KR20060044829A - β-1,3-1,6-Ｄ-글루칸 및 그 용도 - Google Patents

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KR20060044829A
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세이지 나카무라
사토시 나카야마
고우지 니시가와
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다이소 가부시키가이샤
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Abstract

(과제) 유용한 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액의 제공
(해결수단) β-1,3-1,6-D-글루칸의 수용액이고, 그 수용액의 1H NMR 스펙트럼이 4.7ppm 과 4.5ppm 의 2개의 시그널을 갖고, 그 수용액의 30℃, pH 5.0, 농도 0.5% (w/v) 에 있어서의 점도가 50cP (mPaㆍs) 이하인 것을 특징으로 하는 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액.

Description

β-1,3-1,6-Ｄ-글루칸 및 그 용도{β-1,3-1,6-D-GLUCAN AND ITS USE}
도 1 은 2차원 NMR (13C-lH COSY NMR) 스펙트럼을 나타낸다.
도 2 는 초음파 조사 후의 입도 분포 (메디안 직경 0.23㎛) 을 나타낸다.
도 3 은 용해도와 pH 의 관계 (다당 농도 0.2%, 25℃ 의 경우) 를 나타낸다.
도 4 는 용해도와 온도의 관계 (다당 농도 0.2%, pH 4 의 경우) 를 나타낸다.
[특허문헌 1] 일본 공개특허공보 소61-146192호
[특허문헌 2] 일본 공개특허공보 소62-201901호
[특허문헌 3] 일본 공개특허공보 평7-51082호
[특허문헌 4] 일본 공개특허공보 평6-340701호
[특허문헌 5] 일본 공개특허공보 2002-204687호
[특허문헌 6] 일본 공개특허공보 평5-308987호
[특허문헌 7] 일본 공개특허공보 평9-322795호
[특허문헌 8] 일본 공개특허공보 평10-276740호
[특허문헌 9] 국제공개 제02/087603호 팜플렛
[비특허문헌 1] Fragrance Journal, 5, 71-75 (1995)
[비특허문헌 2] 닛케이바이오, No.2, pp.91-94 (2003)
[비특허문헌 3] Agric. Biol. Chem., 47, 1167-1172 (1983)
[비특허문헌 4] 과학과 공업, 64, 131-135 (1990)
본 발명은 미생물, 특히 오레오바시디움속 (Aureobasidium sp.) 에 속하는 미생물이 균체 외에 생산하는 β-글루칸, 특히 β-1,3-1,6-D-글루칸을 주성분으로 하는 배양액에서 얻어지는, 청량음료수나 건강식품 소재, 식품용 증점제, 또는 의약 등으로 유용한 다당류인 β-1,3-1,6-D-글루칸에 관한 것이다.
β-글루칸 (β-1,3-D-글루칸, 또는 β-1,6-D-글루칸 또는 β-1,3-1,6-D-글루칸) 은 자연계에서 생식하는 버섯 (담자균의 자실체) 에 많이 함유되는 성분으로, 그 자실체뿐만 아니라 배양균사체에도 함유되어 있는 것이 최근 밝혀지고 있다. 또 β-글루칸에는 면역 부활 활성, 항종양 활성이 있는 것이 알려져 있다. 예를 들어 치마버섯, 운지버섯 및 표고버섯에서 추출된 β-글루칸이 항암제 등의 의약품으로서 판매되고 있다 (비특허문헌 1, 2 참조).
한편, 불완전균인 오레오바시디움속 (Aureobasidium sp.) 에 속하는 미생물도 β-글루칸을 균체 외에 생산하는 것이 알려져 있다.
이 미생물이 β-1,3-1,6-D-글루칸과 프락토올리고당을 동시에 생산하는 것 (특허문헌 1 참조) 이나 β-글루칸과 함께 풀루란을 생산하는 것 (특허문헌 2 참조) 이 보고되어 있다.
오레오바시디움속 (Aureobasidium sp.) K-1 주가 수크로스를 탄소원으로 하는 배지 중에 β-1,3-1,6-D-글루칸을 균체 외에 분비생산 (비특허문헌 3 및 4 참조) 하고, 그 구조는 β-1,3-D-글루칸을 주쇄로 하는 구조에 D-글루코스가 측쇄로서 β-1,6-결합으로 결합되어 있는 것, 그리고 그 일부 측쇄의 글루코스 잔기가 술포아세트산기 (HO3SCH2COOH) 로 치환되어 있는 것, 또 이 다당의 분자량은 겔 여과법 (GPC) 에 의해 200만인 것으로 추정되고 있다 (비특허문헌 3, 4, 특허문헌 3 참조).
오레오바시디움속 (Aureobasidium sp.) 에 속하는 미생물에서 생산되는 β-1,3-1,6-D-글루칸도 면역 부활 활동을 갖고 있는 것, 그리고 그 물질이 기능성 식품 (장내 비피더스균의 증식, 변비 방지, 면역 증강) 이나 정장제 등에 이용할 수 있는 것으로 보고되어 있다 (특허문헌 2, 4, 5 참조).
일반적으로 β-글루칸 수용액은 β-글루칸이 1중 나선이나 3중 나선 구조를 갖기 때문에 겔을 형성하기 쉽고, 따라서 β-글루칸의 배양액은 고점도이며, 그 정제는 매우 곤란하였다 (비특허문헌 1 참조). 예상한 바와 같이, 오레오바시디움속 (Aureobasidium sp.) 에 속하는 미생물이 생산하는 β-글루칸도 점도가 높아 그 배양액으로부터 균체와 β-글루칸을 공업적으로 분리, 회수, 정제하는 방법은 적다.
현재 보고되어 있는 방법은 다음과 같다.
1) 특허문헌 1 에서는 오레오바시디움속 (Aureobasidium sp.) FERM-P, No.4257 주의 배양액을 가열 살균한 후 여과 또는 원심 분리하여 음식물로서 이용가능한 배양액을 얻는 방법이 개시되어 있다.
2) 특허문헌 6 에서는 불용성 β-1,3-글루칸을 유기용매 존재하에서 알칼리 열처리하여 불용성인 β-1,3-글루칸을 회수하는 방법이 개시되어 있다.
3) 특허문헌 7 에서는 버섯이나 미생물 등의 균체의 현탁액에 과산화물과 수산화물을 첨가해 pH 를 10-12 로 하여, 불용성 β-글루칸을 회수 정재하는 방법이 개시되어 있다.
4) 특허문헌 8 에서는, 배양액을 열 살균 후 균체를 원심제거하고, 그 상청에 에탄올을 60%(v/v) 이상이 되도록 첨가하여 β-글루칸을 침전시키고, 계속하여 과회수, 건조시키는 β-글루칸의 정제방법이 개시되어 있다.
그러나 상기 1) 의 특허문헌 1 의 방법은, β-1,3-1,6-D-글루칸을 고농도로 함유하는 그 배양액은 상온에서 매우 점도가 높아 (수 천 cP([mPaㆍs]) 이상), 여과나 원심분리에 의해 배양액에서 균체 등의 불용성 물질을 분리하는 것은 공업적으로는 곤란하다.
상기 2), 3) 및 4) 의 특허문헌 6-8 에 기재된 방법은 버섯이나 효모 등의 주로 미생물 세포벽에 존재하는 불용성의 β-글루칸을 추출ㆍ회수하기 위한 방법이며, 이들 특허문헌 6-8 에 기재된 방법으로 얻어지는 β-D-글루칸은 매우 물에 녹기 어려워 착색 등의 점에서 식품소재, 특히 음료소재로서 사용하기에는 문제가 있었다.
그 때문에 최근에는 버섯 등에서 얻어진 불용성 β-글루칸을 뜨거운 물이나 알칼리 추출ㆍ부분 정제한 후 주로 레시틴 등의 유화제로 사용되는 일반적인 분산화제의 존재 하에서 고압 처리 (300-800kgf/㎠) 하고, 콜로이드상으로 초미립자화하는 방법도 개시되어 있다 (특허문헌 9 참조), 그러나 이 방법은 특수한 미분쇄화 처리나 유화제를 필요로 한다.
β-글루칸 수용액은 점도가 높기 때문에 저농도인 것밖에 얻을 수 없어 그에 따른 각종 문제가 있으며, 고농도 수용액의 개발이 요망되고 있었다.
또, 분상의 순수한 β-글루칸의 요망이 높아지고 있으나, 균체 제거가 곤란하고 균체, 배지, 분무 건조시키기 위한 조제, 알칼리 등을 함유하는 순도가 낮은 분체의 제조밖에 알려져 있지 않다. 또 에탄올로 수용액에서 석출시키는 제법 (특허문헌 8) 의 경우, β-글루칸 농도가 낮기 때문에 공업적 관점에서 실제적인 방법이라고는 하기 어렵다.
본 발명자들은 오레오바시디움속 (Aureobasidium sp.) 속에 속하는 미생물의 배양액으로부터 저점도의 β-글루칸의 제법을 개발하여 특허출원하고 있다 (일본 특허출원 2003-106676호). 즉, 오레오바시디움속 (Aureobasidium sp.) 에 속하는 미생물이 균체 외에 생산하는 수용성 β-1,3-1,6-글루칸을 주성분으로 하는 배양액에 상온에서 알칼리를 첨가하여 pH 를 12 이상으로 하고, 점도를 저하시켜 그 후에 산을 첨가하여 pH 를 중성역 (pH 7.5) 에서 산성역 부근 (pH 4 이하) 으로 조정하여, 불용성 균체와 β-1,3-1,6-D-글루칸 함유액을 고수율로 분리하는 것을 특 징으로 하는 저점도, 그리고 수용성 β-1,3-1,6-D-글루칸 함유 수용액의 회수정제방법을 개발하였다.
본 발명자들이 개발한 상기 방법 (일본 공개특허공보 2004-092330호) 에서 얻어진 배양액에 대하여 더 상세하게 검토한 결과, β-1,3-1,6-D-글루칸의 용해도와 pH, 온도, 분자량, 입도분포에 특징이 있는 것을 발견하고, 제법의 개량에 대해 더 연구하여 겔화, 응집 등, 액체에서의 보존안정성이나 열안정성이 개선되고, 또한 면역 부활 특성 등의 효능을 대폭 높일 가능성이 있는 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 나아가서는 고순도의 β-1,3-1,6-D-글루칸 분말을 효율적으로 제조하는 방법도 발견하였다.
본 발명이 제공하는 β-1,3-1,6-D-글루칸은 수용액으로 되어 있는 것과 미립자로 분산되어 있는 것이 동시에 존재하고 있으며, pH, 금속 이온 (Na, Ca) 강도, 온도에서 안정성이 대폭 영향을 받는다는 것을 알았다. 흥미롭게도, 본 미립자상 β-1,3-1,6-D-글루칸은 pH, 금속 이온 (Na, Ca) 강도, 온도 등 여러 가지 조건 하에서 결정되는 용해도와의 관계에 의해, 용해도 범위를 초과한 β-1,3-1,6-D-글루칸이 미립자화되는 것이 분명해졌다 (실시예 5, 6 참조). 그리고 본 미립자화 β-1,3-1,6-D-글루칸은 분자량 1만에서 50만의 가용성 글루칸에서 유래되는 것이 판명되었다.
본 미립자화 β-1,3-1,6-D-글루칸은 금속 이온이 많은 상태에서는 35℃ 이상에서 응집, 나아가서는 겔화되어 버린다. 그 때문에, 청량음료와 같이 유동성을 가진 식품으로서 사용하는 경우에는, 가열 멸균시에 예를 들어 pH 3.5, 온도 90 ℃ 에서 열처리할 때, 응집, 그리고 겔화 등의 불균일화를 초래하게 된다. 청량음료수 용도의 경우, 탁해지거나 침전물이 생기는 것은 바람직하지 않다. 이러한 문제에 대하여 금속 이온 농도를 컨트롤함으로써 이들 문제점이 대폭 개선된다는 것을 알았다.
한편, 겔화, 증점을 적극적으로 목표로 하는 용도의 경우, 그 용도의 허용 범위 내에서 반대로 금속 이온 농도를 높임으로써 겔화, 증점을 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 목적 중 하나는 열 및 보존시의 안정성이 컨트롤된 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액을 제공하는 것이다.
