KR100782984B1

KR100782984B1 - 유산균 다중 마이크로캡슐의 제조방법, 이 방법에 의해제조된 마이크로캡슐 및 이를 포함하는 제품

Info

Publication number: KR100782984B1
Application number: KR1020060036360A
Authority: KR
Inventors: 신홍식; 박시호; 엄수종; 김희정; 진하룡; 이종현; 김형수; 박종미; 이아름
Original assignee: (주)케비젠
Priority date: 2006-04-21
Filing date: 2006-04-21
Publication date: 2007-12-07
Also published as: KR20070104140A

Abstract

본 발명은 (a) 유청분말, 저지방탈지분유, 글루코오스 또는 박토트립톤 중에서 선택된 1종, 글리세린 및 배지용액을 멸균 호화시킨 후 유산균을 부가하여 이를 균질화시켜 1차 코팅 물질을 제조하는 단계; (b) 상기에서 제조된 1차 코팅 물질에 정제 가공유와 폴리글리세린지방산 에스테르 및 글리세린호박산지방산 에스테르를 혼합 균질화시켜 2차 코팅 물질을 제조하는 단계; (c) 탄수화물, 단백질 성분 및 검류 증점제, 유화제를 혼합하여 호화 균질화시킨 후, 2차 코팅물질을 부가하여 균질시켜 3차 코팅 물질을 제조하여 멸균된 냉각수 속에 분무하는 단계를 포함하는 유산균 다중 마이크로캡슐 제조방법, 이 방법으로 제조된 마이크로캡슐, 이 마이크로캡슐을 포함하는 제품에 관한 것이다. 상기 방법으로 제조된 마이크로캡슐은 4℃에서 3개월 이상 유산균 생균수가 10⁸CFU/mL 이상으로 유지되는 작용효과를 나타낸다.

CLA 생산 특허균주, 유산균, 다중 마이크로캡슐, 생균수

Description

유산균 다중 마이크로캡슐의 제조방법, 이 방법에 의해 제조된 마이크로캡슐 및 이를 포함하는 제품{The method of preparing multi-microcapsule of lactic acid bacteria, the microcapsule prepared by the method, and article comprising the microcapsule}

도 1은 본 발명에 따른 유산균과 불포화지방산 공유 다중 마이크로캡슐 제조방법의 모식도를 나타낸다.

도 2는 실시예 1에서 제조된 마이크로캡슐의 4℃ 냉장상태에서 저장기간 동안의 1mL의 캡슐 당 생균수를 나타낸다.

도 3은 실시예 1에서 제조된 마이크로캡슐의 저장온도 및 저장기간에 따른 생균수를 나타낸다.

도 4는 실시예 1에서 제조된 마이크로캡슐의 크기를 측정한 분석도표이다.

도 5는 실시예 1에서 제조된 마이크로캡슐 및 실시예 1에서 제조된 마이크로 캡슐 0.3%를 우유에 첨가했을 때 4℃에서 저장기간에 따른 생균수를 나타낸다.

도 6은 실시예 1에서 제조된 마이크로캡슐의 펩신에 대한 인비트로 실험결과로 체내에서 캡슐의 분해시간을 나타낸다.

도 7은 실시예 1에서 제조된 마이크로캡슐을 직접 살균했을 때와 우유에 첨가한 후 살균했을 때 열처리에 의한 생균수를 나타낸다.

도 8은 실시예 1에서 제조한 마이크로캡슐을 음료수에 첨가한 다음 90℃, 30초간 가열 살균조건에서 캡슐이 얼마나 깨지는지를 나타낸 실험결과를 나타낸다.

도 9는 실시예 4에서 제조된 L. Lactis 마이크로캡슐을 김치에 2% 첨가했을 때 생균수와 pH의 변화(20℃)를 나타낸 도표이다.

도 10은 실시예 4에서 제조된 L. Lactis의 캡슐이 0.5% 우유에 첨가 했을 때 제조일로부터 15일까지 유산균 생균수를 나타낸다.

도 11은 실시예 4에서 제조된 L. Lactis의 캡슐이 0.5% 두유에 첨가 했을 때 제조일로부터 15일까지 유산균 생균수를 나타낸다.

도 12는 실시예 5에서 제조된 5.0% 락토바실러스 에시도필러스와 락토코커스 써머필러스 공유 마이크로캡슐이 4℃의 냉장상태에서 90일 동안 생균수(mL당)를 도표로 나타낸 것이다.

도 13은 실시예 6에서 제조된 마이크로캡슐의 생균수를 나타낸 실험결과이다.

도 14는 실시예 9a에서 제조된 유산균과 CLA 공유 마이크로캡슐내의 CLA 함량을 분석한 GC 자료이다.

도 15는 실시예 9a에서 제조된 유산균과 CLA 공유 마이크로캡슐내의 비피더스 유산균의 생균수를 나타낸 도표이다.

도 16은 실시예 10에서 제조된 분말의 생균수와 생존기간(12개월)을 측정한 자료를 도표로 나타낸 것이다.

도 17은 실시예 11에서 제조된 분말의 혼합균주의 생균수(g당)를 저장기간 동안 측정한 자료를 도표로 나타낸 것이다.

본 발명은 유산균을 함유하는 다중 마이크로캡슐 제조방법, 그 제조방법에 의해 생산된 마이크로캡슐, 이 마이크로캡슐을 포함하는 제품에 관한 것이다. 또한 본 발명은 유산균과 불포화지방산을 함께 포함하는 유산균-불포화지방산 다중 마이크로캡슐 제조방법, 그 제조방법에 의해 생산된 마이크로캡슐, 이 마이크로캡슐을 포함한 제품에 관한 것이다.

유산균은 락트산균 · 젖산이라고도 하며, 포유류의 장내에 서식하여 잡균에 의한 이상발효를 방지하여 정장제(整腸劑)로도 이용되는 중요한 세균이다. 예를 들어, 락토바실루스속:L. bulgarcus는 불가리아젖산균이며 가장 오래 전부터 알려져 있다. 요구르트의 제조에 사용되며, 종은 순수 배양한 균을 치즈나 발효 버터 제조시의 스타터로도 사용되며, L. acidophilus는 호기성 젖산균으로 사람 및 모든 포유류와 그 밖의 동물의 장에 존재하며, 버터 ·우유의 제조나 장내 자가중독의 치료에 사용된다. 또한 L. lactis는 DL-젖산을 생성하며, 이것은 항상 우유 속에 존재하여 버터 ·치즈 제조에 사용되며 낙농용 젖산균으로서 가장 중요한 균종이다. 스트렙토코쿠스속:S. faecalis는 정장제로 이용되고 S. lactis는 치즈 제조의 스타터로 사용된다.

이처럼 유용한 유산균은 장에 정착하여 장관운동 활성화, 유해균 억제, 비타 민 및 면역증강 물질 촉진 등 다양한 생리활성 효과를 발휘하는데, 인체의구조상 사람이 유산균 섭취시 위를 거치게 되어 있어 위에서 분비되는 위산으로 인해 유산균이 사멸하여 유산균 본래의 생리활성 기능을 발휘하지 못하게 되는 경우가 많다. 따라서 위에 유산균이 파괴되는 것을 최소화하기위하여, 과거에는 유산균의 농도를 임의로 조절함으로써 항암 및 면역기능이 가능하도록 하는 방법을 사용하여 왔다. 그러나 최적의 유산균 농도를 결정하는 일이 매우 어려워서 그 사용이 극히 제한되어 왔다.

