KR20090131316A - 아우레오바시디움 풀루란스 ｉｍｓ-822 ｋｃｔｃ11179ｂｐ, 신균주가 생산하는 세포외 분비형 베타-글루칸및 이의 용도 - Google Patents

아우레오바시디움 풀루란스 ｉｍｓ-822 ｋｃｔｃ11179ｂｐ, 신균주가 생산하는 세포외 분비형 베타-글루칸및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 베타-글루칸 (β-glucan)을 생산하는 신균주 아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans) IMS-822 KCTC11179BP 및 본 균주가 생산하는 세포외 분비형 베타-글루칸을 생산하는 방법에 관한 것으로, 베타-글루칸을 생산하는 새로운 균주 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 KCTC 11179BP이 제공된다. 또한, 본 발명의 균주를 배양하여 그 배양액과 균체로부터 분자량 8.9 x 105의 세포외 분비형 베타-글루칸을 생산하는 방법이 제공된다. 본 발명에 의해 생산되는 베타-글루칸은 세포외로 분비되는 형태의 베타-글루칸으로서 물에 대한 용해성이 우수하고 정제하기에 편리하여 대량생산이 용이하며, 따라서 의약품, 건강보조식품 및 화장품 원료 등을 포함하는 다양한 용도로 이용 가능하다.
아우레오바시디움 풀루란스, 베타-글루칸, 생고분자 물질, 면역활성 증진제

Description

아우레오바시디움 풀루란스 ＩＭＳ-822 ＫＣＴＣ 11179ＢＰ, 신균주가 생산하는 세포외 분비형 베타-글루칸 및 이의 용도{Aureobasidium pullulans IMS-822 KCTC 11179BP, exo-type β-glucan and uses of the same}
본 발명은 세포외 분비형 베타-글루칸을 생산하는 아우레오바시디움 플루란스 신균주, 이 신균주가 생산하는 베타-글루칸 및 이 베타-글루칸의 용도에 관한 것이다.
베타-글루칸(β-glucan)은 최근 그 우수한 생체 조절 기능성, 예를 들면, 지질대사 개선작용, 정장작용, 혈당치 상승 억제 효과, 항종양 효과, 면역 증강 효과 등이 밝혀짐에 따라 그 용도 측면에서 주목되고 있는 소재이다. 베타-글루칸은 미생물류, 담자균류, 식물의 세포벽에 주로 포함되어 있으며, 이러한 생물체의 골격인 세포벽을 구성하는 성분으로서 존재하고 있다. 베타-글루칸의 구조는 β－1－2, 1－3, 1－4, 1－6－D－글루코피라노스(glucopyranose) 결합이 적어도 2종류 이상을 갖는 글루코오스의 중합체를 주성분으로 한다. 동물의 면역계에 대한 활성 증진력을 갖는 베타-글루칸은 여러 가지 종류의 식용버섯, 효모, 보리, 귀리 등에 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 특히 담자균(버섯)의 자실체나 균사체에 함유되어 있 는 베타-글루칸은 면역 증강 활성이 높고, 표고버섯 자실체로부터 추출되는 렌티난(lentinan)과 같은 폴리머는 의약품으로서 이용되고 있는 것도 있다. 그러나, 일반적으로 담자균(버섯)의 자실체나 균사체에 함유되어 있는 베타-글루칸은 그 생육·재배 조건에 따라 포함되는 베타-글루칸의 함량이나 분자량 등이 크게 차이가 있어 추출 결과로서 얻어지는 베타-글루칸의 경우 고분자체와 저분자체가 혼재하는 등 품질이 일정하지 않아 실용화하기 어려운 단점이 있다. 한편, 미생물 균체의 세포벽은 다량의 베타-글루칸을 포함하고 있으며, 베타-글루칸의 공급원으로서 중요한 의미가 있으며, 효모 균체, 유산균 균체, 아우레오바시디움 균체 등은 안전성이 우수하여 식품 소재로서 이용가치가 높은 것으로 알려져 있다.