(과제를 해결하기 위한 수단)
본 발명은, β-1,3-1,6-D-글루칸의 수용액으로서, 1N 수산화나트륨 중수용액을 용매로 하는 그 용액의 1H NMR 스펙트럼이 4.7ppm 과 4.5ppm 인 2개의 시그널을 갖고, 그 수용액의 30℃, pH 5.0, 농도 0.5%(w/v) 에서의 점도 (BM 형 회전점도계, 12rpm) 가 50cP(mPaㆍs) 이하, 바람직하게는 40cP, 더욱 바람직하게는 30cP 이하인 것을 특징으로 하는 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 β-1,3-1,6-D-글루칸의 분자량이 1만∼50만인 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액; 일차 입자 직경이 0.05∼2.0㎛ 인 미립자 β-1,3-1,6-D-글루칸을 함유하는 상기 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액; β-1,3-1,6-D-글루칸의 β-1,3 결합/β-1,6 결합의 결합비가 0.5∼2.0 인 상기 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액; 1N 수산화나트륨 중수용액을 용매로 하는 1H NMR 스펙트럼에서의 β-1,3 결합과 β-1,6 결합의 시그널 적분비에 기초한, β-1,3 결합/β-1,6 결합의 결합비가 1.0∼1.5 인 상기 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액; β-1,3-1,6-D-글루칸이 황함유기를 갖는 상기 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액; β-1,3-1,6-D-글루칸이 오레오바시디움속 (Aureobasidium sp.) 에 속하는 미생물이 균체 외에 생산하는 β-1,3-1,6-D-글루칸인 상기 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액; 미생물이 오레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans) 인 상기 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액; 미생물이 오레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans) GM-NH-1A1 주 또는 오레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans) GM-NH-1A2 주인 상기 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액; 미생물을 함유하지 않는 상기 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액; 금속 이온 농도, 특히 Na 이온 및 Ca 이온 농도가 120㎎/100㎖ 이하인 상기 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액; 그리고 상기 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액에서 미립자 β-1,3-1,6-D-글루칸을 제거하여 얻어지는 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액에 관한 것이다.
본 발명은, 상기 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액으로부터 수용해 β-1,3-1,6-D-글루칸을 제거하여 얻어지는 미립자 β-1,3-1,6-D-글루칸; 상기 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액 및 상기 미립자 β-1,3-1,6-D-글루칸을 임의로 배합하여 얻어지는 β-1,3-1,6-D-글루칸 함유액; 그리고 상기 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액을 건조시켜 얻어지는 건조 β-1,3-1,6-D-글루칸에도 관한 것이다.
본 발명은 또한 β-1,3-1,6-D-글루칸을 함유하는 미생물 배양액에 알칼리, 또는 그 수용액을 첨가하고 pH 를 12 이상으로 하여 그 배양액을 저점도화한 후, 미생물을 함유하는 불용물을 분리 제거하고, 다시 금속 이온 농도가 120㎎/100㎖ 이하가 되도록 그 금속 이온, 특히 Na 이온 농도 및 Ca 이온을 제거하는 것을 특징으로 하는 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액의 조제방법; 그리고 상기 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액을 투석 농축하고 그 농축액에 알코올류를 첨가하여 β-1,3-1,6-D-글루칸을 석출시키고, 얻어지는 β-1,3-1,6-D-글루칸/알코올/물로 이루어지는 슬러리를 분액하여 침강 슬러리를 분무 건조시키는 것을 특징으로 하는 고순도 β-1,3-1,6-D-글루칸 분말의 조제방법; 상기 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액을 투석한 후 다시 감압 농축하고, 계속하여 농축액을 분무 건조시키는 것을 특징으로 하는 고순도 β-1,3-1,6-D-글루칸 분말의 조제방법에도 관한 것이다.
그리고 본 발명은, 본 발명에 관한 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액 또는 β-1,3-1,6-D-글루칸을 유효성분으로 하는 항악성신생물제, 특히 항악성종양제 또는 항암제, INF-γ생산제, INF-γ생산효과에 기초하여 억제 또는 치유되는 질병의 치료제, 악성신생물 전이 억제제, 앨러지성 질환 억제제, 특히 I 형 앨러지성 질환 억제제, 매크로파지 활성화제에도 관한 것이다.
또한 본 발명은 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액 또는 β-1,3-1,6-D-글루칸을 함유하는 건강식품 또는 건강증진제, 외용제, 화장품에 관한 것이다.
(발명을 실시하기 위한 형태)
본 발명에서 사용되는 미생물은, β-1,3-1,6-D-글루칸을 생산할 수 있는 미생물이라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 오레오바시디움속 (Aureobasidium sp.) 에 속하는 미생물이다.
오레오바시디움속 (Aureobasidium sp.) 에 속하는 미생물을 배양하여 β-1,3-1,6-D-글루칸 (이하 그 글루칸이라 약칭하기도 함) 을 생산시키는 방법은 여러 가지 보고되어 있다. 사용할 수 있는 탄소원으로는, 수크로스, 글루코스, 프룩토스, 전분 등의 탄수화물, 시트르산, 말산, 글루콘산, 락트산 등의 유기산, 펩톤이나 효모 추출물 등의 유기 영양원을 들 수 있다. 질소원으로는, 황산암모늄이나 질산나트륨, 질산칼륨 등의 무기 질소원을 들 수 있다. 경우에 따라서는 그 β-글루칸의 생산량을 상승시키기 위해 적절히 염화나트륨, 염화칼륨, 인산염, 마그네슘염, 칼슘염 등의 무기염, 그리고 철, 구리, 망간 등의 미량 금속염이나 비타민류를 첨가하는 것도 효과적인 방법이다.
예를 들어, 오레오바시디움속 (Aureobasidium sp.) 에 속하는 미생물을 탄소원으로 하여 수크로스를 함유하는 차펙 배지에 아스코르브산을 첨가한 배지에서 배양한 경우, 고농도의 β-1,3-1,6-D-글루칸을 생산하는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 3, 4, 특허문헌 3). 그러나, 배지는 미생물이 생육하여 β-1,3-1,6-D-글루칸을 생산하는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 필요에 따라 효모 추출물이나 펩톤 등의 유기 영양원을 첨가해도 된다.
오레오바시디움속 (Aureobasidium sp.) 에 속하는 미생물을 상기 배지에서 호기 배양하기 위한 조건으로는, 온도는 10-45℃, 바람직하게는 20-35℃ 이고, pH 는 3-7, 바람직하게는 3.5-5 이다.
효과적으로 배양 pH 를 제어하기 위해 알칼리 또는 산으로 배양액의 pH 를 제어하는 것도 좋은 방법이다. 또한 배양액의 기포 제거를 위해 적절히 기포제거제를 첨가해도 된다. 배양시간은 통상 1-10일간이 바람직하고, 통상 1-4일간 배양하면 그 β-글루칸을 생산하는 것이 가능하다. 또한 그 β-글루칸의 생산량을 측정하면서 배양시간을 결정해도 된다.
상기 조건 하 오레오바시디움속 (Aureobasidium sp.) 에 속하는 미생물을 4-6일간 통기 교반 배양하였더니, 배양액에는 β-1,3-1,6-D-글루칸을 주성분으로 하는 β-글루칸 다당이 0.1% 에서 수 %(w/v) 함유되어 있으며, 그 배양액의 점도는 BM 형 회전점도계 (도키산교사 제조) 에 의해 30℃ 에서는 수 백 cP([mPaㆍs]) 부터 수천 cP([mPaㆍs]) 의 매우 높은 점도를 갖고 있었다.
이 배양액을 상온에서 교반하면서 여기에 알칼리를 첨가하면, 급격히 점도가 저하한다. 이용할 수 있는 알칼리는 물에 가용화인 것이라면 특별히 제한은 없지만, 수산화나트륨에서는 최종 농도가 0.5%(w/v) 이상, 바람직하게는 1.25%(w/v) 이상이 되도록 첨가하여 잘 교반할 필요가 있다. 즉, pH 가 12 이상이고, 바람직하게는 13 이상이 되도록 알칼리를 첨가하여 교반하면 순간적으로 배양액의 점도가 수 cP([mPaㆍs]) 로까지 저하한다.
알칼리처리 배양액에서 균체 등의 불용성 물질을 분리하는 방법으로는, 배양액에서 균체 등의 불용성 물질을 분리할 수 있는 방법이라면 특별히 제한은 없으며, 균체가 침강할 때까지 기다려 상청을 회수하는 방법 (데칸트법), 원심분리, 여과지 또는 여과포를 이용한 전체량 여과, 필터프레스, 그리고 막여과 (MF 막 등의 한외 여과) 등으로 실시할 수 있다. 여과지 또는 여과포에 의한 전체량 여과의 경우는 셀라이트 등 여과보조제를 이용하는 것도 하나의 수단이다. 공업적으로는 필터프레스에 의한 균체 제거가 바람직하다.
또 균체 등의 불용물을 분리하기 전에 산을 첨가하여 pH 를 중성에서 산성역 부근으로 해도 되고, 분리 후에 pH 를 중성에서 산성역 부근으로 해도 된다. 또 상온 (15∼35℃) 에서는 pH 를 중성 부근에서 산성 부근으로 재조정하더라도 β-글루칸 다당이 겔화되는 일은 없고, 점도는 고점도화되지 않고 저점도 그대로이다. 이와 같이 본 발명은, 고점도의 β-글루칸 수용액을 알칼리 처리에 의해 저점도화시키고, 계속해서 pH 를 산성 (pH 4＞) 으로 재조정하더라도 점도의 상승이 없다는 점에서, 건강식품 소재, 특히 건강식품음료 소재, 그리고 화장품 등의 외용제로서 유용한 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액을 제공하는 것이다.
다음에 건강음료의 배합예를 나타낸다.
1) 드링크제 A
성분 배합량 (중량%)
아쿠아 β* 99.85
아세술팜 0.10
레몬 에센스 0.05
*: 저점도 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액, 다이소주식회사 제조
2) 드링크제 B
성분 배합량 (중량%)
아쿠아 β* 50
알로에 추출물 50
3) 드링크제 C
성분 배합량 (중량%)
아쿠아 β* 40
알로에 추출물 20
바이탈 K (강장 식용식물 농축액) 40
다음에 화장수의 배합예를 나타낸다.
성분 배합량 (중량%)
아쿠아 β* 80
세리신 0.3
1,3-부틸렌글리콜 5
글리세린 2
카모마일 추출물 2
해초 추출물 (알긴산 Na) 2
아스코르브인산 Na 1
메틸파라벤 0.2
물 7.5
알칼리 처리에 사용되는 알칼리로는, 탄산칼슘 수용액, 탄산나트륨 수용액, 탄산칼륨 수용액, 탄산암모늄 수용액 등의 탄산알칼리 수용액, 수산화나트륨 수용액, 수산화칼륨 수용액, 수산화칼슘 수용액 등의 수산화 알칼리 수용액 또는 암모니아 수용액 등 통상 사용되는 알칼리라면 특별히 제한은 없다. 단, β-1,3-1,6-D-글루칸을 식용으로 제공하기 위해서는 식품첨가물로서 인정되고 있는 알칼리를 사용하는 것이 바람직하다.
중화, 산 처리에 사용되는 산으로는, 염산, 인산, 황산, 시트르산, 말산, 글루콘산 등 통상 알칼리를 중화시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한은 없다. 단, 이것에 대해서도 식용으로 제공하기 위해서는 식품첨가물로서 인정되고 있는 산이 바람직하다.
여기에서, 알칼리 처리, 그리고 중화 처리 또는 산 처리를 한 배양액을 그대로 식용으로 사용해도 되지만, 다음의 과열 멸균이나 보존안정성을 생각하면 금속 이온을 제거하는 편이 바람직하다.
금속 이온의 제거는 UF 막을 사용한 탈염이 이용된다. 금속 이온 농도는 120㎎/100㎖ 배양액 이하, 보다 바람직하게는 50㎎/100㎖ 배양액 이하, 더욱 바람 직하게는 20㎎/100㎖ 배양액 이하로 해 두는 것이 바람직하다. 예를 들어, 수산화나트륨을 사용하여 알칼리 처리에 의한 저점도화를 실시한 경우는, 여기서 기재하는 금속 이온은 나트륨 이온이다.