따라서 최근에는 이러한 단점을 극복하기 위하여 각종 피복제를 사용하여 유산균을 코팅시키는 방법으로 전분, 젤라틴, 알긴산, 셀룰로오스, 경화유, 각종 유화제 등을 코팅물질로 사용하여 거대캡슐이나 50마이크로미터 이상의 미세캡슐을 제조하거나, 기능성 불포화지방산을 필요 이상 고농도로 함유하도록 캡슐화하여 유통기간 내에 품질을 유지하도록 하는 방법이 개발되기도 하였다. 또한 기능성 유산균이나 기능성 물질의 안정성을 증가시켜 인체 내에 지속적으로 공급하고자 각종 코팅제들을 이용하여 캡슐화시키는 방법이 개발되기도 하였다. 그러나 종래의 캡슐화 방법은 캡슐 속에서 유산균의 생균수가 1밀리미터 당 10²개 이하이거나 유산균의 저장성이 5일 이상을 유지하지 못하고 20℃에서 5일 이내에 캡슐이 붕괴되는 단점이 존재한다. 그러므로 현 거래 시장에서는 유산균의 안정성과 분산성을 동시에 갖춘 마이크로캡슐 개발이 요구되어지고 있다.

최근에는 유산균과 함께 고도불포화지방산의 여러 가지 생리작용이 보고되고 있다. 특히 불포화지방산인 오메가3지방산은 신경세포막과 망막에 분포하며, 세포막에서 전기적인 자극을 빠른 속도로 다음 세포에 전달하는 역할을 하며, 인체 안에서 세포를 보호하고, 세포의 구조를 유지시키며, 원활한 신진대사를 돕는다고 보고되고 있다. 이와 더불어 혈액의 피막형성을 억제하고, 뼈의 형성을 촉진시키는 동시에 강화하는 효과가 있다고 보고되었다. 오메가3지방산의 종류는 DHA로 알려진 도코사헥사에노산(docosahexaenoic acid), EPA(Eicosapentaenoic acid) 및 알파-레노렌산(α-linolenic acid)등이 있다. 오메가3지방산의 하루 권장량은 0.6 내지 1g이며, 생선기름, 플랑크톤, 해산물, 콩기름, 모유 등에 많이 들어 있다. 특히 신생아와 청소년의 경우에는 정상적인 조직발달을 돕기 위해서 더 많은 양이 필요하며. 결핍되면 우울증, 정신분열증, 주의력결핍과잉행동장애, 시력저하, 심장질병 등이 발생할 수 있으며, 스트레스를 가중시킬 수 있는 것으로 알려져 있어 최근 큰 관심사이다. 그러나, 오메가3지방산은 산소나 광선에 불안정하여 저장 중 쉽게 산화되어 독특한 비린내를 내므로 이에 대한 개선 연구가 다양하게 이루어지고 있다. 이 해결을 위해 미세캡슐화 하는 방법이 제안되고 있으며, 하나의 예로 노 등(대한민국 공개특허 2000-0038444)은 찹쌀전분 등 다당류물질과 트윈 시리즈 유화제를 사용하여 DHA 등 불포화지방산을 캡슐화 하는 방법을 제시하여 어유의 관능적 특성을 개선하는 방법을 제시하였다. 그러나, 수용액상에서 오랫동안 분산성 유지를 못하고 분리되는 현상을 나타낸다. 또 다른 예로 박 등(대한민국 공개특허 10-2004-0042987)은 단백질계 피복물질인 분리대두단백질 등을 이용하여 고도 불포화지방산을 포함하는 어유를 캡슐화 하여 식품을 포함한 여러 분야에 적용 가능성을 제시하였으나 캡슐의 안정성이 문제점으로 나타났다.

본 발명은 종래의 유산균 캡슐기술에 비해 향상된 분산성 및 안정성을 갖고, 긴 저장기간 동안에도 다량의 유산균수가 유지되는 유산균을 함유하는 다중 마이크로캡슐 제조방법, 그 제조방법에 의해 생산된 마이크로캡슐, 이 마이크로캡슐을 포함하는 제품을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 1차 코팅된 유산균과 1차 코팅된 불포화지방산을 함께 포함하는 다중 마이크로캡슐 제조방법 및 그 제조방법에 의해 생산된 마이크로캡슐, 이 마이크로캡슐을 포함하는 제품을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 유청분말, 저지방탈지분유, 글루코오스 또는 박토트립톤 중에서 선택된 1종, 글리세린 및 배지용액을 멸균 호화시킨 후 유산균을 부가하고 균질화시켜 1차 코팅 물질을 제조하는 단계;

(b) 상기에서 제조된 1차 코팅 물질에 정제 가공유와 폴리글리세린지방산 에스테르 및 글리세린호박산지방산 에스테르를 혼합 균질화시켜 2차 코팅 물질을 제 조하는 단계;

(c) 탄수화물, 단백질 성분, 검류 증점제 및 유화제를 혼합하여 호화 균질화시킨 후, 2차 코팅물질을 부가하여 균질시켜 3차 코팅 물질을 제조하여 멸균된 냉각수 속에 분무시키는 단계를 포함하는 유산균 다중 마이크로캡슐 제조방법1을 제공한다.

상기 제조 단계에서, 탄수화물은 전분, 변성전분, 말토덱스트린, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 섬유소 성분인 CMC(카복시메틸세룰로오스), MC(메틸셀룰로오스), EC(에틸셀룰로오스), NC(나이트로셀룰로오스), AC(아세틸셀룰로오스)등이 사용될 수 있으며, 단백질성분은 젤라틴, 유청단백질, 유청분말, SMP8515(성풍양행), 글루텐, 카제인, 알부민, 헤모글로빈, 펩타이드 등이 사용될 수 있다. 검류 증점제는 아카시아검, 아라비아검, 잔탄검, 구아검 등이 사용될 수 있으며, 유화제는 트윈 80, 트윈 60, 트윈 40, 트윈 20, 스판 85, 스판 80, 스판 60, 스판 40, 스판 20, 폴리글리세린지방산에스테르, 모노글리세린지방산에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명 상기 제조방법1 중 유산균은 CLA(conjugated linoleic acid, 이하 ‘CLA'라 한다) 생산 특허균주인 비피도박테리움브레베(CBG-C2, 등록번호 제0516377호, 기탁번호KACC 91001), 비피도박테리움 슈도카르테눌라툼(CBG-C4, 등록번호 제0514592호, 기탁번호 KACC 91003), 엔테로코커스 패시움(CBG-C5, 등록번호 제0514593호, KACC 91002), 락토바실러스 에시도필러스, 락토코커스 써머필러스, 락토바실러스 카제인, 락토바실러스 루테리 또는 비피더스 유산균에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하다(CBG-C2,.CBG-C4 및 CBG-C5는 각각 2002년 4월 3일 농업생명공학연구원 농용미생물보존센터에 상기와 같은 기탁번호로 기탁되었다).

본 발명 상기 제조방법1 중 (a) 단계에서 유산균은 마이크로캡슐 총량에 1.0 내지 5.0%(w/w)인 것이 바람직하다. 또한 본 발명 상기 제조방법1중 (a) 단계의 유청분말, 저지방탈지분유, 글루코오스 또는 박토트립톤 중에서 선택된 1종은 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.05 내지 0.5%(w/w)이고, 글리세린은 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.1 내지 1.0%(w/w)이며, 배지 용액은 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.05 내지 0.5%(w/w)인 것이 바람직하다.

본 발명 상기 제조방법1 중 (b) 단계의 정제가공유는 마이크로캡슐 총량을 기준으로 정제가공유가 1.5 내지 5.0%(w/w)이고, 폴리글리세린지방산에스테르는 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.3 내지 0.5%(w/w)이며, 글리세린호박산지방산에스테르는 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.2 내지 0.4%(w/w)인 것이 바람직하다.

본 발명 상기 제조방법1 중 (c) 단계의 탄수화물은 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.1 내지 0.3%(w/w)이고, 단백질 성분은 마이크로캡슐 총량을 기준으로 1.5 내지 3.0%이며, 검류 증점제는 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.1 내지 0.3%이고, 유화제는 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.1 내지 0.5%인 것이 바람직하다.

본 발명 상기 제조방법1 중 (a), (b) 및 (c) 단계의 균질화 온도는 30℃ 내지 50℃인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 35℃ 내지 45℃인 것, 보다 바람직하게는 40℃이다.