그러나, 이러한 미생물 균체의 세포벽에 함유되어 있는 베타-글루칸의 경우 다양한 불순물도 포함하고 있어 분리, 정제에 어려움이 따르며, 또한 물에 불용성이기 때문에 다양한 용도로의 이용에 많은 제한이 있다.
이에 비하여, 균체 밖에 면역 증강 활성이 높은 수용성 베타-글루칸을 분비 생산하는 미생물을 이용한 베타-글루칸의 발효 생산은 균일하며 수용성인 고활성의 베타-글루칸을 얻을 수 있으므로 매우 유효한 방법이다. 이러한 생각에 기초하여, 고활성의 베타-글루칸을 균체 밖에 분비 생산하는 것이 알려져 있는 미생물을 사용한 베타-글루칸의 제조방법이 제안되어 왔다. 현재까지 베타-글루칸을 생산하는 미생물로서는 애그로박테리움 속 (Agrobacterium sp.)이나 매크로포모프시스 속 (Macrophomopsis sp.), 알칼리게네스 속 (Alcaligenes sp.)이 생산하는 커드란 (curdlan)(식물섬유의 과학, p108, 아사쿠라 쇼텐 (Asakura Shoten), 1997년), 아 우레오바시디움 풀루란스 (Agaric. Biol. Chem. 47(6), 1167-1172(1983) 등이 밝혀졌다.
미생물이 생산하는 고분자 물질은 이제까지 다양한 구조와 성질을 갖는 것이 밝혀져 왔고, 그 중에는 식물성 고분자에서 볼 수 없는 독특한 성질의 생리활성과 비교할 만한 물성적 특성을 갖는 것들이 있다. 미생물 유래 베타-글루칸은 면역증강을 통한 다양한 암에 대한 항암활성 (Wagner 등, 1988), 항세균성 및 항바이러스 활성 (Bohn & BeMiller, 1995)이 우수하다. 또한, 상처 치료효과와 피부재생 효과(Jamas 등, 1991)가 탁월해 항염증 및 피부의 노화방지 효과가 확인되었으며, 이밖에 혈압강하작용 (Chang & Miles, 1991), 혈당강하작용 (Chang & Miles, 1987) 등의 다양한 약리학적 효능이 발표되어 의약품 산업 및 건강보조식품, 화장품 산업 등에의 응용이 기대되고 있다. 또한, 이들 베타-글루칸은 점성, 젤 형성능, 열 안정성, pH 안정성 및 유화 활성 (Hamada, 1987) 등이 뛰어나 식품, 화장품 및 다양한 공업 용도로서 주목받고 있다.
따라서 베타-글루칸의 생산수율이 우수하고 정제하기에 간편한 세포외 분비형(exo-type) 베타-글루칸을 생성하는 신균주를 발굴하는 것이 필요하다.
이에 본 발명의 목적은 자연계로부터 베타-글루칸의 생산수율이 우수하고, 정제하기에 간편한 세포외 분비형의 베타-글루칸을 생산하는 새로운 균주를 제공하려는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 신균주로부터 면역증강 활성이 우수한 세포외 분비형 베타-글루칸을 효과적으로 생산하는 방법을 제공하려는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 얻어진 세포외 분비형 베타-글루칸을 포함하는 면역증강 조성물, 건강보조식품 및 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
이에 본 발명자들은 다년간의 연구를 통하여 세포외 분비형 베타-글루칸을 생산하는 신균주를 탐색하고 이를 배양하여 신균주 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822를 발명하였다. 새로운 균주인 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822는 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC, Korean Collection for Type Cultures)에 2007년 8월 22일자로 기탁하여 기탁번호:KCTC 11179BP를 부여받음으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 새로운 균주 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 KCTC 11179BP가 생산하는 베타-글루칸은 세포 외로 분비되는 형태의 베타-글루칸으로서, 물에 대한 용해성이 우수하고 정제하기에 편리하여 대량생산이 용이하다. 따라서, 의약품, 건 강보조식품 및 화장품 조성물 등 다양한 용도로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 베타-글루칸을 생산하는 새로운 균주 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 KCTC11179BP을 제공한다.