하기에 실시예 1 에 나타내는 배양액을 사용하여 실시한 열안정성 실험의 결과를 표 1 에 나타낸다. 버퍼 교환 및 염화나트륨의 배합에 의해 Na 이온 농도를 조정한 배양액을 50℃ 항온 오븐에 정치하여 안정성을 조사하였다. 여기서, 다당 농도는 2㎎/㎖, Ca 이온은 10mg/100㎖ 로 조정하였다.
Figure 112005016204383-PAT00001
표시는 변화 없음, × 표시는 겔화, 응집, 침전이 생긴 것을 나타낸다. 여기서 겔화는 유동성이 없어진 상태로 정의한다.
50℃ 에서의 보존안정성 (Na 이온의 영향)
Na 이온 농도 [㎎/100㎖] 1 일 후 2 일 후 5 일 후 10 일 후 15 일 후
19
Figure 112005016204383-PAT00002
Figure 112005016204383-PAT00003
Figure 112005016204383-PAT00004
Figure 112005016204383-PAT00005
Figure 112005016204383-PAT00006
40
Figure 112005016204383-PAT00007
Figure 112005016204383-PAT00008
Figure 112005016204383-PAT00009
Figure 112005016204383-PAT00010
Figure 112005016204383-PAT00011
60
Figure 112005016204383-PAT00012
Figure 112005016204383-PAT00013
Figure 112005016204383-PAT00014
 × ×
84
Figure 112005016204383-PAT00015
Figure 112005016204383-PAT00016
Figure 112005016204383-PAT00017
 × ×
112
Figure 112005016204383-PAT00018
Figure 112005016204383-PAT00019
 × × ×
160 × × × × ×
260 × × × × ×
다음에 Ca 이온에 관해서도 동일하게 실험하였다. 그 결과를 표 2 에 나타낸다. 실시예 1 에 나타내는 배양액을 사용하여 UF 막에 의해 탈염한 후, 염화칼슘의 배합에 의해 Ca 이온 농도를 조정하였다. 50℃ 항온 오븐에 정치하여, 마찬가지로 안정성을 조사하였다. 여기서, 다당 농도는 2㎎/㎖, Na 이온은 16㎎/100㎖ 로 조정하였다.
Figure 112005016204383-PAT00020
표시는 변화 없음, × 표시는 겔화, 응집, 침전이 생긴 것을 나타낸다. 여기서 겔화는 유동성이 없어진 상태로 정의한다.
50℃ 에서의 보존안정성 (Ca 이온의 영향)
Ca 이온 농도 [㎎/100㎖] 1 일 후 2 일 후 5 일 후 10 일 후 15 일 후
2
Figure 112005016204383-PAT00021
Figure 112005016204383-PAT00022
Figure 112005016204383-PAT00023
Figure 112005016204383-PAT00024
Figure 112005016204383-PAT00025
31
Figure 112005016204383-PAT00026
Figure 112005016204383-PAT00027
Figure 112005016204383-PAT00028
Figure 112005016204383-PAT00029
Figure 112005016204383-PAT00030
63
Figure 112005016204383-PAT00031
Figure 112005016204383-PAT00032
Figure 112005016204383-PAT00033
 × ×
84
Figure 112005016204383-PAT00034
Figure 112005016204383-PAT00035
Figure 112005016204383-PAT00036
 × ×
122
Figure 112005016204383-PAT00037
Figure 112005016204383-PAT00038
 × × ×
227 × × × × ×
본 β-1,3-1,6-D-글루칸의 회수정제법은, 주로 오레오바시디움속 (Aureobasidium sp.) 에 속하는 임의의 균주가 생산하는 고분자 (분자량 200만 이상) 에서 저분자 (분자량 수백 내지 2만) β-글루칸까지도 적용하는 것이 가능하고, 모든 미생물이나 버섯이 생산하는 β-1,3-1,6-D-글루칸에 적용하는 것이 가능하다. 특히 바람직하게는 오레오바시디움속 (Aureobasidium sp.) K-1 주의 변이 균주인 오레오바시디움 풀루란 (Aureobasidium pullulans) GM-NH-1A1 주와 오레오바시디움 플루란 (Aureobasidium pullulans) GM-NH-1A2 주이다. 오리지널 균주인 오레오바시디움속 (Aureobasidium sp.) K-1 주는 고분자량의 β-글루칸을 여러 종류 (200만 이상과 100만 정도의 β-글루칸) 를 생산하는 것이 알려져 있다. 또한 오레오바시디움속 (Aureobasidium sp.) K-1 주가 생성하는 β-글루칸은 술포아세트산기를 갖는 것으로 알려져 있다 (비특허문헌 3, 4 참조).
본 변이 균주 GM-NH-1A1 주와 GM-NH-1A2 주는, 실시예에서 나타내는 바와 같이 메인 피크가 외관상 50∼250만인 고분자량의 β-글루칸 (미립자 글루칸) 과 메인 피크가 2∼30만인 저분자량의 β-글루칸 양쪽을 생산하는 균주로서, GM-NH-1A1 주와 GM-NH-1A2 주의 성질은 하기 표에 나타낸 바와 같다. 그 결과, 각각의 균주의 형태학적 성질 및 28SrDNA 의 염기 서열로부터 본 균주는 오레오바시디움 플루란 (Aureobasidium pullulans) 에 속하는 균주로서 동정되었다. 이들 균주는 독립 행정법인 산업기술연구소 특허생물 기탁센터에 각각 FERM P-19285 와 FERM P-19286 으로서 기탁되어 있다.
다음에, 본 배양액의 입도 분포를 측정한 결과, 배양액은 완전히 β-1,3-1,6-D-글루칸이 용해되어 있는 것은 아니고, 일부는 1 차 입자직경이 0.05∼2.0㎛ 정도의 미립자로 구성되어 있음을 알 수 있었다.
또 이 미립자 β-1,3-1,6-D-글루칸 함유 수용액에 레시틴 등의 공지된 유화제나, 환형 덱스트린 등의 안정화제를 첨가함으로써 더욱 안정화시킬 수도 있다.
GM-NH-1A1 주 및 GM-NH-1A2 주의 형태학적 성질
항목 성상
생육속도 (25℃, 7일간) 2% MEA 배지 집락의 직경 42-48㎜
PCA 배지 집락의 직경 34-35㎜
집락 표면의 색조 2% MEA 배지 황색을 띤 회색에서부터 올리브색
집랍 표면의 조직 효모상
균사 무색에서부터 암갈색, 활(滑)면, 암갈색 세포는 세포벽이 두꺼워 진다. 무색의 균사 폭: 2-5㎛ 암갈색의 균사폭: 2-10㎛
분생자 형성 세포 무색, 활면, 세포벽은 얇고, 균사 상에서 직접 또는 균사 측면에 형성되는 송곳니형상 돌기로부터 분생자를 형성한다.
분생자 무색, 활면, 타원형에서부터 원통형 5-8㎛ ×2-3㎛
내생포자 무색, 활면, 타원형에서부터 원통형 4-6㎛ ×약 2㎛
ㆍ2% MEA: 2% 말토엑기스 한천 평판 배지
ㆍPCA: 포테이토 캐롯 한천 평판 배지
본 발명의 저점도 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액으로부터, 건조 β-1,3-1,6-D-글루칸을 제조하기 위해서는, 분무건조법, 동결건조법 등 공지된 건조방법을 채용할 수 있다. 이 경우, 저점도 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액은 균체나 염을 함유한 것이어도 된다.
본 발명은 β-1,3-1,6-D-글루칸을 함유하는 미생물 배양액에 알칼리, 또는 그 수용액을 첨가하여 저점도화한 후, 필요에 따라 미생물을 함유하는 불필요물을 분리제거하고, 계속하여 투석농축하고, 그 농축액에 교반하에 알코올류를 첨가하고, 얻어지는 β-1,3-1,6-D-글루칸/알코올/물로 이루어지는 슬러리를 분액하여, 침강 슬러리 농도를 1.0%(w/w) 이상이 되도록 조제하여, 분무건조시키는 것을 특징으로 하는 β-1,3-1,6-D-글루칸 분말의 조제방법에 관한 것이다. 이 방법에 의하면, 저점도인 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액을 농축하여, 용량을 당초의 수분의 1 에서 수십분의 1 로 줄일 수 있기 때문에, 다당 침전 정제를 위해 첨가하는 알코올의 양을 비약적으로 줄일 수 있다. 투석을 필요에 따라 충분히 실시함으로써, 불필요한 염을 줄일 수 있다. 또 본 제법에 의하면, 알코올 첨가시에 고분자량의 β-1,3-1,6-D-글루칸이 우선적으로 침강되기 때문에, 시트르산나트륨 등의 무기염을 제거할 수 있어, 순도 향상, 정제에 매우 유효하다.
미생물 배양액으로는 특히 오레오바시디움속에 속하는 미생물이 균체 밖에 생산하는 β-글루칸, 특히 β-1,3-1,6-D-글루칸을 주성분으로 하는 배양액이 바람직하다. 미생물의 분리제거는 필터 프레스 또는 원심분리에 의해 실시하는 것이 바람직하다. 알코올류로는 배양액으로부터 β-1,3-1,6-D-글루칸을 석출시킬 수 있는 것이면 무엇이든 좋지만, 특히 바람직한 알코올은 에탄올이다. 에탄올의 사용량은 배양액에 대하여 1 배 (용적비) 이상, 바람직하게는 2 배 이상 첨가하는 것이 바람직하다. 분액 후 알코올/물 혼합액으로부터 알코올을 증류 등에 의해 회수하여, 리사이클할 수 있다.
한편, 본 발명의 저점도 β-1,3-1,6-D-글루칸 분말은 하기 제법에 의해 알코올을 사용하지 않고 제조할 수 있다. 즉, β-1,3-1,6-D-글루칸을 함유하는 미생물 배양액에 알칼리, 또는 그 수용액을 첨가하여 저점도화 후, 필요에 따라 미생물을 함유하는 불필요물을 분리제거하고, 계속하여 투석농축을 필요에 따라 충분히 실시한 다음, 다시 감압농축하고, 계속하여 농축액을 분무건조시킴으로써 고순도 β-1,3-1,6-D-글루칸 분말을 얻을 수 있음을 발견하였다. 이 방법에 의해, 알코올 회수시의 손실이 없고, 방폭형 설비도 필요로 하지 않으며, 간편하고 또한 저렴하게 고순도 β-1,3-1,6-D-글루칸 분말이 얻어진다. 이러한 감압농축 공정을 갖는 β-1,3-1,6-D-글루칸 분말의 제법은, 본 발명의 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액이 저점도이기 때문에 가능해진 것이다.
본 발명의 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액은 실시예에 나타내는 바와 같이, 마우스에 있어서의 Colon 26 대장암 세포를 사용한 악성신생물 억제 실험에서, 항악성신생물 효과, 악성신생물 전이 억제 효과가 인정되었다.
따라서, 본 발명에 관한 β-1,3-1,6-D-글루칸 또는 그 수용액은, 악성 종양 치료제 등의 항악성신생물제로서 유용하다.
또 장관 점막 조직 중의 NK 양성 세포수 및 INF-γ 양성 세포수가 β-글루칸 비투여군과 비교하여 유의하게 증가되고, 또한, 혈 중의 IL-12 생성도 증강되어 있음을 알 수 있었다. 이것은 본 β-1,3-1,6-D-글루칸이 항원 제시 세포인 매크로파지의 활성화를 시사하고 있는 것이다.
따라서, 본 발명에 관한 β-1,3-1,6-D-글루칸 또는 그 수용액은, 하기 1-3 의 효과도 기대된다.
1. 항바이러스 및 항세균 감염제:
INF -γ는, 세포의 RNAase (RNA 분해효소) 를 활성화하여, 더욱 DNA 합성이나 단백질 합성, 펩티드 합성이 억제되고, 그 결과 바이러스의 증식이 저해된다. 구체적으로는, A 형, B 형 및 C 형 간염, 간경변, 헤르페스 질환, 인플루엔자ㆍ구내염 등 바이러스성 질환, 각종 악성신생물 (바이러스성의 것도 포함한다) 의 억제 및 그 전이 억제 등에 효과가 보인다. 또한, MRSAㆍVRE 등의 항세균 감염에도 효과가 있다.
