KR101633610B1 - 자가분해효소를 제거한 유포자 프로바이오틱스의 마이크로캡슐화 방법 및 그 방법으로 제조된 유포자 프로바이오틱스 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유포자 프로바이오틱스 균주로 구분되는 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butyricum), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실루스 메센테리쿠스 (Bacillus mesentericus), 바실루스 리체니폴미스 (Bacillus licheniformis), 바실루스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus)의 자가분해효소(autolysin)가 포함된 전포자(forespore)를 화학적 충격법(chemical shock)에 의해 자가분해효소가 제거된 포자로 유도하는 단계; 화학적 충격법(chemical shock)을 통해 자가분해효소를 제거한 포자를 1차 박막코팅(film coating), 2차 마이크로캡슐화(microencapsulation) 방법으로 코팅하여 포자 전환율이 높고 안정성 및 내구성이 증가된 제형을 제조하는 단계로 이루어진 자가분해효소를 제거한 유포자 프로바이오틱스의 마이크로캡슐화 제조방법에 관한 것으로, 온도와 영양분 제한으로 영양세포를 포자로 전환하는 기존의 방법에 비해 포자의 생산성과 균일성이 우수하고 본 발명에 따른 마이크로캡슐화 유포자 프로바이오틱스는 장기 보존성과 재발아율이 뛰어나는 등의 효과를 제공한다.
Description
본 발명은 자가분해효소를 제거한 유포자 프로바이오틱스의 마이크로캡슐화 제조방법, 그 방법으로 제조된 박막코팅 마이크로캡슐화된 유포자 프로바이오틱스 및 이를 포함하는 제품에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 화학적 충격법(chemical shock)에 의해 자가분해효소가 제거된 포자를 형성하고 이를 박막 코팅 및 마이크로캡슐화하는 방법, 상기 방법으로 제조된 마이크로캡슐화 코팅 유포자 프로바이오틱스 및 이를 포함하는 제품에 관한 것이다.
유포자 프로바이오틱스(spore-forming probiotics)는 포유류의 장내에 서식하여 장내 유해세균에 의한 이상발효를 방지해 장내 세균총(microflora)을 정상화시키는 역할을 하는 유익균이다.
예를 들어 낙산균(C. butyricum)은 오래 전부터 알려진 유포자 프로바이오틱 균주로 정장제, 동물의약품에 사용된다. 또한 소화균인 바실루스(Bacilli)균은 각종 소화효소를 생산하고 발효를 통해 각종 유효물질을 생성함으로써 장내 유익균에는 영양공급을 하고 장내 유해세균은 억제시키는 역할을 하는 중요한 유포자 프로바이오틱 균이다.
상기와 같이 유용한 유포자 프로바이오틱스는 포자형태로 위장관을 통과하여 영양세포(vegetative cell)로 발아(germination) 후, 정착하여 장관운동의 활성화, 유해세균의 억제, 숙주의 면역력 강화 등 각종 생리활성 효과를 발휘한다.
유포자 프로바이오틱스는 영양세포상태에서는 온도, 습도, 각종 소화효소에 노출시 사멸하게 되어 프로바이오틱스의 생리활성 기능을 나타내지 못하는 경우가 많다.
유포자 프로바이오틱스를 산업적으로 제품화하기 위해서는 영양세포를 포자형태로 전환시켜 안정화된 제품을 생산해야 한다. 영양세포를 포자로 전환시키는 종래의 기술로는 영양분고갈법(starvation), 열 충격법(heat shock), 냉각충격법(cold shock)등을 이용한 스트레스 유도 내생포자 생성법 등이 있었다.
구체적으로 종래 유포자균의 포자유도기술은 배양과정에서 배지 영양분을 고갈시켜 포자를 생성시키는 방법과 배양온도보다 높은 온도로 일정시간 승온하여 포자생성을 유도하는 방법, 배양온도보다 낮은 온도로 일정시간 냉각시켜 세포성장을 정지시켜 포자생성을 유도하는 것을 특징으로 하였다.
상기의 종래 유포자균의 포자유도기술은 통상의 방법으로 배양된 유포자균을 대상으로 하기 때문에 균의 성장단계(growth phase)가 일정하지 못하고 영양세포(vegetative cell), 전포자(forespore), 포자(spore)로 구분되는 균이 혼합되어 있어 종래 포자유도기술로는 포자로 전환시키는데 한계점을 나타내고 배양시간을 늘리게 됨으로써 공정추가에 따르는 비용부담이 발생하고 생산성이 떨어지게 된다. 또한 종래 포자유도기술이 발효조 안에서 이루어지기 때문에 영양부분에 포함되어 있는 자가분해효소를 완전히 제거하기는 어려워 제품의 안정성도 떨어지게 된다.
대한민국 특허공개 제 10-2008-0070168호는 영양분 고갈법(starvation)으로 형성된 포자에 열 스트레스를 가하여 온도 변화에도 안정한 바실러스 서브틸러스 AH18의 제제화 방법을 개시하고 있다. 구체적으로 상기 제조방법은 열 스트레스를 통한 열 저항성 포자를 유도하고 무기 미세다공성 담체에 혼입하는 것을 특징으로 한다.
그러나 상기의 개선된 종래 유포자균의 포자 유도방법은 균 성장 phase별로 42 ℃-4시간, 57℃-2시간동안 열 스트레스를 가하여 유포자균의 열내성(heat resistance)만을 획득하도록 하였기 때문에 포자 생성시 영양분 고갈에 소요되는 시간이 길어지고 균일한 포자가 생성되지 않는 등의 문제점이 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위한 방법을 연구하던 중, 본 발명자들은 내열성과 내구성이 뛰어나고 장기 보존성이 우수한 포자 생성을 위한 새로운 방법을 확립하였다.
유포자 프로바이오틱스가 영양세포단계에서 포자로 형성되는 과정에는 자가분해효소(autolysin)가 관여하는 데, 이 자가분해효소는 유포자 프로바이오틱스의 안정성(stability)을 저해하는 인자로 배양과정에서 세포사멸을 유도한다.
본 발명자들은 상기의 자가분해효소를 제거하면 유포자 프로바이오틱스로부터 포자 생성이 가능하다는 사실을 확인하고 이를 바탕으로 안정성이 뛰어난 포자 생성방법을 완성하였다.
본 발명자들은 영양분 고갈법으로 유도된 포자가 아닌 포자 이전 단계의 균일한 생장 phase인 전포자(forespore)단계에서 포자를 생성하고, 생성된 포자를 제조온도와 보관온도에서 내열성과 내구성이 우수하며 장기보관시 유입되는 수분입자가 직접 포자에 닿지 않도록 마이크로캡슐화(microencapsulation)된 유포자 프로바이오틱스를 제공하고자 한다.
