CN1325065C - 改善肠胃的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种改善肠胃功能的组合物，它含有猴菇菌碱醇提取物经薄层层析分离到的Rf值在0.15-0.6之间的分离物。一种优选的组合物还含有甲壳低聚糖和/或橘粉。本发明还提供了获得对幽门螺杆菌有抑制作用的分离物的方法以及产生甲壳低聚糖的方法。本发明的组合物可有效地抑制幽门螺杆菌的生长，达到改善肠胃功能的效果。
Description
技术领域
本发明涉及抑制改善肠胃的组合物，更具体地，本发明涉及衍生自猴菇菌的、可用作幽门螺杆菌抑制剂的分离物，以及含有该分离物的组合物。
背景技术
自1982年Marshall和Warren从胃炎患者中分离出幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，Hp)之后，世界各国的科学家对幽门螺杆菌的生物学特性、致病机理、诊断和治疗进行了广泛的研究，现已确认幽门螺杆菌是慢性胃炎的主要致病因子，与消化性溃疡的发病密切相关，WHO和国际癌研究组织已将其列为第一类致癌因子。
临床上，应用单一抗生素很难根除幽门螺杆菌的感染，因此采用了不同的药物组合，比如以铋剂为基础的二联和三联疗法。虽然这种组合疗法的效果明显，但其应用仍然遇到了一些困难，主要表现为副作用大；耐药性增加；肠道内有益菌的数量和种类减少，菌群失衡。因此，寻找治疗简单、安全无副作用、治愈率高的药物是医药研究者孜孜以求的目标，幽门螺杆菌感染的治疗也趋于多元化。
猴菇菌(Hericium erinaceum，He)也称为猴菇菌，可用来治疗慢性胃炎、胃十二指肠溃疡、胃癌等疾病已得到广泛的认可，上海市中药制药三厂的猴菇菌片已在临床应用多年。虽然众多的报道认为猴菇菌中含有多糖、生物碱、萜类等生物活性成分，但这些成分对幽门螺杆菌是否有抑制作用尚未见报道。
已有大量研究表明分子量低于1万的甲壳低聚糖，具有更为广泛和独特的生理活性物质。甲壳低聚糖的制备方法通常有化学法(包括酸降解法和氧化降解法)和酶降解法。
氧化降解法普遍采用了多种试剂进行降解反应或降解产物的处理，这给产品的分离、纯化和安全性增添了困难，增加了产品的成本。
酸水解法由于是非特异的，分解步骤难以控制，特别是不能得到高级的寡聚糖(＞6)，大大影响了其生物功能的发挥。
酶解法，由于具有特异性，可选择性地酶解切断特定链，从而得到高级的寡聚糖，而且反应条件温和，没有强酸强碱，减少了环境污染。其酶解产物特别适合于医药、食品、化妆品领域中的运用。然而，目前没有大规模的生产工艺且生产成本高。
目前工业上主要采用化学法制取甲壳低聚糖，然而成本高、质量差，用这种方法得到的产品中化学物质的残留影响了其在食品、医药中的应用。
因此，本领域迫切需要开发衍生自猴菇菌的、对幽门螺杆菌有抑制作用的可改善肠胃功能的组合物。
发明内容
本发明人经过多年深入研究，对猴菇菌中抗幽门螺杆菌的成分进行了提取分离，获得了有效抑制幽门螺杆菌生长的分离物，并研制成幽门螺杆菌抑制剂。在此基础上完成了本发明。
在本发明的第一方面，提供了一种组合物，它含有猴菇菌碱醇提取物经薄层层析分离到的Rf值在0.15-0.6之间的分离物。
在一优选例中，所述的分离物选自下组物质：
(1)猴菇菌菌丝体碱醇提取物中经硅胶柱层析分离得到的四环三萜酸
FrIII-3，Rf值为0.50±0.05；
(2)FrIII-4和5，Rf值为0.4±0.05和0.45±0.05
(3)FrIII-6和7，Rf值分别为0.30±0.05，0.20±0.05；
或它们的混合物。
在另一优选例中，所述的分离物是猴菇菌菌丝体碱醇提取物中经硅胶柱层析分离得到的四环三萜酸FrIII-3，其分子式为C34H52O7。
在另一优选例中，所述的分离物的结构式为：
在另一优选例中，所述的组合物还含有选自下组的组份：
(a)分子量小于10000道尔顿的甲壳低聚糖；(b)橘粉；或其混合物。
在另一优选例中，所述的甲壳低聚糖是从猴菇菌培养物中分离出的。
