KR100485687B1 - 칡아가리쿠스 유래 올리고당의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 칡아가리쿠스 유래 올리고당의 제조방법에 관한 것으로, 바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945 균주의 배양상등액 또는 이로부터 회수된 엔도-베타-1,6-글루카나제를 칡아가리쿠스로부터 분리정제한 베타-글루칸 분획에 첨가하여 효소반응시킴으로써 단시간 내에 효율적으로 칡아가리쿠스 유래 올리고당을 제조할 수 있으므로 식품 및 의약산업상 매우 유용한 것이다.

Description

칡아가리쿠스 유래 올리고당의 제조방법{Method for production of oligosaccharide from Agaricus blazei Murill}
본 발명은 칡아가리쿠스 유래 올리고당의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945을 배양하여 얻은 엔도-베타-1,6-글루카나제를 이용하여 칡아가리쿠스로부터 올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.
아가리쿠스버섯은 들버섯속에 속하는 식용버섯류로서 예전부터 식용과 약용으로 널리 이용되고 있으며 식이섬유의 일종인 베타-글루칸(β-glucan)이 매우 풍부하다(Mizuno, T. et al. 1990a. Antitumor activity and some properties of water-soluble polysaccharides from "Himematsutake", the fruition body of Agaricus blazei Murill. Agric. Biol. Chem. 54(11):2889-2896.). 특히 칡을 배지로 하여 키운 칡아가리쿠스는 일반적인 볏짚에서 키운 버섯에 비해 베타-글루칸이 2.1배나 높으며 사탕수수에서 키운 일본산 버섯에 비해서도 1.6배나 많이 함유하고 있다. 이 베타-글루칸은 대부분 베타-1,6-글루칸으로 항종양에 대한 높은 저해 활성이 보고되었으며(Mizuno, T. et al. 1990a. Antitumor activity and some properties of water-soluble polysaccharides from "Himematsutake", the fruition body of Agaricus blazei Murill. Agric. Biol. Chem. 54(11):2889-2896., Mizuno, T. et al. 1990b. Antitumor activity and some properties of water-insoluble polysaccharides from "Himematsutake", the fruition body of Agaricus blazei Murill. Agric. Biol. Chme. 54(11):2897-2905.) 이뿐만 아니라 면역활성(조수목. et al. 1999. 신령버섯으로부터 면역증강활성 다당류의 분리 및 화학적 특성. 한국균학회지. 27(2):170-174.), 혈당, 콜레스테롤, 중성지방 강하 작용(최정미, 구성자. 2000. db/db 마우스에서 아가리쿠스 버섯 베타-글루칸이 혈당과 지질성분에 미치는 영향. 한국식품과학회지. 32(6):1418-1425.)도 나타낸다. 하지만 이러한 베타-글루칸은 분자량이 커서 체내에서 잘 흡수되지 못하여 식이섬유로서의 활성만 나타내고 있다.
최근 기능성 식품에 대한 관심이 고조되면서 특히 기능성 올리고당의 기능이 새롭게 평가되어지고 있다. 이는 생체 내에서 천연 식이섬유소와 유사한 역할을 하여 혈당치와 인슐린 분비 조절 효과(채영미, 이순재. 2001. Streptozotocin 유발 당뇨쥐의 혈당 및 혈중 지질조성에 미치는 올리고당(oligosaccharide)의 영향. 한국식품영양과학회지. 30(4):710-716., Levrat, M. et al. 1994. Role of dietary propionic acid and bile acid excretion in the hypocholesterolemic effects of oligosaccharides in rats. J. Nutr. 124:531-538.)를 나타낼 뿐만 아니라 대장의 유용균에 대해 성장을 촉진시켜 장내 환경을 개선시키기도 한다(Kohomoto, T. et al. 1991. Dose-response of isomaltooligosaccaride for increasing fecal Bifidobacteria. Agric. Biol. Chem. 55:2157-2164.). 전세계적으로 12종의 기능성 올리고당(food-grade oligosaccharide)이 현재 상업적으로 생산되고 있다. 또한 그 생리활성 기능이 하나씩 밝혀짐에 따라서 올리고당의 생산량이 급속하게 증가되고 있는 추세이다.
베타-글루칸에는 베타-1,3-, 베타-1,3-1,4-, 베타-1,6-글루칸 등의 링키지 타입(linkage type)이 존재한다. 이런 링키지 타입에 따른 베타-글루카나제의 효소반응에 의해 다양한 올리고당이 생성된다. 이런 올리고당은 다양한 기능성을 나타낼 것으로 기대된다.