2. I 형 앨러지 (아나필락시스 반응) 억제제:
INF -γ는, IgE 항체 생성에 관계하는 헬퍼 T 세포의 1 종인 Th2 세포의 분화와 활성화를 저해한다. 또한, INF-γ는 IL4 의 생성을 억제하는 것이 보고되어 있다. 이 결과, IgE 항체가 관여하는 앨러지 (I 형 앨러지) 를 억제하는 것으로 추측된다. 구체적으로는, 화분증, 비염 앨러지, 앨러지성 결막염, 식품 앨러지 (담마진, 설사 등 위장 앨러지), 아토피성 피부염, 기관지 천식, 벌독이나 페니실린 등의 약제에 의한 쇼크 증상의 억제 효과가 기대된다.
3. Ⅳ 형 앨러지 억제제 및 자기면역 질환 억제제:
2. 에서 서술한 바와 같이, 바이러스나 세균의 감염에 의해 부분적으로 변성된 자기성분이 항원성을 가지게 되어 (자기항원), 자기면역 질환이 된다. 구체적으로는, 만성 관절류머티즘, 류머티즘열, 교원병, 쇼그렌 증후군, 하시모토병, 바세도우씨병, 자기면역성 용혈성 빈혈이나 악성 빈혈 등의 빈혈, 인슐린 의존성 당뇨병 (Ⅰ 형 당뇨병), 중증 근무력증 등을 들 수 있다.
본 발명에 관한 β-1,3-1,6-D-글루칸 또는 그 수용액은 바람직하게는 경구투여된다. 그 투여량은 증상, 연령, 체중, 투여형태, 투여횟수 등에 따라 다르지만, 통상은 1 일당 1-200㎎ (β-1,3-1,6-D-글루칸으로서), 바람직하게는 5-100㎎ 투여된다.
(실시예)
다음에 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하지만, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 오레오바시디움 풀루란 (Aureobasidium pullulans) GM-NH-1A1 주의 사용
1) β-글루칸의 배양 생산 1
하기 표 4 의 조성으로 이루어지는 100㎖ 의 액체 배지를 500㎖ 쇼울더가 형성된 플라스크에 넣고, 121℃, 15분간, 가압 증기멸균을 실시한 후, 오레오바시디움 풀루란 (Aureobasidium pullulans) GM-NH-1A1 주를 동 배지 조성의 슬랜트로부터 무균적으로 1 백금이 식균하고, 24시간, 30℃ 에서 130rpm 의 통기 교반 배양하여 종(種) 배양액을 조제하였다. 계속하여, 동 조성의 배지 200ℓ 를 300ℓ용 배양장치 (마루비시바이오엔지제니어링 제조) 에 넣고, 121℃, 15분간, 가압 증기멸균하고, 앞서 얻어진 종배양액 2ℓ 를 무균적으로 식균하여, 200rpm, 27℃, 40ℓ/min 으로 통기 교반 배양하였다. 또, pH 는 수산화나트륨과 염산을 사용하고 pH 4.2 에서 4.5 의 범위 내에서 제어하였다. 96 시간 후의 균체 탁도는 OD 660㎚ 에서 23 OD 이고, 다당 농도는 0.5%(w/v) 였다.
다당 농도는, 배양액을 수 ㎖ 샘플링하고, 균체를 원심분리 제거한 후, 그 상청에 최종 농도가 66%(v/v) 가 되도록 에탄올을 첨가하여 다당을 침전시키고ㆍ회수 후, 이온 교환수에 용해하여, 페놀황산법으로 정량하였다.
또한, 이 균체를 제거한 배양 상청에 에탄올을 최종 농도가 66% 가 되도록 첨가하고, β-글루칸을 침전회수하였다. 그 후, 다시 이온 교환수에 용해하고, 재차 원심분리 후, 그 상청에 최종 농도가 0.9% 가 되도록 식염을 첨가한 후, 다시 66% 에탄올로 β-글루칸을 회수하였다. 이 β-글루칸 회수 정제 조작을 또 다시 2 회 반복하여, 얻어진 β-글루칸 수용액을 이온 교환수로 투석 후, 동결건조에 의해 β-글루칸 분말을 얻었다. 본 β-글루칸의 조성 분석 결과로부터 S 함량은 239㎎/㎏ 이고, 여기서부터 계산되는 치환 술포아세트산 함량은 0.09% 였다.
배지 조성
화합물 농도 %(w/v)
질산나트륨 0.2
인산 2 칼륨 0.1
염화칼륨 0.1
황산마그네슘ㆍ7 수화물 0.05
황산철ㆍ7 수화물 0.001
아스코르브산 0.3
자당 3
pH 4.3
2) 알칼리 처리
실시예 1 에서 얻어진 배양액을 BM 형 회전 점도계 (도쿄 계기 제조) 를 사용하여, 30℃, 12rpm 으로 측정한 결과, 1500cP((mPaㆍs)) 였다. 측정에 사용하는 로터는 점도에 맞춰 적당한 것을 선택하였다. 이 배양액에 수산화나트륨의 최종 농도가 2.4%(w/v) 가 되도록 25%(w/w) 수산화나트륨을 첨가하여 교반한 결과 (pH 13.6), 순간적으로 점도가 저하되고, 계속해서 50%(w/v) 시트르산 수용액으로 pH 5.0 으로 중화시킨 후 점도를 측정한 결과, 그 때의 점도 (30℃) 는 20cP([mPaㆍs]) 였다. 계속하여, 이 배양액에 여과보조제로서 KC 프록 (닛뽄 제지사 제조) 을 1wt% 첨가하고, 야부타식 여과 압착기 (야부타 기계 제조) 를 사용하여 균체를 제거하여, 최종적으로 배양여과액 (약 230ℓ) 을 얻었다. 그 다당 농도는 0.5%(w/v) 로서, 거의 100% 의 회수율이었다.
3) β-글루칸 수용액의 탈염
상기 β-글루칸 수용액 (배양여과액) 을 0.3% 로 희석 후, UF 막 (분자량 커트 5만, 닛토 덴꼬사 제조) 에 의해 탈염하여, 최종적으로 나트륨 이온 농도를 20㎎/100㎖ 로 떨어뜨린 후, 50%(w/v) 시트르산 수용액에 의해 pH 를 3.5 로 조정하였다. 계속해서, 핫 충전용 가열 유닛 (히사카 제작소 제) 을 사용하여 95℃, 3분간 유지의 살균처리를 실시하여, 최종 제품인 β-글루칸 수용액을 얻었다. 이 때의 β-글루칸의 농도는 페놀황산법에 의해 측정한 결과 0.22%(w/v) 였다. 또한, 배양액으로부터의 토탈 수율은 약 73% 였다. 또한, 얻어진 β-글루칸 수용액을 이온 교환수로 투석 후, 동결건조에 의해 β-글루칸 분말을 얻었다. 본 β-글루칸의 조성 분석 결과로부터 S 함량은 330㎎/㎏ 이고, 여기서부터 계산되는 치환 술포아세트산 함량은 0.12% 였다.
또한, 탈염한 상기 배양여과액에 관해서, 콩고레드법에 의해, 480㎚ 에서부터 525㎚ 부근으로의 파장 시프트를 확인할 수 있었기 때문에 β-1,3 결합을 함유하는 글루칸을 함유하고 있음이 증명되었다 (K.0gawa, Carbohydrate Research, 67, 527-535 (1978), 이마나카 다타유키 감수, 미생물 이용의 대전개, 1012-1015, 엔ㆍ티ㆍ에스 (20O2)). 그 때의 극대치로의 시프트 차분은 Δ0.48/500㎍ 다당이었다.
상기 배양여과액 15㎖ 를 추출하여, 30㎖ 의 「에탄올」을 첨가하고, 4℃, 1000rpm, 10min 으로 원심하여, 침전되는 다당을 회수하였다. 66% 에탄올로 세정하고, 4℃, 1000rpm, 10min 으로 원심하여, 침전되는 다당에 2㎖ 의 이온 교환수와, 1㎖ 의 1N 수산화나트륨 수용액을 첨가 교반 후, 60℃, 1시간 보온하여 침전을 용해시켰다. 다음에 -80℃ 에서 동결 후, 하룻밤, 진공 동결건조를 실시하고, 건조 후의 분말을 1㎖ 의 중수에 용해시켜, 2 차원 NMR 시료로 하였다. 2 차원 NMR (13C-1H COSY NMR) 106ppm 과 상관관계를 갖는 1H NMR 스펙트럼 4.7ppm 과 4.5ppm 부근의 2 개의 시그널을 얻었다 (도 1 참조). 이 결과, 본 β-글루칸이 β-1,3-1,6-D 글루칸임이 증명되었다 (이마나카 다타유키 감수, 미생물 이용의 대전개, 1012-1015, 엔ㆍ티ㆍ에스 (20O2)). 각각의 1H NMR 시그널의 적분비로부터, β-1,3 결합/β-1,6 결합의 비는 1.15 임이 판명되었다.
또한, 상기 1H NMR 스펙트럼을 1N-NaOH 중수 용매로부터 디메틸술폭시드-d6 중수소화 용매로 바꿔, 80℃ 에서 측정한 결과, 4.7ppm 의 피크는 4.5ppm 으로, 4.5ppm 의 피크는 4.2ppm 으로 각각 시프트하였다.
얻어진 β-1,3-1,6-D-글루칸을 엑소형의 β-1,3-글루카나아제 (키타라아제 M, 케이아이 화성사 제조) 로 30℃ 에서 수시간 가수분해 처리하였다 (방법은 비특허문헌 3, 비특허문헌 4 참조). 분해성 생물의 동정은, 아미드 칼럼 (TSK-GEL AMIDE-80, 직경 4.6㎜×250㎜, 토소사 제조) 을 사용한 HPLC 분석 (아세토니트릴/물, 70/30; 85℃; 유속, 1㎖/min) 에 의해 실시하여, 분해성 생물로서 글루코스와 겐티오비오스의 유리를 확인할 수 있었다. 각각의 리텐션 타임은, 글루코스, 5.7분; 겐티오비오스, 8.5분이었다. 이것으로부터 본 글루칸의 구조는 글루코스가 β-1,3-결합으로 연결된 주쇄에 대하여, β-1,6-결합으로 글루코스 1 분자가 측쇄에 분기하고 있는 것을 확인하였다.
다음에, 레이저 회절/산란식 입도분포 측정장치 (HORIBA 제 LA-920) 를 사용하여 배양액의 입도를 측정한 결과, 입자로는 0.3㎛ 와 100㎛ 정도의 크기였을 때 피크가 보였다. 계속해서, 초음파를 조사하면서 입도를 측정하면, 100㎛ 의 피크는 순식간에 소실되고, 0.3㎛ 의 피크가 늘어나, 최종적으로 0.3㎛ 만으로 되었다 (도 2 참조). 0.3㎛ 는 β-1,3-1,6-D-글루칸의 1 차 입자, 100∼200㎛ 는 β-1,3-1,6-D-글루칸의 1 차 입자가 응집한 2 차 입자인 것으로 생각된다. 또한, 2 차 입자는 마그네틱 스틸러에 의한 교반, 가벼운 진탕으로도 동일하게 소실되어, 쉽게 1 차 입자로 부서지는 것을 확인하였다. 따라서, 2 차 입자는 매우 헐거운 응집 (완응집 상태) 으로 생각된다.
또한, 토소사 제조의 토요팔 HW65 (칼럼 사이즈 75㎝×φ1㎝, 배제 분자량 250만 (덱스트란)) 에 의해 0.1M 의 수산화나트륨 수용액을 용리액으로서 겔 크로마토그래피하여, 그 용해 β-1,3-1,6-D-글루칸과 β-1,3-1,6-D 글루칸의 1 차 입자로 이루어지는 β-1,3-1,6-D-글루칸 함유액의 분자량을 측정한 결과, 얻어진 다당의 분자량은 용해 β-1,3-1,6-D-글루칸에 유래하는 2∼30만 피크의 저분자 분획과, 1 차 입자에 우래하는 외관상 50∼250만의 고분자 분획의 2 종류로 이루어지는 것이 판명되었다. 여기서, 분자량의 마커로서 Shodex 사 제조의 풀루란을 사용하였다.