在另一优选例中，所述的组合物是药物组合物，它还含有药学上可接受的载体，并且是胶囊形式。
在本发明的第二方面，提供了一种获得对幽门螺杆菌有抑制作用的分离物的方法，它包括步骤：
(a)将猴菇菌菌丝体和水的混合物在90-100℃回流提取5-100小时；
(b)过滤得到滤渣；
(c)向滤渣加入碱性乙醇，回流提取5-50小时；
(d)过滤得到滤液；
(e)浓缩滤液；
(f)用酸酸化滤液至pH为2-4；
(g)放置5-100小时，过滤获得沉淀。
在一优选例中，碱性乙醇的pH为8-10，体积为滤渣的5-20倍或更多，较佳地为滤渣的10-15倍。
在另一优选例中，在步骤(c)中回流条件是回流提取3-8次，每次2-6小时。
在另一优选例中，步骤(f)中，用2-8mol/L盐酸酸化至pH2.5-3.5。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：
(h)对沉淀进行硅胶柱层析，从而获得对幽门螺杆菌有抑制作用的分离物。
在本发明的第三方面，提供了一种生产甲壳低聚糖的方法，包括步骤：
(a)提供一原料液，所述的原料液是从猴菇菌发酵液中分离出菌丝体后得到的上清液；
(b)向原料液中加入乙醇至终浓度为55-70％；
(c)放置混合物6-24小时(较佳地8-12小时)，产生多糖沉淀；
(d)过滤混合物得到滤液；
(e)浓缩滤液，得到浓缩液。
在一优选例中，还包括步骤(f)向浓缩液中加入乙醇至85％-90％，室温(如4℃)放置一段时间，如6-24小时，较佳地8-12小时，产生的沉淀即为甲壳低聚糖。
附图说明
图1是本发明获得对幽门螺杆菌有抑制作用的分离物以及生产甲壳低聚糖的流程图。
图2显示了本发明的分离物FrII(即甲壳低聚糖)对幽门螺杆菌的抑制作用。
图3显示了本发明的分离物FrIII对幽门螺杆菌的抑制作用。
具体实施方式
如本文所用，Rf值指各成分在薄层层析板上斑点的位置，称作比移值。其计算公式如下：
Rf＝展开后，起始线至斑点中心的距离/展开后，起始线至溶剂前沿的距离
可用于本发明原料没有特别限制，只要是猴菇菌或其发酵产物即可。较佳地为猴菇菌菌丝体(对于组份FrII和FrIII而言)，或发酵液的上清液(对于组份FrII而言)。
在本发明的分离方法(参见图1)中，首先将猴菇菌菌丝体(宜为粉碎形式)与一定量的水混合。水的体积没有特别限制，通常为猴菇菌菌丝体体积的5-20倍或更多，较佳地为10-15倍。
然后，将水的混合物在90-100℃(较佳地95-100℃)回流提取。回流时间特别特别限制，通常为5小时以上，较佳地为5-100小时。可以分段进行，例如回流提取3-8次，每次2-6小时(更佳地3-5小时)。
回流处理过的混合物，经过滤后得到滤渣。
接着，向滤渣加入碱性乙醇，进行回流提取。碱性乙醇的pH为8-10，浓度越高越好，例如99.9％，体积为滤渣的5-20倍或更多，较佳地为10-15倍。回流时间特别特别限制，通常为5小时以上，较佳地为5-100小时。可以分段进行，例如回流提取3-8次，每次2-6小时(更佳地3-5小时)。
对回流处理过的混合物进行过滤，得到滤液。再用常规方法，例如真空浓缩滤液。通常至少浓缩为原体积的1/2以上。
接着，用酸酸化滤液。其中，采用的酸没有特别限制，可以是盐酸，硫酸等无机酸或乙酸等有机酸，较佳地是盐酸，其浓度通常2-8mol/L。通常将pH调节为2-4，较佳地pH2.5-3.5即可。
最后，放置一段时间(通常为5小时以上，例如5-100小时)，对产生的沉淀进行过滤即可获得对幽门螺杆菌有抑制作用的分离物。
在另一优选例中，还可获得的分离物进一步地进行硅胶柱层析，获得对幽门螺杆菌有抑制作用的级分FrIII3-7。
本发明还提供了一种生产甲壳低聚糖的方法，它包括步骤：
(a)提供一原料液，所述的原料液是从猴菇菌发酵液中分离出菌丝体后得到的上清液；
(b)向原料液中加入乙醇至终浓度为55-70％(较佳地58-65％，更佳地约60％)；
(c)放置混合物6-24小时(较佳地8-12小时)，产生多糖沉淀；