따라서, 본 발명의 과제는 전포자(forespore) 단계에서 에탄올을 이용한 화학적 충격법(chemical shock)에 의한 포자유도방법, 유도된 포자를 수용성 폴리머에 의한 1차 박막코팅, 다공성 입자로 2차 마이크로캡슐화된 유포자 프로바이오틱스의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 마이크로캡슐화된 유포자 프로바이오틱스를 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은
(a) 유포자균의 전포자(forespore)를 화학적 충격법(chemical shock)을 적용하여 자가분해효소가 제거된 포자를 유도하는 단계;
(b) 유도된 포자에 수용성 폴리머를 혼합하여 1차 박막 코팅하는 단계;
(c) 상기 (b)단계에서 1차 박막코팅된 유포자균에 다공성 입자를 가지는 코팅제를 혼합하여 2차 마이크로캡슐화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가분해효소가 제거된 유포자 프로바이오틱스의 마이크로캡슐화의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기의 제조 방법으로 제조된 마이크로캡슐화된 자가분해효소가 제거된 유포자 프로바이오틱스 및 이를 포함하는 의약품, 식품, 기능성 식품, 화장품, 동물의약품, 보조사료첨가제 등을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
(a) 유포자균의 전포자(forespore)를 화학적 충격법(chemical shock)을 적용하여 자가분해효소가 제거된 포자를 유도하는 단계;
상기 유포자균의 전포자(forespore)는 포자 전단계의 세포로 포자부분과 영양부분으로 구성된다. 영양부분에는 자가분해효소가 포함되어 있는 데, 전포자에 용매를 이용한 화학적 충격을 가하면 영양부분이 제거되어 포자가 생성되고 자가분해효소는 비가역적으로 불활성화된다. 화학적 충격에 사용되는 용매로는 단백질을 쉽게 변성(denaturation)시킬 수 있는 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명의 화학적 충격법에 사용된 유기용매는 이에 한정되지는 않지만 메탄올(methyl alcohol), 에탄올(ethyl alcohol), 아세톤(acetone), 클로르포름(chloroform), 헥산(hexane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 메탄올(methyl alcohol), 에탄올(ethyl alcohol)이며, 가장 바람직하게는 에탄올(ethyl alcohol)이다.
또한 상기 유포자균은 이에 한정되지는 않지만 클로스트리듐 속(Clostridium sp.), 바실루스 속(Bacillus sp.)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유포자균이며, 바람직하게는 Clostridium butyricum, Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus mesentericus, Bacillus polyfermenticus 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유포자균, 더 바람직하게는 Clostridium butyricum IDCC 5101이다.
상기 유포자균의 화학적 충격은 유포자균 배양액을 원심분리를 통해 균체를 수득하고 화학적 충격법에 사용되는 유기용매를 배양액 부피의 1/20 내지 1 비율로 가하여 일으킨다.
(b) 유도된 포자에 수용성 폴리머를 혼합하여 1차 박막 코팅하는 단계 :
상기 수용성 폴리머는 포자 표면 점착력이 우수하여 코팅시 외부의 습윤공기의 유입을 차단하고 2차 마이크로캡슐화 코팅제인 다공성 입자와의 결합력이 우수한 바인더로 역할을 하는 것이 적합하다. 구체적으로 본 발명의 1차 박막코팅제로 사용된 수용성 폴리머는 이에 한정되지는 않지만, 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose, CMC), 하이드록시에틸셀룰로오스(hydroxyethylcellulose, HEC), 잔탄검 (xanthan gum), 구아검(guar gum), 젤라틴(gelatin), 아라비아검(arabia gum), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone, PVP), 카보폴(carbopol), 소듐알기네이트(sodium alginate), 프로필렌글리콜 알기네이트(propylene glycol alginate)로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose, CMC), 하이드록시에틸셀룰로오스(hydroxyethylcellulose, HEC), 잔탄검 (xanthan gum), 구아검(guar gum), 젤라틴(gelatin), 아라비아검(arabia gum), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone, PVP), 카보폴(carbopol) 이며, 그 중 더 바람직하게는 카르복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose, CMC), 하이드록시에틸셀룰로오스(hydroxyethylcellulose, HEC), 잔탄검 (xanthan gum), 구아검(guar gum), 젤라틴(gelatin), 아라비아검(arabia gum), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone, PVP) 가장 바람직하게는 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone, PVP)이다.
상기 에탄올을 이용한 화학적 충격법(chemical shock)에 의해 전포자(forespore)에서 전환된 포자의 배양액을 기준으로 수용성 폴리머 0.1 %(w/v) 내지 10 %(w/v)의 비율로 혼합하여 1차 박막코팅한다. 바람직하게는 배양액 부피를 기준으로 수용성 폴리머 0.1 %(w/v) 내지 0.5 %(w/v)로 혼합한다.
(C) 상기 (b)단계에서 1차 코팅된 포자에 다공성 입자를 가지는 코팅제를 혼합하여 2차 마이크로캡슐화하는 단계 :
상기 다공성 코팅제는 균체에 다공성 입자성을 가진 기제의 코팅제로서 외부 수분 및 습윤 공기의 유입을 차단시키는 역할을 한다. 미세캡슐화(microencapsulation)에 사용되며 다공성 입자를 가지는 것은 상기 2차 코팅제로 사용가능하며 구체적으로는 이에 한정되지는 않지만 알기네이트(alginate), 말토덱스트린(maltodextrin), 키토산(chitosan), 전분(starch), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG), 트리아세틴(triacetin), 프로필렌글리콜(propyleneglycol), 아세틸트리에틸 시트레이트(acetyl triethyl citrate), 트리에틸 시트레이트(triethyl citrate), 또는 글리세린(glycerin) 등이 포함되며, 바람직하게는 알기네이트(alginate), 말토덱스트린(maltodextrin), 키토산(chitosan), 전분(starch), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol, PEG)일 수 있으며, 더 바람직하게는 말토덱스트린(maltodextrin)을 말한다.
상기 다공성 코팅제는 1차 박막코팅된 포자의 배양액 기준으로 0.1 %(w/v) 내지 10 %(w/v)의 비율, 바람직하게는 0.1 %(w/v) 내지 0.5 %(w/v)로 혼합된다.
본 발명에 따른 포자 생성방법은 포자생성 시간이 짧고 생산성이 높으며 균질의 포자를 생성할 수 있을 뿐만 아니라, 포자가 다시 발아할 때 사멸 인자로 작용하는 자가분해효소가 제거되었기 때문에 완성품의 발아율을 향상시키는 또 다른 효과가 있다.