한편, 수용성 β-1,3-1,6-D-글루칸과 미립자를 분리하기 위해, 본 법에서 조제한 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액 (미립자와 가용화 글루칸을 함유하는 것) 을 아도반텍사 제조의 필터 (0.2㎛) 로 여과한 결과, 50∼250만의 고분자 분획이 소실되었다. 즉 고분자 분획은 β-1,3-1,6-D-글루칸의 1 차 입자나 1 차 입자가 응집한 2 차 입자에 상당하는 것으로 판명되었다. 따라서, 수용성 β-1,3-1,6-D-글루칸의 분자량은 2∼30만인 것으로 생각된다.
다음에 가열멸균시의 열안정성을 조사하였다. 실시예 1 에서 알칼리 처리 후, 제균하고, 금속 이온을 50㎎/100㎖ 이하로 제거한 다음, 다당 농도를 0.2%(2㎎/㎖), 0.40%, 0.52%, 0.77%, 0.96% 로 조정한 후, 90℃ 의 오토클레이브에서 15분간 가열멸균하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다. 여기서,
Figure 112005016204383-PAT00039
표시는 변화 없음, △ 표시는 응집이 일부 보임, × 표시는 유동성이 없는 겔을 나타낸다.
다당 농도가 높으면 응집하기 쉬운 경향이 보였다. 당 농도가 0.5% (5㎎/㎖) 를 초과하면 응집의 경향이 보이고, 0.7% 이상에서는 유동성이 없는 겔이 되었다.
90℃ 가열멸균에서의 안정성
다당 농도[%] 0.20 0.40 0.52 0.77 0.96
겔화
Figure 112005016204383-PAT00040
Figure 112005016204383-PAT00041
 △ × ×
실시예 2 오레오바시디움 (Aureobasidimn sp.) K-1 주의 사용
1) β-글루칸의 배양 생산 2
상기 표 4 의 조성으로 이루어지는 60㎖ 의 액체 배지를 버플이 부착된 300㎖ 삼각 플라스크에 넣고, 121℃, 15분간, 가압 증기멸균을 실시한 후, 오레오바시디움 (Aureobasidium sp) K-1 주를 동 배지 조성의 슬랜트로부터 무균적으로 1 백금이 식균하고, 96시간, 30℃ 에서 130rpm 의 통기 교반 배양하여 다당 생산 실험하였다. 96시간 후의 균체 탁도는 OD 660㎚ 에서 35 OD 이고, 다당 농도는 0.5%(w/v) 였다. 다당 농도는, 배양액으로부터 균체를 원심제거한 후, 66%(v/v) 가 되도록 에탄올을 첨가하여 침전시키고, 이온 교환수에 용해한 후, 페놀황산법으로 정량하였다. 또한, 본 β-글루칸의 조성 분석 결과로부터 S 함량은 2300㎎/㎏ 이고, 여기서부터 계산되는 치환 술포아세트산 함량은 0.9% 이었다.
2) 이하 실시예 1 과 동일하게 하여 이 다당의 성질을 조사하였다.
콩고 레드에서의 시프트 효과를 조사한 바, 극대 흡수가 480㎚ 에서 525㎚ 부근으로의 시프트가 관찰되어 β-1,3 결합을 포함하는 글루칸을 함유하고 있는 것이 증명되었다. 그 때의 극대치로의 시프트 차분은 Δ0.50/500㎍ 다당이었다. 또한 2차원 NMR (13C-1H COSY NMR) 분석을 하였다. 그 결과로부터, 얻어진 다당은 β-1,3-1,6-D-글루칸인 것이 증명되었다. 각각의 1H 시그널의 적분비로부터, β-1,3결합/β-1,6 결합의 비는 1.38 이었다. 또한 분자량을 측정한 바, 그 분자량은 10∼300만이었다.
얻어진 β-1,3-1,6-D-글루칸을 실시예 1 과 동일하게 하여 분석하고, 본 글루칸의 구조는 글루코오스가 β-1,3-결합으로 연결된 주쇄에 대하여, β-1,6-결합으로 글루코오스 1분자가 측쇄에 분기하고 있는 것을 확인하였다.
얻어진 배양액을 BM 형 회전 점도계를 사용하여 실시예 1 과 동일하게 측정한 바, 점도는 30℃ 에서 1900cP ([mPaㆍs]) 이었다. 이 배양액에 최종 수산화나트륨 농도가 2.4% (w/v) 가 되도록 25% (w/w) 수산화나트륨을 첨가하여 교반한 바 (pH 13.4), 순간적으로 점도가 저하되었다. 계속해서 pH 를 50% (w/v) 시트르산 수용액으로 pH 4.8 로 조정하였다. 그 때의 점도는 28cP ([mPaㆍs]) 이었다.
실시예 3 오레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans) GM-NH-lA2 주의 사용
균주를 오레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) GM-NH-lA1 주에서 오레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullu1ans) GM-NH-lA2 주로 변경한 것 이외에는 전부 실시예 1 의 방법으로 행하였다. 그 결과, 생성된 다당 농도는 0.5% (w/v), 그 때의 점도는 1300cP ([mPaㆍs]) 이었다. 얻어진 배양액에 실시예 2 와 동일하게 하여 수산화나트륨을 최종 농도가 2.4% 가 되도록 첨가하고 (pH 13.6), 계속하여 50% (w/v) 시트르산 수용액으로 pH 5.0 으로 조정한 다음 실시예 1 과 동일하게 점도를 측정한 바, 점도는 7cP ([mPaㆍs]) 로 저하되었다. 그 때의 다당 농도는 0.5% (w/v) 이었다.
이하 실시예 1 과 동일하게 하여 이 다당의 성질을 조사하였다.
콩고 레드에서의 시프트 효과를 조사한 바, 극대 흡수가 480㎚ 에서 525㎚ 부근으로의 시프트가 관찰되었다. 그 때의 극대치로의 시프트 차분은 Δ0.45/500㎍ 다당이었다. 또한 2차원 NMR (13C-1H COSY NMR) 분석을 하였다.
그 결과로부터, 얻어진 다당은 β-1,3-1,6-D-글루칸인 것이 증명되었다. 각각의 1H 시그널의 적분비로부터, β-1,3결합/β-1,6 결합의 비는 1.23 이었다.
또한 분자량을 측정한 바, 그 분자량은 평균 분자량으로 2∼30만의 피크의 저분자 분획과 50∼250만의 고분자 분획의 2종류로 이루어지는 것이 판명되었다. 또한, 본 β-글루칸의 조성 분석 결과로부터 S 함량은 229㎎/㎏ 이고, 이것으로부터 계산되는 치환 술포아세트산 함량은 0.09% 이었다.
실시예 4 배지 조성의 변경
균주를 오레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pu11ulans) GM-NH-lA2주로 변경하고, 표 4 의 배지의 아스코르브산을 무첨가로 한 것 이외에는 전부 실시예 1 의 방법으로 행하였다. 그 결과, 생성된 다당 농도는 0.6%, 그 때의 점도는 1500cP ([mPaㆍs]) 이었다. 얻어진 배양액에 실시예 2 와 동일하게 하여 수산화나트륨의 최종 농도가 2.4% (w/w) 가 되도록 첨가하고 (pH 13.6), 계속하여 50% (w/v) 수용액으로 pH 4.9 로 한 다음 실시예 1 과 동일하게 점도를 측정한 바, 그 점도는 7cP ([mPaㆍs]) 로 저하되었다. 콩고 레드법으로, 극대 흡수가 480㎚ 에서 525㎚ 부근으로 시프트되는 것이 관찰되었다. 그 때의 극대치로의 시프트 차분은 Δ0.45/500㎍ 다당이었다.
또한 실시예 1 과 동일하게 2차원 NMR (13C-1H COSY NMR) 분석을 행하였다. 그 결과, 얻어진 다당은 β-1,3-1,6-D-글루칸인 것이 증명되었고, 각각의 1H 시그널의 적분비로부터, β-1,3결합/β-1,6결합의 비는 1.21 이었다.
계속하여 분자량을 실시예 3 과 동일한 방법으로 측정한 바, 그 분자량은 평균 분자량으로 2∼30만의 피크의 저분자 분획과 50∼250 의 고분자 분획의 2종류로 이루어지는 것이 판명되었다.
얻어진 β-1,3-1,6-D-글루칸을 실시예 1 과 동일하게 하여 분석하고, 본 글루칸의 구조는 글루코오스가 β-1,3-결합으로 연결된 주쇄에 대하여, β-1,6-결합으로 글루코오스 1분자가 측쇄에 분기되어 있는 것을 확인하였다.
실시예 5 pH 에 의한 용해도에 대한 영향
β-1,3-1,6-D-글루칸의 용해도는 배양액의 pH 에 의해서 크게 변하였다. 실시예 1 에 나타나는 바와 같이, 입도 분포 측정의 결과, 입자로서 존재하는 β-1,3-1,6-D-글루칸은 그 대부분이 0.1㎛ 이상의 크기인 것을 알 수 있었으므로, 어드밴텍사 제조의 필터 (0.21㎛) 로 통과할 수 있는 것을 용해되어 있는 것, 통과하지 못한 것을 미립자라고 생각할 수 있다. 여기서는 그 존재비 (0.2㎛ 를 통과한 배양액의 다당의 무게/배양액의 다당의 무게×100 (%)) 를 용해도로 정의한다. 실시예 1 의 배양액의 다당 농도를 0.2% (2㎎/㎖) 로 조제 후, pH 를 바꾸었을 때의 용해도를 도 3 에 나타낸다.
실시예 6 온도에 의한 용해도에 대한 영향
β-1,3-1,6-D-글루칸의 용해도는 온도에 따라서도 크게 변한다. 여기서는 온도를 바꾸고, 실시예 5 와 동일하게 어드밴텍사 제조의 필터 (0.2㎛) 로 여과하고, 용해도를 구하였다. 실시예 1 의 배양액의 다당 농도를 0.2% (2㎎/㎖) 로 조제 후, 온도를 바꾸었을 때의 용해도를 도 4 에 나타낸다. 여기서는 그 존재비 (0.2㎛ 를 통과한 배양액의 다당의 무게/배양액의 다당의 무게×100 (%)) 를 용해도로 정의한다.
실시예 5, 6 에 나타나는 바와 같이, pH 와 온도를 컨트롤함으로써 용해 β-1,3-1,6-D-글루칸, 미립자 β-1,3-1,6-D-글루칸을 선택적으로 조제할 수 있다.
실시예 7 분말화 글루칸의 특징
실시예 1 의 알칼리 처리 및 균체 제거 처리에 의해 조제된 미립자 β-1,3-1,6-D-글루칸을 포함하는 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액에, 최종 농도가 66% (v/v) 가 되도록 에탄올을 첨가하고, 다당글루칸을 침전시켜 원심 분리법에 의해 회수하였다. 계속하여 동결 건조법에 의해 에탄올과 수분을 제거하여 건조 β-1,3-1,6-D-글루칸을 얻었다. 그 때의 수율은 에탄올 침전 전의 전체 당 농도와 비교하여 95% 이상이었다. 계속하여, 얻어진 건조 β-1,3-1,6-D-글루칸을 최종 농도가 0.3% (w/v) 가 되도록 물에 용해 분산 후, 실시예 1 에 나타내는 바와 같이 토소사 제조의 토요펄 HW65 (칼럼 사이즈 75cm×φ1cm, 배제 분자량 250만 (덱스트란)) 에 의해 0.1M 의 수산화나트륨 수용액을 용리액으로 하여 겔 크로마토그래피를 사용하여 분자량을 측정한 바, 얻어진 다당의 분자량은 2∼30만의 피크의 저분자 분획과 외관상 50∼250만의 고분자 분획의 2종류로 이루어지는 것이 판명되었다. 여기서, 분자량의 마커로서 Shodex 사 제조의 풀루란을 사용하였다.
한편, 수용성 β-1,3-1,6-D-글루칸과 미립자를 분리하기 위해서, 본 방법으로 조제한 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액 (미립자와 가용화 글루칸을 포함하는 것) 을 어드밴텍사 제조의 필터 (0.2㎛) 로 여과한 바, 50∼250만의 고분자 분획이 소실되었다. 따라서, 본 방법에 의해 얻어진 β-1,3-1,6-D-글루칸을 건조시키더라도, 재용해시키면 건조 전의 β-1,3-1,6-D-글루칸과 동일한 물리적 거동을 재현하는 것이 실증되었다.