본 발명 상기 제조방법1에서 (c) 단계의 탄수화물은 전분, 또는 변성 전분인 것이 바람직하며, 단백질 성분은 젤라틴 또는 한천인 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 제조방법1에서 (c) 단계의 검류 증점제는 구아검 또는 잔탄검인 것이 바람직하며, 유화제는 폴리글리세린지방산에스테르인 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 본 발명인 제조방법1에 따라 제조된 마이크로캡슐을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명인 제조방법1에 따라 제조된 마이크로캡슐을 포함하는 제품을 제공한다. 여기서 제품은 발효유, 가공유, 장류 발효식품, 김치발효식품, 기능성 식품, 기능성 음료, 일반식품, 의약품, 화장품을 포함한다.

본 발명은 또한 폴리글리세린지방산에스테르와 인산염 완충액으로 별도로 코팅된 불포화지방산을 (a)단계에서 생산된 1차 코팅물질과 함께 (b)단계에 첨가시키 는 유산균-불포화지방산 공유 다중 마이크로캡슐 제조방법2를 제공한다.

본 발명 제조방법2에 있어서, 불포화지방산은 DHA(docosahexaenoic acid), EPA(Eicosapentaenoic acid) 또는 CLA인 것이 바람직하다.

본 발명 제조방법2에 있어서, 코팅된 불포화지방산이 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.3 내지 0.5%(w/w)의 폴리글리세린지방산에스테르, 0.5 내지 1.0%(w/w)의 0.1N인 인산염 완충액 및 5.0 내지 10.0%(w/w)의 불포화지방산으로 균질화되어 캡슐된 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 제조방법2에 의해 제조된 마이크로캡슐을 제공한다.

본 발명은 또한 제조방법2에 의해 제조된 마이크로캡슐을 포함한 제품을 제공한다. 여기서 제품은 제품이 발효유, 가공유, 장류 발효식품, 김치발효식품, 기능성 음료, 기능성 식품, 일반식품, 의약품, 화장품을 포함한다.

본 발명은 제조방법1에 의해 제조된 마이크로캡술을 탈지분유, 덱스트린, 클로렐라와 혼합하여 동결건조시키는 분말제조방법3을 제공한다.

본 발명의 제조방법3에서, 제조방법1에서 제조된 마이크로캡슐은 0.1 내지 0.5 중량%이고, 탈지분유는 5 내지 15중량%이며, 덱스트린은 5 내지 15중량%이며, 클로렐라는 70 내지 85중량%인 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 제조방법3으로 제조된 분말을 제공한다.

본 발명은 또한 제조방법3으로 제조된 분말을 포함하는 제품을 제공한다. 여기서 제품은 발효유, 가공유, 장류 발효식품, 김치발효식품, 기능성 음료, 기능성 식품, 일반식품, 의약품, 화장품을 포함한다.

본 발명은 또한

(a) 저지방탈지분유, 배지용액, 글리세린 및 시스테인을 멸균 호화시킨 후에 유산균을 부가하고 이를 균질화시켜 1차 코팅 물질을 제조하는 단계;

(b) 상기에서 제조된 1차 코팅 물질에 폴리글리세린지방산 에스테르 및 모노글리세린지방산 에스테르를 혼합 균질화시켜 2차 코팅 물질을 제조하는 단계;

(c) 단백질 성분 검류 증점제 및 유화제를 혼합하여 호화 균질화시킨후, 2차 코팅물질을 부가하여 균질시킨 후 3차 코팅 물질을 제조하여 멸균된 냉각수속에 분무시키는 단계를 포함하는 분산성이 보다 향상된 유산균 다중 마이크로캡슐 제조방 법4를 제공한다.

상기 제조 단계에서, 사용할 수 있는 단백질 성분, 검류 증점제 및 유화제는 상기에서 언급한 것과 동일하다.

본 발명 상기 제조방법4 중 유산균은 CLA 생산 특허균주인 비피도박테리움브레베(CBG-C2, 등록번호 제0516377호), 비피도박테리움 슈도카르테눌라툼(CBG-C4, 등록번호 제0514592호), 엔테로코커스 패시움(CBG-C5, 등록번호 제0514593호), 락토바실러스 에시도필러스, 락토코커스 써머필러스, 락토바실러스 카제인, 락토바실러스 루테리 또는 비피더스 유산균에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하다.

본 발명 상기 제조방법4 중 유산균은 마이크로캡슐 총량에 1.0 내지 5.0%(w/w)인 것이 바람직하다.

본 발명 상기 제조방법4 중 (a) 단계의 저지방탈지분유는 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.05 내지 0.5%(w/w)이고, 글리세린은 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.1 내지 1.0%(w/w)이며, 배지 용액은 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.05 내지 0.5%(w/w)이고, 시스테인은 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.01% 내지 0.1%(w/w)인 것이 바람직하다.

본 발명 상기 제조방법4 중 (a) 단계의 시스테인은 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.05%(w/w)인 것이 바람직하다.

본 발명 상기 제조방법4 중 (b) 단계의 폴리글리세린지방산에스테르는 마이크로캡슐 총량을 기준으로 5.0 내지 10.0%(w/w)이며, 모노글리세린지방산 에스테르는 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.2 내지 0.4%(w/w)인 것이 바람직하다.

본 발명 상기제조방법4 중 (c) 단계의 단백질 성분은 마이크로캡슐 총량을 기준으로 1.5 내지 3.0%이며, 검류 증점제는 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.3 내지 0.5%이고, 유화제는 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.1 내지 0.5%인 것이 바람직하다.

본 발명 상기 제조방법4 중 (a), (b) 및 (c) 단계의 균질화 온도는 30℃ 내지 50℃인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 35℃ 내지 45℃인 것, 보다 바람직하게는 40℃이다.

본 발명 상기 제조방법4 중 (c) 단계에서의 단백질 성분은 젤라틴 또는 한천인 것이 바람직하며, 검류 증점제는 구아검 또는 잔탄검인 것이 바람직하고, 유화제는 폴리글리세린지방산에스테르인 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 본 발명인 제조방법4에 따라 제조된 마이크로캡슐을 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명인 제조방법4에 따라 제조된 마이크로캡슐을 포함하는 제품을 제공한다. 여기서 제품은 발효유, 가공유, 장류 발효식품, 김치발효식품, 기능성 음료, 기능성 식품, 일반식품, 의약품, 화장품을 포함한다.

본 발명은 또한 폴리글리세린지방산에스테르와 인산염 완충액으로 별도로 코팅된 불포화지방산을 (a)단계에서 생산된 1차 코팅물질과 함께 (b)단계에 첨가시키는 유산균-불포화지방산 공유 다중 마이크로캡슐 제조방법5를 제공한다.

본 발명 제조방법5에 있어서, 불포화지방산은 DHA(docosahexaenoic acid), EPA(Eicosapentaenoic acid) 또는 CLA인 것이 바람직하다.

본 발명 제조방법5에 있어서, 코팅된 불포화지방산은 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.3 내지 0.5%(w/w)의 폴리글리세린지방산에스테르, 0.5 내지 1.0%(w/w)의 0.1N인 인산염 완충액 및 5.0 내지 10.0%(w/w)의 불포화지방산으로 균질화되어 캡슐된 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 제조방법5에 의해 제조된 마이크로캡슐을 제공한다.

본 발명은 또한 제조방법5에 의해 제조된 마이크로캡슐을 포함한 제품을 제공한다. 여기서 제품은 제품이 발효유, 가공유, 장류 발효식품, 김치발효식품, 기능성 음료, 기능성 식품, 일반식품, 의약품, 화장품을 포함한다.

본 발명은 제조방법4에 의해 제조된 마이크로캡술을 탈지분유, 덱스트린, 클로렐라와 혼합하여 동결건조시키는 분말제조방법6을 제공한다.