또한, 본 발명의 방법에 따른 마이크로캡슐화 포자는 자가분해효소에 의해 세포 사멸이 되지 않으며 구조적으로는 1차 박막코팅과 2차 마이크로캡슐화로 안정하여 수분, 공기 등의 외부 환경인자를 효율적으로 차단시켜 높은 경시적 안정성을 나타낼 수 있어, 이에 본 발명의 화학적 충격법과 마이크로캡슐화 방법이 사용된 유포자 프로바이오틱스는 종래 영양분고갈법(starvation), 냉각충격법(cold shock), 열 충격법(heat shock) 등으로 유도된 것에 비하여 포자 생산성이 높고 장기보관에 따른 경시적 안정성이 월등하다.
도 1은 본 발명에 의한 클로스트리듐 부틸리쿰의 배양 24시간-전포자 성상을 나타낸 현미경사진이다.
도 2는 클로스트리듐 부틸리쿰의 영양분 고갈로 유도된 포자 성상을 나타낸 현미경
사진이다.
도 3은 클로스트리듐 부틸리쿰의 화학적 충격법으로 유도된 포자의 성상을 나타낸 현미경사진이다.
도 4는 전포자를 화학적충격법으로 유도한 클로스트리듐 부틸리쿰의 포자의 전자현미경 성상을 나타낸 전자현미경사진이다.
도 5는 화학적충격법으로 유도된 클로스트리듐 부틸리쿰 포자의 수용성 폴리머에 의한 1차 박막코팅의 전자현미경 성상을 나타낸 전자현미경사진이다.
도 6은 수용성 폴리머에 의한 1차 박막코팅된 클로스트리듐 부틸리쿰의 다공성 기제에 의한 2차 마이크로캡슐화의 전자현미경 성상을 나타낸 전자현미경사진이다.
도 2는 클로스트리듐 부틸리쿰의 영양분 고갈로 유도된 포자 성상을 나타낸 현미경
사진이다.
도 3은 클로스트리듐 부틸리쿰의 화학적 충격법으로 유도된 포자의 성상을 나타낸 현미경사진이다.
도 4는 전포자를 화학적충격법으로 유도한 클로스트리듐 부틸리쿰의 포자의 전자현미경 성상을 나타낸 전자현미경사진이다.
도 5는 화학적충격법으로 유도된 클로스트리듐 부틸리쿰 포자의 수용성 폴리머에 의한 1차 박막코팅의 전자현미경 성상을 나타낸 전자현미경사진이다.
도 6은 수용성 폴리머에 의한 1차 박막코팅된 클로스트리듐 부틸리쿰의 다공성 기제에 의한 2차 마이크로캡슐화의 전자현미경 성상을 나타낸 전자현미경사진이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 전포자로부터 자가분해효소 제거
<1-1> 화학적 충격 용매 선정실험
유포자 프로바이오틱스의 전포자로부터 자가분해효소를 효율적으로 제거하기 위한 방법으로 화학적 충격법(chemical shock)을 고안하였으며, 제거효과가 우수한 유기용매를 선정하였다. 유포자균의 배양액을 10,000 RPM, 10분간 원심분리하고 침전된 균체를 회수하였다. 회수된 균체에 화학적 충격법을 가하기 위한 유기용매를 배양액 부피의 1/5배 양을 10분동안 교반하면서 각각 처리하였다. 이때 선정기준은 대표적 유포자 프로바이오틱스인 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butyricum), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실루스 메센테리쿠스 (Bacillus mesentericus), 바실루스 리체니폴미스 (Bacillus licheniformis), 바실루스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus)의 전포자가 갖는 자가분해효소의 역가를 측정하고 실험에 사용한 유기용매를 각각 처리한 후, 자가분해효소의 잔존역가를 측정하여 활성 백분율이 가장 낮은 유기용매를 선정하였다. 자가분해효소의 역가는 sodium dodecyl sulfate (SDS)를 처리한 각 균주의 세포벽(SDS-CWF, SDS-treated cell wall)을 기질로 하여 이 기질의 탁도(turbidity)의 감소치를 600 ㎚ 에서 측정하였다. 탁도는 37℃에서 10분간격으로 60분까지 측정하였으며, 자가분해효소 1 unit를 분당 0.01 탁도를 낮추는 양으로 정의하였다.
| 종류 | 자가분해효소의 활성 백분율(%) | ||||
| None | Methanol | Ethanol | Acetone | Chloroform | |
| Bacillus coagulans | 100 | 32.6 | 16.3 | 47.4 | 58.5 |
| Bacillus licheniformis | 100 | 41.6 | 16.1 | 20.1 | 43.7 |
| Bacillus mesentericus | 100 | 33.0 | 6.6 | 29.5 | 35.2 |
| Bacillus polyfermenticus | 100 | 28.9 | 18.2 | 50.1 | 61.7 |
| Bacillus subtilis | 100 | 33.0 | 12.3 | 53.5 | 62.3 |
| Clostridium butyricum | 100 | 39.6 | 20.0 | 71.4 | 45.2 |
용매에 따른 자가분해효소를 효과적으로 제거한 것은 에탄올을 사용할 때였다. 각 균주별 평균 자가분해효소의 활성 백분율은 14.9%로 제거율은 평균 85% 수준이었다.
<1-2> 화학적 충격법의 에탄올처리부피 결정실험
유포자 프로바이오틱스의 전포자로부터 자가분해효소를 효율적으로 제거하기 위해 에탄올처리 부피를 결정하였다. 유포자균의 배양액을 10,000RPM, 10분간 원심분리하고 침전된 균체를 회수하였다. 회수된 균체에 화학적 충격법을 가하기 위한 용매인 에탄올을 배양액 부피의 1/2.5배, 1/5배, 1/10배, 1/20배의 양을 10분간 교반하면서 각각 처리한 후 자가분해효소의 역가를 측정하였다. 이때 기준은 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butyricum), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실루스 메센테리쿠스 (Bacillus mesentericus), 바실루스 리체니폴미스 (Bacillus licheniformis), 바실루스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus)의 전포자가 갖는 자가분해효소의 역가를 측정하고 에탄올로 화학적 충격을 가한 후의 자가분해효소의 역가를 측정하여 가장 낮은 잔존역가를 나타낸 에탄올의 부피로 결정하였다.
| 에탄올 처리부피 (배양액 부피 대비) |
자가분해효소의 활성 백분율(%) | ||||
| None | 1/2.5x | 1/5x | 1/10x | 1/20x | |
| Bacillus coagulans | 100 | 21.9 | 20.3 | 14.3 | 25.0 |
| Bacillus licheniformis | 100 | 21.4 | 18.0 | 17.1 | 22.3 |
| Bacillus mesentericus | 100 | 17.9 | 13.8 | 10.6 | 35.5 |
| Bacillus polyfermenticus | 100 | 23.7 | 20.8 | 19.9 | 35.6 |
| Bacillus subtilis | 100 | 18.6 | 16.9 | 11.3 | 46.8 |
| Clostridium butyricum | 100 | 25.5 | 23.6 | 22.0 | 29.8 |
자가분해효소 제거 수단으로 에탄올처리 부피를 최적화하는 실험을 하였을 때, 각각의 균주별 배양액 부피의 1/10을 처리시 제거율이 높은 것으로 나타났다. 보다 상세하게는 각각의 균주별 평균 자가분해효소의 활성 백분율은 15.8%로 제거율은 평균 84% 수준이었다.