현재까지 아가리쿠스로부터 효율적으로 베타-글루칸을 분리·정제한 연구는 일부 보고된 바 있으나(Dong, Qun. et al. 2002. Structural characterization of a water-soluble β-D-glucan from fruiting bodies of Agaricus blazei Murr. Carbo. Res. 337:1417-1421., Ohno, Naohito. et al. 2001. Antitumor β-glucan from the cultured fruit body of Agaricus blazei. Biol. Pharm. Bull. 24(7):820-828.) 칡아가리쿠스에 대한 연구보고는 아직 이루어진 바 없고, 이로부터 분리·정제한 베타-글루칸의 올리고당화는 전무한 상태이다.
이에 본 발명자들은 칡아가리쿠스 베타-글루칸과 그 올리고당을 고기능성 식소재로서 활용하기 위하여 바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945 유래의 효소에 의한 새로운 올리고당의 생성법을 제공하고자 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945 균주의 배양상등액 또는 이로부터 회수된 엔도-베타-1,6-글루카나제를 칡아가리쿠스로부터 분리정제한 베타-글루칸 분획에 첨가하여 효소반응시킴으로써 단시간 내에 효율적으로 칡아가리쿠스 유래 올리고당을 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 상기 목적은 바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945 균주의 배양상등액 또는 이로부터 회수된 엔도-베타-1,6-글루카나제를 칡아가리쿠스로부터 분리정제한 베타-글루칸 분획에 첨가하여 효소반응시킴으로써 단시간 내에 효율적으로 칡아가리쿠스 유래 올리고당을 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명의 구성을 설명한다.
본 발명은 칡아가리쿠스로부터 베타-글루칸을 추출하는 단계; 바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945 균주를 배양하여 엔도-베타-1,6-1,4-글루카나제 효소액을 제조하고 상기 효소액에 상기 단계에서 얻은 칡아가리쿠스 유래의 베타-글루칸 분획을 첨가하여 효소반응을 시키는 단계; 상기 단계에서 얻은 가수분해 산물을 TLC와 HPLC를 이용하여 분석하여 올리고당류를 확인하는 단계로 구성된다.
상기 목적을 달성하기 위해서 본 발명은 바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945 균주의 배양상등액 또는 이로부터 회수된 엔도-베타-1,6-글루카나제를 칡아가리쿠스로부터 분리정제한 베타-글루칸 분획에 첨가하여 효소반응시킴으로써 칡아가리쿠스 유래 올리고당을 제조하는 것을 특징으로 하는 칡아가리쿠스 유래 올리고당의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945 균주의 배양상등액 또는 이로부터 회수된 엔도-베타-1,6-글루카나제를 칡아가리쿠스로부터 분리정제한 베타-글루칸 분획에 첨가하여 효소반응시킴으로써 칡아가리쿠스 유래 올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 사용된 균주는 바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945로서 재조합 또는 형질전환되지 않은 상태인 것을 사용한다.
상기 바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945를 배양하여 배양상등액을 직접 회수하거나 또는 이로부터 엔도-베타-1,6-글루카나제를 추출한다.
상기 배양상등액 또는 이로부터 얻은 엔도-베타-1,6-글루카나제를 칡아가리쿠스로부터 분리정제한 베타-글루칸 분획에 첨가하여 효소반응시켜 칡아가리쿠스로부터 올리고당을 제조한다. 상기 올리고당은 글루코-비오올리고사카라이드 또는 글루코-트리올리고사카라이드이다.
이 때 바람직스럽게 상기 칡아가리쿠스 유래 베타-글루칸은 건조된 칡아가리쿠스를 분쇄한 후 에탄올에 48시간 동안 침지하여 전처리하는 단계; 상기 전처리된 칡아가리쿠스를 열수추출하는 단계; 상기 열수추출물을 겔여과 크로마토그래피하여 다당체 분획을 얻는 단계; 및 상기 분획을 20mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)에 용해하여 DEAE-세파텍스 A-25로 충전된 컬럼에 적정한 다음 상기 완충액으로 용출한 후 상기 완충액에 0 내지 0.5M NaCl 용매로 용출하여 베타-글루칸 분획을 얻는 단계를 통하여 얻어지는 것이 좋다. 이는 칡아가리쿠스로부터 라미나린을 효율적으로 추출할 수 있는 조건이다.
상기와 같이 바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945를 배양하여 얻은 엔도-베타-1,6-글루카나제는 베타-1,6-글루칸에만 특이적으로 활성을 나타내어 칡아가리쿠스 베타-1,6-글루칸의 올리고당화에 사용한다.
