KR101170979B1 - 배당체 획득방법 및 이에 따른 배당체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 버섯균사체에 포함된 베타-글루칸(β-glucan)과 녹차 또는 양파에 포함된 파이토케미컬(phytochemical)이 결합된 배당체 획득방법으로서, 녹차분말 또는 양파분말이 첨가된 배지를 준비하는 단계; 상기 준비된 배지에 버섯균사체를 배양하는 단계; 및, 상기 버섯균사체가 배양된 배양물에 에탄올을 첨가하여 침전물을 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하며, 이러한 본 발명에 의하는 경우, 항산화력, 항암성, 항관절염성 또는 면역능력 증진성을 가지는 것을 특징으로 하는 배당체를 제공할 수 있다.

배당체, 버섯균사체, 베타-글루칸

Description

배당체 획득방법 및 이에 따른 배당체{METHOD OF OBTAINING A GLUCOSIDE AND GLUCOSIDE USING THE SAME}

본 발명은 녹차와 양파에 함유된 phytochemical을 버섯균을 이용하여 bioconversion시키는 기술에 대한 것이다. 특히, 녹차와 양파제품의 기호성을 향상시키는 기술(녹차 또는 양파를 배지로하여 버섯균사체 배양기술, 버섯균사체 배양물과 녹차 또는 양파와 반응하는 기술)을 이용하여, 항산화성, 항관절염성, 항당뇨성, 골다공증치료효과, 갱년기장애억제, 면역력향상, 항암효과 등의 기능성을 갖는 고 기능성 소재(배당체)를 제공하기 위한 것이다.

녹차, 양파, 버섯은 면역증진효과, 항산화성, 항암성, 관절염억제효과 등의 다기능성이 있는 소재로 오래전부터 사용되어 오고 있다.

녹차 중에는 카테킨이 기능성을 갖는 주요화합물임이 밝혀져있으며, 이와 유사구조를 가진 flavonoids 화합물이 당과의 배당체로 존재하면서 여러 가지 생리활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 이들 flavonoids계 화합물은 배당체보다 비배당체 (aglycon)의 형태로써 고 기능성을 나타내는 것으로 보고되어있다. 또한, 녹차를 발효시켜 만든 발효차는 발효과정에서 효소에의해 agycon으로 변화된 flavonoids에 의해 기능성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 녹차는 잎을 사용하여 잎차를 생산하고 있는데, 부위별로 수확시기별로 등급이 나뉘어 지며 고급제품은 수량이 매우 작아 고가이다. 녹차 수확량의 대부분을 차지하는 분말 형 티백제품은 생산량은 많은데 비해 저가의 제품으로써 농가에서는 인건비도 건지기 어려울 때가 있다. 따라서 녹차재배농가의 소득증대를 위해서는 저급 녹차를 고기능성 제품으로 고급화하는 기술의 개발과 가공식품에 사용하기에 적합한 형태의 소재로 개발해야 한다.

한편, 양파는 수요와 공급의 불균형에 의해 농가수익을 예측할 수 있는 작목중의 하나이다. 양파가격의 폭락과 급등을 반복하는 상황속에서도 이를 극복하기위한 농가, 산업체, 연구소의 노력은 계속되고 있다. 이러한 노력에 의해 양파고추장, 양파음료, 양파농축액, 양파건면 등이 상품화되어있다. 그러나, 이러한 양파 식품은 음료, 농축액등의 경우, 상품의 기호성이 문제가 되고 있다. 냄새를 제거하는 기술개발 등 여러 가지로 기호성 향상을 위해 기술개발을 해왔지만, 커다란 성과를 거두지 못하고 있다.

이에 따라, 버섯을 이용하여, 버섯균사체 배양시 녹차 또는 양파를 배지 또는 배양물의 효소와 반응시켜 고기능성 녹차제품 또는 양파제품을 개발하는 것이 필요한 실정이다.

상기한 문제점을 해결하기 위한 본 발명은, 녹차와 양파에 함유된 phytochemical을 버섯균을 이용하여 bioconversion시킴으로써, 항산화성, 항관절염성, 항당뇨성, 골다공증치료효과, 갱년기장애억제, 면역력향상, 항암효과 등의 기능성을 갖는 고 기능성 소재(배당체)를 제공하는 것이 목적이다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 배당체 획득방법은, 버섯균사체에 포함된 베타-글루칸(β-glucan)과 녹차 또는 양파에 포함된 파이토케미컬(phytochemical)이 결합된 배당체(glucoside) 획득방법으로서, 녹차분말 또는 양파분말이 첨가된 배지를 준비하는 단계; 상기 준비된 배지에 버섯균사체를 배양하는 단계; 및, 상기 버섯균사체가 배양된 배양물에 에탄올을 첨가하여 침전물을 분리하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명자들은 녹차분말이나 양파분말을 함유하는 배지에 버섯균사체를 배양하거나 배양된 버섯균사체 효소를 녹차분말이나 양파분말과 반응시키는 경우, flavonoids glycoside를 aglycoside로 전환이 가능하고, flavonoids의 생물학적 작용에 의해 기능성이 높은 flavonoid로 전환됨으로써, 그 기능성을 증가시킬 수 있다는 것을 알게 되었다.. 또한 항암효과가 우수한 flavonoid-β-D-glucan으로 전환이 가능하 다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

즉, 녹차와 양파에 함유된 phytochemical(카테킨과 퀘르세틴)을 버섯균을 이용하여 bioconversion시킴으로써, 항산화성, 항관절염성, 항당뇨성, 골다공증치료효과, 갱년기장애억제, 면역력향상, 항암효과 등의 기능성을 갖는 고 기능성 소재(배당체)를 제공할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 버섯균사체에 포함된 베타-글루칸(β-glucan)과 녹차에 포함된 카테킨 또는 양파에 포함된 퀘르세틴이 결합되어, 항산화력, 항암성, 항관절염성 또는 면역능력 증진성을 가지는 것을 특징으로 하는 배당체일 수 있다.

본 발명에 따른 배당체 획득방법은 먼저 녹차분말이나 양파분말이 첨가된 배지를 준비하고, 이렇게 준비된 배지에 버섯균사체를 배양하는데, 여기서 사용되는 배지는 이 기술분야에서 알려진 다양한 배지를 사용할 수 있고, 바람직하게는 본 발명자에 의해 개발된 후술하는 HK 기본배지가 적합하다. 이어서, 상기 버섯균사체가 배양된 배지, 즉 버섯균사체가 배양된 배양물에 에탄올을 첨가하여 침전물을 분리한다. 에탄올을 첨가하는 침전물을 분리하기 위한 것으로 이러한 에탄올 침전법 외에 다른 분리방법을 사용하는 것도 본 발명에 포함될 수 있다.

이러한 본 발명에서, 상기 녹차분말 또는 양파분말이 첨가된 배지를 준비하는 단계는, 대두박분해물, 황백당, MgSO_4?7H₂O 및 KH₂PO₄ 가 포함된 액체배지에, 상기 액체배지의 중량에 대하여 0.25% 내지 0.50% 범위 내의 녹차분말 또는 0.25%, 0.50% 또는 1.0%의 양파분말을 첨가하여 배지를 준비하는 것을 특징으로 하는 것이 가능하다.