<1-3> 화학적 충격 시간 최적화실험
유포자 프로바이오틱스의 전포자로부터 자가분해효소를 효율적으로 제거하기 위한 에탄올처리 시간을 결정하였다.유포자균의 배양액을 10,000 RPM, 10분간 원심분리하고 침전된 균체를 회수하였다. 회수된 균체에 화학적 충격법을 가하기 위한 에탄올을 배양액 부피의 1/10배 되는 양을 10, 20, 30, 60분동안 각각의 시간별로 교반하면서 처리하였다. 이때 기준은 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butyricum), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실루스 메센테리쿠스 (Bacillus mesentericus), 바실루스 리체니폴미스 (Bacillus licheniformis), 바실루스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus)의 전포자가 갖는 자가분해효소의 역가를 측정하고 실험에 사용한 배양액 부피의 1/10배 부피의 에탄올을 10~60분 동안 처리한 후, 자가분해효소의 역가를 측정하여 가장 낮은 잔존역가를 나타낸 최적 에탄올처리 시간으로 결정하였다.
| 에탄올처리시간(분) | 자가분해효소의 활성 백분율(%) | ||||
| None | 10 | 20 | 30 | 60 | |
| Bacillus coagulans | 100 | 14.3 | 16.7 | 18.3 | 19.9 |
| Bacillus licheniformis | 100 | 15.1 | 15.8 | 19.2 | 24.5 |
| Bacillus mesentericus | 100 | 7.6 | 9.1 | 11.0 | 14.7 |
| Bacillus polyfermenticus | 100 | 19.2 | 20.8 | 21.5 | 22.3 |
| Bacillus subtilis | 100 | 11.3 | 14.4 | 15.4 | 16.9 |
| Clostridium butyricum | 100 | 18.0 | 22.2 | 24.5 | 25.2 |
전포자로부터 자가분해효소를 제거하기 위해 에탄올처리 시간을 최적화하는 실험을 한 결과, 10분간 처리하였을 때 다른 실험군에 비해 상대적으로 높은 제거율을 나타냈다. 보다 상세하게는 에탄올을 10분간 처리시 각각의 균주별 평균 자가분해효소의 활성 백분율은 14.2%로 제거율은 평균 85% 수준이었다.
실시예 2. 현미경 성상 비교
대표적 유포자 프로바이오틱스인 클로스트리듐 부틸리쿰의 배양시기별 포자성상과 클로스트리듐 부틸리쿰 전포자에 에탄올을 배양액 부피대비 1/10배의 양을 10분간 처리하였을 때, 포자성상을 현미경으로 관찰하였다. [도1]에서 보는 바와 같이, 클로스트리듐 부틸리쿰은 배양 24시간이 되면 영양세포단계에서 전포자를 형성하였다. 48시간이 되었을 때 전포자가 완전 한 형태의 포자로 전환되면서 자가분해효소가 상실되었다[도2]. 배양 24시간의 클로스트리듐 부틸리쿰 전포자에 에탄올처리에 의한 화학적 충격(chemical shock)을 10분간 가하여 포자로 전환시켰다[도3]. 기존의 영양분 고갈법을 통한 포자유도방법은 상기 균주가 배양액 중 포함된 영양분을 모두 섭취 고갈시켜 환경이 나빠져야 하기 때문에 배양시간이 오래 걸리는 단점이 있다. 또한 온도 스트레스에 의한 포자유도방법(cold shock, heat shock)은 정지기(stationaty phase)와 사멸기(death phase)의 포자를 대상으로 처리하는 방법이기 때문에 생산성 유지를 위해 상기 영양분 고갈법과 혼용하여 사용해야 하는 단점이 있고 열 안정성 기반으로 한 방법이기 때문에 자가분해효소를 완전히 제거하거나 불활성시키는데 한계점이 있다.
이에 비해 화학적 충격법(chemical shock)에 의한 포자전환은 대수증식기(exponential phase) 말에서 정지기(stationary phase)초기의 전포자(forespore)를 대상으로 에탄올충격을 가하여 영양부분을 제거하고 그 안의 자가분해효소를 불활성화시킨다. 따라서 세포성장 상태가 동시성(simultaneity)을 갖기 때문에 생산성을 월등히 높일 수 있고 배양시간을 효율적으로 단축시킬 수 있다.
실시예 3. 마이크로캡슐화 코팅 유포자 프로바이오틱스의 제조
<3-1> 박막 코팅제 선발 및 최적농도실험
에탄올처리한 유포자 프로바이오틱스의 반응액을 10,000 RPM, 10분간 원심분리를 하여 균체를 회수하였다. 에탄올처리에 의한 구조적 손상을 회복시키기 위해 회수된 균체를 수용성 폴리머로 1차 박막코팅하여 이를 건조하여 원료로 조제하였다. 실험에는 수용성 폴리머로 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG), 젤라틴(gelatin), 폴리비닐피롤리돈, 아라비아검(arabia gum)을 사용하였다.