본 발명 제조방법6에서, 제조방법4에서 제조된 마이크로캡슐은 0.1 내지 0.5 중량%이고, 탈지분유는 5 내지 15중량%이며, 덱스트린은 5 내지 15중량% 이고, 클로렐라는 70 내지 85중량%인 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 제조방법6으로 제조된 분말을 제공한다.

본 발명은 또한 제조방법6으로 제조된 분말을 포함하는 제품을 제공한다. 여기서 제품은 발효유, 가공유, 장류 발효식품, 김치발효식품, 기능성 음료, 기능성 식품, 일반식품, 의약품, 화장품을 포함한다.

이하, 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법의 이해를 돕 기 위하여 실시예를 기재한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본실시 예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

[ 실시예 1]

CLA 생산 특허균주 비피도박테리움 브레베(CBG-C2)의 다중 마이크로캡슐 제조

1단계 코팅으로 고온내성이 있는 호화유리용기 1L에 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.05%(w/w) 저지방탈지분유와 0.15%(w/w) 글리세린, 0.05%(w/w) 배지용액을 각각 멸균기(Vision VS-1221-60)를 이용하여 121℃에서 10분 동안 멸균호화시킨 다음 혼합시켰다. 이 혼합액을 40℃까지 냉각시킨 다음 배양 회수된 5.0%(w/w) CLA 생산 비피도박테리움 브레베(CBG-C2)와 혼합하여 정밀균질기(IKA T-50)를 사용하여 6,400rpm에서 1분 동안 균질화시켰다. 이후 2단계 코팅으로 1차 코팅물질에 5.0%(w/w) 정제가공유를 80℃로 가열한 다음 40℃로 냉각시켜 0.5%(w/w) 폴리글리세린지방산에스테르(Almax 9025), 0.4%(w/w) 글리세린호박산지방산에스테르(Almax 5100)를 혼합하여 정밀균질기(IKA T-50)를 사용하여 6,400rpm에서 5분 동안 균질화시켜 CLA 생산 특허균주의 2차 코팅을 완료하였다. 이후 3단계 코팅으로 0.3%(w/w) 전분, 3.0%(w/w) 젤라틴, 0.5%(w/w) 폴리글리세린지방산에스테르(Almax 9080), 0.3%(w/w) 구아검을 충분한 멸균수에 혼합하여 120℃에서 호화시킨 다음 40℃까지 냉각시킨 후 정밀균질기(IKA T-50)를 사용하여 6,400rpm에서 5분 동안 균질화 시켰으며, 다음으로 CLA 생산 특허균주의 2차 코팅물질을 부가시켜 다시 1분 동안 6,400rpm에서 균질화시킨 다음 3중 코팅을 완성한 후, 멸균된 냉각수속에 직접 분무하여 다중 유산균 마이크로캡슐을 제조하였다. 그 결과 수득된 CLA 생산 비피도박테리움 브레베(CBG-C2) 유산균 다중 마이크로 캡슐은 평균 1.5～1.7㎛ 크기의 흰색 구형으로 경화된 5.0%(w/w) 유산균이었으며, 수율은 99% 이었다.

실시예 1의 물성 테스트:

이하, 상기에서 제조한 캡슐 또는 분말을 이용하여 이들의 성질을 테스트해보았다. 다만, 여기서 이용된 제조된 다중 CLA 유산균 캡슐의 유산균 생균수의 확인은 다음과 같은 방법을 통해 이루어졌다. BL-agar 배지를 코팅한 플레이트에 희석배율에 따라 접종한 다음 골고루 분포시켜 혐기성병에 넣어 37℃ 인큐베이터에서 48시간 배양하여 유산균 생균수인 콜로니 숫자로 계산하였다. 또한 상기 다중코팅 유산균 캡슐은 4℃상태에서 3개월(또는 경우에 따라서는 12개월)간 보관하면서 위와 같은 BL-agar 배지 플레이트에서 계속적인 생균수를 계산하면서 저장성을 확인하였다.

<실험예 1> 4℃의 냉장 보관 실험

실시예 1에 따라 제조된 유산균(CBG-C2) 다중 마이크로캡슐을 95일 동안 4℃의 냉장상태 보관한 후 일 수 경과에 따른 1mL의 캡슐 당 생균수를 측정해보았다. 그 결과는 도2와 같으며, 95일이 경과하여도 유산균수는 다량 존재하는 것으로 관찰되었다.

<실험예 2> 25℃ 및 37℃에서의 보관 실험

실시예 1에 따라 제조된 유산균(CBG-C2) 다중 마이크로캡슐을 25℃ 및 37℃에서 50시간동안 보관한 후 그에 따른 생균수를 측정해보았다. 그 결과는 도3과 같으며, 도 3에서 BB1202와 BB1208은 CBG-C2 다중 마이크로캡슐의 제조번호를 나타낸다.

<실험예 3> 캡슐의 크기 측정

실시예 1에 따라 제조된 유산균(CBG-C2) 다중 마이크로캡슐의 크기를 ELS-Electrophoretic Light Scattering System, 제작사 : Ostuka, 모델명 : ELS-8000인 측정기기를 이용하여 autoclaved 3rd DIW로 250배 희석하는 전처리 과정후 측정하였다. 그 결과는 도 4와 같으며, 대부분 평균 1,500nm 내지 1,700nm 크기를 갖는 것으로 측정되었다.

<실험예 4> 캡슐 0.3%를 우유에 첨가한 후, 4℃에서 냉장보관 실험

실시예 1에 따라 제조된 유산균(CBG-C2) 다중 마이크로캡슐 및 본 캡슐 0.3%를 우유에 첨가한 경우를 각각 4℃에서 약 10일 내지 15일간 보관한 후, 이에 따른 생균수 변화를 측정해보았다. 그 결과는 도5와 같으며, 본 발명에 따른 마이크로 캡슐 0.3%를 넣은 우유의 경우도, 약 10일이 지나도 유산균수가 다량 존재하는 것으로 나타났다.

<실험예 5> pH 안정성과 분산성 실험

실시예 1에서 제조된 유산균(CBG-C2) 다중 마이크로캡슐의 pH 안정성과 분산성을 37℃에서 Trizma-base Buffer (20mM Triz / 100mM NaCl) 및0.1N HCl & 0.1N NaOH을 이용하여 pH 적정한 후, 시간에 따라 측정하여 보았다. 그 결과는 하기의 표 1과 같다.

[표1]

시간 pH	15 min	30 min	45 min	1 hr	1 hr 15 min	1 hr 30 min	2 hr	2 hr 30 min
1.04	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	서서히 풀림
2.10	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	서서히 풀림
3.00	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	서서히 풀림
4.11	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	서서히 풀림
5.52	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	서서히 풀림
7.10	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	안정성유지	서서히 풀림
8.13	캡슐 엉김	캡슐 엉김	캡슐 엉김	캡슐 엉김	캡슐 엉김	캡슐 엉김	캡슐 엉김	캡 슐 엉 김
9.50	캡슐 엉김	캡슐 엉김	캡슐 엉김	캡슐 엉김	캡슐 엉김	캡슐 엉김	캡슐 엉김	캡 슐 엉 김

즉, 본 발명에 따른 캡슐은 산성 및 중성에서 2시간가량 안정성 및 분산성이 양호하나, 2시간 이상에서는 안정성이 크게 감소하는 것으로 나타내었다. 다만, 알칼 리성에서는 캡슐의 분산성이 불량한 것으로 나타났다.