또한, 상기 준비된 배지에 버섯균사체를 배양하는 단계는, 버섯균주를 대두박분해물, 황백당, MgSO_4?7H₂O 및 KH₂PO₄ 가 포함된 액체배지와 혼합한 후 인큐베이터로 배양하여 버섯균사체 액체배양액을 제조하는 단계; 및, 상기 준비된 배지에 상기 제조한 버섯균사체 액체배양액을 주입하여 버섯균사체를 배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 배당체 획득방법의 다른 실시형태는, 버섯균사체에 포함된 베타-글루칸(β-glucan)과 녹차 또는 양파에 포함된 파이토케미컬(phytochemical)이 결합된 배당체(glucoside) 생성방법으로서, 버섯균사체가 배양된 배양물을 감압여과하고, 상기 감압여과한 여액을 원심분리하여 침전물을 분리하며, 분리한 침전물을 크로마토그래피로 분획하여 분획물을 얻는 단계; 상기 얻은 분획물을 녹차분말 또는 양파분말과 혼합하여 반응시키는 단계; 및, 상기 반응시킨 반응물에 에탄올을 첨가하여 침전물을 분리하는 단계;를 포함하고, 상기 분리한 에탄올 침전물은 70% 내지 90% 범위 내의 에탄올 농도를 가지는 것을 특징으로 한다.

이는 먼저 버섯균사체를 배양하여 이로부터 효소를 생성/분리한 다음, 분리한 효소를 녹차 또는 양파분말과 혼합하여 배당체를 생성하는 것이다. 버섯균사체와 녹차 또는 양파분말을 혼합하여 새로운 배당체를 생성하는 것이라는 점에서, 녹차분말이나 양파분말을 함유하는 배지에 버섯균사체를 배양하는 상술한 본 발명과 동일한 특성을 가지고, 이와 같이 효소를 생성/분리한 다음 이것을 녹차 또는 양파분말과 혼합하는 방법 또한 본 발명에 당연히 포함된다.

본 발명의 다른 실시형태는 상술한 배당체 획득방법에 의해 얻은 것으로, 베타-글루칸과 카테킨(catechin) 또는 퀘르세틴(quercetin)이 결합되어, 항산화력, 항암성, 항관절염성 또는 면역능력 증진성을 가지는 것을 특징으로 하는 배당체도 가능하다.

기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다.

상기한 본 발명에 따르면, 녹차와 양파에 함유된 phytochemical을 버섯균을 이용하여 bioconversion시킴으로써, 항산화성, 항관절염성, 항당뇨성, 골다공증치료효과, 갱년기장애억제, 면역력향상, 항암효과 등의 기능성을 갖는 고 기능성 소재(배당체)를 제공할 수 있다. 또한, 이와 같이 녹차와 양파제품의 기호성을 향상시키는 기술(녹차 또는 양파를 배지로하여 버섯균사체 배양기술, 버섯균사체 배양 물과 녹차 또는 양파와 반응하는 기술)을 이용하여, 버섯균사체 녹차제품 및 버섯균사체 양파제품 등을 개발할 수 있다.

그리고, 버섯균사체 배양에 의한 녹차나 양파 가공품의 기능성 시너지효과 창출할 수 있다. 즉, 버섯균사체를 배양할 경우 녹차와 양파 중의 유효성분의 기능성과 기호성을 증진시키고, β-D-glucan과 같은 버섯균사체의 기능성을 부가함으로써 synergy효과를 얻을 수 있다.

또한, 버섯균사체 배양에 의한 기호성을 증진시킬 수 있다. 즉, 버섯균사체배양에 의해 생성되는 B-glucan은 휘발성 황화합물을 흡착시키는 기능이 있어 섭취 시에 느끼는 역한 맛을 경감시킬 수 있어 양파를 이용한 기능성 제품의 활용성을 증진시키고 또한 녹차의 경우 풋내를 경감시켜 소비를 증대시킬 수 있다. 버섯균사체 배양 시 다양한 효소반응에 의해 생성되는 물질에 의해 기호성이 부여된다.

이하에서는 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명하기로 한다. 본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 녹차 또는 양파를 함유하는 배지에 버섯균사체를 배양하여 β-glucan과 phytochemical의 배당체 생성

먼저, 본 발명자들은 Phytochemical bioconversion에 적합한 기본 액체배지를 직접 준비하였고, 구체적으로는 대두박분해물 0.1%, 황백당 1.2%, MgSO_4?7H₂O 0.0375%, KH₂PO₄ 0.0375%가 첨가된 액체배지를 기본배지 또는 HK기본배지라 명명하였다.

그리고, 상기 HK기본배지에 녹차분말(상기 HK기본배지의 중량 대비 0.125%, 0.25%, 0.50%, 1.0%)과 양파분말(상기 HK기본배지의 중량 대비 0.125%, 0.25%, 0.50%, 1.0%)을 각각 첨가하였고, 이렇게 조성된 배지에 아가리쿠스, 영지, 느타리 버섯균사체를 각각 배양하였다.

여기서 상기 버섯균사체로는, 상술한 HK기본배지 300㎖ 을 500㎖ 용량의 삼각플라스크에 첨가하고 고압멸균 (121℃, 30분)한 다음, 실온에서 충분히 식힌 후 PDA배지에서 생육한 아가리쿠스, 영지, 느타리 버섯균주(1/4 petri dish/flask)를 지름 5 mm이하로 잘게 잘라 접종한 후, shaking incubator(120 rpm, 25℃)에서 배양한 버섯균사체 액체배양액을 이용하였다. 즉, 이렇게 배양한 버섯균사체 액체배양액을 상기 녹차분말 또는 양파분말이 첨가된 배지에 주입하여 버섯균사체를 각각 배 양하였다.

버섯균사체 배양조건은 25℃에서 3-7일간 배양하고, 공기공급량을 1v/v/m으로 하였을 때 균사체 배양이 양호하였으며, 특히 아가리쿠스 버섯균주(신령 버섯균주)를 이용한 것의 균사체 배양이 가장 양호하였다.

이어서, 상기와 같이 배양한 배양물 시료를 10배 농축한 액 100 g에, 에탄올 농도가 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90%가 되도록 각각 가하여, 4에서 24시간 동안 방치하여 침전시킨 다음, 원심분리(10,000 rpm, 10분)한 후 상등액과 침전물을 분리하였다.

이렇게 분리된 에탄올 침전물의 농도별, 침전물의 양을 예시하면 하기 표 1에 나타난 바와 같다. 여기서, GT0.5는 녹차(Green Tea)분말을 0.50% 첨가한 경우이고, ON1.0은 양파(ONion)분말을 1.0% 첨가한 경우를 뜻한다.

[표 1: 에탄올 침전물의 농도별, 침전물의 양]

한편, HK기본배지에 (상기 HK기본배지의 중량에 대비하여) 녹차분말 0.125%, 0.25%, 0.5% 또는 양파분말 0.25%, 0.5%, 1.0% (w/v)을 첨가한 배지에서 배양 (J-fermenter, 1 v/v/m, 3일, 25℃)된 배양물을, 열수추출 (100℃, 60분)법에 준하여 균사체를 열수추출하여 열수 추출물을 얻었고, 이렇게 열수 추출된 추출물을 상기한 에탄올 침전법으로 분리하여 기능성 성분을 얻었다.