본 발명은 상기 신균주를 배양하여 그 배양액 및/또는 균체로부터 분자량 8.9 x 105 달톤의 세포외 분비형 베타-글루칸을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 방법으로 얻어진 신균주 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 KCTC11179BP가 생산하는 베타-글루칸을 함유하여 수지상 세포의 분화 유도 및 면역 세포를 활성화시키는 면역활성증강 효과를 나타냄을 특징으로 하는 면역증강 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 방법으로 얻어진 신균주 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 KCTC11179BP가 생산하는 베타-글루칸을 포함함을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 방법으로 얻어진 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 KCTC11179BP가 생산하는 베타-글루칸을 포함함을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물을 제공한다. 화장료 등 피부 외용제 조성물에 포함된 베타-글루칸은 피부세포의 면역력을 증강시킴으로써 알러지를 완화하는 등의 효과를 나타낼 수 있다.
이하, 본 발명에 대하여 좀더 자세하게 설명한다.
본 발명자들은 베타-글루칸의 생산수율이 우수하고 정제하기에 간편한 세포외 분비형 베타-글루칸을 생성하는 균주를 순수분리하였고, 균주의 형태학적, 생리학적 및 배양학적 특성을 조사하여 본 균주를 동정하였다. 또한, 생산수율을 극대화하기 위하여 대량배양 조건 및 간편한 분리ㆍ정제방법을 확립하였다. 본 발명의 신균주 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 KCTC11179BP(2007.8.22. 기탁)로부터 생산되는 베타-글루칸은 면역활성 증강효과가 우수하여 이를 면역증강 조성물, 건강보조식품 또는 화장료 조성물 등에 매우 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명자들은 상기 조건들을 만족시키는 균주를 탐색하기 위하여 토양으로부터 균주 분리를 실시하여, 베타-글루칸의 생산수율이 우수하고 정제하기에 간편한 세포외 분비형 베타-글루칸을 생성하는 균주를 분리하고, 균주의 형태적, 생리학적 및 배양학적 특성을 조사하여 이 균주가 아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans) 균주임을 확인하였으며, 본 발명에 따라 분리된 신균주를 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 (Aureobasidium pullulans IMS-822)로 명명하고 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC, Korean Collection for Type Cultures)에 2007년 8월 22일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC 11179BP).
이러한 본 발명의 균주는 하기 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이, 세포외 분비형 베타-글루칸을 생산하며, 그 배양 조건은 서당 1.0~5.0중량%, 질산나트륨 0.01~0.05중량%, 제이인산칼륨 0.1~1.0중량%, 염화칼륨 0.05~0.50중량%, 황산마그네슘 0.02~0.2중량%, 황산제일철 0.001~0.01중량%을 포함하여 제조된 액체 배지에 서 잘 자라는 것으로 확인되었다.
본 발명의 균주 배양의 일례로서, 상기 액체 배지를 발효조에 넣고 121℃이상에서 30~60분간 가압 습윤 살균한 다음, 살균된 상기 액체 배지를 30℃로 냉각하고 상기 균주를 접종한 후, 30℃의 배양온도, 0.5~1.0 vvm의 에어 공급 및 150~300 rpm 교반 속도로 발효조에서 배양된다.
상기 균주 배양 후 그 배양물로부터 베타-글루칸의 정제는 일반적인 원심분리법 및 동결건조를 통하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 베타-글루칸의 정제는 상기 균주 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 후, 균체가 제거된 상등액에 에탄올을 가하여 베타-글루칸을 침전시켜 분자량 8.9 x 105 달톤의 베타-글루칸을 회수한 다음 동결건조함으로써 분말 상태의 베타-글루칸을 획득할 수 있다.