이상과 같이, 오레오바시디움 (Aureobasidium) 속에 속하는 미생물에 의해 생산되는 고점도의 β-1,3-1,6-D-글루칸을 알칼리 처리함으로써 저점도화에 성공하였다. 본 발명자들의 수법으로 얻어지는 β-1,3-1,6-D-글루칸은 수용성 성분과 미립자 분산 성분을 포함하고, pH, 온도로 그 비율을 컨트롤할 수 있다. 또한, 탈염 공정에서 금속이온의 농도를 컨트롤함으로써, 보존성 및 열안정성이 우수한 배양액이 얻어지는 것을 알 수 있었다. 그 결과, β-1,3-1,6-D-글루칸을 고수율로 회수 정제하는 방법을 제공할 수 있다.
실시예 8 고순도 β-1,3-1,6-D-글루칸 분말의 제조
실시예 1 의 알칼리 처리를 한 배양액 (다당 농도 0.5% (5㎎/㎖)) 90ℓ 를 50% 시트르산 수용액 9㎏ 으로 중화 후, 여과 조제 (닛폰 제지 케미컬 제 분말 셀룰로 오스 KC 블록) 를 1.8㎏ 프리코트한 야부타식 여과 압착기 40D-4 를 통해서, 균체를 제거하였다. 여과액을 한외여과 스파이럴 엘리먼트 (닛토 덴코 제 NTU3150-S4) 로 9ℓ까지 농축시켰다. 본 농축액을 교반하면서, 에탄올 18ℓ를 첨가하여 글루칸/에탄올/물 슬러리를 얻었다. 슬러리의 점도는 BM 형 점도계로 22mPaㆍs (30℃) 이었다. 실온에서 3시간 정치하고, 상청액 (에탄올/물) 약 17ℓ를 제거하였다. 남은 슬러리의 점도는 45mPaㆍs (30℃) 이었다. 본 농축 슬러리 10ℓ를 사카모토 기술 연구소 제조의 분무 건조 장치 R-3 을 사용하여 분무 건조시켜 360g 의β-1,3-1,6-D-글루칸 분말을 얻었다 (회수율 80%). 얻어진 β-1,3-1,6-D-글루칸의 순도는 NMR 스펙트럼의 해석의 결과, 90% 이상이었다.
상기 제법으로 얻어진 β-1,3-1,6-D-글루칸은 약 10% 의 글루칸 이외의 물에 잘 녹는 다당을 포함하고 있지만, 물세척에 의해 용이하게 정제할 수 있었다.
실시예 9
실시예 1 의 알칼리 처리를 한 배양액 (다당 농도 5㎎/㎖) 100ℓ를 50% 시트르산 수용액 10ℓ로 중화 후, 여과 조제 (닛폰 제지 케미컬 제 분말 셀룰로오스 W-200 을 1.8㎏ 프리코트한 야부타식 여과 압착기 40D-4 를 통해서 균체를 제거하였다. 여과액을 한외여과 스파이럴 엘리먼트 (닛토덴코 제 NTU-3150-S4) 로 반량인 55ℓ까지 농축시켰다. 계속해서, 가수농축을 반복하여 최종적으로 1/100 농도까지 희석시켰다. 이 액을 감압농축에 의해 5L 까지 농축시켰다. 농축액의 점도는 100mPaㆍs, 고형분 농도 10% 에 도달하였다. 본 농축 엑기스를 사카모토 기술 연구소 제조의 분무 건조 장치 R-3 을 이용하여 분무건조시켜 (입구 온도 185℃, 출구 온도 120℃, 회전수 33000rpm), 310g 의 β-1,3-1,6-D-글루칸분말을 얻었다 (회수율: 62%). 얻어진 β-1,3-1,6-D-글루칸 분말 0.5% 를 물에 녹여 다당 농도를 측정한 결과, 다당 농도는 4.8㎎/㎖ 이었다. 이러한 점에서, 이 분말의 순도는 약 95% 이상으로 추측되었다. 얻어진 분체는 담갈색으로 평균 입자 직경 25㎛ 이었다. 물에 대한 재분산성은 양호하고 10% 정도까지는 간단한 교반으로 행할 수 있었다. 15% 에서는 페이스트 형상으로 되어 용기를 뒤집어도 떨어지지 않는 상태이었다.
실시예 10 악성신생물 억제 활성 및 면역 부활 활성에 관해 (복강 투여)
실시예 1 에서 나타낸 방법으로 조제한 오레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pu11ulans) GM-NH-lA1 주 유래의 β-1,3-1,6-D-글루칸 (이하 간단히 글루칸이라고 한다.) 을 사용하여, 마우스에 의한 악성신생물 억제 활성과 악성신생물 전이 억제 활성을 검토하였다.
1. 방법 및 재료
1) 실험 재료
Matrigel (Reduced Growth Factor) 은 Becton Dickison 사에서 구입하였다. 글루칸은 실시예 1 에서 조제한 것을 사용하여, 생리식염수로 투석하고, 0.45㎛ 의 막으로 여과 제균 후, 0.5㎎/㎖ 와 1.5㎎/㎖ 의 글루칸 용액을 조제하여 실험에 제공하였다. 마우스 10g 체중당 0.1㎖ 를 복강 내 투여하였다.
2) 동물
Balb/c 마우스 (수컷, 5주령) 는 쿠레아 (주) 에서 구입하여, 1주간 예비 사육한 후, 건강한 마우스를 실험에 사용하였다.
3) Colon 26 대장암 세포
악성신생물로서 토호쿠 대학 가령 연구소 의용세포자원센터로부터 분여된 Colon 26 대장암 세포를, 계대유지한 것을 사용하였다.
4) 비장 내로의 Colon 26 대장암 세포 이식 마우스의 제작
Colon 26 대장암 세포 (5×104 세포수/㎖) 를 인산-생리 식염 완충액 (PBS, pH 7.4) 에 현탁하고, 그 세포 현탁액에 1㎎/㎖ 의 Matrigel 을 첨가하였다. Balb/c 마우스를 넴뷰탈 마취 하에서 등을 작게 절개하여 비장을 노출시키고, 그 비장 내에 Colon 26 대장암 세포 현탁액 0.2㎖ (1×104 세포수/비장) 를 주입하였다. 그 후, 즉시 작게 절개한 부분을 봉합하였다. Colon 26 대장암을 이식한 다음날부터, 조제된 글루칸 용액을 5㎎/㎏ 체중과 15㎎/㎏ 체중의 비율로 1일 1회 복강 내 투여하여 14일간 투여하였다. 정상군 및 대조군은 생리 식염수만을 투여하였다. 최종 투여 다음날 (암 이식 15일째) 에 에테르 마취 하, 하대정맥으로부터 헤파린 채혈하였다. 또한, 마우스는 채혈 후, 도살하고, 비장, 간장 및 흉선을 적출하여 각 조직 중량을 측정하였다. 간장에 전이된 Colon 26 대장암 세포 콜로니수를 계측하였다.
또한 소장을 적출하여 10% 중성 포르말린 완충액으로 고정하였다. 파라핀 포매 후, 소장의 병리 절편을 제작하였다. 각 소장 병리 절편은 통상적인 방법에 의해서 처리 후, NK 항체 및 INF-γ 항체 를 사용하여 면역 염색을 하였다. 그리고 NK 양성 세포수와 INF-γ 양성 세포수를 계측하였다.
계속하여, 비장 내 Colon 26 대장암 이식 마우스의 혈액 중 1L-12 를 측정하였다. 방법은 혈액을 원심 분리 후에 혈장을 얻고, 혈장 중의 IL-12 는 ELISA 키트에 의해 측정하였다.
2. 실험결과
1) 비장 내로의 Colon 26 대장암 이식 마우스에 있어서의 원발 종양에 미치는 글루칸의 효과
표 6 에 나타내는 바와 같이, 비장 내에 Colon 26 대장암을 이식하면, 확실히 비장 내에서 암 세포가 증식되었지만, 글루칸 투여군은 비장 내의 암 중량 증가에 대하여 억제 효과를 나타내었다. 즉 15㎎/㎏ 투여군에 있어서 33.2% 의 억제 효과가 관찰되었다.
2) 비장 내로의 Colon 26 대장암 이식 마우스에 있어서의 간장 전이에 미치는 글루칸의 영향
표 6 에 나타내는 바와 같이, 비장 내에 Colon 26 대장암을 이식하면, 확실히 간장으로의 Colon 26 대장암의 전이가 인정되어 간장 중량이 증가하였다. 한편, 글루칸 복강 내 투여군에서는 간장으로의 전이에 대하여 Colon 26 대장암 이식 마우스군과의 비교에 있어서, 유의하게 간장으로의 암 전이 콜로니수를 억제하였다. 즉 5㎎/㎏ 투여군에서 44.5%, 15㎎/㎏ 투여군에서 31.2% 의 항암 전이 효과가 관찰되었다.
비장 내로의 Colon 26 대장암 세포 이식 마우스에 있어서의 비장 원발 종양 중량과 간장으로의 종양 전이 콜로니수에 미치는 글루칸 복강 내 투여의 영향
동물수 평균치±표준 오차
원발 종양 중량 (㎎) 간장으로의 종양 전이 콜로니수 (개)
정상군 5 74.8±3.29* 비장 중량
Colon 26 대장암 이식 마우스군 8 1758.1±278.1 (100%) 154±16 (100%)
＋글루칸 복강 투여군 (5㎎/㎏) 7 2079.0±361.6 (119.3%) 84±23* (54.5%)
＋글루칸 복강 투여군 (15㎎/㎏) 8 1174.0±246.1 (66.8%) 106±22* (68.8%)
유의차 검정은 Fisher's Protected LSD 의 다중 검정으로 행하였다.
*: Colon 26 대장암 세포 이식 마우스군에 대하여 P＜0.05 로 유의차가 관찰되었다.
3) 비장 내 Colon 26 대장암 세포 이식 마우스에 있어서의 장관 면역 기능에 미치는 복강 내 투여 글루칸의 영향
표 7 에 나타내는 바와 같이, 소장 점막 조직 중의 NK 양성 세포수는 비장 내에 Colon 26 대장암을 이식에 의해서 유의하게 저하시키고, 5㎎ 및 15㎎/㎏ 의 글루칸 복강 내 투여는 소장 점막 조직 중의 NK 양성 세포를 유의하게 정상치까지 회복시켰다. 또한 5㎎ 및 15㎎/㎏ 의 글루칸 복강 내 투여는 소장 점막 내의 INF -γ 양성 세포를 Colon 26 이식 마우스에 비하여 유의하게 증가시켰다.
4) 비장 내로의 Colon 26 대장암 이식 마우스에 있어서의 혈중 IL-12 값에 미치는 복강 내 투여 글루칸의 영향
표 8 에 나타내는 바와 같이, 비장 내에 Colon 26 대장암을 이식하면, 혈중의 IL-12 농도는 증가하였다. 이 사실은 암을 배제하고자 하는 생체 방어 시스템의 작용에 의한 면역 기능이 증강된 것으로 생각된다. 글루칸의 복강 내 투여는 어느 투여량에서나, Colon 26 대장 암 이식 마우스에서, IL-12 의 혈중 농도를 상승시켰다.
글루칸의 복강 내 투여에 의해 IL-12 의 혈중 농도를 상승시킨 점에서, 본 글루칸이 항원 제시 세포인 매크로파지의 활성화능을 갖는 것이 시사되었다.
비장 내로의 Colon 26 대장암 세포 이식 마우스에 있어서의 소장 점막 조직 중의 NK 및 INF-γ 양성 세포수에 미치는 글루칸 복강 내 투여의 영향
동물수 평균치±표준 오차
NK 양성 세포수/Field (개) IFN-γ양성 세포수/Field (개)
정상군 5 248±13* 222±11
Colon 26 대장암 이식 마우스군 8 166±13 (100%) 221±20 (100%)
＋글루칸 복강 투여군 (5㎎/㎏) 7 196±15 (118%) 274±13* (124%)
＋글루칸 복강 투여군 (15㎎/㎏) 8 212±15* (128%) 265±10* (120%)
유의차 검정은 Fisher's Protected LSD 의 다중 검정으로 행하였다.
*: Colon 26 대장암 세포 이식 마우스군에 대하여 P＜0.05 로 유의차가 관찰되었다.