상기한 바와 같이 얻은 각각의 에탄올 침전물을 포함하여, 본 명세서의 실시예 1에 따라 제조된 추출물과 침전물 및 본 발명에서 사용된 물질 등을 정리하여 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 정리하였다.

[표 2: 실시예 1에 따른 에탄올 침전물 등의 정리 요약]

표현	용어
AG	신령버섯균사체배양추출물
AG-80EP	신령버섯균사체배양추출물의 80% 에탄올침전물
GT	녹차분말
GT0.25-80EP	기본배지에 녹차분말0.25%를 추가로 첨가하여 배양한 버섯균사체배양추출물의 80% 에탄올침전물
GT0.5	기본배지에 녹차분말0.5%를 추가로 첨가하여 배양한 버섯균사체배양추출물
GT0.5-80EP	기본배지에 녹차분말0.5%를 추가로 첨가하여 배양한 버섯균사체배양추출물의 80% 에탄올침전물
GT1.0	기본배지에 녹차분말0.25%를 추가로 첨가하여 배양한 버섯균사체배양추출물
GTC	녹차에서분리한 catechin
GTC0.1-80EP	기본배지에 녹차에서분리한 catechin을 0.1%첨가하여 배양한 버섯균사체배양추출물의 80% 에탄올침전물
GTC-80EP	기본배지에 녹차에서분리한 catechin을 첨가하여 배양한 버섯균사체배양추출물의 80% 에탄올침전물
GTC-BM	기본배지에 녹차에서 분리한 catechin을 첨가하여 열수추출한 추출물
GTC-HE	녹차에서 분리한 catechin을 첨가하여 열수추출한 추출물
GTE	녹차분말열수추출물
GTE-BM	기본배지에 녹차분말을 첨가하여 열수추출한 추출물
ON	양파분말
ON0.5	기본배지에 양파분말 0.5%를 추가로 첨가하여 배양한 버섯균사체배양추출물
ON0.5-80EP	기본배지에 양파분말 0.5%를 추가로 첨가하여 배양한 버섯균사체배양추출물의 80% 에탄올침전물
ON1.0	기본배지에 양파분말 1.0%를 추가로 첨가하여 배양한 버섯균사체배양추출물
ON1.0-80EP	기본배지에 양파분말 1.0%를 추가로 첨가하여 배양한 버섯균사체배양추출물의 80% 에탄올침전물
ONE	양파분말열수추출물
ONE-BM	기본배지에 양파분말을 첨가하여 열수추출한 추출물

실시예 2: 버섯균사체를 배양하여 효소를 생성/분리 한 다음, 녹차와 양파에 버섯균사체가 분비한 효소를 처리하여 β-glucan과 phytochemical 배당체생성

상기 실시예 1에서는 배지에 녹차 또는 양파분말을 첨가하고, 여기에 버섯균사체를 배양함으로써 배당체를 생성한 것이고, 본 실시예 2는 다른 방법으로서 먼 저 버섯균사체를 배양하여 효소를 생성/분리한 다음 이것을 녹차 또는 양파분말과 혼합하여 배당체를 생성하였다.

먼저, 버섯균사체 배양물을 감압여과한 여액에 TCA를 혼합(최종농도가 10%되도록)하여 4℃ 에서 24시간 동안 방치한 다음, 원심분리 (10,000 rpm, 15 min, 4℃)하여 침전물을 분리하였다. 여기서 사용한 버섯균사체 배양물은 상기 실시예 1에서 사용한 버섯균사체 액체배양액과 동일한 것을 이용하였다.

그런 다음, 분리된 침전물을 50 mM sodium acetate buffer (pH.5.0)에 녹여 DEAE column (2cm, 110cm)에서 분리하여 10㎖ 씩 collection하였다. 이때 사용된 mobile phase는 20 mM sodium phosphate buffer(20 mM NaH₂PO₄와 20 mM Na₂HPO₄, pH 7.0)이었다.

이후, 자가분해효소가 함유되어 있는 것으로 추정되는 DEAE column chromatography 분획물의 UV spectrum을 측정(225~445 nm)하였다. 또한, DEAE column에서 분리된 분획물로부터 용매를 제거한 후 소량의 SDS-PAGE sample buffer로 녹인 후 Laemmli의 방법에 따라 12% SDS-PAGE에서 전기영동하였으며, 분자량표준단백질로는 β-galactosidase (175KDa), Paramyosin (83KDa), Glutamic dehydrogenase (62KDa), Aldolase (48KDa), Triosephosphate isomerase (33KDa), β-Lactoglobulin A (25KDa), Lysozyme (17KDa) Aprotinin (7KDa)를 이용하였다. 이러한 UV spectrum 측정 및 SDS-PAGE를 이용한 효소 분자량 측정을 통하여 DEAE column chromatography 분획물에 효소가 포함되어 있는 것을 확인하였다.

이어서, 녹차분말 또는 양파분말이 담긴 500㎖ 삼각플라스크에 상기한 효소 0.1% (dry weight)를 함유하는 버섯균사체 배양액을 상기 녹차 및 양파분말 분량에 대해 (1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:10, 1:20)의 비율로 첨가한 다음, 55℃에서 3시간동안 반응시켰으며, 이렇게 만들어진 반응물을 상기한 실시예 1의 에탄올 침전법과 동일한 으로 분리하여 기능성 성분을 얻었다.

실험예 1: β-glucan과 phytochemical의 배당체 생성 확인

실험예 1-1 : DEAE column chromatography

DEAE cellulose column (2.2×110 ㎝)에 5 mM sodium phosphate buffer (pH 7.7)로 충진 시키고 동일한 buffer로 column을 세척(300 ㎖)하였다. HK기본배지에 녹차분말 0.5% (w/v)을 첨가하여 배양한 버섯균사체 배양추출물의 80% 에탄올 침전물(GT0.5-80EP) 2㎖(0.424g/)를 loading 한 후 5 mM sodium phosphate buffer (pH 7.7)를 mobile phase로 하여 fraction collector (Pharmacia Biotech RediFrac)를 이용하여 10㎖ 씩 collection하였다. 분리된 분획물들은 UV spectrum (Backman p-680 spectrophotometer) 을 이용하여 280nm 에서 흡광을 확인하였다. 그 결과, 도 1(Fractionation of GT0.5-80EP by DEAE column. 5 mM sodium phosphate buffer (pH 7.7) was used as eluent. The collected volume of each fraction was 10㎖)에 나타난 바와 같이, 3~7번 tube, 8~11 tube에서 동일한 물질로 판단되는 2개의 peak를 얻었다.

또한, 기본배지에 양파분말 0.5% (w/v)을 첨가하여 배양한 버섯균사체 배양추출물의 80% 에탄올 침전물(ON1.0-80EP)를 DEAE cellulose column을 이용하여 분획하였다. ON1.0-80EP 2㎖(0.423g/)를 loading한 다음, 5 mM sodium phosphate buffer (pH 7.7)로 용출시켜 fraction collector (Pharmacia Biotech RediFrac)를 이용하여 10㎖씩 분획하였다. 분획물들은 UV spectrum (Backman p-680 spectrophotometer)을 이용하여 280nm 에서 흡광을 확인하였다. 그 결과, 도 2(Fractionation of ON1.0-80EP by DEAE column. 5 mM sodium phosphate buffer (pH 7.7) was used as eluent. The collected volume of each fraction was 10㎖)에 나타난 바와 같이, 6~9 tube, 10~14, 20~25, 31~34 fraction 4개를 얻었다.