이하 본 발명을 다음과 같은 실시예 및 실험예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 다음의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이 것들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 칡아가리쿠스버섯으로부터 베타-글루칸 추출
칡아가리쿠스 버섯 농장으로부터 아가리쿠스버섯을 제공받아 다음과 같은 일련의 과정으로 베타-글루칸을 추출하였다. 열풍 건조된 버섯을 분쇄한 후 100% 에탄올에 48시간 침지하여 전처리한 다음 분말 200g을 증류수 2.5L에 100℃, 3시간 동안 3번 열수추출하였다. 이 추출물을 10배 농축하여 겔 여과 크로마토그래피(gel filtration chromatography)를 통해 분자량을 확인하고 다당체 분획을 받았다. 이 분획을 20mM Tris-HCl 완충액, pH8.0에 용해하여 DEAE-세파덱스(sephadex) A-25로 충전된 컬럼에 적정한 다음 완충액으로 용출 후 같은 완충액에 0∼0.5M NaCl의 용매로 용출하여 베타-글루칸 분획을 얻었다. 분획은 당의 경우 페놀-H2SO4 법으로, 단백질의 경우 UV 280으로 확인하고 분석하였다.
도 1에서 나타내는 바와 같이 칡아가리쿠스를 에탄올에 전처리하여 지질 등 저분자 물질을 제거하고 열수 추출과 겔 여과 크로마토그래피, DEAE-이온 교환 크로마토그래피를 통해 칡아가리쿠스 베타-글루칸을 간편하게 추출하였고 이를 AG1이라 명명하였다. 추출된 AG1 분획의 수율은 5∼6%를 나타내었다. 도 2에서 나타내는 바와 같이 칡아가리쿠스로부터 추출한 베타-글루칸의 분자량은 덱스트란(dextran) 39,100Da, 9,300Da, 라미라닌(laminarin) 5,000Da을 사용하여 표준 교정식을 만들고 이것을 이용하여 분석해 본 결과 평균범위가 30∼50kDa로 확인되었고 도 3에서처럼 당 피크(peak)와 단백질 피크가 거의 일치하는 것으로 보아 칡아가리쿠스로부터 추출한 베타-글루칸은 단백질이 결합되어 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 2 : 바실러스 메가테리움( B. megaterium ) ATCC14945을 이용한 효소 준비 및 칡아가리쿠스 유래 베타-글루칸의 올리고당화
바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945 유래 효소의 베타-1,3-, 베타-1,3-1,4- 및 베타-1,6-글루칸 기질에 대한 활성 검색을 실시했을 때 바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945 유래 효소는 베타-1,6-글루칸에만 특이적으로 활성을 나타내어 칡아가리쿠스 베타-1,6-글루칸의 올리고당화에 사용하였다.
다음과 같이 효소액을 준비하여 반응시켰다. 바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945 유래의 효소를 사용하였는데 바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945는 LB 액체배지를 사용하여 37℃에서 18시간 동안 진탕 배양 후 12,000rpm에서 20분간 원심 분리한 후, 상등액을 효소반응에 사용하였다. 기질은 1% 칡아가리쿠스 베타-글루칸이 첨가된 0.2M 인산완충용액(pH6.8)을 사용하였다. 효소 반응은 기질 0.5ml에 효소 1mL를 혼합하여 55℃에서 시간대별로 반응시켰다. 환원당 측정은 3,5-디니트로살리실산(3,5-dinitrosalicylic acid; DNS)에 의한 방법에 따라 550nm에서 흡광도를 측정, 비색정량하였으며 55℃에서 1분간 1μ㏖의 환원당을 생성하는 효소량을 1unit로 표시하였다.
바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945 유래의 효소는 베타-1,3-, 베타-1,3-1,4- 및 베타-1,6-글루칸 기질에 대한 활성 검색에서 베타-1,6-글루칸에만 특이적으로 활성을 나타내고 다른 결합은 기질로서 인식하지 못하여 베타-1,6 결합인 칡아가리쿠스 베타-글루칸과 효소반응을 한 결과 글루코-비오올리고사카라이드(gluco-biooligosaccharide; G2) 및 글루코-트리올리고사카라이드(gluco-trioligosaccharide; G3)를 생성했으며 다른 결합은 기질로서 인식하지 못하였다.
실시예 3. 효소반응에 의한 올리고당의 확인
칡아가리쿠스 베타-글루칸의 가수분해 산물은 TLC를 이용하여 분석하였다. TLC는 시간대별로 효소반응이 끝난 후 실리카겔 60 TLC 플레이트(silica gel 60 TLC plate)에 팁(tip)으로 5㎕씩 로딩(loading)하여 수행하였다. 이 때 에틸아세테이트(Ethylacetate) : 아세트산(acetic acid) : DW(2 : 1 : 1) 혼합액을 전개 용매로 사용한 후 공기 중에서 완전히 건조시키고 5% 4-메톡시벤즈알데하이드(4-methoxybenzaldehyde) (C8H8O2), 5% H2SO4, 90% 에탄올 그리고 소량의 빙아세트산(glacial acetic acid)이 혼합된 용액으로 스프레이(spray)한 후 120℃에서 15분간 반응시켰다.