<실험예 6> 펩신에 대한 인비트로 실험

실시예 1에서 제조된 유산균(CBG-C2) 다중 마이크로캡슐은 37℃에서 펩신에 대한 in vitro 실험을 해보았다. 펩신에 의한 캡슐의 in vitro 실험방법은 인공위액을 제조하여 각 시간대별로 유산균의 생균수를 측정하는 방법을 사용하였다. 그 측정방법은 4ml의 펩신 용액(pH 1.2, 1mg/ml : from porcine gastric mucosa ; 분말, 800 내지 2,500 units/mg protein)을 첨가한 후, 1N HCl로 pH 2를 맞추고, 전체용액을 100ml 내외로 맞추어 인큐베이터 37도에서 보관하였다. 기준시료인 유산균 캡슐도 인큐베이터 37도에서 보관하면서 사용하였다. 시료수는 각각 3개씩 시간대별로 선정(0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4시간)하도록 한다. 유산균 캡슐은 전체용액에 10%씩 첨가한 후 각 시간대별로 시료를 채취하여 플레이팅 함으로서 생균수를 측정하였다. 그 결과는 도6과 같으며, 본 발명에 따른 캡슐은 약 3시간 동안 펩신에 대해 안정한 것으로 나타났다.

<실험예 7> 살균에 의한 생균수 변화 측정

실시예 1에서 제조된 유산균(CBG-C2) 다중 마이크로캡슐을 직접 또는 우유에 첨가한 후, 72℃에서 20초간 살균한 경우 및 135℃에서 2초간 살균한 경우에 있어서 생균수 감소를 각각 확인하여보았다. 그 결과는 도7과 같으며, 직접 캡슐살균 및 우유에 첨가 후 살균했을 때 생균수의 변화는 72℃, 20초 처리한 결과보다 135℃, 2초 처리한 결과에서 열처리 하지 않은 캡슐의 생균수와 유사한 생균수가 확인되었다.

<실시예 8> 90℃에서의 시간의 경과에 따른 생균수의 변화

실시예 1에서 제조된 유산균(CBG-C2) 다중 마이크로캡슐을 두유(베지밀 )에 첨가한 다음 90℃, 30초간 가열 살균조건에서 캡슐이 얼마나 깨지는지를 측정하여보았다. 그 결과를 도 8에 나타내었으며, 90℃, 30초 열처리에 의해 CLA 생산 비피더스 유산균 마이크로캡슐이 50% 정도 붕괴되는 것으로 확인되었다(도 14에서, 세로축은 균체농도(O.D.)를 나타낸다).

[ 실시예 2]

CLA 생산 특허균주 슈도카르테눌라툼(CBG-C4)의 다중 마이크로캡슐의 제조

실시예 1에서 5.0%(w/w) CLA 생산 비피도박테리움 브레베(CBG-C2) 대신에 5.0%(w/w) CLA 생산 특허 균주 비피도박테리움 슈도카르테눌라툼(CBG-C4)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 표제의 캡슐을 수득하였다. 그 수득된 5.0%(w/w) CLA 생산 특허 균주 비피도박테리움 슈도카르테눌라툼(CBG-C4) 유산균 다중 마이크로캡슐은 평균 1.5～1.7㎛ 크기의 흰색 구형으로 경화된 것이었으며, 수율은 99% 이었다.

[ 실시예 3]

CLA 생산 특허균주 엔테로코커스 패시움(CBG-C5)의 다중 마이크로캡슐의 제조

실시예 1에서 5.0%(w/w) CLA 생산 비피도박테리움 브레베(CBG-C2) 대신에 5.0%(w/w) CLA 생산 특허 균주 엔테로코커스 패시움(CBG-C5)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 표제의 캡슐을 수득하였다. 그 수득된 5.0%(w/w) CLA 생산 특허 균주 엔테로코커스 패시움(CBG-C5) 유산균 다중 마이크로캡슐은 평균 1.5～1.7㎛ 크기의 흰색 구형으로 경화된 것이었으며, 수율은 99% 이었다.

[ 실시예4 ]

L. Lactis 유산균의 다중코팅 마이크로캡슐의 제조

실시예 1에서 5.0%(w/w) CLA 생산 비피도박테리움 브레베(CBG-C2) 대신에 5.0%(w/w) L. Lactis 유산균(Rhodia Inc.)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 표제의 캡슐을 수득하였다. 그 수득된 5.0%(w/w) L. Lactis 유산균의 다중 마이크로캡슐은 평균 1.5～1.7㎛ 크기의 흰색 구형으로 경화된 것이었으며, 수율은 99% 이었다.

실시예 4의 물성 테스트:

<실험예 9> 김치에 첨가한 경우의 생균수 변화측정

실시예 4에서 제조된 L. Lactis 다중 마이크로캡슐을 김치에 2% 첨가한 후, 20℃에 서 10일간의 보관한 후, 그에 따른 생균수와 pH의 변화를 측정해보았다. 그 결과는 도 9와 같다. 발효가 진행됨에 따라 김치는 산성화 되며, 생균수는 pH가 약 3.5 부근에서 최대의 수를 갖는 것으로 관찰되었다.

<실시예 10> 우유 안에서의 생균수 변화 측정

실시예 4에서 제조된 L. Lactis의 다중 마이크로캡슐 0.5%를 우유에 첨가 한 후, 4℃에서 저장한 후, 제조일로부터 15일까지 유산균 생균수를 측정하여보았다. 그 결과는 도 10과 같으며, 15일이 지나도 생균수는 제조당시와 유사하였다.

<실시예 11> 두유 안에서의 생균수 변화 측정

실시예 4에서 제조된 L. Lactis의 다중 마이크로캡슐 0.5%를 두유에 첨가 한 후, 4℃에서 저장한 후, 제조일로부터 15일까지 유산균 생균수를 측정하여보았다. 그 결과는 도 11과 같으며, 15일이 지나도 생균수는 제조당시와 유사하였다.

[ 실시예5 ]

5.0% 락토바실러스 에시도필러스와 락토코커스 써머필러스의 공유 마이크로 캡슐 제조

실시예 1에서 5.0%(w/w) CLA 생산 비피도박테리움 브레베(CBG-C2) 대신에 락토바실러스 에시도필러스(Rhodia Inc.)와 락토코커스 써머필러스(Rhodia Inc.)을 5.0%(w/w, L. 에시도필러스 : S. 써머필러스=1:1)사용한 것을 제외하고는 실시예 1 과 동일한 방법을 수행하여 표제의 캡슐을 수득하였다. 그 수득된 5.0%(w/w) 락토바실러스 에시도필러스와 락토코커스 써머필러스의 공유 다중 마이크로캡슐은 평균 1.5～1.7㎛ 크기의 흰색 구형으로 경화된 것이었으며, 수율은 99% 이었다.

실시예 5의 물성 테스트:

<실시예 12>

실시예 5에 따라 제조된 다중 마이크로캡슐을 4℃의 냉장상태에서 90일 동안 저장하면서 시간의 경과에 따라 생균수(mL당)를 측정하였다. 그 결과는 도 12과 같으며, 90일 경과 후, 생균수는 BL-agar 배지 플레이트를 이용하여 계산하였다.

[ 실시예 6]

분산성이 향상된 CLA 생산 특허균주 비피도박테리움 브레베(CBG-C2)의 다중 마이크로캡슐의 제조

1단계 코팅으로 호화유리용기 1L에 마이크로캡슐의 총량의 0.05%(w/w) 저지방탈지분유와 배지용액, 0.17%(w/w) 글리세린, 0.05% 시스테인을 각각 멸균기를 이용하여 121℃에서 10분 동안 멸균호화시킨 다음 40℃까지 냉각시킨 후 배양 회수된 5.0%(w/w) CLA 생산 특허 균주 비피도박테리움 브레베(CBG-C2)와 혼합하여 6,400rpm에서 1분 동안 균질화시켰다. 2단계 코팅으로 1차 코팅물질에 10.0%(w/w) 폴리글리세린지방산에스테르(Almax 9025)와 0.4%(w/w) 모노글리세린지방산 에스테르(Almax 1800)를 넣은 후 6,400rpm에서 5분 동안 균질화시켜 CLA 생산 특허균주의 2차 코팅을 완료하였다. 3.0%(w/w) 젤라틴, 0.5%(w/w) 폴리글리세린지방산에스테르 (Almax 9080), 0.5%(w/w) 구아검을 충분한 멸균수에 혼합하여 120℃에서 호화시킨 다음 40℃까지 냉각시킨 후 6,400rpm에서 5분 동안 균질화시켰다. 그 다음 CLA 생산 특허 균주의 2차 코팅물질을 부가시켜 다시 1분 동안 6,400rpm에서 균질화시킨 후 3차 코팅을 완료한 다음 멸균된 냉각수속에 직접 분무하여 5.0%(w/w) CLA 생산 비피도박테리움 브레베(CBG-C2) 유산균의 다중 마이크로캡슐을 제조하였다. 그 결과 수득된 표제의 캡슐은 냉장상태에서도 분산성을 유지하여 굳어지지 않은 효과를 나타내었으며, 수율은 99% 이었다.