상기 방법으로 얻어진 베타-글루칸은 면역증강 조성물, 건강보조식품 및 화장료 조성물로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
또한 본 발명은 상기와 같이 얻어진 베타-글루칸을 유효성분으로 함유하고, 면역증강에 효과적인 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 베타-글루칸을 0.01 ~ 99.9% 함유하는 것이 바람직하고, 0.1 ~ 90% 함유하는 것이 더욱 바람직하다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태, 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.
본 발명의 베타-글루칸을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적 으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 베타-글루칸을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 베타-글루칸을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제한다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propyleneglycol), 폴리에틸렌 글리 콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 베타-글루칸을 포함한 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 베타-글루칸은 1일 0.01㎎/㎏ ~ 10g/㎏, 바람직하게는 1㎎/㎏ ~ 1g/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 면역 증강 효과를 나타내는 베타-글루칸을 포함하는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 베타-글루칸을 포함하는 조성물은 면역 증강을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 베타-글루칸물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 베타-글루칸 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으 로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
본 발명의 상기 베타-글루칸은 면역 증강을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 베타-글루칸의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물인 경우 전체 식품 중량의 0.01 ~ 15중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물인 경우 100㎖를 기준으로 0.02 ~ 10g, 바람직하게는 0.3 ~ 1g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 베타-글루칸을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 탄수화물은 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 이당, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 다당, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 포함한다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파탐 등)를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 ~ 20g, 바람직하게는 약 5 ~ 12g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 또는 천연 풍미제와 같은 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유 할 수 있다. 기타 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위하여 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 각각 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지는 않으나, 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0~20 중량부 범위에서 선택하는 것이 일반적이다.
본 발명은 또한, 상기 베타-글루칸을 함유하는 화장료 조성물을 비롯한 피부 외용제 조성물을 제공한다. 본 발명의 피부 외용제 조성물을 유효성분으로 하는 도포제는 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있다. 일례로서 크림형 도포제를 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 베타-글루칸을 함유하고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 필요에 따라 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 베타-글루칸은 화장료로서 이용할 수 있는데, pH 조절제, 향료, 유화제, 방부제 등을 필요에 따라 부가하여 통상의 화장료 제조 방법으로 화장수, 젤, 수용성 파우더, 지용성 파우더, 수용성 리퀴드, 크림 또는 에센스 등으로 제형화할 수 있다.
본 발명의 베타-글루칸이 면역증강 조성물로 사용되는 경우, 수지상 세포의 분화 유도 및 면역세포를 활성화하는 작용을 함으로써 면역증강 효과를 나타낼 수 있다. 이와 같은 면역증강 조성물에 첨가되어 사용되는 경우, 상기 베타-글루칸은 다량 함유될수록 효과가 우수하며, 최소 10㎍/㎖의 양으로 함유되는 것이 바람직하 다. 만일, 본 발명의 베타-글루칸 함량이 10㎍/㎖ 미만으로 함유되는 경우 면역증강 효과를 기대하기 어렵다. 좀더 바람직하게는 상기 베타-글루칸은 10 ~ 1,000㎍/㎖의 양으로 면역증강 조성물에 함유된다. 베타-글루칸 함량이 1,000㎍/㎖를 초과하면 베타-글루칸 증량에 따른 면역증강 효과 증대가 미미하여 비경제적이다.
또한, 상기 베타-글루칸이 건강보조식품 또는 화장료 조성물에 사용되는 경우 상기한 바와 같은 면역활성증강 효과를 나타내어 매우 유용하게 이용될 수 있으며, 그 첨가량은 대상에 따라 달라질 수 있으며 이에 한정하지 않는다.