칡아가리쿠스 베타-글루칸의 가수분해 산물을 확인하기 위해 HPLC로 분석하였다. 분해 산물의 확인을 위해 카보하이드레이트 NH2 컬럼(carbohydrate NH2 column)을 40℃로 사용하였고 이동상은 70% 아세토나이트릴(acetonitrile; CH3CN)을 사용하였고 0.9mL/min 유속으로 흘려주며 분석하였다.
바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945 효소와 칡아가리쿠스로부터 추출한 베타-글루칸을 반응시킨 후 분해 생성물을 확인해 본 결과 새로운 가수분해 양상을 나타내었다. 도 4에서 나타내는 바와 같이 TLC 분석에서는 효소 반응 후 주요 분해 산물이 글루코-비오올리고사카라이드(gluco-biooligosaccharide; G2)로 확인되었다. 분해 생성물의 세밀한 분석을 위해서 동일 시료를 사용하여 HPLC로 측정하여 본 결과 주요 생성물로 글루코-비오올리고사카라이드(gluco-biooligosaccharide; G2) 뿐만 아니라 글루코-트리올리고사카라이드(gluco-trioligosaccharide; G3)도 확인되었다.
이상 상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명은 바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945 균주의 배양상등액 또는 이로부터 회수된 엔도-베타-1,6-글루카나제를 칡아가리쿠스로부터 분리정제한 베타-글루칸 분획에 첨가하여 효소반응시킴으로써 단시간 내에 효율적으로 칡아가리쿠스 유래 올리고당을 제조하는 뛰어난 효과가 있으므로 식품 및 의약산업상 매우 유용한 것이다.
도 1은 칡아가리쿠스로부터 베타-글루칸을 추출하는 과정 및 바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945로부터 얻은 효소에 의해 가수분해된 베타-글루칸 올리고당을 제조하는 과정을 보여준다.
도 2는 칡아가리쿠스 유래의 다당체 분획의 겔여과 크로마토그램이다.
도 3은 DEAE-세파덱스 A-25 이온 교환 크로마토그래피을 통한 칡아가리쿠스로부터 베타-글루칸의 일루션 프로파일(elution profile)을 나타낸다. 여기에서, 탄수화물(◆)은 페놀-황산법으로 490nm에서 측정되었고, 단백질(■)은 UV 280nm에 의해 측정되었다.
도 4는 바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945로부터 얻은 효소에 의해 얻은 베타-글루칸 가수분해물의 얇은 박 크로마토그램(Thin layer chromatogram: T. L. C)이다. 여기에서, 레인 1은 대조구로서 표준 물질 글루코스(G1)와 셀로비오즈(G2)를 나타낸다. 레인 2는 효소 반응이 시작되기 전이고, 레인 3은 4시간 동안 효소반응시킨 후, 레인 4는 12시간 동안 효소반응시킨 후, 레인 5는 24시간 동안 효소반응시킨 후를 나타낸다.
도 5는 칡아가리쿠스로부터 얻은, 바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945에 의해 효소적으로 가수분해된 베타-글루칸의 HPLC 프로파일이다.

Claims (4)

  1. 바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945의 배양상등액을 칡아가리쿠스부터 분리한 베타-글루칸에 첨가하여 효소반응시킴으로써 올리고당을 제조하는 것을 특징으로 하는 칡아가리쿠스 유래 올리고당의 제조방법.
  2. 바실러스 메가테리움(B. megaterium) ATCC14945의 배양상등액으로부터 회수된 엔도-베타-1,6-글루카나제를 칡아가리쿠스부터 분리한 베타-글루칸에 첨가하여 효소반응시킴으로써 올리고당을 제조하는 것을 특징으로 하는 칡아가리쿠스 유래 올리고당의 제조방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 칡아가리쿠스 유래 베타-글루칸은
    건조된 칡아가리쿠스를 분쇄한 후 에탄올에 48시간 동안 침지하여 전처리하는 단계;
    상기 전처리된 칡아가리쿠스를 열수추출하는 단계;
    상기 열수추출물을 겔여과 크로마토그래피하여 다당체 분획을 얻는 단계; 및
    상기 분획을 20mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0)에 용해하여 DEAE-세파텍스 A-25로 충전된 컬럼에 적정한 다음 상기 완충액으로 용출한 후 상기 완충액에 0 내지 0.5M NaCl 용매로 용출하여 베타-글루칸 분획을 얻는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 참다시마 유래 올리고당의 제조방법.
  4. 제 1항 또는 제 2에 있어서, 상기 올리고당은 글루코-비오올리고사카라이드 또는 글루코-트리올리고사카라이드인 것을 특징으로 하는 칡아카리쿠스 유래 올리고당의 제조방법.
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