실시예 6의 물성 테스트:

<실험예 13> 실험예 6 캡슐의 냉장 보관

실시예 6에서 제조된 CLA 생산 특허 균주 비피도박테리움 브레베(CBG-C2) 다중 마이크로캡슐을 4℃에서 15일간 보관한 후, 저장 기간에 따른 생균수를 측정하여 보았다. 그 결과는 도 13과 같으며, 15일 보관 후에도 크게 유산균수가 감소하지 않음을 알 수 있었다.

[ 실시예 7]

분산성이 향상된 CLA 생산 특허균주 슈도카르테눌라툼(CBG-C4)의 다중 마이크로캡슐의 제조

실시예 4에서 5.0%(w/w) CLA 생산 비피도박테리움 브레베(CBG-C2) 대신에 5.0%(w/w) CLA 생산 특허 균주 비피도박테리움 슈도카르테눌라툼(CBG-C4)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 방법을 수행하여 표제의 캡슐을 수득하였다. 그 결과 수득된 표제의 캡슐은 냉장상태에서도 분산성을 유지하여 굳어지지 않은 효과를 나타내었으며, 수율은 99% 이었다.

[ 실시예 8]

분산성이 향상된 CLA 생산 특허균주 엔테로코커스 패시움(CBG-C5)의 다중 마이크로캡슐의 제조

실시예 4에서 5.0%(w/w) CLA 생산 비피도박테리움 브레베(CBG-C2) 대신에 5.0%(w/w) CLA 생산 특허 균주 엔테로코커스 패시움(CBG-C5)을 사용한 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 방법을 수행하여 표제의 캡슐을 수득하였다. 그 결과 수득된 표제의 캡슐은 냉장상태에서도 분산성을 유지하여 굳어지지 않은 효과를 나타내었으며, 수율은 99% 이었다.

[ 실시예 9a]

5.0% CLA 생산 비피도박테리움 브레베(CBG-C2)과 CLA 공유 다중 마이크로캡슐 제조

유산균의 1단계 코팅으로 고온내성이 있는 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.05%(w/w) 유청분말(또는 SMP8515)과 0.15%(w/w) 글리세린, 0.05%(w/w) 배지용액을 각각 호화시킨 다음 혼합하여 5분 동안 균질기(IKA T-50)를 이용하여 6,400rpm에서 균질화 시킨 후 40℃까지 냉각시켜 5.0%(w/w) CLA 생산 비피도박테리움 브레베(CBG-C2)를 부가하여 1분 동안 균질기를 이용하여 다시 6,400rpm에서 균질화시켰 다. CLA의 1단계 코팅으로 0.5%(w/w) 폴리글리세린지방산에스테르(Almax 9025)와 10.0%(w/w) CLA, 1.0%(w/w) 0.1N-인산염 완충액을 혼합한 다음 균질기를 이용하여 5분 동안 6,400rpm에서 균질화시켰다.

그 다음으로 코아물질인 1단계 코팅된 유산균과 개별적으로 1단계 코팅된 CLA를 5.0%(w/w) 정제가공유와 0.5%(w/w) 폴리글리세린지방산에스테르(Almax 9025), 0.4%(w/w) 글리세린호박산지방산에스테르(Almax 5100)과 혼합하여 혼합용기에 넣고 1분 동안 균질기를 이용하여 다시 6,400rpm에서 균질화시켜 5.0%(w/w) CLA 생산 비피더스 유산균과 10.0%(w/w) CLA 공유의 2차 코팅을 완료하였다.

그 후, 호화유리용기 1L에 0.3%(w/w) 전분, 3.0%(w/w) 젤라틴, 0.5%(w/w) 폴리글리세린지방산에스테르(Almax 9080), 0.3%(w/w) 구아검을 충분한 멸균수에 혼합하여 120℃에서 호화시킨 다음 40℃까지 냉각시켜 균질기를 이용하여 다시 6,400rpm에서 5분 동안 균질화시킨 후 2차 코팅물질을 부가하여 다시 1분 동안 6,400rpm에서 균질화 시켜 3차 코팅을 완료한 후 멸균된 냉각수속에 직접 분무함으로서 5.0%(w/w) CLA 생산 비피더스 유산균과 10.0%(w/w) CLA 공유 다중 마이크로캡슐을 제조하였다. 이때 수율은 99% 였다.

[ 실시예 9b]

5.0% CLA 생산 비피도박테리움 슈도카르테눌라툼(CBG-C4)과 CLA 공유 다중 마이크 로캡슐 제조

실시예 9a에서 5.0% CLA 생산 비피도박테리움 브레베(CBG-C2)대신에 5.0% CLA 생산 비피도박테리움 슈도카르테눌라툼(CBG-C4)을 넣고 실시예9a와 동일한 방법으로 표제의 마이크로캡슐을 제조하였다. 이때 수율은 99% 였다.

[ 실시예 9c]

5.0% CLA 생산 엔테로코커스 패시움 ( CBG - C5 ) 과 CLA 공유 다중 마이크로캡슐 제조

실시예 9a에서 5.0% CLA 생산 비피도박테리움 브레베(CBG-C2)대신에 5.0% CLA 생산 엔테로코커스 패시움(CBG-C5)을 넣고 실시예9a와 동일한 방법으로 표제의 마이크로캡슐을 제조하였다. 이때 수율은 99%였다.

실시예 9의 물성 테스트:

<실험예 14> 캡슐내의 CLA 함량 분석

실시예 9a에서 제조된 캡슐의 유산균(CBG-C2)과 CLA 공유 다중 마이크로캡슐의 CLA 함량을 GC로 분석하였다. 그 CLA 함유량 검출은 GC 분석법을 이용하여 다음과 같이 측정하였다. 유산균과 CLA 공유 다중 마이크로캡슐을 5시간 동안 인큐베이터에 놓아두고 캡슐을 붕괴시켰다. 캡슐 붕괴 후 냉장 상태에서 보관 하고, 9000rpm, 7분, 4℃ 조건으로 원심분리를 하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상층액에 이소프로필알콜을 섞어서 5분 동안 흔들어준 후 다시 헥산을 첨가하여 5분 동안 흔들고 10분 동안 방치한 후 상등액만 분리하여 45～50℃에서 감압 증류한 후 1N NaOH/MeOH을 첨가 후 현탁시켰다. 그 다음 100℃에서 10분간 가열한 후 BF₃/MeOH을 첨가하여 100℃에서 5분 반응시키고 헥산을 첨가하여 1분 동안 100℃에서 메틸화시켜 냉각시켰다. 이로 얻어진 CLA-OMe을 GC(Varian CP-3800)를 이용하여 캡슐속의 CLA 함유량을 계산하였다. 그 결과 CLA 공유 마이크로캡슐내의 CLA 함량은 4.45%(체류시간 13.77분에서)였다(도 14 참조).

<실험예 15> CLA가 비피더스 유산균의 생육에 미치는 효과

실시예 9a에서 제조된 캡슐인 CLA 생산 비피더스 유산균(CBG-C2)과 CLA 공유 다중 마이크로캡슐의 비피더스 유산균의 생균수를 4℃에서 20일 동안 저장한 후, 그에 따른 생균수를 측정하여 보았다. 그 결과는 도 15와 같으며, CLA는 비피더스 유산균의 생육유지에 큰 저해를 입힘을 알 수 있었다.