상기 베타-글루칸이 건강보조식품에 포함되어 사용되는 경우, 총 중량에 대하여 0.01 ~ 2중량%로 첨가되며, 화장료 조성물에 포함되어 사용되는 경우에는 총 중량에 대하여 0.001 ~ 2중량%로 첨가되는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성을 좀더 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래 실시예의 기재 범위 내로 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
< 실시예 1> 베타- 글루칸 생산 균주 분리 및 보존
본 발명자들은 전국의 토양시료를 채취하여 멸균된 생리 식염수에 넣고 진탕한 후 시료액의 상등액을 취하여 희석하고, 그 희석액을 서당 1.0∼5.0 중량%, 질산나트륨 0.01∼0.05 중량%, 제이인산칼륨 0.1∼1.0 중량%, 염화칼륨 0.05∼0.50 중량%, 황산마그네슘 0.02∼0.2 중량%, 황산제일철 0.001∼0.01 중량%(pH 7.0)를 함유한 한천 배지 상에서 24∼72시간 배양하여 점액성 물질을 생산하는 단일 콜로니 (single colony)의 분리 미생물 약 60 여종을 얻었다. 순수분리된 미생물들을 상기 액체 배지에서 30℃로 48∼72시간 배양한 후 12,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 균체를 제거하였다. 균체를 제거한 상등액에 3배 부피의 에탄올을 첨가하여 폴리머를 침전시켰으며, 침전된 폴리머가 베타-글루칸인지의 여부는 콩고레드 다이 결합 분석법 (congo-red binding assay)을 이용하여 확인하였으며, 베타-글루칸의 생산량이 최대인 종을 선별하여 IMS-822로 명명하였다.
< 실시예 2> 분리 균주 동정 및 확인
분리한 균주 IMS-822의 동정을 위하여 배양학적 및 생리학적 특성을 확인하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이 배양학적 특성의 경우 탄소원으로서는 글루코오스(glucose), 수크로오스(sucrose) 및 말토오스((maltose)만을 사용할 수 있었다.
D-Glucose + Melezitose D - DL-Lactate - w/o biotin -
D-Galactose - Inulin - Succinate - w/o Thiamin -
L-Sorbose - Starch D - Citrate - w/o Biotin & Thiamin -
D-Glucosamine - Glycerol + Methanol - w/o pyridoxine -
D-Ribose - Erythritol - Ethanol - w/o pyridoxine & Thiamin -
D-Xylose - Riboitol - Propane 1,2 diol - w/o Niacin -
L-Arabinose - Xylitol - Butane 2,3 diol - w/o PABA -
D-Arabinose - L-Arabinitol - Nitrate + at 25℃ +
L-Rhamnose - D-Glucitol - Nitrite + at 30℃ +
Sucrose + D-Mannitol - Ethylamine - at 35℃ -
Maltose + galactitol - L-Lysine + at 37℃ -
α,α-Trehalose D - myo-Inositol - Cadaverine - at 40℃ -
Me α-D-glucoside - D-Glucono-1,5-lactone - Creatine - 0.01% Cycloheximide -
Cellobiose - 2-Keto-D-gluconate - Creatinine - 0.1% Cycloheximide -
Salicin - 5-Keto-D-gluconate - Glucosamine + 1% Acetic acid +
Arbutin - 5-Keto-D-gluconate - Imidazole - 50% D-Glucose -
Melibiose - D-Gluconate - w/o vitamins + 60% D-Glucose -
Lactose - D-Glucuronate - w/o myo-Inositol +
Raffinose - D-Galacturonate - w/o Pantothenate +
선별한 균주의 계통분류학적인 위치를 확인하기 위하여 18S 리보솜 RNA 유전자의 내부 전사 스페이서(internal transcribed spacer) 1, 5.8S 리보솜 RNA 유전자 그리고 내부 전사 스페이서 2를 포함하는 500 bp의 염기서열을 분석하였다. 선별한 균주로부터 18S rDNA 분절 5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3' 을 프라이머(primer) 세트로 중합효소 연쇄반응(PCR)하여 증폭시킨 후, 증폭 산물을 정제한 다음 자동염기서열 분석 장치(Applied Biosystems model 373A automatic sequencer)와 키트(BigDye Terminator Cycle Sequencing kit, Perkin-Elmer Applied Biosystems)를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 선별한 균주의 18S rDNA는 유전자은행의 블라스트 프로그램를 이용하여 상동성을 분석하였다. 그 결과, 선별된 균주는 표준 균주인 아우레오바시디움 플루란스 UWFP 769와 100%의 상동성을 나타냄으로써 본 발명의 균주는 아우레오바시디움(Aureobasidium) 균주인 것으로 최종 확인되었다. 이에 본 발명자들은 분리된 신균주 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 (Aureobasidium pullulans IMS-822)를 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC, Korean Collection for Type Cultures)에 2007년 8월 22일자로 기탁하였다(기탁번호:KCTC 11179BP).