(d)过滤混合物得到滤液；
(e)浓缩滤液，得到浓缩液。
浓缩液可以直接使用。此外，还可将甲壳低聚糖制成固体形式，例如，向浓缩液中加入乙醇至85％-90％，室温(如4℃)放置一段时间，如6-24小时，较佳地8-12小时，产生的沉淀即为甲壳低聚糖。
在本发明中，就发酵工艺而言，与常规的发酵工艺基本相同。不同点仅在于在培养基中加入甲壳素或壳聚糖作为产生分子量小于10000道尔顿的甲壳低聚糖的原料，其加入量通常为1-100克/升培养基，较佳地为10-80克/升培养基。此外，还可在培养基中加入橘粉，其加入量通常为0.1-20克/升培养基，较佳地为1-10克/升培养基。
一种优选的培养基组成如下：
成分 含量(克/升培养基)
玉米粉(或淀粉，马玲薯浸提液等) 20～60
葡萄糖(或蔗糖、乳糖、麦芽糖等) 10～40
甲壳素或壳聚糖 10～80
麸皮(或豆饼粉、大豆蛋白、花生蛋白、橘粉等) 1～10
KH2PO4 0.5～2.5
水 余量
一种优选的发酵过程是：斜面菌种→液体种子→25L发酵罐发酵(装液系数50％-80％，温度25～30℃，接种量5-15％)→70～192小时放罐。
本发明的分离物可用作幽门螺杆菌抑制剂，抑制幽门螺杆菌的生长。因此，可作为药物活性成分用于药物组合物，例如治疗胃病的药物组合物。此外，还可作为添加剂用于食品或保健品。在本发明的抑制剂中，可以添加各种常规的载体、赋形剂、稀释剂、添加剂、香料、防腐剂等物质，只要它们不干扰本发明分离物的抑制幽门螺杆菌的活性。此外，还可与治疗胃病等消化性溃疡或改善肠胃的物质联用。
本发明的优点在于：
(1)本发明以甲壳素或壳聚糖为主要发酵基质，利用药用真菌-猴菇菌深层发酵过程中产生的壳聚糖降解酶，将甲壳素或壳聚糖转化为低聚糖；并对猴菇菌丝体中的多糖和三萜酸类进行生化提取；最后进行合理配伍精制而成。从而通过强化免疫和抑制幽门螺杆菌生长，达到改善胃肠道功能的作用。
(2)本发明的组合物(如肠胃康胶囊等)所含猴菇菌多糖和甲壳低聚糖具有免疫增强作用，能够提高巨噬细胞的吞嗜杀菌能力，因免疫功能低下或放化疗造成的白细胞数目下降可通过服用本品得到遏制，使其恢复到正常水平。
(3)本发明的组合物所含猴菇菌乙醇提取物(三萜类)和甲壳低聚糖能与胃上皮细胞存在粘附因子的特异受体结合，从而抑制幽门螺杆菌的生长，促进有益菌群生长，因而具有改善肠胃功能。
(4)本发明利用猴菇菌发酵过程中产生的壳聚糖酶系，包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和葡聚糖酶等，对甲壳素或壳聚糖进行酶法降解，从而得到均分子量较低的且安全可靠的甲壳低聚糖。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
对幽门螺杆菌有抑制作用的分离物的提取和纯化
以固体培养的猴菇菌菌丝体为原料，按图1所示的流程进行提取。其中，粉碎后的菌丝体和10倍水的混合物在是100℃下回流3小时，共5次；滤渣与12倍碱性乙醇溶液(pH10)的混合物回流3小时，共5次；滤渣与10倍酸性乙醇(pH3-5)溶液的混合物回流3小时，共5次。
制得组分FrI、FrII、FrIII和FrIV。各组分的提取率见表1。
表1 100g猴菇菌菌丝体或菌丝体中各组分的提取率
| 组分 | FrI | FrII | FrIII | FrIV |
| 得率％ | 4.20 | 0.94 | 1.03 | 0.56 |
实施例2
对组分FrIII的进一步分离
A.薄层层析(TLC)及结果
分别以下述系统为展开剂，以硫酸∶甲醇(1∶1)为显色剂，进行薄层层析。
系统1-正己烷∶乙酸乙酯(1∶1)
系统2-正己烷∶乙酸乙酯∶乙醚(1∶1∶1)
系统3-氯仿∶乙醚∶乙酸乙酯(9∶1∶1)
系统4-甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸(12∶4∶0.5)