실험예 1-2 : TLC에서의 확인

상기 실험예 1-1의 DEAE column chromatography에 의해 분리된 분획물을 다시 TLC (Silica 60 F-254 plate, 5 ×10㎝ )를 사용하여 분리하였다. 표준물질로는 DP7 (Maltoheptaose), DP5 (Maltopentaose), DP3 (Maltotriose), 녹차배양물의 경우 catechin을 양파배양물의 경우 quercetin을 사용하였다. 전개물질은 녹차 0.25, 0.5% 배양물과 양파 0.5, 1.0% 배양물이었다. 전개 용매로는 Butanol:Ethanol: H₂O를 5:3:3 (v/v/v)을 전개용매로 사용하였다. 발색시약은 DAP (Diphenylamine Aniline Phosphoric acid)를 사용하였다.

가) GT-80EP

다당체의 표준품으로는 DP7 (maltoheptaose), DP5 (maltopentaose), DP3 (maltotriose)를 사용하였고, 도 3(TLC pattern of GT-80EP. Elution solvent; BuOH:EtOH: DDW (5:3:3: v/v/v). DP7; maltoheptaose. DP5; maltopentaose, DP3; maltotriose, C; Cathchin, GT0.25; Green tea powder (0.25%) was added to the basal culture medium, and cultured liquid was precipitated with 80% ethanol. GT0.5; Green tea powder (0.5%) was added to the basal culture medium, and cultured liquid was precipitated with 80% ethanol.)에 나타난 바와 같이, 이들의 Rf값은 각각 0.19, 0.25, 0.40이었으며, 이들은 모두 DAP에 의해 발색되었다. 표준품 catechin의 경우 Rf 0.89에서 spot을 나타내었고 이것은 UV와 DAP에서 모두 발색하였다. GT 80EP의 경우 Rf 0, 0.1, 0.27부분에서 UV와 DAP에서 모두 발색하였으며, Rf 0.22와 0.30, 0.48에서는 DAP에서만 발색하였다.

DAP에서만 발색된 Rf 0.22는 DP6과 분자량이 유사한 당이며 Rf 0.3은 DP4와 분자량이 유사한 당이고, Rf 0.48은 단당일것으로 예상된다. UV와 DAP모두에서 발색한 Rf 0의 경우 catechin과 동일한 색상의 발색을 나타내면서도 분자량이 커서 전개용매에 전개되지 않는 것으로 보아 고분자의 β-glucan과 catechin이 배당체를 이루고 있는 형태인 것으로 예상된다. Rf 0.1의 spot 또한 고분자다당체의 catechin배당체로부터 분리된 DP 8~10정도의 β-glucan과 catechin 배당체로 예상된다. Rf 0.27은 DP5와 유사한 위치에 spot을 나타낸 것으로 보다 DP5정도의 분자량을 가진 β-glucan과 catechin 배당체로 예상된다.

나) ON-80EP

ON-80EP의 경우, 도 4(TLC pattern of ON-80EP. Elution solvent; BuOH:EtOH: DDW (5:3:3: v/v/v). DP7; maltoheptaose. DP5; maltopentaose, DP3; maltotriose, Q; quercethin, ON 0.5; Onion powder (0.5%) was added to the basal culture medium, and cultured liquid was precipitated with 80% ethanol. ON 1.0; Onion powder (1.0%) was added to the basal culture medium, and cultured liquid was precipitated with 80% ethanol.)에 나타난 바와 같이, Rf 0, 0.05, 0.16, 0.25부분에서 UV와 DAP에서 모두 발색하였으며, Rf 0.30, 0.48에서는 DAP에서만 발색하였다.

DAP에서만 발색된 Rf 0.3은 DP4와 분자량이 유사한 당이고, Rf 0.48은 단당일것으로 예상된다. 양파분말을 첨가하지 않은 버섯균사체배양물 (AP)의 경우 Rf 0.05부위에 DAP에만 발색하는 spot을 나타내었으나 ON-80EP의 경우 Rf 0, Rf 0.07, Rf 0.12의 spot은 UV와 DAP에서 모두 발색을 나타내었으며, 양파유래 quercetin과 β-glucan 배당체일 가능성이 있다.

실험예 1-3 : HPLC 분석

녹차 및 양파분말을 첨가한 배지에서 배양된 버섯균사체 배양액 80EP를 시료를 HPLC [Dionex PDA-100 UV detector, P-680 pump, ASI-100 fraction collector, TSK-GEL column (4.6×50nm, TOSOH), Flow rate; 1 /min), Moblie phase; deionized water, Oven temp 25℃]를 이용하여 분석하였다. UV의 흡광도는 257, 260, 280 nm의 3파장을 측정하였으나 효소활성과 관련된 280nm 에서의 함량변화를 조사하였다.

먼저, GT0.5-80EP를 DEAE 컬럼으로 분획한 것을 HPLC로 분석하였다. DEAE column에서 분획된 첫 번째 peak (GT0.5-80EP-A)를 collection하여 HPLC로 다시 분석한 결과, 도 5(HPLC chromatogram of GT0.5-80EP-A, GT0.5-80EP-B. Detector: UV. Column: TSK-GEL column (4.6×250mm ). Flow rate: 1㎖ /min, Moblie phase: DDW. left column: GT0.5-80EP-A, right column: GT0.5-80EP-B.)에 나타난 바와 같이, RT 10.212에서는 UV에서만 detection되는 peak가 나타났다. DEAE column에서 분획된 컬럼의 두 번째 peak (GT0.5-80EP-B)를 collection하여 HPLC로 다시 분석한 결과, RT 8.886 분대에서 RI와 UV 모두에서 detection되었다. 따라서, RT 8.886분대에 detection된 peak가 배당체일 가능성이 크다.

또한, ON1.0-80EP를 DEAE 컬럼으로 분획한 것을 HPLC로 확인하였다. 그 결과 도 6(HPLC chromatogram of ON1.0-80EP-A, ON1.0-80EP-B, ON1.0-80EP-C and ON1.0-80EP-D. Detector: UV. Column: TSK-GEL column (4.6×250mm). Flow rate: 1㎖ /min, Moblie phase: DDW. A:ON1.0-80EP-A, B:ON1.0-80EP-B, C:ON1.0-80EP-C, D:ON1.0-80EP-D.)에 나타난 바와 같이, DEAE column에서 분획된 첫 번째 peak (ON1.0-80EP-A)는 RT 8.146분대와 17.466에서 RI와 UV모두에서 detection되는 peak가 나타났으며, DEAE column에서 분획된 두 번째 peak (ON1.0-80EP-B)는 RT 8.913분대와 17.724 분대에서 RI와 UV모두에서 detection되는 peak가 나타났다. DEAE column에서 분획된 세 번째 peak (ON1.0-80EP-C)는 RT 6.769, 7.753, 17.480 분대에서 나타났다. DEAE column에서 분획된 네 번째 peak (ON1.0-80EP-D)는 RT 8.867와 17.480 분대에서 나타났다.