< 실시예 3> 베타- 글루칸 확인을 위한 FT - IR 분석
본 발명에서 분리한 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822가 생산하는 점액성 다당류가 베타-글루칸인지의 여부를 확인하기 위하여, FT-IR(Fourier Transform InfraRed) 분석을 시도하였다. 분석을 위한 시료의 준비는 다음과 같다.
단계 1) 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 를 실시예 1의 배양액에서 30℃로 72시간 배양한 후 12,000rpm으로 30분간 원심분리하여 균체를 제거하였다.
단계 2) 균체를 제거한 상등액의 3배에 달하는 에틸알콜을 첨가하여 생물고분자인 다당류를 침전시킨 후 12,000rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 고분자인 다당류를 회수하였다.
단계 3) 회수된 다당류를 적당량의 증류수에 녹인 다음, KBr-disk 방법을 이용하여 스펙트럼을 측정하였다.
측정 결과, D-글루칸의 β-배열을 나타내는 890 ㎝-1 부근에서 흡수파장을 나타내었으며, 3300 ㎝-1 부근으로 이동(shift)된 완만한 -OH 스트레칭(stretching)은 분자 간에 강한 수소결합을 하고 있는 것으로 확인할 수 있었다(도 2).
< 실시예 4> 베타- 글루칸 확인을 위한 13 C- NMR 분석
아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822가 생산하는 베타-글루칸의 구조분석을 위하여 D2O에 50㎎/㎖ 용해한 후 5㎜ NMR 튜브에 700㎕를 주입한다. 시료의 거품을 제거하기 위하여 초음파 분쇄한 다음, NMR 흡광분석기(Varian 400 MHz)로 25℃에서 분석하였으며, 그 결과는 아래의 도 3과 같다. 도 3에서 나타난 것과 같이 104ppm 지역의 피크는 β-배열(configuration)의 C-1을, 84ppm 지역의 피크는 O-치환(substituted) C-3로서 β-1,3-글리코시딕 결합을 나타내며, 69ppm지역의 피크는 O-치환 C-6으로 β-1,6-글리코시딕 결합을 나타내었다.
이러한 결과로 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822가 생산하는 베타-글루칸은 β-1,3 결합이 주결합으로 구성되어 있으며, 분지로 β-1,6 결합을 갖는 β-(1,3)-(1,6)-글루칸임을 확인할 수 있었다.
< 실시예 5> 아우레오바시디움 풀루란스 IMS -822가 생산하는 베타- 글루칸 의 분자량
아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822가 생산하는 베타-글루칸의 점도평균분자량 분석을 위하여 우벨로드 타입(Ubbelohde type)의 모세관 점도계(capillary viscometer)를 이용하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려진 시험 방식으로 30±1℃에서 고유점도를 측정하였다. CMC(Carboxylmethyl cellulose)를 표준물질로 사용하고, 허긴스 방정식(Huggin's equation)과 마크-호윙크 방정식(Mark-Houwink equation)을 이용하여 측정한 베타-글루칸의 점도평균분자량은 약 8.9 x 105인 것으로 확인되었다(도 4).