结果表明，以甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸(12∶4∶0.5)为展开剂时效果最好。在猴菇菌菌丝体乙醇提取物中有10个左右的斑点。
B.硅胶柱层析条件及结果
硅胶：200-300目
洗脱剂：氯仿∶甲醇＝9∶1，8∶2，1∶1
展开剂：甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸＝12∶4∶0.5
流速：快速分离，400ml/15分钟
每管体积：15ml
上样量22g(FrIII)。
经一次硅胶柱层析后得到FrIII-1～2混合物(氯仿∶甲醇＝9∶1)1.15g，FrIII-3～5混合物(氯仿∶甲醇＝8∶2)2.24g，FrIII-6～7混合物(氯仿∶甲醇＝1∶1)12.5g。将FrIII-3～5混合物再次硅胶柱层析(正己烷-乙酸乙酯体系，洗脱程序正己烷100％20ml→90％20ml→80％20ml→70％20ml→60％20ml→50％20ml；减压层析法，保持流速约1.2ml/min；每5ml分管收集，显色剂同上)，得到FrIII-3(80％正己烷部分，1.09g)和FrIII-4～5的混合物0.86g。
实施例3
对各组分或级分的定性鉴定
(1)FrI和FrII：
利用蒽酮硫酸显色的方法。上述沉淀取少量，溶于去离子水中，取1ml溶液，加入4ml蒽酮硫酸试剂(1g蒽酮溶于500ml的浓硫酸中)，煮沸10分钟，呈蓝绿色，证明FrI含有多糖(猴菇菌多糖)，而FrII含低聚糖。
对FrII进一步分析表明，其主要成分是甲壳低聚糖，分子量小于10000道尔顿，1500-3000道尔顿的甲壳低聚糖占85％以上。
(2)FrIII
A.利用醋酐-硫酸反应(Liebermann-Burchard反应)：
取实施例1中的浓缩液各1ml蒸干，加醋酐1ml溶解，后滴加浓硫酸2滴，呈黄色→紫红色→墨绿色转变，说明含有皂甙和三萜类。
B.利用TLC
按实施例2中所述的方法进行TLC，
结果表明，菌丝体中FrIII组份中有5个斑点的Rf值在0.15～0.60之间，另外有2个斑点的Rf值在0.60～0.70之间。在实验中观察到FrIII-3～5(Rf＝0.56～0.40)先显亮红色，然后变为紫色；FrIII-6～7(Rf＝0.40～0.17)则由橙色变为紫色，这表明这些级份中都可能含有萜酸，且具不饱和特性，否则呈黄色并逐渐褪色。
具体而言，以硫酸∶甲醇(1∶1)为显色剂，以甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸(12∶4∶0.5)为展开剂，在猴菇菌发酵菌丝体乙醇提取物中有5个斑点的Rf值介于0.2～0.6之间，其中，FrIII-3，FrIII-4，FrIII-5，FrIII-6，FrIII-7的Rf值分别为0.50±0.05；0.4±0.05，0.45±0.05，0.30±0.05，0.20±0.05。
C.光谱分析
(i)紫外光谱
FrIII-3的最大吸收(λmax)在254nm；FrIII-4～5的最大吸收(λmax)在246nm、FrIII-6～7在223nm左右。
(ii)红外光谱
FrIII-3～7在3000～3500cm-1的有强吸收峰表明含有羟基；2400cm-1处的弱吸收峰表明是三萜酸；在1740cm-1～1760cm-1没有出现五元环酮的特征吸收，表明C15位无羰基。1200～1400cm-1的两个吸收峰(1305cm-1，1400cm-1)是多氢菲环的特征吸收，是四环三萜最为有力的证明。
(iii)核磁共振
对FrIII-3和FrIII-4～5进行了13CNMR分析，数据如表2和3所示：
表2 FrIII-3的13CNMR数据
| C位 | 化学位移(ppm) | C位 | 化学位移(ppm) | C位 | 化学位移(ppm) |
| 1 | 29.7 | 11 | 20.9 | 21 | 18.6 |
| 2 | 22.7 | 12 | 31.6 | 22 | 34.7 |
| 3 | 77.2 | 13 | 44.8 | 23 | 26.9 |