실험예 1-4 : Aglycon 및 β-glucan의 구조 확인

가) IR

녹차 및 양파분말에서 배양된 버섯균사체추출물의 80EEP의 구조분적을 위하여 KBr을 대조구로 하여 FT-IR spectrum (BRUKER IFS 48)을 측정하였다. KBr pellet은 KBr분말을 130℃에서 24시간 가열건조한 후 데시케이타에서 방냉시키킨 다음, KBr 200mg 을 700 kg/㎤의 압력하에서 성형한 다음 시료 30 mg/ml 농도로 희석된 시료액 100 ㎕을 KBr cell에 떨어트린 다음 건조하여 측정하였다.

도 7(IR spectrum of catechin (A), AG-80EP (B), hot water extract of green tea (C), GT0.5-80EP (D))에 나타난 바와 같이, Catechin 표준품의 특징적인 IR 스펙트럼은 3386.33㎝^-1(broad OH absorption), 1606.38~ 1030.41㎝^-1 (very weak or medium sharp eight peaks), 983.55, 870.05, 823.09, 766.59, 666.09㎝^-1(very weak, sharp)이었다.

아가리쿠스버섯균사체 추출물을 80% 에탄올로 침전시킨 침전물(AG-80EP)은 3441.94 (broad OH absorption), 2924.35㎝^-1 (small, medium broad), 1636.45㎝^-1 (medium, broad)와 1058㎝^-1 (medium, broad)에서 특징적인 흡광을 보였다.

녹차열수추출물(GTE)은 3453.83 (broad OH absorption) 및 1636.46㎝^-1 (medium, broad)와 1052.15㎝^-1 (medium, broad)에서 특징적인 흡광을 보였다. GT0.5-80EP의 경우는 GTE 및 AG-80EP에서 관찰된 흡광 이외에 616.96, 540.33㎝^-1 (medium broad)에서 특이한 흡광을 나타내었다.

또한, 도 8(IR spectrum of Quercetin (A), AG-80EP (B), Onion tea hot water extract (C), ON1.0-80EP (D))에 나타난 바와 같이, Quercetin 표준품의 특징적인 IR 스펙트럼은 3410.45㎝^-1(broad OH absorption), 1660.26~ 1168.93㎝^-1 (very weak or medium sharp 9 peaks), 1014.72, 825.55, 639.01㎝^-1(very weak, sharp) 이다.

양파열수추출물 (ONE)은 3441.94 (broad OH absorption), 2924.35㎝^-1 (small, medium broad), 1636.46㎝^-1 (medium, broad)와 1058.33㎝^-1 (medium, broad)에서 특징적인 흡광을 보였다. ON1.0-80EP의 경우는 ONE와 AG-80EP의 흡광벤드 이외에 657.13, 615.79, 540.73㎝^-1 (medium broad)에서 특징적인 흡광을 보였다.

나) UV scan

녹차 및 양파분말을 첨가하여 배양한 버섯균사체 추출물이 녹차유래의 catechin과 양파유래의 quercetin이 버섯균사체가 분비하는 효소에 의해 β-glucan과 결합된 형인지를 확인하기 위하여 catechin과 quercetin의 특이한 UV/Vis 흡수 pattern과 비교하여 확인하였다. UV spectrum (Backman C-680 spectrophotometer)에서 흡광값 (200~600)을 scan하여 이들의 최대흡광도와 흡광 pattern을 비교 측정하였다.

그 결과, 도 9(UV scan of GT. Absorbance was scanned at 200 to 600nm by Backman C-680 series spectrophotometer. A; AG-80EP, B: Submerged liquid culture of Agaricus blazei in medium containing 0.125% green tea powder (GT0.125%), C; GT0.25, D; GT0.5.) 및 도 10(UV scan of AG-80EP (A). B; GTE. C: 6 day Agaricus blazei with green tea extract. D: 9 day Agaricus blazei with green tea extract.)에 나타난 바와 같이, AG-80EP는 273nm에서 최대 peak을 나타내며 GTE의 경우 251, 265nm 에서 최대 peak을 나타내었다. Catechin 표준품은 207nm 에서 최대peak를 나타내고 279, 530, 541, 548 nm에서도 흡광을 나타내었다. DP7 당의 경우 최대 흡광값은 231nm 였으며, 275, 279, 282, 295nm에서 흡광을 나타내었다.

GT0.5-80EP를 6일간 배양하면 251, 258, 265, 279 nm에서 최대 흡광도를 나타내었다. 배양기간이 9일이상 경과되면 이러한 특징적인 UV흡광을 나타내는 peak들이 사라지는데, 이는 bioconversion된 배당체가 다른 물질로 전환되므로써 일어나는 현상일 수 도 있을 것으로 추정된다. 따라서, 배당체를 생성하기위해서는 배양기간을 6일 이내로 하는 것이 바람직할 것으로 생각된다.

한편, ON1.0-80EP은 도 11(UV scan of GT. Absorbance was scanned at 200 to 600 nm by Backman C-680 series spectrophotometer. A; AG-80EP, B: Submerged liquid culture of Agaricus blazei in medium containing 0.5% onion powder (ON0.125), C; ON0.25, D; ON0.5.) 및 도 12(UV scan of AG-80EP (A). B; ONE. C: 6 day Agaricus blazei with onion extract. D: 9 day Agaricus blazei with onion extract.)에 나타난 바와 같이, 255nm 에서 최대 peak을 나타내었으며, 257, 267nm 에서 peak의 흔적을 나타내고 350, 523, 557nm 에서도 peak를 나타내었다. 양파의 quercetin은 228, 202, 373, 557nm 에서 peak를 나타내었다. 양파를 첨가한 배양물의 열수출물에 공통적으로 257, 350nm 에서 peak를 나타낸다는 사실로 미루어 보아 bioconversion 물질, 즉 β-glucan과 quercetin 배당체가 생성되었을 가능성이 크다. Quercetin의 특질적인 peak인 557nm 에서 흡광을 나타내는 것으로 미루어, quercetin 배당체 생성 가능성은 더욱 크다.

다) GC-MS/MS

Pazur등의 방법에 따라 분리된 다당체의 구조 동정은 acetyl화된 단당을 GC-MS를 사용하여 구조를 확인하고, periodate oxidation방법을 이용하여 연결구조를 밝히고, acetolysis방법을 이용하여 1→6 glycosidic linkage와 1→2, 1→3 linkage를 구분하고, methanolysis를 이용하여 다당체를 부분적으로 분해시켜 올리고당을 만들어서 분리 한 다음, 구성당 분석을 통해 구조를 동정하였다.

그 결과, 도 13(GC-MS of GT0.5-80EP (up) and ON1.0-80EP (down). GC column; Supelcowax-10 (60m, 0.32mm i.d.). Temperature program; 150C (5min) - 240C (20min), at 4℃/min.)에 나타난 바와 같이, GT0.5-80EP의 경우 Glucose, xylose, 그리고 ON1.0-80EP의 경우는 Glucose와 mannose가 확인되었다.