[ 실시예 10]

5.0% CLA 생산 비피도박테리움 브레베 ( CBG - C2 ) 다중 마이크로캡슐의 분말제조

상기 실시예(1)에 따라 제조된 5.0% CLA 생산 비피도박테리움 브레베(CBG-C2) 다중 마이크로캡슐과 탈지분유, 덱스트린을 하기의 표의 함량비율로 먼저 혼합하여 균등하게 섞어준 다음 79.6% 클로렐라와 다시 혼합하여 균등하게 섞은 후 동결건조기(Ilshin, Model No : PITFD100R)를 이용하여 처음온도 -43℃, 최종온도 30℃, 진공 내부압력 7 mTorr 조건으로 5일 동안 동결건조 시킨 뒤 분말형태로 제조하였다.

품 목	함유량(g)	혼합비율(%)	비 고
5.0% CLA 생산 비피더스 유산균 마이크로캡슐	37.35	0.37	초기 생균수 2.3×10⁹/g
탈 지 분 유	1,000	10.00
덱 스 트 린	1,000	10.00
클 로 렐 라	7,962.65	79.63
총 함 량	10,000	100.00

실시예 10의 물성 결과:

<실험예 16> 분말의 생균수 및 생존기간 측정

실시예 10에 따라 제조된 마이크로캡슐 분말을 25℃에서 12개월 동안 저장하면서 시간의 경과에 따라 생균수를 측정해보았다. 그 결과는 도 16와 같으며, 초기 생균수 2.3×10⁹/g 일 때, 12개월 후의 생균수 1.3×10⁸/g으로 관찰되었다.

[ 실시예 11]

5.0% 락토바실러스 에시도필러스와 락토코커스 써머필러스 공유 다중 마이크로캡슐의 분말제조

상기 실시예 5에 따라 제조된 5.0% 락토바실러스 에시도필러스와 락토코커스 써머필러스 공유 다중 마이크로캡슐과 CMC, 전분, 덱스트린 및 탈지분유를 하기의 표의 함량비율로 먼저 혼합하여 균등하게 섞어준 다음 클로렐라와 다시 혼합하여 균등하 게 섞은 후 동결건조기(Ilshin, Model No : PITFD100R)를 이용하여 처음온도 -43℃, 최종온도 30℃, 진공내부압력 7 mTorr 조건으로 5일 동안 동결건조 시킨 뒤 분말형태로 제조하였다.

품 목	함유량(g)	혼합비율(%)	비 고
5.0% 락토바실러스 에시도필러스와 락토코커스 써머필러스의 공유 다중 마이크로캡슐	8,100	81.00	초기 생균수 8.5×10⁹/g
CMC	35	0.35
전 분	85	0.85
덱 스 트 린	1,400	14.00
탈 지 분 유	380	3.80
총 함 량	10,000	100.00

실시예 11의 물성 결과:

<실험예17>

실시예 11에서 제조된 분말을 25℃(상온)에서 12개월 동안 저장하여 혼합균주의 생균수(g당)를 측정하여보았다. 그 결과는 도 17과 같으며, 생균수 10⁸ CFU/mL이 12개월간 유지하는 것으로 측정되었다.

본 발명의 유산균 다중 마이크로캡슐은 제조 후 생균수가 10⁸CFU/mL 이상으로 저장기간(4℃상태)이 3개월 이상 유지되는 효과를 나타낸다. 또한 본 발명에 따른 유산균 다중 마이크로캡슐은 4℃에서 6개월 이상, 20℃에서 1개월 이상, 25℃에서 1개월 이상 안정적 유지되는 효과를 나타낸다.

그리고 본 발명의 유산균 다중 마이크로캡슐에서 유효성분이 함유되는 수율은 99% 이상이며, 장기간 보관하여도 수용액상에서 분산성이 유지되는 효과를 나타낸다.

따라서 본 발명의 유산균 다중 마이크로캡슐은 유산균의 기능을 유지하면서 제품유형 및 용도에 따라 다양하고 안정한 제형을 공급할 수 있다.

Claims

(a) 저지방탈지분유, 글리세린 및 배지용액을 멸균 호화시킨 후 유산균을 부가하고 균질화시켜 1차 코팅 물질을 제조하는 단계;

(b) 상기에서 제조된 1차 코팅 물질에 정제 가공유, 폴리글리세린지방산 에스테르 및 글리세린호박산지방산 에스테르를 혼합 균질화시켜 2차 코팅 물질을 제조하는 단계;

(c) 탄수화물, 단백질 성분 및 검류 증점제, 유화제를 혼합하여 호화 균질화시킨 후, 2차 코팅물질을 부가하여 균질시킨 후 3차 코팅 물질을 제조한 다음 멸균된 냉각수 속에 분무하는 단계를 포함하는 유산균 다중 마이크로캡슐 제조방법.
제1항에 있어서, (a)단계의 유산균이 특허균주인 CLA(conjugated linoleic acid) 생산 비피도박테리움 브레베, CLA 생산 비피도박테리움 슈도카르테눌라툼, CLA 생산 엔터로코스 패시움, 락토바실러스 에시도필러스, 락토코커스 써머필러스, 락토바실러스 카제인, 락토바실러스 루테리 또는 비피더스 유산균에서 선택된 1종 이상인 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, (a)단계의 유산균이 마이크로캡슐 총량에 1.0 내지 5.0%(w/w)인 제조방법.
제1항에 있어서, (a) 단계의 저지방탈지분유가 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.01 내지 0.5%(w/w)이고, 글리세린이 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.1 내지 1.0%(w/w)이며, 배지 용액이 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.05 내지 0.5%(w/w)인 제조방법.
제1항에 있어서, (b) 단계의 정제가공유가 마이크로캡슐 총량을 기준으로 1.5 내지 5.0%(w/w)이고, 폴리글리세린지방산에스테르가 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.3 내지 0.5%(w/w)이며, 글리세린호박산지방산에스테르가 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.2 내지 0.4%(w/w)인 제조방법.
제1항에 있어서, (c) 단계의 탄수화물이 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.1 내지 0.3%(w/w)이고, 단백질 성분이 마이크로캡슐 총량을 기준으로 1.5 내지 3.0%이며, 검류 증점제가 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.1 내지 0.3%이고, 유화제가 마이크로캡슐 총량을 기준으로0.1 내지 0.5%인 제조방법.
제1항에 있어서, (a), (b) 및 (c) 단계의 균질화 온도가 30℃ 내지 50℃인 제조방법.
제1항에 있어서, (a), (b) 및 (c) 단계의 균질화 온도가 35℃ 내지 45℃인 제조방법.
제1항에 있어서, (a), (b) 및 (c) 단계의 균질화 온도가 40℃인 제조방법.
제1항에 있어서, 탄수화물이 전분, 또는 변성 전분인 제조방법.
제1항에 있어서, 단백질 성분이 젤라틴 또는 한천인 제조방법.
제1항에 있어서, 검류 증점제가 구아검 또는 잔탄검인 제조방법.
제1항에 있어서, 유화제가 폴리글리세린지방산에스테르인 제조방법.
제1항의 방법으로 제조된, 유산균을 포함하는 1차 코팅물질, 2차 코팅물질 및 3차 코팅물질을 포함하는 유산균 다중 마이크로캡슐.
제14항의 마이크로캡슐을 포함하는 제품.
제15항에 있어서, 제품이 발효유, 가공유, 장류 발효식품, 김치발효식품, 기능성 음료, 기능성 식품, 일반식품, 의약품 및 화장품인 제품.
제1항에 있어서, 폴리글리세린지방산에스테르와 인산염 완충액으로 별도로 코팅된 불포화지방산을 (a)단계에서 생산된 1차 코팅물질과 함께 (b)단계에 첨가시켜 유산균과 불포화지방산이 공유된 마이크로캡슐을 제조하는 유산균 다중 마이크로캡슐 제조방법.
제17항에 있어서, 불포화지방산이 DHA(docosahexaenoic acid), EPA(Eicosapentaenoic acid) 또는 CLA인 제조방법.
제17항에 있어서, 캡슐된 불포화지방산이 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.3 내지 0.5%(w/w)의 폴리글리세린지방산에스테르, 0.5 내지 1.0%(w/w)의 0.1N인 인산염 완충액 및 5.0 내지 10.0%(w/w)의 불포화지방산으로 균질화되어 코팅된 것인 제조방법.
제17항의 방법으로 제조된, 유산균을 포함하는 1차 코팅물질, 불포화지방산을 포함하는 2차 코팅물질 및 3차 코팅물질을 포함하는 유산균과 불포화지방산이 공유된 유산균 다중 마이크로캡슐.
제20항의 마이크로캡슐을 포함하는 제품.
제21항에 있어서, 제품이 발효유, 가공유, 장류 발효식품, 김치발효식품, 기능성 음료, 기능성 식품, 일반식품, 의약품 및 화장품인 제품.
제1항에 따라 제조된 마이크로캡술을 탈지분유, 덱스트린, 클로렐라와 혼합하여 동결건조시키는 분말제조방법.
제23항에 있어서, 제1항에서 제조된 마이크로캡슐이 0.1 내지 0.5 중량%, 탈지분유가 5 내지 15중량%, 덱스트린이 5 내지 15중량% 및 클로렐라가 70 내지 85중량%인 분말제조방법.
제23항의 제조방법으로 제조된, 마이크로캡슐, 탈지분유, 덱스트린 및 클로렐라의 혼합 동결건조물로 구성된 분말.
제25항의 제조방법으로 제조된 분말을 포함하는 제품.
제26항에 있어서, 제품이 발효유, 가공유, 장류 발효식품, 김치발효식품, 기능성 음료, 기능성 식품, 일반식품, 의약품 및 화장품인 제품.
(a) 저지방탈지분유, 배지용액, 글리세린 및 시스테인을 멸균 호화시킨 후에 유산균을 부가하고 이를 균질화시켜 1차 코팅 물질을 제조하는 단계;