| 4 | 36.0 | 14 | 51.7 | 24 | 145 |
| 5 | 39.6 | 15 | 75.8 | 25 | 128.1 |
| 6 | 27.3 | 16 | 36.8 | 26 | 171.1 |
| 7 | 65.2 | 17 | 49.3 | 27 | 12.2 |
| 8 | 132.9 | 18 | 17.0 | 28 | 27.3 |
| 9 | 142.5 | 19 | 17.7 | 29 | 21.4 |
| 10 | 38.5 | 20 | 36.7 | 30 | 20.9 |
| COOMe | 170.5 | COO CH3 | 21.6 |
表3 FrIII-4和FrIII-5的13CNMR采集到的主要数据
| C位 | 化学位移(ppm) | C位 | 化学位移(ppm) | C位 | 化学位移(ppm) |
| 1 | 30.9 | 11 | 114.4 | 21 | 13.4 |
| 2 | 23.8 | 12 | 38.4 | 22 | 74.3 |
| 3 | 78.2 | 13 | 44.4 | 23 | 32.0 |
| 4 | 36.8 | 14 | 50.9 | 24 | 136.8 |
| 5 | 44.4 | 15 | 77.1 | 25 | 128.8 |
| 6 | 22.8 | 16 | 36.8 | 26 | 170.9 |
| 7 | 120.3 | 17 | 45.7 | 27 | 11.6 |
| 8 | 141 | 18 | 16.1 | 28 | 27.1 |
| 9 | 146.9 | 19 | 21.6 | 29 | 21.4 |
| 10 | 37.6 | 20 | 38.4 | 30 | 18.6 |
| COOMe | 172.5 | COO CH3 | 21.6 |
D.质谱分析
经ESI-MS检测到FrIII-3的分子离子峰(m/z)比较明显在572(M+)，570(M+-2H)，535(M+-2H2O)。因此推测FrIII-3的分子式为C34H52O7，其可能的分子结构如下：
(3)FrIV
利用1％三氯化铝显色反应。取组分FrIV溶液1ml，滴加1％三氯化铝溶液，呈黄色反应，证明含有黄酮类物质。
实施例4
各组分和级分的抑菌效果检测
(一)材料
实验材料
1、培养基：营养琼脂，改良布氏琼脂，巧克力琼脂，蛋黄琼脂
2、新鲜脱纤维马血、羊血、RPMI1640
3、混合抗生素：万古霉素(Vancumycin)，多粘菌素B(Polymyxin B)，黄胺增效剂(TMP)
4、实验菌株：幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)三株，编号为12908(常用的标准株)，沪东97，F44(临床分离菌株)
(二)、结果与讨论
1、幽门螺杆菌培养
采用不同培养基，不同培养方式和不同厌气条件进行培养。
表4 不同培养基对幽门螺杆菌生长的影响
| 培养基 | 营养琼脂 | 布氏琼脂 | 巧克力琼脂 | 蛋黄琼脂 |
| 生长状况 | + | ++ | +++ | + |
-：不生长。+，++，+++：生长能力依次递增。下同
表5 不同培养方式对幽门螺杆菌生长的影响
| 培养方式 | 抽真空法 | 燃烧法 | 连二亚硫酸钠法 | 三气培养法 | 穿刺培养 |
| 生长状况 | - | + | - | +++ | + |
由表4、表5可以看出在布氏琼脂、巧克力琼脂上，以及在三气(5％O2，10％CO2，85％N2)条件下幽门螺杆菌生长良好；这说明幽门螺杆菌是一种专性微需氧菌，在大气中和绝对厌氧环境中均不能生长。
2、幽门螺杆菌鉴定
按常规方法进行包括形态特征、生化反应和PCR分型的鉴定。结果如下：
表6 幽门螺杆菌的鉴定
| 菌株 | 尿素酶 | 触酶 | 氧化酶 | Gram | 形态 | CagA |
| 12908 | + | + | + | - | S状或短杆状 | - |