실험예 2: 기능성 조사 실험

실험예 2-1: 항산화력 조사 실험

가) Superoxide (O₂ ^-) assay: NBT reduction

시료로 24시간 처리된 RAW 264.7 cell (murine macro phage cell line)의 상층액을 제거 한 후 PBS로 세척한 후 100㎍/㎖ PMA를 포함한 600㎍/㎖ NBT 반응액을 50㎕ 첨가하여 2시간 배양시킨 후 상층액을 제거하고 methanol로 2회 세척한 후 140㎕ DMSO로 결정을 용해하여 540 에서 흡광도를 측정하고 O^2-의 생성지표는 대조군에 대한 %로 나타내었다.

GT0.5-80EP, GTE, GTE-BM을 각각 용매분획한 다음, ethyl acetate 분획물을 superoxide 측정을 위한 시료로 사용하였다. 그 결과는 도 14(Inhibition of superoxide anion production in RAW 264.7 cell by ethylacetate fraction of GT0.5-80EP(50㎍). GT0.5-80EP is 80% ethanol precipitates of submerged liquid cultured in basal medium with 0.5% green tea powder by mushroom mycelia.)에 나타난 바와 같이, 각각 66.00, 46.80, 53.10%의 superoxide 생성 저해율을 보였으며 GT0.5-80EP의 ethylacetate fraction이 가장 높은 저해율을 보였다

실험예 2-2: 항암성 조사 실험

가) Mouse 항복수암 실험

Female ICR mouse (6~7주령)를 cage당 10마리씩 넣었다 (이때, cage당 평균무게가 같게 임의적으로 넣는다). 온도와 습도가 조절되는 시설에 물과 음식을 자유롭게 먹도록 하여 1주일 동안 사육하였다. ICR 암컷 mouse 복강에서 계대 배양된 S-180 cell (1×10⁷ cell/㎖ PBS)을 각 mouse에 0.1㎖ 씩 복강에 주사하여 복수암을 유발하였다. 복수암 유발 후 2일마다 시료 0.2㎖ 을 mouse의 경구 투여하였다. S-180 세포 복강 투여 후 3일 간격으로 mouse의 무게와 사료 섭취량을 조사하며 42일 동안 생존한 mouse의 수와 생존일수를 기록하였다.

그 결과, 하기 표 3에 나타난 바와 같이, 대조군 마우스의 평균수명은 25.6일 이었으며 마우스의 최장 생존일 수는 32일이었다. GT0.5-80EP 처리구에서는 평균수명이 32.4일로 대조군에 비해 27% 수명이 연장되었으며, 2마리는 복수가 줄어들면서 암이 치유되어 42일이 경과시까지 생존하였다. ON1.0-EP처리구에서는 평균수명이 30.6일로 대조군에 비해 20%의 생명연장효과가 있었다. 그중 1마리가 복수가 줄어들면서 암이 치유되어 42일까지 생존하였다. 이상의 결과로 볼때 녹차 및 양파 추출물을 함유한 버섯균사체 추출물들이 S-180 세포에 의해 유발된 복수암에 항암력을 가지며, 생명연장효과와 암을 치유할수 있음을 알 수 있었다.

[표 3: Mouse 항복수암 실험 결과]

나) GT0.125-80EP, GT0.25-80EP, GT0.5-80EP의 mouse에 대한 항암성

녹차분말 (dry weight base로 0.125, 0.25, 0.5%)을 기본배지에 첨가하여 배양한 버섯균사체배양액을 80%에탄올로 침전시킨 다음, 원심분리하여 얻은 시료 (GT0.125-80EP, GT0.25-80EP, GT0.5-80EP)의 mouse에 대한 항암성을 조사하였다. S-180 복수암 세포를 ICR female mouse의 복강에 투여한 1일 후에 GT0.125-80EP, GT0.25-80EP, GT0.5-80EP 각각 100㎍/0.2㎖을 처리한 다음 2일간격으로 5회에 걸쳐 경구투여한 후 42일 동안 생존한 mouse의 수와 생존일수를 조사하였다.

그 결과 하기 표 4에 나타난 바와 같이, 대조군 마우스의 평균수명은 24.5일 이었으며 마우스의 최장 생존일 수는 30일이었다. GT0.125-80EP 처리구의 평균수명은 32.2일로 대조군에 비해 31% 수명이 연장되었으며 그중 1마리는 암이 치유되어 42일이 경과시까지 생존하였다. GT0.25-80EP 처리구는 평균수평이 33.4일로 대조군에 비해 36%의 연장효과가 있었다. 그중 1마리는 암이 치유되어 42일이 경과시까지 생존하였다. GT0.5-80EP 처리구는 평균수명이 34.7일 이었으며 대조군에 비해 42%의 수명연장효과를 나타내었다. 시험이 종료되는 시점까지 2마리가 생존하였다. 시험종료시까지 약 10~20%는 암에 걸리지 않았다.

[표 4: GT0.125-80EP, GT0.25-80EP, GT0.5-80EP의 mouse에 대한 항암성 실험 결과]

다) ON0.25-80EP, ON0.50-80EP, ON1.0-80EP의 mouse에 대한 항암성

양파분말 (dry weight base로 0.25, 0.5, 1.0%)을 기본배지에 첨가하여 배양한 버섯균사체배양액을 80%에탄올로 침전시킨 다음, 원심분리하여 얻은 시료 (ON0.25-80EP, ON0.50-80EP, ON1.0-80EP)의 mouse에 대한 항암성을 조사하였다. S-180 복수암 세포를 ICR female mouse의 복강에 투여한 1일 후에 ON0.25-80EP, ON0.50-80EP, ON1.0-80EP를 각각 100㎍/0.2㎖을 처리한 다음 2일간격으로 5회에 걸쳐 경구투여한 후 42일 동안 생존한 mouse의 수와 생존일수를 조사하였다.

그 결과 하기 표 5에 나타난 바와 같이, 대조군 마우스의 평균수명은 24.5일 이었으며 마우스의 최장 생존일 수는 30일이었다. ON 0.25-80EP 처리구의 평균수명은 30.2일로 대조군에 비해 23% 수명이 연장되었으며 그중 1마리는 41일이 경과시까지 생존하였다. ON 0.5-80EP 처리구는 평균수평이 31.3일로 대조군에 비해 28%의 연장효과가 있었다. 그중 1마리는 41일이 경과시까지 생존하였다. ON1.0-80EP 처리구는 평균수명이 33.2일 이었으며 대조군에 비해 36%의 수명연장효과를 나타내었다. 시험이 종료되는 시점까지 1마리가 생존하였다. 시험종료시까지 약 10%는 암에 걸리지 않았다.

[표 5: ON0.25-80EP, ON0.50-80EP, ON1.0-80EP의 mouse에 대한 항암성 실험 결과]

실험예 2-3: 항관절염 조사 실험

가) MTT assay에 의한 Cytotoxicity 확인

골아세포인 ROS 17/2.8 (Rat osteosarcoma 17/2.8) cell line을 DMEM/F12 배지에 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ incubator의 조건에서 10 cm Petri dish에 배양하였다. 세포를 배양 후 시료의 처리 농도를 알기 위하여 96 well로 계대 배양 후 각각의 sample을 처리한 후 MTT (3-[4,5-Dimethylthylthiazol-2-yl]- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) 100㎍/100㎕ 로 처리 4시간 후 570 에서 흡광도를 측정하였다.