< 실시예 6> 베타- 글루칸의 물성 실험
고분자의 (1→3)-(1→6)-β-D-글루칸이 수용액 상태에서 나선형의 구조를 가지고 있으며 강한 알칼리 조건하에서 분자간 및 분자 내의 수소결합이 절단되어 나선형 구조의 변성(denaturation)을 유도하는 것으로 알려져 있으므로, 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822가 생산하는 베타-글루칸의 입체구조를 파악하기 위하여 0~1.0M NaOH 수용액에 베타-글루칸의 농도를 0.5%로 조정하여 우벨로드 타입(Ubbelohde type)의 모세관 점도계(capillary viscometer)를 이용하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려진 시험 방식으로 30±1℃에서 점도를 측정하였다.
도 5에서 나타난 바와 같이 NaOH의 농도가 0에서 0.2M로 증가함에 따라 베타-글루칸 수용액의 특이 점성도(specific viscosity)가 급격하게 감소하는 것으로 보아 나선형 구조의 변성이 진행되는 것으로 생각된다. 이러한 특이 점성도 변화는 NaOH의 첨가가 베타-글루칸 분자간 및 분자 내에 존재하는 수소결합을 절단하는 것을 나타내며, 0.2M의 NaOH 농도에서 수소결합의 대부분이 절단되는 것을 의미한다.
고분자의 (1→3)-(1→6)-β-D-글루칸이 알카리 수용액 상태에서 콩고 레드 염색시약과 결합하여 최대흡수파장(λmax)을 이동시키는 것으로 알려져 있으므로, 0~1.0M NaOH 수용액 (베타-글루칸의 농도, 0.5%)에 24.0μM의 콩고 레드를 첨가하여 30분간 반응시킨 후 400~700㎚의 범위에서 최대흡수파장을 조사한 결과는 도 6과 같다. 도 6에서 나타난 바와 같이 콩고 레드의 최대흡수파장은 NaOH의 농도에 따라서 다르게 나타났는데, 0~0.4M NaOH 농도범위에서, NaOH의 농도가 증가함에 따라 최대흡수파장은 장파장으로 이동하여 498㎚에서 515㎚까지 이동하였다. 최대흡수파장은 0.4M NaOH 농도에서 점차로 감소하여 506㎚ 부근에서 안정화되는 것으로 보이는데, 이는 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822가 생산하는 베타-글루칸이 매우 규칙적인 구조(highly ordered conformation)를 가지고 있으며 강알칼리 조건하에서도 안정된 상태를 유지하고 있다는 것을 의미한다.
< 실시예 7> 베타- 글루칸의 면역활성 측정
아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822가 생산하는 베타-글루칸이 생체 내에 존재하는 면역세포들 가운데 면역조절기능의 중추적인 역할을 담당하고 있는 수지상 세포의 분화와 활성에 미치는 영향을 분석하였다(도 7). 수지상세포는 적혈구 농축액을 혈액은행으로부터 공급받아 적혈구 용해완충액을 처리하여 적혈구를 제거하고 단핵구 분리 키트(monocyte isolation kits)를 사용하여 단핵구(monocyte)를 분리하여 실험을 수행하였다. 수지상세포를 GM-CSF(1,000 U/㎖)와 IL-4(1,000 U/㎖)가 포함된 배지(10% FBS, RPM1640)로 6웰 마이크로플레이트에서 배양하였다. 배양 4일 후에 1㎖의 배지와 동량의 GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)와 IL-4를 첨가하고, 배양 6일째 베타-글루칸을 처리한 다음, 37℃ CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하여 수지상 세포의 분화능을 분석하였다. 도 7과 같이 베타-글루칸이 존재하는 상태에서 면역 기능을 담당하는 수지상 세포의 분화가 활발히 진행됨을 알 수 있었고, 이러한 결과를 토대로 베타-글루칸이 수지상 세포의 분화를 유도하여 생체 내에서 면역 기능을 강화시킴을 알 수 있다.