| 沪东97 | + | + | + | - | S状或短杆状 | + |
| F44 | + | + | + | - | S状或短杆状 | - |
+：阳性；-：阴性
虽然幽门螺杆菌对临床微生物实验中常用于鉴定肠道细菌的大多数经典生化实验不起反应，但幽门螺杆菌均能产生尿素酶(Urease)、触酶(Catalase)和氧化酶(Oxidase)。因此以它们作为幽门螺杆菌生化鉴定依据，但这些酶的测定对幽门螺杆菌的分型毫无帮助。而研究认为在幽门螺杆菌菌株中，含有毒素相关蛋白基因(Cytotoxin associated gene A，CagA)的菌株(I型菌)具有较强的毒性，与十二指肠溃疡及胃癌的发生密切相关。因此对三株幽门螺杆菌的CagA基因进行了PGR检测，有一株(沪东97)具有CagA基因。然后，主要以沪东97为实验菌，对猴菇菌提取物进行了抑菌作用实验。
3、猴菇菌提取物对幽门螺杆菌的抑制作用
用不同浓度或稀释度的各组份，通过常规的滤纸扩散法测抑菌圈大小和倍比稀释培养法进行药敏实验。结果如表7A-7B所示。
表7A猴菇菌提取物对幽门螺杆菌的抑制作用
| 组份 | FrI | FrII | FrIII | FrIV |
| 活性 | - | + | + | - |
●+，有活性；-，无活性。
●提取物浓度：FrI，FrII，FrIII，FrIV各为10mg/ml。
由实验结果可以看出，FrII和FrIII对幽门螺杆菌具有抑制作用。测其最低抑菌浓度(MIC)，实验结果见表7B和图2-3。
表7B FrII和FrIII组份的MIC
| 稀释倍数 | 1∶1* | 1∶2 | 1∶4 | 1∶8 | 1∶16 | 1∶32 |
| FrIII | + | + | + | - | - | - |
| FrII | + | + | - | - | ||
| FrII+FrIII | + | + | + | + | - | - |
*1∶1的浓度为10mg/ml.
由上表可以看出，FrIII、FrII和FrII+FrIII的最低抑菌浓度分别为1.25mg/ml、2.5mg/ml、和0.625mg/ml。图2为FrII对幽门螺杆菌的抑菌圈，直径为9mm。图3为FrIII对幽门螺杆菌(沪东97)的抑菌圈，直径为11mm。
此外，还通过体外CFU法。利用候选物质(包括FrII)与幽门螺杆菌共培养，并感染Hep2，计算粘附抑制率。结果如表7C所示。
表7C FrII对幽门螺杆菌的粘附抑制率
| 浓度(mg/ml) | 0(对照) | 1 | 2.5 | 5 | 10 | 20 | 30 |
| 抑制率％(FrII) | 0 | 15.6 | 32.8 | 40.5 | 46.4 | 74.2 | 75.1 |
| 抑制率％(L-岩藻糖) | 0 | 4 | 10.4 | 21.7 | 30.3 | 32.1 | 32.9 |
通过常规的滤纸扩散法测抑菌圈大小和倍比稀释培养法进行药敏实验。猴菇菌提取物FrIII-1至7对幽门螺杆菌的抑制作用如表8A和8B所示。
表8A 猴菇菌提取物FrIII-1至7对幽门螺杆菌的抑制作用
| 组分 | FrIII-1 | FrIII-2 | FrIII-3 | FrIII-4～5 | FrIII-6～7 |
| 活性 | - | - | + | + | + |
+，有活性；-，无活性。
提取物浓度：FrI，FrII，FrIII，FrIV各为10mg/ml。
表8B FrIII各组分的MIC
| 稀释倍数 | 1∶1* | 1∶2 | 1∶4 | 1∶8 | 1∶16 | 1∶32 |
| FrIII | + | + | + | - | - | - |
| FrIII-3 | + | + | + | + | - | - |
| FrIII-4～5 | + | + | + | + | - | - |
| FrIII-6～7 | + | + | + | - | - | |
| FrIII-1～2 | - | - | - | - | - | - |
*1∶1的浓度为10mg/ml.