원료 조제 0주차 분석을 통해 초기 균수를 각각의 균주별로 확인하고 37℃에서 4주간 보관 후 원료분석을 통해 확보된 생존율을 토대로 가장 생존율이 높은 박막코팅제를 선발하고 그 최적농도를 같은 방법으로 선정하였다.
| 박막 코팅제 균주 |
37℃, 4주 보관 후, 생존율(%) | |||
| 폴리에틸렌 글리콜 |
젤라틴 | 폴리비닐 피롤리돈 |
아라비아검 | |
| Bacillus coagulans | 75.7 | 61.5 | 85.1 | 65.2 |
| Bacillus licheniformis | 71.6 | 65.2 | 81.6 | 62.6 |
| Bacillus mesentericus | 78.3 | 71.2 | 82.7 | 69.7 |
| Bacillus polyfermenticus | 80.1 | 74.7 | 85.2 | 66.2 |
| Bacillus subtilis | 74.9 | 72.4 | 80.9 | 68.1 |
| Clostridium butyricum | 76.8 | 67.3 | 82.4 | 71.2 |
실험결과, 수용성 폴리머인 폴리비닐피롤리돈이 모든 실험군에서 37℃에서 4주간 보관 후 생존율이 가장 높게 나타났다. 보다 상세하게는 평균 82.9%의 초기 균수 대비 생존율을 기록하였다.
| PVP 농도 균주 |
37℃, 4주 보관 후, 생존율(%) | ||||
| 0.1% | 0.2% | 0.3% | 0.4% | 0.5% | |
| Bacillus coagulans | 82.7 | 71.7 | 70.5 | 65.2 | 62.3 |
| Bacillus licheniformis | 80.8 | 74.6 | 71.8 | 62.6 | 61.7 |
| Bacillus mesentericus | 84.7 | 72.3 | 65.2 | 69.7 | 66.9 |
| Bacillus polyfermenticus | 86.7 | 72.1 | 68.7 | 66.2 | 60.5 |
| Bacillus subtilis | 81.9 | 77.9 | 67.4 | 68.1 | 60.7 |
| Clostridium butyricum | 85.4 | 78.8 | 71.5 | 69.7 | 64.5 |
박막코팅제로 선발된 폴리비닐피롤리돈의 최적 농도를 확립하기 위해 배양액을 원심분리하여 회수한 자가분해효소가 제거된 각각의 포자에 수용성 폴리머 0.1 %(w/v)~ 0.5 %(w/v)로 혼합하여 박막코팅 포자원료를 조제 평가한 결과, [표5]에서 보는 바와 같이, 각각의 균주에서 폴리비닐피롤리돈 0.1 %(w/v)를 균체에 첨가하였을 때 가장 생존율이 우수하였다. 보다 상세하게는 이 실험군의 평균 생존율은 83.7%였다.
<3-2> 마이크로캡슐화기제 선발 및 최적농도실험
에탄올처리로 배양 24시간의 전포자(forespore)로부터 세포사멸 유도인자인 자가분해효소(autolysin)를 제거한 포자를 만든 후, 폴리비닐피롤리돈으로 1차 박막 코팅된 유포자 프로바이오틱스 균주를 다공성 다당류로 2차 마이크로캡슐화시킨 후 이를 건조하여 원료로 조제하였다. 마이크로캡슐화 기제로 알기네이트(alginate), 말토덱스트린(maltodextrin), 키토산(chitosan), 전분 (starch)를 각각 사용하였다.원료 조제 0주차 분석을 통해 초기 균수를 각각의 균주별로 확인하고 37℃에서 4주간 보관 후, 원료분석을 통해 확보된 생존율을 토대로 가장 생존율이 높은 마이크로캡슐화 기제를 선발하고 그 최적농도를 같은 방법으로 선정하였다.
| 구분 | 37℃, 4주 보관 후, 생존율(%) | |||
| 알기네이트 | 말토덱스트린 | 키토산 | 전분 | |
| Bacillus coagulans | 87.7 | 91.5 | 75.1 | 75.8 |
| Bacillus licheniformis | 81.2 | 94.2 | 71.6 | 72.9 |
| Bacillus mesentericus | 88.8 | 91.2 | 72.7 | 79.7 |
| Bacillus polyfermenticus | 91.3 | 92.7 | 65.2 | 86.2 |
| Bacillus subtilis | 82.7 | 96.4 | 70.9 | 88.1 |
| Clostridium butyricum | 84.8 | 95.3 | 72.4 | 61.2 |
실험결과, 마이크로캡슐화기제로 다공성 다당류인 말토덱스트린이 모든 실험군에서 37℃에서 4주간 보관 후 생존율이 가장 높게 나타났다. 보다 상세하게는 [표6]에서 보는 바와 같이 평균 93.5%의 초기 균수 대비 생존율을 기록하였다.
| MD 농도 균주 |
37℃, 4주 보관 후, 생존율(%) | ||||
| 0.1% | 0.2% | 0.3% | 0.4% | 0.5% | |
| Bacillus coagulans | 72.4 | 79.5 | 85.1 | 92.7 | 88.4 |
| Bacillus licheniformis | 79.8 | 80.6 | 88.7 | 93.5 | 91.4 |
| Bacillus mesentericus | 80.7 | 83.9 | 85.4 | 93.1 | 91.0 |
| Bacillus polyfermenticus | 79.5 | 84.1 | 89.7 | 92.7 | 89.5 |
| Bacillus subtilis | 83.4 | 88.5 | 90.1 | 94.4 | 90.9 |
| Clostridium butyricum | 85.0 | 86.7 | 92.4 | 93.3 | 90.5 |
마이크로캡슐화제로 선발된 말토덱스트린의 최적 농도를 확립하기 위해 1차 박막코팅된 포자의 0.1 %(w/v)~0.5 %(w/v)의 말토덱스트린을 혼합하였다. 0.1~0.5% (w/v)까지 농도를 폴리비닐피롤리돈으로 박막 코팅된 각 포자에 처리하고 균 원료로 조제하여 4주 후 초기균수 대비 생존율을 평가한 결과, [표7]에서 보는 바와 같이, 각각의 폴리비닐피롤리돈 박막처리 포자에 0.4%(w/v)의 말토덱스트린을 첨가하였을 때 가장 생존율이 우수하였다. 보다 상세하게는 이 실험군의 평균 생존율은 93.2%였다.
실시예 4. 전자현미경(FE-SEM) 구조분석
상기 실시예 3에서 조제한 박막코팅 마이크로캡슐화된 유포자 프로바이오틱스의 제조공정에 따른 균체의 성상변화를 관찰하기 위해 전자현미경(FE-SEM)에 의한 구조분석을 하였다.
클로스트리듐 부틸리쿰의 전포자를 에탄올 처리하여 자가분해효소가 제거된 클로스트리듐 부틸리쿰 포자표면에 폴리비닐피롤리돈을 0.1% (w/v)로 박막코팅하고 말토덱스트린을 0.4% (w/v)처리하여 마이크로캡슐화 공정을 완성하였다. [도2]에서 보는 바와 같이, 에탄올 처리후 자가분해효소가 제거된 클로스트리듐 부틸리쿰은 대부분 포자상태로 관찰되었으며[도4], 폴리비닐피롤리돈에 의해서 전포자 표면을 박막코팅하였을 때 클로스트리듐 부틸리쿰 포자표면이 필름형태로 코팅되어있는 상태를 관찰할 수 있었다[도5]. 마지막으로 다공성 입자구조를 가지는 말토덱스트린에 의한 마이크로캡슐화는 박막코팅된 클로스트리듐 부틸리쿰이 복잡한 구조의 말토덱스트린 격자안에 캡슐화된 형태를 관찰할 수 있었다[도6].