비장 내로의 Colon 26 대장암 세포 이식 마우스에 있어서의 혈중 IL-12량에 미치는 글루칸 복강 내 투여의 영향
동물수 평균치±표준 오차
IL-12 (pg/㎖)
정상군 5 587.1±53.2*
Colon 26 대장암 이식 마우스군 8 1031.9±115.2 (100%)
＋글루칸 복강 투여군 (5㎎/㎏) 7 1321.8±93.8* (128%)
＋글루칸 복강 투여군 (15㎎/㎏) 8 1494.8±133.5* (145%)
유의차 검정은 Fisher's Protected LSD 의 다중 검정으로 행하였다.
*: Colon 26 대장암 세포 이식 마우스군에 대하여 P＜0.05 로 유의차가 관찰되었다.
실시예 11 악성신생물 억제 활성 및 면역 부활 활성에 관해 (경구 투여 실험에 관해)
실시예 1 에서 나타낸 방법으로 조제한 오레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pu11ulans) GM-NH-lA1 주 유래의 β-1,3-1,6-D-글루칸 (이하 간단히 글루칸이라고 한다.) 을 사용하여, 마우스에 의한 악성신생물 억제 활성과 악성신생물 전이 억제 활성을 검토하였다.
1. 방법 및 재료
실험 재료
1) Matrigel (Reduced Growth Factor) 은 Becton Dickison 사에서 구입하였다. 글루칸은 실시예 1 에서 조제한 것을 사용하고, 증류수로 투석 후, 5㎎/㎖ 와 4.5㎎/㎖ 의 글루칸 용액을 조제하여 실험에 제공하였다. 마우스 10g 체중당 0.1㎖ 를 경구 투여하였다.
2) 동물
Balb/c 마우스 (수컷, 5주령) 는 쿠레아 (주) 에서 구입하고, 1주일 예비 사육한 후, 건강한 마우스를 실험에 사용하였다.
3) Colon 26 대장암 세포
악성신생물로서, 토호쿠대학 가령 연구소 의용세포자원센터로부터 분여된 Colon 26 대장암 세포를, 계대유지한 것을 사용하였다.
4) 비장 내로의 Colon 26 대장암 세포 이식 마우스의 제작
Colon 26 대장암 세포 (5×104 세포수/㎖) 를 인산-생리 식염 완충액 (PBS, pH 7.4) 에 현탁하고, 그 세포 현탁액에 1㎎/㎖ 의 Matrigel 을 첨가하였다. Balb/c 마우스를 넴뷰탈 마취 하에 등을 작게 절개하여 비장을 노출시키고, 그 비장 내에 Colon 26 대장암 세포 현탁액 0.2㎖ (1×104 세포수/비장) 를 주입하였다. 그 후, 즉시 작게 절개한 부분을 봉합하였다. Colon 26 대장암을 이식한 다음날부터, 조제된 글루칸 용액을 50㎎/㎏ 체중과 450㎎/㎏ 체중의 비율로 1일 1회 경구 내 투여하여 14일간 투여하였다. 정상군 및 대조군은 생리 식염수만을 투여하였다. 최종 투여 다음날 (암 이식 15일째) 에 에테르 마취 하, 하대정맥으로부터 헤파린 채혈하였다. 또한, 마우스는 채혈 후, 도살하고, 비장, 간장 및 흉선을 적출하여 각 조직 중량을 측정하였다. 간장에 전이된 Colon 26 대장암 세포 콜로니수를 계측하였다.
또한 소장을 적출하여 10% 중성 포르말린 완충액으로 고정하였다. 파라핀 포매 후, 소장의 병리 절편을 제작하였다. 각 소장 병리 절편은 통상적인 방법에 의해서 처리 후, INF-γ 항체 를 사용하여 면역 염색을 하였다. INF-γ 양성 세포수를 계측하였다.
2. 실험 결과
1) 비장에 Colon 26 대장암을 이식한 마우스에 있어서의 원발 종양에 미치는 글루칸의 효과
이하의 표 9 에 나타내는 바와 같이, 비장 내에 Colon 26 대장암을 이식하면, 확실히 비장 내로 암 세포가 증식되었지만, 글루칸 투여군은 비장 내의 암 중량 증가에 대하여 유의하게 억제 효과를 나타내었다. 즉 50㎎/㎏ 투여군에서 27.9%, 450㎎/㎏ 투여군에서 23.9% 의 억제 효과가 관찰되었다.
2) 비장 내에 Colon 26 대장암을 이식한 마우스에 있어서의 간장 전이에 미치는 글루칸의 영향
이하의 표 9 에 나타내는 바와 같이, 비장 내에 Co1on 26 대장암을 이식하면, 명확하게 간장으로의 Colon 26 대장암의 전이가 관찰되고, 간장 중량이 증가되었다. 한편, 글루칸 경구 투여군에서는, 간장으로의 전이에 대하여 Co1on 26 대장암 이식 마우스군과의 비교에 있어서, 유의하게 간장으로의 암전이 콜로니수를 억제하였다. 즉 50㎎/㎖ 투여군에서 37.3%, 450㎎/㎏ 투여군에서 4.9% 의 항암 전이 효과가 보였다.
비장 내에 Colon 26 대장암 세포를 이식한 마우스에 있어서의 비장 원발 종양 중량과 간장에 대한 종양 전이 콜로니수에 미치는 글루칸 경구 투여의 영향
동물수 평균치+표준오차
원발 종양 중량(㎎) 간장에 대한 종양 전이 콜로니수 (개)
정상군 5 73.0±2.97* (비장 중량)
Colon 26 대장암 이식 마우스군 8 1809.3±156.5 (100%) 142±11 (100%)
+ 글루칸 경구투여군 (50㎎/㎏) 7 1305.3±193.1* (72.1%) 89±12* (62.7%)
+ 글루칸 경구투여군 (450㎎/㎏) 8 1376.3±193.1* (76.1%) 135±27 (95.1%)
유의차 검정은 Fisher' s Protected LSD 의 다중 검정으로 실시하였다.
* : co1on 26 대장암 세포 이식 마우스군에 대하여 P＜0.05 에서 유의차가 관찰되었다.
3) 비장 내 Co1on 26 대장암 세포 이식 마우스에 있어서의 장관 면역 기능에 미치는 경구 투여 글루칸의 영향
표 1O 에 나타내는 바와 같이, 비장 내에 Colon 26 대장암을 이식하면, 소장 점막 조직 중의 INF-γ양성 세포수는 감소되었다. 50㎎/㎏ 의 글루칸의 경구 투여에서는, INF-γ양성 세포수가 Co1on 26 대장암 이식 마우스와 비교하여, 유의하게 증가하였다. 고용량 (450㎎/㎏) 에서는, INF-γ양성 세포수에 대하여, 유의하게 증가되지 않았다.
비장 내에 Colon 26 대장암 세포를 이식한 마우스에 있어서의 소장 점막 조직 중의 INF-γ양성 세포수에 미치는 글루칸 경구 투여의 영향
동물수 평균치+표준오차
INF-γ양성 세포수
정상군 5 331±16*
Colon 26 대장암 이식 마우스군 8 281±15 (100%)
+ 글루칸 경구투여군 (50㎎/㎏) 7 333±19* (119%)
+ 글루칸 경구투여군 (450㎎/㎏) 8 286±17 (102%)
유의차 검정은 Fisher' s Protected LSD 의 다중 검정으로 실시하였다.
* : co1on 26 대장암 세포 이식 마우스군에 대하여 P＜0.05 에서 유의차가 관찰되었다.
실시예 12
앨러지 억제 효과에 관해서
1. 방법
1) 난백 알부민 경구 섭취에 의한 앨러지 감작 방법
Balb/c 마우스 (암컷, 4주령) 에 β-글루칸함유 분말 사료 (0, 0.25%, 0.5%, 1.0%) 를 실험기간 중에 자유 섭취시켰다 (β-글루칸 투여 마우스군, 또, β-글루칸 미함유 분말 사료를 섭취시킨 마우스를 컨트롤 마우스군으로 하였다). 사육 기간 중, 케이지 마다 (7마리의 마우스를 1 케이지에서 사육 실험) 의 섭취량은 매일 측정하고, 마우스의 체중은 1주간마다 측정하였다. β-글루칸 섭취 개시 후, 2주일째부터 1주일 1% 의 난백 알부민 수용액을 자유롭게 섭취시켰다 (1차 항체 생성, 1차 감작 실험). 또한 후반의 3일간은 2.5% 의 난백 알부민 수용액을 조석 2회 강제 경구 투여하였다 (난백 알부민 5㎎ x 2회/마우스/일).
난백 알부민 수용액에 의한 섭취 종료 후, 3 및 7일째에 수산화알루미늄겔 1.6㎎ 함유 25㎍ 난백 알부민 생리 식염 용액을 복강내 투여하여, 면역 유도하였다 (2차 항체 생성, 2차 감작 실험). 2회의 난백 알부민 복강내 투여 종료 다음날, 에테르 마취 하, 하대정맥으로부터 채혈하여 혈청을 얻었다. 비장, 흉선, 및 소장은 빠르게 적출하여, 비장 및 흉선은 중량을 측정하고, 적출한 소장은 l0% 포르말린 완충액으로 고정하여, 병리 절편을 제작하였다.
2) 혈청 중의 사이토카인류 및 면역 글로부린류의 측정
혈청 중의 난백 알부민 특이적 면역 글로부린 IgG, IgGl, IgG2a, IgA 및 lgE 는 난백 알부민을 코팅한 96웰 플레이트 및 각종 항면역 글로부린 항체를 사용하여 ELISA 법으로 측정하였다.
3) 소장의 면역조직학적 평가
포르말린 고정된 소장 절편을 통상적인 방법에 따라, 파라핀 포매 후, 두께 5㎛ 의 병리 절편을 제작하였다. 그 후, 탈파라핀 처리를 하여, CD4, CD8, INF-γ, IgA 항체를 사용하여 면역 염색하였다. 그 후, CD4 및 CD8 양성 세포수, INF-γ및 IgA 분비 세포수를 계측하였다.
2. 결과
1) 난백 알부민 감작 면역 반응시의 체중, 섭취량, 전신반응성에 미치는β-글루칸의 영향
β-글루칸 섭취 마우스군과 대조 마우스군의 2주간 후의 체중 추이, 난백 알부민 용액 섭취 1주간의 체중 추이 및 난백 알부민 복강내 투여에 면역 감작 유도에 있어서의 체중 추이에 대하여, 난백 알부민으로 감작되어 있지 않은 마우스군 (정상 마우스군) 과 비교하여, 체중 추이, 난백 알부민 투여 (1차 감작) 후의 체중 추이, 난백 알부민 복강 투여 (2차 감작) 후의 체중 추이에 차는 보이지 않았다.
1회째와 2회째의 난백 알부민 복강 투여에 의한 2차 감작에서는, β-글루칸 투여 마우스군에서는, 정상 마우스군 (난백 알부민으로 감작되어 있지 않은 마우스군) 에 비교하여 현저한 섭취량의 저하가 관찰되었다. 즉 양자 사이에서는 즉시 앨러지 증상이 관찰되었다. 1회째의 난백 알부민 감작에 있어서, 섭취량은 β-글루칸 투여 마우스군은 정상 마우스군에 비교하여 감소되었다. 2회째의 난백 알부민 감작에서는, 섭취량은 대조 마우스군에서는 저하되고, 1회째와 같은 앨러지 증상이 보였지만, β-글루칸 투여 마우스군 (1.0% 와 0.5% 함유 먹이) 에서는, 대조 마우스군에 비교하여 섭취량은 증가되고, 정상 마우스군에 가까운 섭취량을 나타내었다. 즉 앨러지 증상이 극적으로 완화되었다.
1회째 및 2회의 난백 알부민 감작에 수반되는 전신의 반응성에 관해서, 1회째 및 2회째의 난백 알부민 감작 (2차 감작) 에 의해서, 마우스의 떨림, 입모, 웅크림 행동이 현저하게 관찰되었다. 1회째의 난백 알부민 감작에 의한 마우스의 떨림, 입모, 웅크림 행동은, 12시간 후의 관찰에 있어서도 회복은 보이지 않고, β-글루칸의 투여에 의해서 해소되지 않았다. 2회째의 난백 알부민 감작에 의한 마우스의 떨림, 입모, 웅크림 행동은, β-글루칸 (0.5% 및 1.O% 함유 혼합 먹이) 의 섭취에 의해서, 난백 알부민 투여 4시간 후에 평상의 행동을 나타내고, 회복되어 있는 것이 판명되었다.