由表8中可以看出，FrIII、FrIII-3、FrIII-4～5和FrIII6～7的最低抑菌浓度分别为1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.625mg/ml和1.25mg/ml，而FrIII-1～2则无活性。
此外，实验还表明，FrII、FrIII、FrIII-3、FrIII-4～5和FrIII6～7对不同的幽门螺杆菌，包括12908和P44，有同样的抑制作用。
实施例5
含分离物FrIII的抑制幽门螺杆菌的组合物
1、提取
猴菇菌菌丝体6kg，粉碎后加入10倍体积的去离子水，95℃回流提取5次，每次3～5小时，收集滤液，浓缩成浸膏0.25kg(FrI)，备用。滤渣加入240L碱性无水乙醇(pH9)回流提取，共5次，每次3～5小时，收集滤液，经真空浓缩到1.5L。然后用6mol/L HCl酸化到pH3，置4℃冰箱中过夜，收集到63g沉淀(FrIII)，备用。
2、配制
产品配方
淀粉 64％
FrI(多糖) 10％
FrIII 5％
大豆蛋白 12％
橘粉 9％
将上述原料按比例进行干粉混合，混匀后，在60℃进行干燥3小时，过100-120目筛，装胶囊或压片，然后在65℃干热灭菌2小时，即为成品。
实施例6
含分离物FrIII的抑制幽门螺杆菌的组合物
1、提取
猴菇菌菌丝体1kg，粉碎后加入10倍体积的去离子水，95℃回流提取5次，每次3～5小时，收集滤液，浓缩成浸膏45g(FrI)，备用。滤渣加入25L碱性无水乙醇(pH10)回流提取，共5次，每次3～5小时，收集滤液，经真空浓缩到0.25L。然后用6mol/L HCl酸化到pH3，置4℃冰箱中过夜，收集到12g沉淀(FrIII)，备用。
2、配制
产品配方
淀粉 64％
FrI(多糖) 15％
FrIII 8％
大豆蛋白 8％
橘粉 5％
将上述原料按比例进行干粉混合，混匀后，在60℃进行干燥3小时，过100-120目筛，装胶囊或压片，然后在65℃干热灭菌2小时，即为成品。
实施例7
含组份FrIII和甲壳低聚糖的抑制幽门螺杆菌的组合物
1、发酵
A：培养基组成
甲壳素或壳聚糖6％，玉米粉2％，葡萄糖2％，麸皮0.5％，橘粉1％，营养盐0.5％，去离子水余量。
B：原料处理
上述固体原料除营养盐外，进行干粉混合；营养盐溶于10ml去离子水，然后干粉与剩余去离子水混合；分别进行高压蒸汽消毒，121℃，30分钟。
C：发酵
将上述消毒液混合，按接种量5％，搅拌转速180r/m，培养温度30℃，通风量1∶1，发酵96小时。
D：离心收集菌丝体
4000r/m，离心20分钟，上清液保留，菌丝体用于下一步的提取步骤。
2、提取
猴菇菌菌丝体1kg，粉碎后加入10倍体积的去离子水，95℃回流提取5次，每次3～5小时，收集滤液，浓缩成浸膏0.26kg(FrI)，备用。滤渣加入20L碱性无水乙醇(pH9)回流提取，共5次，每次3～5小时，收集滤液，经真空浓缩到0.10L。然后用6mol/L HCl酸化到pH3，置4℃冰箱中过夜，收集到95g沉淀(FrIII)，备用。
FrII的制备方法：猴菇菌发酵液，经离心分离得到上清液，向上清液中加入乙醇至终浓度为60％，4℃放置8-12小时，产生多糖沉淀(FrI)；离心后得到上清液，浓缩上清液至原体积1/10，得到浓缩液。该浓缩液可以直接使用，还可进一步加入乙醇至85％-90％，4℃放置8-12小时，得到甲壳低聚糖沉淀。
3、配制
产品配方
淀粉 64％
FrI(多糖) 10％
FrII(甲壳低聚糖) 15％
FrIII 5％
大豆蛋白 6％
将上述原料按比例进行干粉混合，混匀后，在60℃进行干燥3小时，过100-120目筛，装胶囊或压片，然后在65℃干热灭菌2小时，即为成品。
实施例8
含组份FrIII和甲壳低聚糖的抑制幽门螺杆菌的组合物
1、发酵
A：培养基组成
甲壳素或壳聚糖1％，玉米粉2％，葡萄糖3％，麸皮0.5％，橘粉4％，营养盐0.8％，去离子水88.7％。
B：原料处理
上述固体原料除营养盐外，进行干粉混合；营养盐溶于10ml去离子水，然后干粉与剩余去离子水混合；分别进行高压蒸汽消毒，121℃，30分钟。
C：发酵
将上述消毒液混合，按接种量10％，搅拌转速200r/m，培养温度27℃，通风量1∶1，发酵80小时。
D：离心收集菌体
4000r/m，离心20分钟，上清液保留，菌体进入一步抽提。
2、提取