실시예 5. 스트레스 종류에 따른 포자전환율 비교
유포자 균에서 스트레스 종류(stress response)에 따라 영양세포(vegetative cell)에서 포자(spore)로 유도되는 전환율을 실험하였다. 이 전환율은 실제 생산에서 생산성을 결정하는 것으로 산업화 공정에서 의미가 있다. 포자 유도방법으로는 영양분고갈법(starvation), 냉각충격법(cold shock), 열 충격법(heat shock), 화학적 충격법(chemical shock)으로 구분하여 실험하였다. 화학적 충격법(chemical shock)에 의한 포자유도법은 실시예 1에서의 방법으로 포자전환하고 10,000 RPM, 10분간 원심분리한 후 에탄올을 버리고 회수된 포자의 10% 되는 양의 전분을 혼합한 후, 45℃, 4시간 건조한 후 가는 체망으로 분말화하였다.냉각충격법(cold shock)으로 유도된 포자원료의 조제는 정지기(stationary)의 세포에 현재 배양온도보다 25℃에서 8시간 노출시킨 후 배양종료액을 10,000RPM, 10분간 원심분리한 후 상등액을 버리고 회수된 포자 의 10% (w/v)되는 양의 전분을 혼합한 후, 45℃, 4시간 건조한 후 가는 체망으로 분말화하였다.
열 충격법(heat shock)으로 유도된 포자원료의 조제는 정지기(stationary)의 세포에 60℃에서 2시간 노출시킨 후 배양종료액을 10,000RPM, 10분간 원심분리한 후 상등액을 버리고 회수된 포자의 10% (w/v)되는 양의 전분을 혼합한 후, 45℃, 4시간 건조한 후 가는체망으로 분말화하였다. 각각의 원료 중 생균수는 각각의 원료 1g을 0.9% 생리식염수 100 ml에 현탁시켜 균질화하고 이 균질화된 현탁액 1 ml를 취하여 1/10 희석배수로 연속희석하여 fluid thioglycollate medium(FTM, BD, USA) agar와 tryptic soy agar(TSA, BD, USA) 배지에 1 ml 접종한 후, 37℃, 24시간 배양하여 발현된 콜로니를 계수하였다.
| 구분 | 포자전환율(%) | |||
| Starvation | Cold shock | Heat shock | Ethanol shock | |
| Bacillus coagulans | 50 ± 8 | 55 ± 5 | 63 ± 7 | 93 ± 5 |
| Bacillus licheniformis | 40 ± 10 | 48 ± 7 | 54 ± 3 | 90 ± 3 |
| Bacillus mesentericus | 45 ± 5 | 50 ± 2 | 55 ± 5 | 92 ± 4 |
| Bacillus polyfermenticus | 55 ± 3 | 58 ± 5 | 59 ± 3 | 95 ± 2 |
| Bacillus subtilis | 50 ± 4 | 53 ± 7 | 62 ± 4 | 88 ± 7 |
| Clostridium butyricum | 40 ± 11 | 43 ± 5 | 52 ± 5 | 85 ± 4 |
유포자 프로바이오틱스 균주의 생산성을 나타내는 포자전환율을 비교한 결과, 표8에서 보는 바와 같이 에탄올을 충격용매로 사용한 화학적충격법(chemical shock)이 85~95%로의 포자전환율을 나타내었으며, 열충격법(heat shock)으로 인한 포자전환율은 52~63%, 냉각충격법(cold shock)에 의한 포자전환율은 43~58%, 영양분고갈법(starvation)에 의한 포자전환율은 40~55%였다. 특히 열충격법(heat shock)과 냉각충격법(cold shock)은 영양분고갈법에 의해 유도된 포자에 열 또는 냉각충격을 가하기 때문에 이 스트레스에 의한 효과는 실제 영양분고갈법에 의해 유도된 포자전환율을 차감한 20%미만의 전환율을 나타내어 영양분고갈법을 적용하지 않는 화학적충격법(chemical shock)에 의한 포자전환율이 월등히 높은 것으로 나타났다.
실시예 6. 가혹조건에서 경시적 안정성
<6-1> 마이크로캡슐화 포자조제법과 일반 건조 포자조제법의 경시적 안정성
화학적 충격법(chemical shock)으로 자가분해효소가 제거된 클로스트리듐 부틸리쿰(C. butyricum) 포자를 상기 실시예 3의 조제방법을 통한 마이크로캡슐화 포자제제와 실시예 5의 방법으로 조제한 비코팅 포자제제에 대해 경시적 안정성을 37℃, 180일간 비교하였다.
| 구분 | 클로스트리듐 부틸리쿰의 경시적 안정성 (x108 CFU/g) | 생존율(%) | ||||
| 0일 | 30일 | 60일 | 90일 | 180일 | ||
| 마이크로캡슐화 포자 | 50 |
48 | 47 | 46 | 45 | 90.0 |
| 비코팅 포자 |
50 | 42 | 38 | 31 | 26 | 52.0 |
표9에서 보는 바와 같이, 클로스트리듐 부틸리쿰의 전포자(forespore)를 화학적 충격법(chemical shock)으로 전환한 포자는 제거된 영양성분 부분이 결합되어 있는 부위가 구조적으로 불안정하여 이를 코팅하는 것이 중요하다. 보다 상세하게는 마이크로캡슐화하여 조제한 포자는 37℃, 180일의 생존율이 90%이며, 대조군인 비코팅 포자의 생존율은 52%로 마이크로캡슐화한 포자가 높은 내구성과 안정성을 갖는 것으로 분석되었다.