즉, 녹차분말첨가배지의 catechin의 처리 농도를 알기 위하여 MTT assay를 실시하였다. 그 결과, 도 15(MTT assay of GTC0.1-80EP in the ROS 17/2.8 cell. GTC0.1-80EP: 80% ethanol precipitates of submerged liquid cultured in basal medium with 0.1% catechin extracted from green tea powder by mushroom mycelia.)에 나타난 바와 같이, 5㎍ /10㎕ , 10㎍ /10㎕ 처리 시 ROS 17/2.8 cell의 증식도가 감소되는 것을 확인할 수 있었고, 1㎍ 처리 시 control과 비교하여 증식도가 유사하였다. 따라서 NO assay를 위하여 1㎍ /10㎕ 의 농도로 sample의 양을 결정하였다.

나) Cytokine으로 활성화 시킨 ROS 17/2.8 cell의 NO 생성 억제 효과

상기 가)의 10cm dish에 배양한 세포를 PBS로 1회 washing 한 후 24 well plate에 2×10⁵ 개/㎖ 분주하였다. 24시간을 배양하고 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin이 첨가 된 새로운 배지로 교체하였다. TNF-α, IL-1β, LPS를 처리하여 배양하였다. 48시간 배양 후 배지와 Griess Reagent (1% sulfanilamide in 5% phosphate : 0.1% naphthylethylenediamine dihydrochloride in water = 1:1, v/v)를 혼합하여 540nm 에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 sodium nitrite를 사용하였다.

즉, Cyokine으로 활성화 시킨 ROS 17/2.8 cell에 GTC0.1-80EP을 농도별로 첨가하여 NO 생성 억제를 확인 해 보았다. 시료 100 ㎍/ml를 처리하였을 때, NO 생성억제 정도는, 도 16(NO inhibition by GTC0.1-80EP. GTC0.1-80EP: 80% ethanol precipitates of submerged liquid cultured in basal medium with 0.1% catechin extracted from green tea powder by mushroom mycelia.)에 나타난 바와 같이, AG-80EP (14.8±1.3), GTC0.1-80EP (34.4±1.9), GTC0.1-BM (17.3±1.1), GTC0.3-80EP (22.4±1.3), GTC0.3-BM (19.7±1.7), GTC0.5-80EP (30.3±1.7), GTC0.5-BM (27.9±1.3), GTC(22.0±1.5)의 NO 억제율을 나타내었다. Cytokine으로 활성화 된 ROS 17/2.8 cell에 0.1% GTC0.1-80EP의 NO 생성 억제가 가장 좋았다.

또한, GTC0.1-80EP는 녹차분말로부터 추출한 catechin (dry weight base로 0.1%)을 기본배지에 첨가하여 배양한 버섯균사체배양액을 80%에탄올로 침전시킨 다음, 원심분리하여 얻은 시료이다. 녹차를 첨가하지 않고 배양한 신령버섯균사체 배양물에 비해 NO 생성 억제 효과가 나타났다.

다) 신령버섯균사체 배양액의 iNOS 생성억제 효과

상기 가)의 방법으로 배양한 세포를 PBS로 1회 washing 한 후 3 ×10⁶개의 세포를 10 ㎝ dish에 분주하였다. 24시간 배양하고 새로운 배지로 교체하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 1% penicillin-streptomycin과 10% FBS가 첨가 된 새로운 배지로 교체한 후 시료를 처리하였다. 1시간 후 cytokine mixture인 LPS 1㎍/㎖, TNF-α 25㎍/㎖, IL-1β 12.5㎍/㎖를 처리하여 48시간 배양하였다. 배양 후 세포를 PBS로 세척을 한 후 모아서 50 mM Tris buffer (pH 7.4) 용액에 protease inhibitor [1.0 mM EDTA, 0.1 uM (2.0㎍/㎖) aprotini, 1uM (0.5㎍/㎖) leupetin, 1 uM (0.7㎍/㎖) pepstatin A, 1.0 mM (174㎍/㎖) phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)]를 200 ㎕을 처리하여 세포를 파쇄시켰다. 이것을 13,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 상층액을 얻어 Bradford법으로 protein을 정량하였고, 7.5% SDS-PAGE를 이용하여 분리하였다. 전기영동이 끝난 후 gel로부터 단백질을 PVDF membrane로 transfer한 후, TTBS로 10분간 3회 washing한 후 5% non-fat skim milk에 상온에서 2시간 동안 blocking하였다. Blocking 후 PVDF membrane을 washing하고 primary antibody를 처리하여 4℃에서 overnight하고 secondary antibody (HRP-conjugated)를 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후 ECL detection reagents (Amersham, Berkshire, UK)로 감광하여 발현을 확인하였다.

즉, Cytokine으로 활성화 시킨 ROS 17/2.8 cell에서 GTC0.1-80EP가 iNOS의 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과 도 17(Inhibition of iNOS expression by GTC0.1-80EP in the ROS 17/2.8 cell. GTC0.1-80EP: 80% ethanol precipitates of submerged liquid cultured in basal medium with 0.1% catechin extracted from green tea powder by mushroom mycelia.)에 나타난 바와 같이, iNOS 발현이 저해됨을 확인 할 수 있었다. iNOS 발현은 AG-80EP (86.3±1.1), GTC0.1-80EP (27.3±1.0), GTC0.1-BM (82.7±1.1), GTC0.3-80EP (75.0±1.1), GTC0.3-BM (77.3±1.1), GTC0.5-80EP (36.0±1.2), GTC0.5-BM (55.7±1.5), GTC (57.7±1.1) 로 확인하였고, 이 결과로부터 NO 생성억제의 원인은 iNOS 발현에 의한 것이라는 것을 추정할 수 있었다. 상기 NO 생성억제의 결과와 같이 GTC0.1-80EP에서 iNOS 발현억제가 가장 컸다.

실험예 2-4: 면역성 조사 실험

가) 혈장의 C₃, IL-2 및 IL-6 농도를 측정

신령버섯균사체 추출물 80% 에탄올 침전물(AP)과 녹차분말을 첨가해여 배양한 신령버섯균사체 배양물의 80% 에탄올침전물(GT0.25, GT0.5 80EP)와 양파분말을 첨가해여 배양한 신령버섯균사체 배양물의 80% 에탄올침전물(ON0.5, ON1.0 80EP)의 기능성으로서 면역능 증진에 미치는 영향을 살펴보기 위해 혈장의 Interlukin-2 (IL-2), Interlukin-6 (IL-6), C₃의 분비량을 비교 조사하였다.

ICR mouse에 AP 및 GT0.25, GT0.5 80EP, ON0.5, ON1.0 80EP을 100 ㎎/㎖을 5일간 섭취시킨후 2주간 방지한 다음 ON1.0 80EP을 100㎎/㎖의 섭취 전 후의 면역성분으로 혈장의 C₃, IL-2 및 IL-6 농도를 측정하였다. 대조군은 같은 양의 phosphate buffer (pH 7.3)을 사용하였다. 혈장 C₃는 면역 활산법을 이용한 radial immunodiffusion plate (Nor-partigen, Behring Co., Germany)를 사용하여, IL-2,와 IL-6는 enzyme immunoassay kit (Immunotech, A Beckman Coulter Co., France)를 사용하여 ELISA reader로 측정하였다.