猴菇菌菌丝体100g，粉碎后加入10倍体积的去离子水，95℃回流提取5次，每次3～5小时，收集滤液，浓缩成浸膏28g(FrI)，备用。滤渣加入2L碱性无水乙醇(pH9)回流提取，共5次，每次3～5小时，收集滤液，经真空浓缩到0.01L。然后用6mol/L HCl酸化到pH3，置4℃冰箱中过夜，收集到10.1g沉淀(FrIII)，备用。
FrII的制备方法：猴菇菌发酵液，经离心分离得到上清液，向上清液中加入乙醇至终浓度为60％，4℃放置8-12小时，产生多糖沉淀；离心后得到上清液，浓缩上清液至原体积1/10，加入乙醇至85％-90％，4℃放置8-12小时，产生的沉淀即为甲壳低聚糖。
3、配制
产品配方
淀粉 60％
FrI(多糖) 15％
FrII(甲壳低聚糖) 15％
FrIII 7％
大豆蛋白 3％
将上述原料按比例进行干粉混合，混匀后，在60℃进行干燥3小时，过100-120目筛，装胶囊或压片，然后在65℃干热灭菌2小时，即为成品。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (11)
1.一种分离物，其特征在于，它具有以下性质：
经薄层层析分离时的Rf值在0.1 5-0.6之间，其中薄层层析时的展开剂是12∶4∶0.5的甲苯∶乙酸乙酯∶乙酸，显色剂是1∶1的硫酸∶甲醇；
对幽门螺杆菌有抑制作用；
并且是用以下方法制备的，所述方法包括步骤：
(a)将猴菇菌菌丝体和水的混合物在90-100℃回流提取5-100小时；
(b)过滤得到滤渣；
(c)向滤渣加入pH8-10的碱性乙醇，回流提取5-50小时；
(d)过滤得到滤液；
(e)浓缩滤液；
(f)用酸酸化滤液至pH为2-4；
(g)放置5-100小时，过滤获得沉淀。
2.如权利要求1所述的分离物，其特征在于，在所述方法的步骤(c)中，碱性乙醇的体积为滤渣的5-20倍；在步骤(c)中回流条件是回流提取3-8次，每次2-6小时；步骤(f)中，用2-8mol/L盐酸酸化至pH2.5-3.5；并且在步骤(g)之后，还包括步骤(h)：对沉淀进行硅胶柱层析，从而获得对幽门螺杆菌有抑制作用的分离物。
3.如权利要求1所述的分离物，其特征在于，所述的分离物选自下组物质：
(1)经硅胶柱层析分离得到的四环三萜酸FrIII-3，Rf值为
0.50±0.05；
(2)FrIII-4和5，Rf值为0.4±0.05和0.45±0.05
(3)FrIII-6和7，Rf值分别为0.30±0.05，0.20±0.05；
或它们的混合物。
4.如权利要求3所述的分离物，其特征在于，所述的分离物含有经硅胶柱层析分离得到的四环三萜酸FrIII-3，其分子式为C34H52O7。
5.如权利要求4所述的分离物，其特征在于，四环三萜酸的结构式为：
6.一种组合物，其特征在于，含有权利要求1～5中任一所述的分离物和药学上可接受的载体。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，还含有选自下组的组份：
(a)分子量小于10000道尔顿的甲壳低聚糖；
(b)橘粉；或其混合物。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述的甲壳低聚糖是猴菇菌培养物中分离出的。
9.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述的组合物是胶囊形式。
10.一种制备权利要求1所述的分离物的方法，其特征在于，它包括步骤：
(a)将猴菇菌菌丝体和水的混合物在90-100℃回流提取5-100小时；
(b)过滤得到滤渣；
(c)向滤渣加入pH8-10的碱性乙醇，回流提取5-50小时；
(d)过滤得到滤液；
(e)浓缩滤液；
(f)用酸酸化滤液至pH为2-4；
(g)放置5-100小时，过滤获得沉淀。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(c)中，碱性乙醇的体积为滤渣的5-20倍；在步骤(c)中回流条件是回流提取3-8次，每次2-6小时；步骤(f)中，用2-8mol/L盐酸酸化至pH2.5-3.5；并且在步骤(g)之后，还包括步骤(h)：对沉淀进行硅胶柱层析，从而获得对幽门螺杆菌有抑制作用的分离物。
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| CNB021109524A CN1325065C (zh) | 2002-03-06 | 2002-03-06 | 改善肠胃的组合物 |
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