2为中等分布聚合物；PDI≥2为宽分布聚合物。
色谱条件：流动相0.1M NaSO4(用0.1M磷酸盐缓冲溶液pH7.0配制)；
色谱柱：TSKgel G2000 SWXL日本东曹公司内径：7.8mm。
结果见表1。由表1可知，本发明得到的低分子量透明质酸的PDI值明显较传统工艺制备的样品低，说明本发明得到的低分子量透明质酸的分子量分布较窄。
表1 GPC凝胶渗透色谱分子量分布结果
样品名称 PDI值
实施例2 1.46
实施例3 1.44
实施例4 1.47
对比例1 3.05
对比例2 3.16
由上述实施例可知，本发明提供的连续化生产低分子量透明质酸的方法操作简单、制备条件温和，高分子量透明质酸转化成低分子量透明质酸的转化率高达94.3％～95.7％，转化效率高。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种连续化生产低分子量透明质酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)获得透明质酸酶；所述透明质酸酶由重组毕氏酵母LC32136发酵培养得到；
2)将高分子量透明质酸溶液持续加入设置有超滤膜的装置；在步骤1)所述透明质酸酶的作用下进行酶解；酶解所得低分子量透明质酸透过超滤膜，得到低分子量透明质酸滤液；所述超滤膜的孔径为2～20KDa之间的任意一种；
3)将所述低分子量透明质酸滤液进行脱水干燥，得到低分子量透明质酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述透明质酸酶的酶活为5.2×106～9.5×106IU/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述高分子量透明质酸溶液中高分子透明质酸的质量百分含量为0.5％～20％；所述透明质酸酶添加量为高分子量透明质酸溶液体积的0.5％～10％。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述高分子透明质酸的分子量≥20KDa。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述水解的温度为30～50℃，所述水解的pH值为4.5～7.0。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，自开始酶解4h后，所得酶解液开始通过超滤膜进行过滤截留；开始进行过滤截留后，每隔2～4h在所述酶解液中补加高分子量透明质酸，所述高分子量透明质酸的补加量为初始量的10～50％；每隔8～14h在所述酶解液中补加水，所述水的补加量为初始水体积的30～50％；每隔1.5～2.5d在所述酶解液中补加透明质酸酶，所述透明质酸酶的补加量为初始酶液体积10～50％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述连续化生产结束前8～14h前，停止补加透明质酸和透明质酸酶。
8.一种连续化生产低分子量透明质酸的装置，包括依次连通的酶催化反应釜、超滤膜、过滤收集罐和喷雾干燥塔；所述酶催化反应釜和超滤膜由管道连接，所述管道设置有输料泵；所述超滤膜设置回流装置，所述回流装置与酶催化反应釜连通；所述超滤膜和滤液收集罐连通，所述滤液收集罐和喷雾干燥塔连通。
9.权利要求1～7任一项所述的方法得到的低分子量透明质酸，所述低分子量透明质酸的平均分子量为超滤膜孔规格分子量的85％～95％之间，所述低分子量透明质酸的分子量分散系数PDI在1.2～1.5之间。
10.权利要求9所述低分子量透明质酸在化妆品、保健品和医药上的应用。
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