2) 난백 알부민 감작 면역 반응시의 비장과 흉선 중량에 미치는 β-글루칸의 영향
비장 중량은 난백 알부민 감작에 의해서, 정상군 (난백 알부민 투여하지 않은 마우스) 에 비하여 증가되었다. 한편, 흉선 중량은 저하되었다. β-글루칸 투여 마우스군에서는, 대조 마우스군에 비하여, β-글루칸 1.0% 혼합 먹이 섭취군에서는 더욱 비장 중량을 증가시키고, 흉선 중량을 저하하였다. 이 사실로부터 β-글루칸 투여에 의한 비장으로부터의 면역 기능 항진을 생각할 수 있다 (표 11).
난백 알부민 감작 마우스에 있어서의 비장과 흉선의 중량 변화
처리 마우스 동물수 비장 (㎎) 흉선 (㎎)
정상 마우스 7 90.2±1.5* 47.2±2.2*
대조군 (0%) 8 113.9±2.9# 35.4±1.7#
Beta-glucan 0.25% 7 112.7±2.9# 33.7±2.8#
Beta-glucan 0.5% 7 119.4±5.8# 30.6±1.5#
Beta-glucan 1.0% 7 127.0±5.2#* 28.7±1.2#*
* ; 대조 마우스 (P＜O.O5), #; 정상 마우스 (P＜0.O5)
유의차 검정은 Fisher' s Protected LSD 의 다중 검정으로 실시하였다.
3) 난백 알부민 감작에 의한 난백 알부민 반응 혈중 면역 글로부린류 생성 (2차 항체 생성) 에 미치는 β-글루칸의 영향
난백 알부민 감작에 의한 항체 생성 (IgC, lgG1 (Th1 세포 유래 면역 글로부린), lgG2a (Th2 세포 유래 면역 글로부린), IgA 및 IgE) 은, 정상 마우스군에 비교하여, 대조 마우스군에서는 유의하게 증가되고, 난백 알부민의 경구 투여에 의해 2차 항체 생성이 일어나고, 면역 반응을 야기하고 있는 것이 판명되었다. 또한, 1gG, IgG1, IgG2a 및 IgA 의 생성은 β-글루칸 섭취에 의해서도 대조 마우스군과 비교하여 영향을 주지 않았다 (표 12).
한편, 앨러지 반응에 관계하는 IgE 생성은, β-글루칸 투여 마우스군 (1.0% 혼합 먹이) 에서 저하가 관찰되었다 (표 12). 이 사실은 β-글루칸이 항앨러지 작용을 가질 가능성이 시사되었다.
난백 알부민 감작 마우스에 있어서의 혈중의 난백 알부민 특이적 항체 생성에 관한 β-글루칸의 효과
처리 마우스 동물수 난백 알부민 감작 마우스의 혈중 난백 알부민 특이적 항원 (OD ×100)1)
IgG IgG1 IgG2a IgA IgE
정상 마우스 7 17.0±1.9# 0.6±0.1# 0.3±0.1# 13.7±3.2# 0.9±0.2
대조군(0%) 8 47.2±8.6# 43.8±11.3# 7.7±3.8# 23.5±2.3# 1.4±0.3
Beta-glucan 0.25% 7 48.1±8.7# 45.8±13.5# 7.9±3.5# 25.6±3.5# 0.8±0.2
Beta-glucan 0.5% 7 45.2±9.8# 40.6±13.1# 4.0±1.2# 20.8±4.1# 1.0±0.2
Beta-glucan 1.0% 7 47.1±7.8# 34.0±10.7# 7.1±3.0# 24.7±2.9# 0.3±0.1#*
1) 각 항체의 측정치는, 흡광도의 값을 나타낸다.
* ; 대조 마우스 (P＜0.05) ; # ; 정상 마우스 (P＜0.05)
유의차 검정은 Fisher' s Protected LSD 의 다중 검정으로 실시하였다.
4) 난백 알부민 감작에 의한 소장 면역 반응에 미치는 β-글루칸의 영향 (면역 조직학적 평가)
표 13 에 나타내는 바와 같이, 난백 알부민 섭취에 의해, 소장 내의 림프구의 CD4 양성 세포수와 CD8 양성 세포수는 대조 마우스군에 비하여, β-글루칸 섭취군 (0.5% 과 l.0% 혼합 먹이) 에서 유의하게 증가하였다. 이 사실은 난백 알부민 감작에 의한 소장내에서의 면역 염증 반응을 β-글루칸이 더욱 증강되고 있는 것을 나타내고, 이물에 대한 생체 방어 반응으로서 작용하고 있을 가능성을 시사하고 있다. 즉, CD4 의 Th1 세포가 활성화되어, IFN-γ등을 생성하여, B 세포에 기능 면역 글로부린을 생성함과 함께 병원 미생물 등을 배제하고 있을 가능성이 있다. 또한, CD8 양성 세포수가 증가한 것은, 장관에서의 지나친 면역 염증 반응의 제어와 지나친 항원 진입의 배제를 하고 있을 가능성이 있다.
또한, CD4 양성 세포는 Th1 및 Th2 세포에 보이고, 헬퍼 T 세포를 활성화하고 있는 것을 나타내고 있다. β-글루칸 투여군의 IgA 분비 세포수가, 대조 마우스군에 비하여 유의한 차가 보이지 않았지만 항진되어 있는 경향이 있다. 한편, CD8 양성 세포는 Thl 세포의 활성화에 의해 유도되는 킬러 T 세포의 활성화를 나타내고 있고, CD8 양성수의 증가가 Th2 세포계에 비하여 Thl 세포계를 유의하게 활성화하고 있는 것을 시사하고 있다. 이것으로부터 β-글루칸은 앨러지 반응을 억제하는 것이 시사된다.
난백 알부민 감작 마우스에 있어서의 소장의 CD4 및 CD8 양성 세포수와 1 gA 분비 세포수에 관한 β-글루칸의 효과
처리 마우스 동물수 난백 알부민 감작 마우스의 소장의 세포수 (필드 당의 세포수)
CD4 CD8 IgA
Noamal mice 7 54±4 229±21 40±5
Control(0%) 8 44±7 204±25 32±4
Beta-glucan 0.25% 7 77±9* 249±37 30±4
Beta-glucan 0.5% 7 100±5*# 386±17*# 39±4
Beta-glucan 1.0% 7 133±12*# 402±22*# 41±4
* ; 대조 마우스 (P＜0.05) ; # ; 정상 마우스 (P＜0.05)
유의차 검정은 Fisher' s Protected LSD 의 다중 검정으로 실시하였다.
결론)
이상의 결과로부터, β-글루칸의 섭취는 음식물 항원이 되는 난백 알부민에 대하여, 면역 반응에 수반되는 염증을 제어하여, 생체 방어 반응을 유지하는 기능이 있는 것이 시사된다.
본 발명의 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액은 보존안정성이나 열안정성이 개선되 고, 면역 부활 특성 등의 효능을 대폭 높일 수 있어, 항악성신생물제, 특히, 항악성종양제 또는 항암제, INF-γ생산제, INF-γ생산효과에 기초하여 억제 또는 치유되는 질병의 치료제, 악성신생물 전이 억제제, 앨러지성 질환 억제제, 특히 I 형 앨러지성 질환 억제제, 매크로파지 활성화제로서 의약품, 건강식품, 외용제, 화장품 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (29)

  1. β-1,3-1,6-D-글루칸의 수용액이고, 1N 수산화나트륨 중수용액을 용매로 하는 그 용액의 1H NMR 스펙트럼이 4.7ppm 과 4.5ppm 의 2개의 시그널을 갖고, 그 수용액의 30℃, pH 5.0, 농도 0.5% (w/v) 에 있어서의 점도가 50cP (mPa·s) 이하인 것을 특징으로 하는 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액.
  2. 제 1 항에 있어서, β-1,3-1,6-D-글루칸의 분자량이 1만∼50만인 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 1차 입자직경이 0.05∼2.0㎛ 인 미립자 β-1,3-1,6-D-글루칸을 포함하는 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, β-1,3-1,6-D-글루칸의β-1,3결합/β-1,6결합의 결합비가 0.5∼2.0 인, β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 1N 수산화나트륨 중수용액을 용매로 하는 1H NMR 스펙트럼에 있어서의 β-1,3결합과 β-1,6결합 시그널의 적분비에 근거하는, β-1,3결합/β-1,6결합의 결합비가 1.0∼1.5 인 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, β-1,3-1,6-D-글루칸이 황함유 기를 갖는 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, β-1,3-1,6-D-글루칸은 오레오바시디움속 (Aureobasidium sp.) 에 속하는 미생물이 균체외에 생성하는 β-1,3-1,6-D-글루칸인 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액.
  8. 제 7 항에 있어서, 미생물이 오레오바시디움 풀루란 (Aureobasidium pullulans) 인 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액.
  9. 제 8 항에 있어서, 미생물이 오레오바시디움 풀루란 (Aureobasidium pullulans) GM-NH-lA1주 (기탁번호 : FERM P-l9285), 또는 오레오바시디움 풀루란 (Aureobasidium pu11ulans) GM-NH-lA2주 (기탁번호 : FERM P-19286) 인 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물을 함유하지 않은 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 금속 이온 농도가 120㎎/100㎖ 이하인 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액.
  12. 제 11 항에 있어서, 금속 이온이 Na 이온 및 Ca 이온인 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액으로부터 미립자 β-1,3-1,6-D-글루칸을 제거하여 얻어지는 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액.
  14. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액으로부터, 수용해 β-1,3-1,6-D-글루칸을 제거하여 얻어지는 미립자 β-1,3-1,6-D-글루칸.
  15. 제 13 항에 의해 얻어지는 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액 및 제 14 항에 의해 얻어지는 미립자 β-1,3-1,6-D-글루칸을 임의로 배합하여 얻어지는 β-1,3-1,6-D-글루칸 함유액.
  16. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액을 건조시켜 얻어지는 건조 β-1,3-1,6-D-글루칸.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액 또는 β-1,3-1,6-D-글루칸을 유효성분으로 하는 항악성신생물제.
  18. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액 또는 β-1,3-1,6-D-글루칸을 유효성분으로 하는 악성신생물 전이 억제제.
  19. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액 또는 β-1,3-1,6-D-글루칸을 유효성분으로 하는 INF-γ생성제.
  20. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액 또는 β-1,3-1,6-D-글루칸을 유효성분으로 하는 INF-γ생성에 기인하여 억제 또는 치유되는 질환의 치료제.
  21. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액 또는 β-1,3-1,6-D-글루칸을 유효성분으로 하는 앨러지 억제제.
  22. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액 또는 β-1,3-1,6-D-글루칸을 유효성분으로 하는 매크로 퍼지 활성화제.
  23. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액 또는 β-1,3-1,6-D-글루칸을 함유하는 건강식품 또는 건강증진제.
  24. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액 또는 β-1,3-1,6-D-글루칸을 함유하는 외용제.
  25. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액 또는 β-1,3-1,6-D-글루칸을 함유하는 화장품.
  26. β-1,3-1,6-D-글루칸을 포함하는 미생물 배양액에 알칼리, 또는 그 수용액을 첨가하여, pH 를 12 이상으로 하여 그 배양액을 저점도화한 후, 미생물을 함유하는 불용물을 분리제거하고, 다시 금속 이온 농도가 120㎎/100㎖ 이하가 되도록 그 금속 이온을 제거하는 것을 특징으로 하는 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액의 조제방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 금속 이온이 Na 이온 및 Ca 이온인 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액의 조제방법.
  28. 제 1 항 내지 제 10 항의 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액을 투석 농축하여, 그 농축액에 알코올류를 첨가하여 β-1,3-1,6-D-글루칸을 석출시켜, 얻어지는 β-1,3-1,6-D-글루칸/알코올/물로 이루어지는 슬러리를 분액하여, 침강슬러리를 분무 건조 하는 것을 특징으로 하는 고순도 β-1,3-1,6-D-글루칸 분말의 조제방법.
  29. 제 1 항 내지 제 10 항의 β-1,3-1,6-D-글루칸 수용액을 투석 후, 다시 감압 농축하고, 계속하여 농축액을 분무 건조시키는 것을 특징으로 하는 고순도 β-1,3-1,6-D-글루칸 분말의 조제방법.
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