(b) 상기에서 제조된 1차 코팅 물질에 폴리글리세린지방산 에스테르 및 모노글리세린지방산 에스테르를 혼합 균질화시켜 2차 코팅 물질을 제조하는 단계;

(c) 단백질 성분 및 검류 증점제, 유화제를 혼합하여 호화 균질화시킨후, 2차 코팅물질을 부가하여 균질시킨 후 3차 코팅 물질을 제조한 다음 멸균된 냉각수 속에 분무하는 단계를 포함하는 유산균 다중 마이크로캡슐 제조방법.
제28항에 있어서, (a)단계의 유산균이 특허균주인 CLA 생산 비피도박테리움 브레베, CLA 생산 비피도박테리움 슈도카르테눌라툼, CLA 생산 엔터로코스 패시움, 락토바실러스 에시도필러스, 락토코커스 써머필러스, 락토바실러스 카제인, 락토바실러스 루테리 또는 비피더스 유산균에서 선택된 1종이상인 제조방법.
제28항 또는 제29항에 있어서, (a)단계의 유산균이 마이크로캡슐 총량에 1.0 내지 5.0%(w/w)인 제조방법.
제28항에 있어서, (a) 단계의 저지방탈지분유가 마이크로캡슐의 총량을 기준으로 0.05 내지 0.5%(w/w)이고, 글리세린이 마이크로캡슐의 총량을 기준으로 0.1 내지 1.0%(w/w)이며, 배지 용액이 마이크로캡슐의 총량을 기준으로 0.05 내지 0.5%(w/w)이고, 시스테인이 마이크로캡슐의 총량을 기준으로 0.01% 내지 0.1%(w/w)인 제조방법.
제28항에 있어서, (a) 단계의 시스테인이 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.05%(w/w)인 제조방법.
제28항에 있어서, (b) 단계의 폴리글리세린지방산에스테르가 마이크로캡슐 총량을 기준으로 5.0 내지 10.0%(w/w)이며, 모노글리세린지방산 에스테르가 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.2 내지 0.4%(w/w)인 제조방법.
제28항에 있어서, (c) 단계의 단백질 성분이 마이크로캡슐 총량을 기준으로 1.5 내지 3.0%이며, 검류 증점제가 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.3 내지 0.5%이고, 유화제가 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.1 내지 0.5%인 제조방법.
제28항에 있어서, (a), (b) 및 (c) 단계의 균질화 온도가 30℃ 내지 50℃인 제조방법.
제28항에 있어서, (a), (b) 및 (c) 단계의 균질화 온도가 35℃ 내지 45℃인 제조방법.
제28항에 있어서, (a), (b) 및 (c) 단계의 균질화 온도가 40℃인 제조방법.
제28항에 있어서, 단백질 성분이 젤라틴 또는 한천인 제조방법.
제28항에 있어서, 검류 증점제가 구아검 또는 잔탄검인 제조방법.
제28항에 있어서, 유화제가 폴리글리세린지방산에스테르인 제조방법.
제28항의 방법으로 제조된, 유산균을 포함하는 1차 코팅물질, 2차 코팅물질 및 3차 코팅물질을 포함하는 유산균 다중 마이크로캡슐.
제41항의 마이크로캡슐을 포함하는 제품.
제42항에 있어서, 제품이 발효유, 가공유, 장류 발효식품, 김치발효식품, 기능성 음료, 기능성 식품, 일반식품, 의약품 및 화장품인 제품.
제28항에 있어서, 폴리글리세린지방산에스테르와 인산염 완충액으로 별도로 코팅된 불포화지방산을 (a)단계에서 생산된 1차 코팅물질과 함께 (b)단계에 첨가시켜 유산균과 불포화지방산이 공유된 마이크로캡슐을 제조하는 유산균 다중 마이크로캡슐 제조방법.
제44항에 있어서, 불포화지방산이 DHA(docosahexaenoic acid), EPA(Eicosapentaenoic acid) 또는 CLA인 제조방법.
제17항에 있어서, 캡슐된 불포화지방산이 마이크로캡슐 총량을 기준으로 0.3 내지 0.5%(w/w)의 폴리글리세린지방산에스테르, 0.5 내지 1.0%(w/w)의 0.1N인 인산염 완충액 및 5.0 내지 10.0%(w/w)의 불포화지방산으로 균질화되어 코팅된 것인 제조방법.
제44항의 방법으로 제조된, 유산균을 포함하는 1차 코팅물질, 불포화지방산을 포함하는 2차 코팅물질 및 3차 코팅물질을 포함하는 유산균과 불포화지방산이 공유된 유산균 다중 마이크로캡슐.
제47항의 마이크로캡슐을 포함하는 제품.
제48항에 있어서, 제품이 발효유, 가공유, 장류 발효식품, 김치발효식품, 기능성 식품, 기능성 음료, 일반식품, 의약품 및 화장품인 제품.
제28항에 따라 제조된 마이크로캡술을 탈지분유, 덱스트린, 클로렐라와 혼합하여 동결건조시키는 분말제조방법.
제50항에 있어서, 제1항에서 제조된 마이크로캡슐이 0.1 내지 0.5 중량%, 탈지분유가 5 내지 15중량%, 덱스트린이 5 내지 15중량% 및 클로렐라가 70 내지 85중량%인 제조방법.
제50항의 제조방법으로 제조된, 마이크로캡슐, 탈지분유, 덱스트린 및 클로렐라의 혼합 동결건조물로 구성된 분말.
제52항의 제조방법으로 제조된 분말을 포함하는 제품.
제53항에 있어서, 제품이 발효유, 가공유, 장류 발효식품, 김치발효식품, 기능성 식품, 기능성 음료, 일반식품, 의약품 및 화장품인 제품.