<6-2> 자가분해효소가 제거된 박막코팅 마이크로캡슐화 유포자 균주의 37℃ 경시적 안정성
상기 실시예 3에서 제조된 본 발명에 의한 자가분해효소가 제거된 박막코팅 마이크로캡슐화 유포자 프로바이오틱스를 180일 동안 37℃에서 보관 후, 생존균수 및 생존율을 대조군인 영양분 결핍과 온도 스트레스에 의한 자연 포자과정으로 전환시켜 조제한 유포자 프로바이오틱스 원료와 비교하였다. 보다 상세하게는 시간경과에 따라 원료 1g 당 생존균수를 측정하여 그 결과를 [표9]에 기재하였다. 이때 실험에 사용한 유포자 프로바이오틱스 균주는 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butyricum), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실루스 메센테리쿠스 (Bacillus mesentericus), 바실루스 리체니폴미스 (Bacillus licheniformis), 바실루스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus)이며, 원료 중 생균수는 각각의 원료 1g을 0.9% 생리식염수 100 ml에 현탁시켜 균질화하고 이 균질화된 현탁액 1 ml를 취하여 1/10 희석배수로 연속희석하여 fluid thioglycollate medium(FTM, BD, USA) agar와 tryptic soy agar(TSA, BD, USA) 배지에 1 ml 접종한 후, 37℃, 24시간 배양하여 발현된 콜로니를 계수하였다. 대조군으로 영양분고갈법(starvation)으로 유도된 포자의 원료는 배양종료액을 10,000RPM, 10분간 원심분리한 후 상등액을 버리고 회수된 포자의 10% (w/v)되는 양의 전분을 혼합한 후, 45℃, 4시간 건조한 후 가는 체망으로 분말화하였다. 냉각충격법(cold shock)은 정지기(stationary)의 세포에 현재 배양온도보다 25℃에서 8시간 노출시킨 후 배양종료액을 10,000RPM, 10분간 원심분리한 후 상등액을 버리고 회수된 포자를 실시예 3의 방법으로 마이크로캡슐화하였다.
열 충격법(heat shock)은 정지기(stationary)의 세포에 60℃에서 2시간 노출시킨 후 배양종료액을 10,000RPM, 10분간 원심분리한 후 상등액을 버리고 회수된 포자 를 실시예3의 방법으로 마이크로캡슐화하였다.
| 포자생성 구분 | 균주 | 37℃ 경시적 안정성 (x108 CFU/g) |
생존율(%) | ||||
| 0일 | 30일 | 60일 | 120일 | 180일 | |||
| Ethanol shock | Bacillus coagulans | 150 | 145 | 141 | 140 | 139 | 92.6 |
| Bacillus licheniformis | 180 | 179 | 175 | 169 | 162 | 90.0 | |
| Bacillus mesentericus | 120 | 119 | 111 | 107 | 105 | 87.5 | |
| Bacillus polyfermenticus | 100 | 97 | 94 | 92 | 90 | 90.0 | |
| Bacillus subtilis | 100 | 96 | 96 | 95 | 93 | 93.0 | |
| Clostridium butyricum | 50 | 48 | 47 | 46 | 45 | 90.0 | |
| Starvation | Bacillus coagulans | 75 | 62 | 55 | 51 | 41 | 54.6 |
| Bacillus licheniformis | 72 | 62 | 56 | 52 | 43 | 59.7 | |
| Bacillus mesentericus | 54 | 45 | 40 | 37 | 28 | 53.3 | |
| Bacillus polyfermenticus | 100 | 81 | 72 | 65 | 53 | 53.0 | |
| Bacillus subtilis | 100 | 78 | 67 | 59 | 51 | 51.0 | |
| Clostridium butyricum | 50 | 41 | 35 | 31 | 29 | 58.0 | |
| Cold shock | Bacillus coagulans | 82 | 75 | 64 | 57 | 49 | 60.7 |
| Bacillus licheniformis | 57 | 52 | 44 | 41 | 36 | 63.8 | |
| Bacillus mesentericus | 60 | 55 | 51 | 43 | 41 | 68.7 | |
| Bacillus polyfermenticus | 60 | 53 | 50 | 48 | 40 | 67.6 | |
| Bacillus subtilis | 53 | 48 | 42 | 35 | 34 | 65.4 | |
| Clostridium butyricum | 21 | 19 | 18 | 16 | 12 | 61.8 | |
| Heat shock | Bacillus coagulans | 94 | 80 | 75 | 69 | 48 | 51.2 |
| Bacillus licheniformis | 97 | 85 | 79 | 74 | 53 | 54.7 | |
| Bacillus mesentericus | 66 | 63 | 60 | 52 | 39 | 60.5 | |
| Bacillus polyfermenticus | 70 | 65 | 62 | 56 | 40 | 57.4 | |
| Bacillus subtilis | 68 | 64 | 57 | 52 | 34 | 51.2 | |
| Clostridium butyricum | 26 | 23 | 20 | 19 | 15 | 59.7 | |
화학적 충격(chemical shock)-박막코팅-마이크로캡슐화 포자는 37℃, 180일 후 평균 90.5%의 생존율을 나타내었으며, 대조군인 영양분고갈(starvation)-박막코팅-마이크로캡슐화 포자는 180일 후 평균 54.7%의 생존율을 나타내었다. 또한 온도 스트레스인 냉각충격법(cold shock)-박막코팅-마이크로캡슐화 포자는 60%대의 생존율을 나타내었으며, 열충격법(heat shock)-박막코팅-마이크로캡슐화 포자는 50%대의 생존율로 화학적 충격법(chemical shock)에 의해 유도된 포자의 생존율보다 상대적으로 낮은 결과를 나타내었다.
<6-3> 자가분해효소가 제거된 박막코팅 마이크로캡슐화 유포자 균주의 45℃ 경시적 안정성
상기 실시예 3에서 제조된 본 발명에 의한 자가분해효소가 제거된 박막코팅 마이크로캡슐화 유포자 프로바이오틱스를 180일 동안 45℃에서 보관 후, 영양분고갈법(starvation),냉각충격법(cold shock),열충격법(heat shock)으로 유도된 포자를 실시예 3의 방법으로 조제하여 비교하였다. 시간경과에 따라 원료 1g 당 생존균수를 측정하여 그 결과를 [표10]에 기재하였다. 이때 실험에 사용한 유포자 프로바이오틱스 균주는 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butyricum), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실루스 메센테리쿠스 (Bacillus mesentericus), 바실루스 리체니폴미스 (Bacillus licheniformis), 바실루스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus)이며, 원료 중 생균수는 각각의 원료 1g을 0.9% 생리식염수 100 ml에 현탁시켜 균질화하였다. 이 균질화된 현탁액 1 ml를 취하여 1/10 희석배수로 연속희석하여 fluid thioglycollate medium(FTM, BD, USA) agar와 tryptic soy agar(TSA, BD, USA) 배지에 1 ml 접종한 후, 37℃, 24시간 배양하여 발현된 콜로니를 계수하였다.