그 결과, AG-80EP 및 GT0.25, GT0.5의 IL-2 (Antiinflammatroy cytokine의 혈장농도는 AG, GT0.5, GT1.0에서 각각 31.2, 25.2, 24.0 pg/㎖로 대조구의 49.6 pg/㎖과 비교하였을때 유의적으로 낮아졌다(도 18(Serum interlukin-2 level of mice injected I.P. with GT0.25-80EP and GT0.5-80EP for 2 weeks.)). IL-6는 대조군의 140.5 pg/㎖보다 높은 193.8, 219.7, 240.8 pg/㎖으로 녹차분말을 첨가하고 농도를 증가시킬수록 IL-6의 활성이 높게 나타났다(도 19(Serum interlukin-6 level of mice injected I.P. with GT0.5-80EP for 2 weeks.)). C₃함량은 녹차분말의 처리와 농도가 증가할수록 증가는 하였으나 유의적인 증가를 보이지는 않았다(도 20(Serum C3 level of mice injected I.P. with GT0.5-80EP for 2 weeks.)).

IL-6 및 C₃의 주요작용은 T 세포와 B 세포의 발달 및 활성화, 다른 cytokines의 유도 및 cytokines receptor 합성등에 있다. 생체의 면역 체계에서 T 세포와 식세포가 주 역할을 하여, 세포성 면역과 B 세포와 T 세포에 항원을 나타내는 마이크로파지 등에 의해 형성되는 항체생산 등이 있다.

IL-2 (T-cell growth factor)는 T 세포에서 분비되는 glycosiylated protein으로 helper T cell의 합성에 결정적인 역할을 하는데, 활성화된 T 세포는 IL-2를 분비하며 표면에 IL-2 receptor와 transferrin recepter가 나타나고, 이것이 T 세포의 계속적인 증식을 일으킨다. 그러므로 IL-2의 분비가 적으면 림프구 억제와 NK 세포증식 및 B 세포의 항체합성을 증가시키며, 동물에서 antimetastatic 효과를 나타낸다. 이상의 결과로 볼때 GT-80EP의 섭취로 인하여 마우스의 T 세포와 B 세포의 증식을 증가시키고 혈장 C₃함량을 증가시키므로 GT0.5-80EP의 섭취가 일반적으로 면역 능력증진에 효과가 있다고 볼 수 있다.

또한, 양파분말을 첨가한 배지에서 배양시킨 버섯균사체의 IL-2, IL-6, C₃농도를 조사하였다. 그 결과 AG-80EP, 및 GT0.25-80EP, GT0.5-80EP의 IL-2의 혈장농도는 AG, GT0.5-80EP, GT1.0-80EP에서 각각 31.2, 28.0, 27.2 pg/㎖를 나타내었다(도 21(Serum interlukin-2 level of mice injected I.P. with ON0.5-80EP and ON1.0-80EP for 2 weeks.)). 대조구의 49.6 pg/㎖ 보다는 낮은 수치였으나 각각의 처리구간에는 유의적인 증가는 없었다. IL-6는 대조군의 140.5 pg/㎖보다 높은 193.8, 208.0, 221.4 pg/㎖으로 양파분말을 첨가하고 농도를 증가시킬수록 IL-6의 활성이 높게 나타났다(도 22(Serum interlukin-6 level of mice injected I.P. with ON0.5-80EP and ON1.0-80EP for 2 weeks.)). C₃함량은 양파분말의 처리농도가 증가 할수록 활성이 증가 하였으나 유의적인 증가를 보이지는 않았다(도 23(Serum C₃ level of mice injected I.P. with ON0.5-80EP and ON1.0-80EP for 2 weeks.)).

한편, 상기에서는 본 발명을 특정의 바람직한 실시예에 관련하여 도시하고 설명하였지만, 이하의 특허청구범위에 의해 마련되는 본 발명의 기술적 특징이나 분야를 이탈하지 않는 한도 내에서 본 발명이 다양하게 개조 및 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백한 것이다.

본 발명에 따르면, 항산화성, 항관절염성, 항당뇨성, 골다공증치료효과, 갱년기장애억제, 면역력향상, 항암효과 등의 기능성을 갖는 고 기능성 배당체를 제공할 수 있다.

도 1 및 도 2는 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 GT0.5-80EP 침전물 및 ON1.0-80EP 침전물의 DEAE column chromatography 결과를 나타내는 그래프이고,

도 3 및 도 4는 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 GT-80EP 침전물 및 ON-80EP 침전물의 TLC 패턴을 나타내는 사진이고,

도 5 및 도 6은 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 GT0.5-80EP 침전물 및 ON1.0-80EP 침전물의 HPLC 분석 결과를 나타내는 그래프이고,

도 7 및 도 8은 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 GT 침전물 및 ON 침전물에 대한 IR 스펙트럼 결과 그래프이고,

도 9 및 도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 GT 침전물에 대한 UV scan 결과 그래프이고,

도 11 및 도 12은 본 발명의 일 실시예에 따른 ON 침전물에 대한 UV scan 결과 그래프이고,

도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 GT0.5-80EP 침전물의 GC-MS/MS 결과 그래프이고,

도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 침전물의 superoxide 측정 결과 그래프이고,

도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 침전물의 MTT assay 실험의 결과 그래프이고,

도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 침전물의 NO 생성 억제 효과 실험의 결 과 그래프이고,

도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 침전물의 iNOS 생성억제 효과 실험의 결과 그래프이고,

도 18 내지 도 20은 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 GT0.5-80EP 침전물의 C₃, IL-2 및 IL-6 농도를 측정한 결과 그래프이고,

도 21 내지 도 23은 각각 본 발명의 일 실시예에 따른 ON0.5-80EP 침전물과 ON1.0-80EP 침전물의 C₃, IL-2 및 IL-6 농도를 측정한 결과 그래프이다.

Claims (6)

1. 버섯균사체에 포함된 베타-글루칸(β-glucan)과 녹차에 포함된 파이토케미컬(phytochemical)이 결합된 배당체(glucoside) 획득방법으로서,

   대두박분해물, 황백당, MgSO_4?7H₂O 및 KH₂PO₄ 가 포함된 액체배지에, 상기 액체배지의 중량에 대하여 0.25% 내지 0.50% 범위 내의 녹차분말을 첨가하여 배지를 준비하는 단계;

   상기 준비된 배지에 버섯균사체를 6일 이내로 배양하는 단계; 및,

   상기 버섯균사체가 배양된 배양물에 에탄올을 첨가하여 침전물을 분리하는 단계;를 포함하고,

   상기 분리한 에탄올 침전물은 70% 내지 90% 범위 내의 에탄올 농도를 가지는 것을 특징으로 하는 배당체 획득방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 준비된 배지에 버섯균사체를 배양하는 단계는,

   버섯균주를 대두박분해물, 황백당, MgSO_4?7H₂O 및 KH₂PO₄ 가 포함된 액체배지와 혼합한 후 인큐베이터로 배양하여 버섯균사체 액체배양액을 제조하는 단계; 및,

   상기 준비된 배지에 상기 제조한 버섯균사체 액체배양액을 주입하여 버섯균사체를 배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 배당체 획득방법.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제

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