도 1은 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 KCTC11179BP를 나타낸 사진이고,
도 2는 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 KCTC11179BP가 생산하는 베타-글루칸의 적외선 스펙트럼을 나타낸 그림이고,
도 3은 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 KCTC11179BP가 생산하는 베타-글루칸의 13C-NMR 분석 결과를 나타낸 그림이고,
도 4는 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 KCTC11179BP가 생산하는 베타-글루칸의 점도 평균 분자량을 나타낸 그림이고,
도 5는 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 KCTC11179BP가 생산하는 베타-글루칸의 수산화나트륨 첨가에 따른 점도의 변화를 나타낸 그림이고,
도 6은 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 KCTC11179BP가 생산하는 베타-글루칸이 콩고 레드 염색시약과 결합하여 콩고 레드 염색시약의 최대흡수파장 (λmax)의 변화를 나타낸 그림이고,
도 7은 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 KCTC11179BP가 생산하는 베타-글루칸이 수지상 세포의 분화에 미치는 영향을 나타낸 그림이다. GM-CSF: Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Aureobasidium pullulans IMS-822 KCTC 11179BP, exo-type b-glucan and uses of the same <130> MSKIM-IMS822 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 500 <212> RNA <213> Aureobasidium pullulans <400> 1 ccuccaaccc uuuguuguua aaacuaccuu guugcuuugg cgggaccgcu cggucucgag 60 ccgcugggga uucgucccag gcgagcgccc gccagaguua aaccaaacuc uuguuauuua 120 accggucguc ugaguuaaaa uuuugaauaa aucaaaacuu ucaacaacgg aucucuuggu 180 ucucgcaucg augaagaacg cagcgaaaug cgauaaguaa ugugaauugc agaauucagu 240 gaaucaucga aucuuugaac gcacauugcg ccccuuggua uuccgagggg caugccuguu 300 cgagcgucau uacaccacuc aagcuaugcu ugguauuggg ugccguccuu aguugggcgc 360 gccuuaaaga ccucggcgag gccucaccgg cuuuaggcgu aguagaauuu auucgaacgu 420 cugucaaagg agaggacuuc ugccgacuga aaccuuuauu uuucuagguu gaccucggau 480 cagguaggga uacccgcuga 500 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Aureobasidium pullulans <400> 2 tccgtaggtg aacctgcgg 19

Claims (9)

  1. 베타-글루칸을 생산하는 신균주 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 KCTC 11179BP
  2. 베타-글루칸을 생산하는 신균주 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 KCTC 11179BP를 배양하여 그 배양액 또는 균체로부터 점도 평균분자량 8.9 x 105의 세포외 분비형 베타-글루칸을 생산하는 방법.
  3. 신균주 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 KCTC 11179BP가 생산하는 세포외 분비형 베타-글루칸을 함유하며, 면역 세포를 활성화시켜 면역활성증강 효과를 나타냄을 특징으로 하는 면역증강용 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 베타-글루칸을 10~1,000㎍/㎖의 양으로 포함함을 특징으로 하는 면역증강용 약학 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 베타-글루칸은 점도평균분자량 8.9 x 105인 것을 특징으로 하는 면역증강용 약학 조성물.
  6. 베타-글루칸을 생산하는 신균주 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 KCTC 11179BP가 생산하는 세포외 분비형 베타-글루칸을 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 베타-글루칸은 점도평균분자량 약 8.9 x 105인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
  8. 베타-글루칸을 생산하는 신균주 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 KCTC 11179BP가 생산하는 세포외 분비형 베타-글루칸을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 베타-글루칸은 점도평균분자량 약 8.9 x 105인 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
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