| 포자생성 구분 | 균주 | 45℃ 경시적 안정성 (x108 CFU/g) |
생존율(%) | ||||
| 0일 | 30일 | 60일 | 120일 | 180일 | |||
| Ethanol shock | Bacillus coagulans | 150 | 141 | 140 | 137 | 131 | 87.3 |
| Bacillus licheniformis | 180 | 175 | 170 | 162 | 157 | 87.2 | |
| Bacillus mesentericus | 120 | 115 | 108 | 105 | 102 | 85.0 | |
| Bacillus polyfermenticus | 100 | 94 | 90 | 87 | 81 | 81.0 | |
| Bacillus subtilis | 100 | 93 | 91 | 88 | 84 | 84.0 | |
| Clostridium butyricum | 50 | 47 | 43 | 41 | 40 | 80.0 | |
| Starvation |
Bacillus coagulans | 75 | 57 | 55 | 47 | 39 | 52.0 |
| Bacillus licheniformis | 72 | 58 | 49 | 44 | 39 | 39.0 | |
| Bacillus mesentericus | 54 | 45 | 41 | 36 | 27 | 50.0 | |
| Bacillus polyfermenticus | 100 | 79 | 64 | 55 | 49 | 49.0 | |
| Bacillus subtilis | 100 | 76 | 71 | 60 | 48 | 48.0 | |
| Clostridium butyricum | 50 | 41 | 38 | 31 | 24 | 48.0 | |
| Cold shock |
Bacillus coagulans | 82 | 70 | 61 | 51 | 40 | 49.6 |
| Bacillus licheniformis | 57 | 48 | 42 | 35 | 30 | 53.8 | |
| Bacillus mesentericus | 60 | 50 | 48 | 42 | 28 | 47.8 | |
| Bacillus polyfermenticus | 60 | 51 | 45 | 34 | 28 | 47.3 | |
| Bacillus subtilis | 53 | 42 | 38 | 35 | 31 | 59.8 | |
| Clostridium butyricum | 21 | 19 | 16 | 12 | 11 | 56.7 | |
| Heat shock |
Bacillus coagulans | 94 | 75 | 72 | 68 | 42 | 45.3 |
| Bacillus licheniformis | 97 | 82 | 73 | 71 | 57 | 59.5 | |
| Bacillus mesentericus | 66 | 61 | 55 | 48 | 29 | 45.4 | |
| Bacillus polyfermenticus | 70 | 62 | 58 | 53 | 29 | 42.0 | |
| Bacillus subtilis | 68 | 62 | 55 | 50 | 30 | 45.3 | |
| Clostridium butyricum | 26 | 22 | 18 | 17 | 11 | 43.5 | |
화학적 충격(chemical shock)-박막코팅-마이크로캡슐화 포자는 45℃, 180일 후 평균 84%의 생존율을 나타내었으며, 대조군인 영양분 고갈(starvation)-박막코팅-마이크로캡슐화 포자는 180일 후 평균 44.6%의 생존율을 나타내었다.또다른 대조군인 냉각충격법(cold shock)-박막코팅-마이크로캡슐화 포자는 40~50%대의 생존율을 나타내었으며, 열 충격법(heat shock)-박막코팅-마이크로캡슐화 포자는 40%대의 생존율로 화학적 충격(chemical shock)에 의해 유도된 포자의 생존율 80%대보다 상대적으로 낮은 결과를 나타내었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 화학적 충격-박막코팅-마이크로캡슐화 공정으로 자가분해효소가 제거된 마이크로캡슐화 유포자 프로바이오틱스는 유포자 프로바이오틱스의 경시적 안정성을 떨어뜨리는 위협인자인 자가분해효소를 전포자(forespore)단계에서 제거하는 방법을 개발하였으며, 박막코팅 마이크로캡슐화 공법개발로 자가분해효소가 제거된 부분을 수용성폴리머로 1차 박막 코팅(film coating) 시키고 다공성 입자구조의 다당류로 2차 마이크로 캡슐화(microencapsulation)함으로써 내구성을 갖게 하였다.
자가분해효소를 제거하는 화학적 충격법(chemical shock)은 기존의 영양분고갈법(starvation)과 냉각충격법(cold shock), 열 충격법(heat shock)에 비해 월등히 높은 포자 전환율을 나타내어 실제 생산에 있어 생산성을 높일 수 있게 되었다. 또한 보관 온도에 따른 균원료의 안정성을 장기간 관찰하면서 산업적 생산성을 높일 수 있는 지 여부를 판단한 결과, 기존의 원료 생산 방식보다 균일화된 구조의 원료를 생산할 수 있으며, 영양분고갈법(starvation)에 의한 포자유도시간이 전포자(forespore)를 생성하는 시간보다 상대적으로 긴 점을 감안할 때, 본 발명은 전포자 (forespore)단계에서 포자를 유도하기 때문에 생산시간을 단축시킬 수 있는 장점이 있다.
자가분해효소가 제거된 마이크로캡슐화 유포자 프로바이오틱스는 의약품은 물론 일반식품, 기능성식품, 화장품 원료, 동물용 의약품 등의 다양한 제품에 효과적으로 이용될 수 있다.
Claims (9)
- 유포자 프로바이오틱스균주의 전포자에서 자가분해효소를 화학적 충격법(chemical shock)으로 제거하여 자가분해효소가 제거된 포자의 제조방법
- 제1항의 방법으로 자가분해효소가 제거된 유포자 프로바이오틱스균주의 포자를 생성하고 생성된 포자를 수용성 폴리머로 표면을 1차 박막코팅한 후 이를 2차 마이크로캡슐화하여 박막코팅 마이크로캡슐화된 유포자 프로바이오틱스의 제조방법
- 제 1항에 있어서, 화학적 충격법(chemical shock)으로 에탄올을 유기용매로 사용하여 화학적 충격(chemical shock)을 가하는 것을 특징으로 하는 자가분해효소가 제거된 포자의 제조방법
- 제 2항에 있어서, 포자의 내구성과 안정성을 개선시키기 위한 박막코팅 기제로 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone, PVP)을 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법
- 제 2항에 있어서, 포자의 내구성과 안정성을 개선시키기 위한 마이크로캡슐화기제로 말토덱스트린(maltodextrin, MD)을 사용하는 것을 특징으로 하는 제조방법
- 제 1항 내지 5항 중 어느 한항에 있어서, 유포자 프로바이오틱스 균주는 클로스트리듐 부틸리쿰(Clostridium butyricum), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실루스 메센테리쿠스 (Bacillus mesentericus), 바실루스 리체니폴미스 (Bacillus licheniformis), 바실루스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제조방법
- 제 2항, 4항 또는 5항 중 어느 한항의 방법으로 제조된 박막코팅 마이크로슐화된 유포자 프로바이오틱스
- 제 7항의 박막코팅 마이크로캡슐화된 유포자 프로바이오틱스를 포함하는 정장용 의약품 조성물
- 제 7항의 박막코팅 마이크로캡슐화된 유포자 프로바이오틱스를 포함하는 식품 조성물
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